Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей

Смагин, Владимир Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей"

На правах рукописи

/%4-г ^

СМАГИН ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ

Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей

(03.01.04 - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

МОСКВА-2011

4847157

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Учреждения Российской академии наук Центра «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Турова Татьяна Павловна

доктор химических наук Тишков Владимир Иванович

Ведущая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится «02» июня 2011 г. в 14 часов на заседании Совета Д 002.247.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » апреля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

ДНК-лигазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма ДНК и принимают участие в процессах репликации, репарации и рекомбинации. Они присутствуют у эукариот, бактерий и архей, и могут быть разделены на два семейства в соответствии с используемыми кофакторами, - АТФ-зависимые ДНК-лигазы (ЕС 6.5.1.1) и НАД -зависимые лигазы (ЕС 6.5.1.2). ДНК лигазы катализируют присоединение 5'-Р донорного конца к З'-ОН акцепторному концу в результате трех последовательных реакций переноса. АТФ-зависимые ДНК-лигазы найдены в бактериофагах, археях, эукариотах и эукариотических вирусах, в то время как НАД+ -зависимые ДНК-лигазы встречаются в основном у бактерий. Все известные в настоящее время эукариотические и архейные ДНК лигазы, а также лигазы из бактериофагов и вирусов, являются АТФ-зависимыми и содержат специфические мотивы в их аминокислотных последовательностях.

Археи являются одноклеточными организмами, обитающими, как правило, в экстремальных условиях окружающей среды, характеризующихся высокой или низкой температурой, экстремальными значениями рН и т.п. Одной из важнейших эволюционно древних групп архей являются термофилы. Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации, включая ДНК-лигазы, более близок к эукариотическому. Таким образом, ДНК-лигазы архей, в особенности гипертермофильных, представляют собой модель для изучения ДНК-лигаз эукариот, в частности, в качестве объектов структурных исследований.

ДНК-лигазы архей могут использовать в качестве кофактора АТФ, но, в отличие от ДНК-лигаз эукариот, некоторые лигазы гипертермофильных архей могут также использовать и НАД+. Эти данные

позволяют предположить, что некоторые архейные ДНК-лигазы могут представлять неспециализированные предковые ферменты, являющиеся эволюционными предшественниками специализированных ДНК-лигаз бактерий и эукариот. Таким образом, ДНК-лигазы термофильных архей, являющихся эволюционно-древними организмами, представляют собой интересную модель для изучения фундаментальных проблем эволюции семейства ДНК-лигаз.

Наконец, важной особенностью ДНК лигаз термофильных архей является устойчивость этих ферментов к высоким температурам, открывающая, как и случае термостабильных ДНК-полимераз, перспективы их практического применения в молекулярной диагностике и генетической инженерии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является выделение и характеристика новых ДНК-лигаз из двух эволюционно удаленных друг от друга гипертермофильных архей, - эуриархеи штамма 1519 и кренархеи штамма Acidilobus aceticus 1904.

Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Молекулярная идентификация и определение филогенетического положения штамма термофильных архей 1519.

2. Выделение и секвенирование генов ДНК-лигазы LigThl519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAcl904 из Acidilobus aceticus 1904.

3. Создание штаммов Escherichia coli - продуцентов рекомбинантных ДНК-лигаз LigThl519 и LigAcl904, выделение и очистка ферментов.

4. Проведение биохимической характеристики рекомбинантных ДНК-лигаз, включающей определение зависимости активности от температуры и значения рН, концентрации солей, термостабильности, определение используемых нуклеотидных кофакторов.

Научная новизна и практическая значимость работы

Идентифицированы и охарактеризованы две новые ДНК-лигазы гипертермофильных архей, - кренархеи Acidilobus aceticus и эуриархеи Thermococcus sp 1519. Созданы системы экспрессии этих лигаз в клетках Е. coli, позволяющие получать рекомбинантные ферменты для функциональной характеристики и структурных исследований. Установлено, что обе ДНК-лигазы являются АТФ-зависимыми и, в отличие от всех ранее охарактеризованных ДНК-лигаз архей рода Thermococcus, не способны использовать в качестве «энергетического» кофактора НАД+.

Практическая значимость работы обусловлены перспективами применения термостабильных ДНК-лигаз для молекулярно-биологических исследований в самых различных областях деятельности, от медицины до криминалистики. Так, наряду с ПЦР, для детекции и амплификации специфических последовательностей ДНК, в том числе полиморфизмов ДНК, используется метод лигазной цепной реакции (ЛЦР). Этот метод известен уже давно и активно применяется в диагностической практике, например в США, в России он практически не используется, в значительной степени из-за отсутствия термостабильных ДНК-лигаз на Российском рынке. Новая ДНК-лигаза LigAcl904 является перспективной для использования в ЛЦР. Другой областью использования термостабильных лигаз является их использование для «сборки» синтетических генов из олигонуклеотидов проводимой при повышенной температуре для снижения вероятности образования неспецифических продуктов лигирования. Для этого может быть использована ДНК-лигаза LigThl519. Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,

2007), международной конференции "Thermophiles-2007" (Берген, Норвегия, 2007), Международной конференции BioMicroWorld2007 (Севилья, Испания, 2007).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Получено 2 патента РФ на изобретения. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста и включают 46 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 3 отечественных и 140 иностранных источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи штамма 1519

Определение филогенетического положения штамма 1519

Штамм архей 1519 был выделен В.А. Светличным из проб с гидротермального поля Гуаймас в Атлантическом океане, отобранных В.Ф. Гальченко в ходе рейса №12 НИС «Академик М. Келдыш» (1986 г.). Оптимальная температура роста 85°С, оптимальный рН среды 6.2-6.4.

Идентификацию микроорганизма проводили молекулярными методами, по последовательности генов 16S рибосомной РЖ. Для этого ген 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием универсальных праймеров 8F и 1491R, и секвенировали полученный фрагмент. Сравнение последовательности гена 16S рРНК штамма 1519 с представленными в GenBank последовательностями показало, что штамм 1519 относится к отделу Euryarchaeota, классу Thermococci, порядку Thermococcales, семейству Thermococcaceae и роду Thermococcus, в котором наиболее близкородственными ему организмами являются Thermococcus gammatolerance и Thermococcus kodakaraensis с 99% уровнем сходства последовательностей генов 16S рРНК.

Клонирование и экспрессия гена ligTh!519

Анализ представленных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов ДНК-лигаз архей семейства Thermococcaceae, выявил несколько консервативных участков, два из которых были использованы для создания пары специфических праймеров. С их помощью на суммарной ДНК Thermococcus sp. 1519 был амплифицирован фрагмент длиной около 600 п.н., последовательность которого имела высокую гомологию с генами АТФ-зависимых ДНК-лигаз архей. Полная

последовательность гена ДНК-лигазы ligThl519 была определена методом «инверсного» ПЦР.

Анализ последовательности предсказанного продукта гена ligThl519 показал, что LigThl519 состоит из 559 аминокислот и имеет высокую степень гомологии с другими АТФ-зависимыми ДНК-лигазами архей, в том числе с лигазой Thermococcus kodakaraensis (91%), Thermococcus fumicolans (89%), Pyrococcus abyssi (82%). Сравнение последовательности LigThl519 с базой данных консервативных доменов CDD выявило трехдоменную организацию этой ДНК-лигазы, - N-концевой ДНК-связывающий домен (Pfam04675), нуклеотидил-трансферазный домен (Pfam01068) и С-концевой OB-fold домен (Pfam04679).

Ген ligThl519 клонировали в экспрессионном векторе pQE30 (Qiagen), таким образом, что синтезируемый рекомбинантный белок LigThl519 дополнительно содержал на N-конце шесть аминокислотных остатков гистидина. Экспрессию LigTh 1519 проводили в штамме Е. coli DLT1270, дополнительно содержащем плазмиду pRARE-2 (Novagen), обеспечивающую синтез тРНК для кодонов, редко используемых Е. coli. Рекомбинантный белок LigThl519 очищали с помощью металл-афинной хромотографии (Рис. 1).

120-

86-

1 2 3

4 5

LigTh1519 2, - белковый препарат из клеток

Рисунок 1. Экспрессия LigThl519 в E.coli и очистка белка. Приведены результаты SDS-PAGE анализа белковых препаратов:

Дор. 1 и 4, - маркеры мол. веса, размеры указаны в кД,

Ы-ШШ

47-Ш

- 1

штамма БЫ1270/рКА11Е,

содержащего р(ЗЕ30- 1л§ТЫ519, до индукции синтеза 1^ТЬ1519, 3, - то же, что на дор. 2, но через 3 часа после индукции синтеза 1^ТЪ1519 внесением в среду 1мМ ИПТГ,

5, - очищенный препарат LigThl 519

Для определения функциональных свойств лигазы 1^ТЫ519 был использован метод, основанный на определении способности исследуемого белка лигировать когезивные концы ДНК фага X. Эти концы имеют длину 12 нт и образуют стабильный дуплекс при нормальной температуре реакции (45-50°С). ДНК фага лямбда обрабатывали эндонуклеазой рестрикции ЕЫЕИ и инкубировали с 1^ТЫ519. Если тестируемый фермент обладает лигазной активностью, то из двух концевых Е^ЕП - фрагментов длиной 8453 нт. и 5678 нт., образуется фрагмент длиной 14131 нт., что легко можно детектировать с помощью электрофореза в агарозном геле. Представленные на Рис. 2 результаты показывают, что рекомбинантный белок Ы§ТЫ519 действительно проявляет активность АТФ-зависимой ДНК-лигазы. Отметим, что лигирование остальных (не концевых) рестрикционных фрагментов не наблюдалось ни в описанном эксперименте с ВяШП, ни в случае обработки ДНК фага X рестриктазой НтсЦП, образующей липкие концы длиной 4 нт.

12 3 4

Рисунок 2. Анализ способности 1л£ТЫ519 лигировать фрагменты, образованные при обработке ДНК фага X эндонуклеазой Вз1ЕН.

1 - маркер молекулярной массы ДНК (длины фрагментов указаны в т.п.н.);

2 - ДНК фага X после обработки рестриктазой ЕЫЕП;

3 - Препарат Е^ЕП-фрагментов ДНК фага X после инкубации с лигазой 1^Т111519 в буфере, содержащем 1мМ АТФ.

4 - тоже, что на дорожке 3, но без добавления АТФ в буфер для лигирования. Перед нанесением на электрофорез препараты ДНК были прогреты в течение 10 мин. при 70°С. Справа стрелками показаны концевые Вз1ЕП-фрагменты А (5678 п.н.) и В (8453 п.н), а также продукт их лигирования, С (14131 п.н.).

Влияние температуры, рН и концентрации солей на активность ДНК лигазы LigThl519

Полуколичественное определение лигазной активности LigThl519 проводили, измеряя эффективность «зашивания» однонитевого разрыва в двунитевом фрагменте ДНК. В качестве субстрата использовали ДНК-дуплекс, образованный в результате отжига трех синтетических олигонуклеотидов, - LA30, LA40 и LA80 (Рис. 3). В олигонуклеотид LA-30 вводили радиоактивную метку на 5'-конце. В результате «зашивания» однонитевого разрыва ДНК-лигазой радиоактивно-меченый праймер LA30 соединялся с LA40, что приводило к образованию радиоактивно-меченного олигонуклеотида LA70 длиною 70 нт. Определяли зависимость активности LigThl519 от рН буфера, концентраций NaCl и MgCl2, а также температуры.

LA40 LA30

CGCRCCGTGACGCCAJVGCTTGCMTCCTACAGGTCGACTC CAGAGGbTTGTTGACCeGCCCGTTTGTCAG AACCGCGTGGCACTGCGGTTCGAACGTAAGGATGTCCAGCTGAG-GTCTCCTAACAACTGGCCGGGCAAACAGTCGTTGC

LA80

Рисунок 3. Структура синтетического субстрата, использованного для определения эффективности лигирования однонитевого разрыва. Положение у32Р - радиоактивной метки, введенной на 5'- конец олигонуклеотида LA30, указано звездочкой.

Лигаза LigThl519 активна в широком диапазоне концентраций NaCl, от 0 до 200мМ. Оптимум достигается при довольно высоких концентрациях и находится в районе 75-100 мМ NaCl (Рис. 4). Высокие концентрации NaCl, 500мМ и более, полностью ингибируют активность фермента. Представленные на Рис. 4 результаты показывают, что LigThl519 активен в широком диапазоне значений рН (7,0-10,7), с оптимумом реакции при рН ~ 10.0. Активность фермента резко падает при рН ниже 7.0. В этом отношении LigTh 1519 отличается от ДНК-лигазы Thermococcus fumicolans, проявляющей активность в узком диапазоне значений рН (6.5 -7.0).

NaCI, мМ к, О О 2S 50 75 100 150 200 500 рН К.7 5,5 8 6,5 7 9 S.5 10 10,7

Рисунок 4. Зависимость активности лигазы LigThl519 от концентрации NaCI (левая панель) и рН (правая панель).

А - Результаты электрофоретического анализа продуктов лигирования в полиакриламидном геле (показана радиоавтография геля). Верхняя полоса (LA70*) соответствует продукту лигирования, нижняя (LA30*) - одному из субстратов.

Б - диаграмма, показывающая относительную эффективность лигирования (соотношение интенсивностей полос продукт/субстрат).

Мы установили, что для лигазной активности LigTh 1519 необходимо наличие в среде двухвалентного катиона (Mg+), причем фермент активен в широком диапазоне концентраций MgCl2 (2-80 мМ), с оптимумом при довольно высокой концентрации, в районе 50 мМ (Рис. 5). Интересно, что столь высокие концентрации двухвалентного металла не оказывают ингибирующего действия на фермент, в отличие от лигазы Т. fumicolans, активность которой максимальна при 2 мМ MgCl2 и резко снижается при концентрации выше 5 мМ.

ДНК лигаза LigThl519 проявляет активность в широком диапазоне температур. Хотя оптимальная температура реакции составляет 70°С (Рис. 5), фермент активен при температурах от 50 до 75°С, а, возможно, и выше, поскольку при температурах выше 70°С денатурация субстрата не позволяет проводить определение активности фермента.

Термостабильность 1^ТЫ519 оценивали, инкубируя фермент в реакционном буфере (без АТФ) при 80°С или 94°С, затем определяли активность фермента стандартный методом.

MgCl2, мМ к,20 0 20 30 40 50 60 70

5 0,2 {

МдС1г, мМ к,20 0 20 30 40 50 60 70

"•ИШй

Т, °С к,55 50 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 90

1,2 -........-.........................

. Eil Й Й В

Т, °С к,55 50 55 60 65 70 75 80 90

Рисунок 5. Зависимость активности лигазы LigThl519 от концентрации MgCl2 (слева) и температуры реакции (справа).

Мы установили, что фермент теряет около половины своей активности в течение 20 минут при 80°С (Рис. 6) и 5 минут при 94°С. Так как температура роста Thermococcus sp. 1519 составляет 85°С, то возникает вопрос о том, что может служить причиной низкой термостабильности. Одной из возможных причин может быть наличие в составе рекомбинантного белка использованного для очистки N-концевого 6-гистидинового тага и нескольких дополнительных аминокислот, являющихся следствием клонирования. Мы решили проверить это предположение, протестировав термостабильность рекомбинантного белка без гистидинового тага. Для этого ген ligThl519 был клонирован в экспрессионном векторе pQE60, обеспечивающем продукцию «природного» белка без дополнительных последовательностей. Рекомбинантный вектор вводили в штамм Е. coli DLT1270/pRARE. После индукции экспрессии ДНК-лигазы был приготовлен препарат клеточного экстракта, содержащий немодифицированный LigThl519. Для частичной

очистки препарата от термолабильных белков и инактивации ДНК-лигазы Е. coli, клеточный экстракт препарат был прогрет в течении 20 мин при 70°С и для определения термостабильности лигазы. Хотя полученные результаты (Рис. 6) показали более высокую термостабильность (время полуинактивации при 80°С составило 30-35 минут), фермент по-прежнему быстро инактивировался при температуре, нормальной для роста микроорганизма. Возможными причинами могут быть различия фолдинга белка в Е. coli и археях Thermococcus и/или наличие в клетках Thermococcus дополнительно стабилизирующих белок факторов.

1,2

I 1 ¡0,8 я

I 0,6

I 0,4

50,2 0 ;

О 20 40 60 80 100 120 Время инативации при 80 °С, мин.

О 20 40 60 80 100 120 140 Время инативации при 80 °С, мин.

■_____________

0 20 40 60 80 100 120 Время инативации при 80 °С, мин.

1,2

I 1 I °'8 I 0,6

с:

I 0,2

I ..... ' '

I I

Iii,..

0 20 40 60 80 100 120 140 Время инативации при 80 сС, мин.

Рисунок 6. Термостабильность лигазы LigThl519 при 80°. В реакциях использовали рекомбинантный белок с 6-гистидиновым тагом (слева) и белок, не содержащий N-концевого 6-гистидинового тага (справа).

Определение специфичности ДНК-лигазы LigThl519 в отношении кофактора

Известно, что некоторые ДНК-лигазы архей, в частности, представителей рода Thermococcus, могут наряду с АТФ использовать в качестве «энергетического» кофактора и НАД+, что может быть обусловлено особенностями эволюции ДНК-лигаз архей. Поэтому мы протестировали возможность использования этого кофактора ДНК-лигазой LigThl519. Поскольку выделенный из Е. coli фермент, вследствие наличия

в препарате предаденилированной фракции, проявлял активность и в отсутствии добавленного в реакцию АТФ, первой задачей было получение препарата без предаденилированной фракции, активность которого строго зависела бы от внесения кофактора в реакцию. Это является необходимым условием для исследования использования НАД+ в качестве кофактора, так как эффективность его использования лигазой 1^ТЫ519 может быть гораздо ниже, чем в случае с АТФ.

Фермент предварительно инкубировали в стандартных реакционных условиях с немеченым субстратом без добавления нуклеотидного кофактора, для того, чтобы преаденилированная фракция лигазы израсходовала АМФ, ковалентно связанный в активном центре. Затем в реакцию вносили радиоактивно-меченый субстрат и кофактор в различных концентрациях. Из данных, представленных на Рис. 7 видно, что этот подход позволил существенно снизить «фоновую» лигазную активность препарата в отсутствии добавленного кофактора, что повысило чувствительность метода. Отметим, что в этом эксперименте было также установлено, что лигаза 1^ТЫ519 активна в широком диапазоне концентраций АТФ, от 0.1 до 100 цМ, а более высокая концентрация АТФ (1 мМ) оказывает ингибирующий эффект.

Рисунок 7. Удаление преданилированной фракции в препарате лигазы 1^ТЬ1519. Дорожка 1- контроль без фермента; дор. 2-1000 цМ АТФ без фермента; дор. 3 - 1^ТЫ519 без кофактора; дор. 4- 7 - 1^>ТЫ519, различные концентрации АТФ (дор. 4-1000 цМ, дор. 5-100 цМ, дор. 6-10 цМ, дор. 7 -1 рМ АТФ).

ШГО"-*.

N9 дорожки 1 1.2

I 1 | 0,8 к

1 0,6 с

I 0,4

| 0,2 0

№ дорожки 1

В следующем эксперименте с помощью описанного выше метода мы тестировали способность лигазы LigTh 1519 использовать НАД+ в качестве кофактора. Для этого во вторую реакцию, проводимую после выработки предаденилированной фракции фермента, вместо АТФ вносили НАД+ в различных концентрациях. В результате этого эксперимента (Рис. 8) в присутствии НАД+ не было выявлено достоверного лигирования (образования продукта LA70*) в сравнении с контролем без добавления кофактора. Сравнивая полученные результаты с данными контрольного лигирования в присутствии АТФ, можно сделать вывод, что если НАД+ и используется в качестве кофактора, то с эффективностью не менее чем на порядок ниже, чем АТФ.

LA30'-

■Ш Ж

14 12 10

4 5 6

№ дорожки

1 г

. Г

№ дорожки

---ОЛЭ---

Рисунок 8. Тестирование способности 1л§ТЫ519 использовать в качестве кофактора НАД+. Дорожка 1 - контроль без фермента, с 1000 рМ НАД+, дор. 2- 1^ТЫ519 без кофактора; дор. 3- б - 1л§ТЫ519, различные концентрации НАД+ (дор. 3-1000 цМ, дор. 4-100 цМ, дор. 5-10 цМ, дор. 6 -1 рМ НАД+), дор 7 - 1л§ТЫ519 с 10 рМ АТФ. На дорожках 8 и 9 представлен результат лигирования того же субстрата с использованием НАД+ зависимой ДНК-лигазы Т. aquaticus (дор. 8 - 1 ед. Taq-лигaзы' без НАД+, дор. 9 - 1 ед. Taq-лигaзы с 1000 рМ НАД+).

Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи рода Ас'кШоЬт

Определение и анализ последовательности гена Ас1904

Штамм 1904 относится к отделу Сгепагскаео(а, классу Ткегторго(е1, порядку Ас1сШоЬа1ез, семейству АасШоЬасеае, роду АсМИоЪш и был описан как представитель вида АсиШоЪш асейст (РгокоГеуа е? а1, 2000).

Анализ представленных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов ДНК-лигаз архей порядка Desulfurococcales выявил несколько консервативных участков, два из которых были использованы для создания пары «консервативных» праймеров. С помощью этих праймеров на суммарной ДНК Acidilobus sp 1904 был амплифицирован фрагмент длиной около 250 п.н., последовательность которого имела высокую гомологию с генами АТФ-зависимых ДНК-лигаз архей. Полная последовательность гена ДНК-лигазы ligThl519 была определена методом «инверсного» ПЦР.

Предсказанная длина лигазы LigAcl904 составила 607 аминокислотных остатков, молекулярная масса - 67,6 кДа. LigAcl904 имеет гомологию с другими АТФ-зависимыми ДНК-лигазами архей, в том числе с лигазами Staphylothermus marinus (63%), Aeropyrum pernix (62%) и Hyperthermics butylicus (62%). Как и LigThl519, лигаза LigAcl904 содержит три домена, - N-концевой ДНК-связывающий домен, нуклеотидил-трансферазный домен и С-концевой OB-fold домен.

Клонирование гена ligAcl904, экспрессия и очистка рекомбинантного белка

На следующем этапе ген ligAcl904 клонировали в экспрессионном векторе pQE30 (Qiagen), в результате чего был получен рекомбинантный экспрессионный вектор pQE30-LigAcl904.

Экспрессию LigAcl904 проводили в штамме Е. coli DLT1270, дополнительно содержащем плазмиду pRARE-2 (Novagen). Этот штамм, содержащий рекомбинантную плазмиду pQE30-LigAcl904, выращивали на шейкере при 37°С до достижения OD6oo ~ 0.5, затем индуцировали синтез рекомбинантного белка внесением ИПТГ до 1мМ. Выделение и очистку лигазы LigAcl904 осуществляли методом металл-афинной хроматографии, в результате был получен препарат рекомбинантного белка LigAcl904 (Рис. 9).

1 2 3 4 5 Рисунок 9. Экспрессия LigAcl904 в E.coli и

•120—очистка белка.

Приведены результаты SDS-PAGE анализа белковых препаратов: 1 и 4, - маркеры молекулярного веса, ИдАс1904 размеры указаны в кД,

2, - суммарный белковый препарат, выделенный из клеток штамма DLT1270/

47—pRARE, содержащего плазмиду pQE30-

LigAcl904, до индукции синтеза LigAcl904,

3, - то же, что на дорожке 2, но через 3 часа ^после индукции синтеза LigAc 1904,

5, - очищенный препарат LigAc 1904.

Лигирование когезивных концов ДНК фага X лигазой LigAc1904.

Для определения функциональных свойств лигазы LigAc 1904 на первом этапе мы использовали метод, основанный на определении способности исследуемого белка лигировать когезивные концы ДНК фага X. ДНК фага лямбда обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BstEII и инкубировали с LigAcl904. Представленные на Рис. 10 результаты показывают, что рекомбинантный белок LigAc 1904 действительно проявляет активность АТФ-зависимой ДНК-лигазы. Высокая эффективность лигирования наблюдалась как в присутствии, так и в отсутствии вносимого в реакцию АТФ (Рис. 10, дор. 3), что свидетельствует о наличии значительной фракции предаденилированного фермента в препарате. Также установлено, что высокие концентрации АТФ (1мМ, дор. 4) ингибируют лигазную активность. Как и в случае LigThl519, лигирование остальных (не концевых) рестрикционных фрагментов не наблюдалось ни в описанном эксперименте с BstEII, ни в случае обработки ДНК фага X рестриктазой Hindlll, образующей липкие концы длиной 4 нт.

1 23 456789 10 11

шш

-й-•"' :Iг ' " "Щ^ШШ ■

Рисунок 10. Анализ способности LigAcl904 лигировать фрагменты, образованные при обработке ДНК фага X эндонуклеазой ВзгЕП.

1 - маркер молекулярной массы ДНК (длины фрагментов указаны в т.п.н.);

2 - ДНК фага X после обработки ВэИШ;

3 - X ВвШП после инкубации с лигазой 1^Ас1904 (без кофактора);

дор. 4- 9, - X СЫЕИ после инкубации с лигазой LigAcl904, различные концентрации АТФ (дор. 4-1000 рМ, дор. 5-100 рМ, дор. 6-10 цМ, дор. 7 -1 цМ, дор. 8-0.1 цМ, дор. 9-0.01 цМ АТФ).

дор. 10, - X {МЕП после лигирования Т4 ДНК-лигазой (без АТФ) дор. 11, - X Вз1ЕП после лигирования Т4 ДНК-лигазой (0.1 мМ АТФ) Перед нанесением на электрофорез препараты ДНК были прогреты в течение 10 мин. при 70°С. Справа стрелками показаны концевые Вз1ЕП-фрагменты А (5678 п.н.) и В (8453 п.н), а также продукт их лигирования, С (14131 п.н.).

Влияние температуры, рН, концентрации солей на активность ДНК лигазы LigAcl904

Полуколичественное определение лигазной активности LigAcl904 проводили на полученном в результате отжига трех олигонуклеотидов фрагменте ДНК, содержащим однонитевой разрыв в одной из цепей (Рис. 3). Определяли зависимость активности 1л£ТЫ519 от рН буфера, концентраций АТФ, ЫаС1 и М%С\2, а также температуры.

Представленные на Рис. 11 результаты показывают, что лигаза 1л§Ас1904 активна при низких концентрациях №С1 с оптимумом активности при 25мМ, при увеличении концентрации ЫаС1 наблюдался ингибирующий эффект. Оптимум для 1л§ТЫ519 достигался при более высоких концентрациях и находится в районе 75-100 мМ ЫаС1, а слабое ингибирующее действие №С1 проявлялась только при концентрациях выше 200мМ. Более высокий оптимум концентрации №С1 и меньшая чувствительность 1л£ТЫ519 к высоким концентрациям натрия, по

сравнению с LigAcl904 может объясняться особенностями местообитаний этих микроорганизмов. Так, Acidilobus 1904 был выделен из пресного горячего источника, a Thermococcus sp. 1519 - из глубоководной морской гидротермы. Вероятно, внутриклеточные концентрации ионов натрия у этих архей коррелируют с внеклеточными.

Штамм Acidilobus 1904 является умеренным ацидофилом с оптимумом роста при значении рН среды 3,8. В отличие от экстремальных ацидофилов эта архея, видимо, поддерживает нейтральный внутриклеточный рН, что соответствует данным о том, что LigAcl904 проявляет активность в диапазоне рН 6,6-8,2 (оптимум 6.8), а при значении рН ниже 6,6 активность резко падает до нуля (Рис. 11).

к,0 0 25 50 75 100 150 200 500

NaCl

lililí.: к,0 0 25 S0 75 1 00 1 50 200 500

Рисунок 11. Зависимость активности лигазы LigAcl904 от концентрации NaCl (левая панель) и рН реакционного буфера (правая панель).

Мы установили, что для лигазной активности LigAcl904 необходимо наличие в среде двухвалентного катиона Mg2+, причем фермент активен в диапазоне концентраций MgCl2 от 5 до 25 мМ (Рис. 12). ДНК лигаза LigAcl904 проявляла активность в широком диапазоне температур. Хотя оптимальная температура реакции составляла 65-70°С (Рис. 13), фермент активен при температурах от 50 до 70°С, а, возможно, и выше, поскольку при температурах выше 70°С денатурация субстрата не позволяет проводить определение активности фермента.

шиЖ

6,4 6,5 6,6 6,8 7 7 7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2 9

'ШШШ * * - - - ШШшШЩ

мМ к,2 0 2 4 6 8 10 к, 20 10 15 20 25 30 40 50 60

МдС12. мМ к,2 0 2 4 6

1.....Ж.......„

Ю К, 20 10 15 20 25 30 40 50 60

Рисунок 12. Зависимость активности лигазы 1^Ас1904 от концентрации М8С12

Термостабильность 1^Ас1904 оценивали, инкубируя фермент в реакционном буфере (без АТФ) при 94°С, затем активность фермента определяли в стандартной реакции при 70°С. Мы установили, что фермент терял половину своей активности в результате инкубации в течение 30 мин. при 94°С (Рис. 13). При температуре 80°С снижение активности фермента не наблюдалось по крайней мере в течение 1 часа. Таким образом, в отличие от ДНК-лигазы 1^ТЫ519, параметры термостабильности 1^Ас1904 соответствуют оптимальной температуре роста АсШИоЬш асейсш, составляющей 85°С.

|_А70*н

1-А70*-

1_А30*н

«• ** »

Т,°С к,70 50 55 60 65 70 75 80 90

Е 0,в I

I 0,6 ;

■ I

5 0,6 Щ

■ 0,4 !|а|

Т,°С к,70 50 55 60 65 70 75 80 90

0 15 30 46 60 75 90 105 Время инактивации при 94 °С, мин.

IВ 8 в в «а а *

0 15 30 45 60 75 90 105 Время инактивации при 94 °С, мин.

Рисунок 13. Зависимость активности лигазы LigAcl904 от температуры и (левая панель) и термостабильность фермента при 94°С (правая панель).

Определение специфичности ДНК-лигазы LigAcl904 в отношении кофактора

В следующем эксперименте была протестирована возможность использования в качестве альтернативного нуклеотидного кофактора НАД+. Как и в случае с ДНК лигазой LigThl519, для уменьшения уровня лигирования без добавления кофактора, фермент был предварительно проинкубирован в стандартных реакционных условиях без добавления нуклеотидного кофактора с немеченым субстратом, для того, чтобы преаденилированная фракция лигазы израсходовала АМФ, ковалентно связанный в активном центре. Затем в реакцию добавлялся радиоактивно-меченный субстрат и кофактор в различных концентрациях. В результате этого эксперимента (Рис. 14) не было выявлено лигазной активности фермента (образования продукта LA70*) при использовании НАД+ (дор 36) в сравнении с контролем без добавления кофактора (дор. 2). Сравнивая полученные результаты с данными контрольного лигирования в присутствии АТФ (дор. 7), можно сделать вывод, что если НАД+ и используется в качестве кофактора, то с существенно более низкой эффективностью, чем АТФ.

1 2 34567 89

Рисунок 14. Тестирование способности 1^Ас1904 использовать в качестве кофактора НАД+.

Дорожка 1- контроль без фермента, дор. 2- 1^ТЫ519 без кофактора; дор. 3- 6 -1л£Ас1904, различные концентрации НАД+ (дор. 3-1000 рМ, дор. 4-100 рМ, дор. 5 -10 рМ, дор. 6 -1 рМ НАД+), дор 7 - 1^Ас1904 с 100 рМ АТФ. На дорожках 8 и 9 представлен результат лигирования того же субстрата в течение 3 ч. при 45 °С с использованием НАД+ зависимой ДНК-лигазы Т. ациаНст (дор. 8 -Тац-лигаза без НАД+, дор. 9 - Тая-лигаза с 1000 рМ НАД+).

Потенциальные области практического применения ДНК-лигаз 1^ТЫ519 и ^Ас1904

Одной из основных областей практического применения термостабильных ДНК-лигаз является амплификация ДНК в лигазной цепной реакции, ЛЦР. Проведение ЛЦР требует высокой термостабильности фермента при температурах денатурации ДНК (90-94°С), что позволяет использовать для этих целей ДНК-лигазу 1л§Ас1904, но делает проблематичным применение 1лцТК1519. Однако, 1^ТЬ1519 обладает другим полезным свойством, - он обеспечивает лигирование лишь фрагментов ДНК, имеющих протяженные (12-нт в случае ЕЫЕП-фрагментов фага Я,), но не короткие (4-нт концы НтсНП фрагментов фага X) липкие концы. Поэтому, одним из перспективных применений нового фермента может быть «сборка» синтетических генов из олигонуклеотидов. Проведение реакции лигирования при повышенной температуре (60-70°С) должно повысить эффективность «сборки» фрагмента ДНК из олигонуклеотидов за счет снижения вероятности образования неспецифических продуктов лигирования в результате отжига случайным образом слипшихся коротких комплиментарных участков олигонуклеотидов, использованных для синтеза гена. Термостабильность 1л§ТЫ519 и ее способность лигировать лишь протяженные липкие должны снизить вероятность образования неспецифических продуктов при «сборке» генов с ее применением.

Зависимость от кофактора и эволюция ДНК-лигаз

Особенностью некоторых ДНК-лигаз эуриархей, представляющих порядок ТИегтососса^, является возможность использования наряду с АТФ в качестве нуклеотидного кофактора НАД+. Способностью использовать НАД+ обладают все три ранее охарактеризованные ДНК-лигазы представителей рода ТИегтососсиэ (Т. кос1акагаетич, Т. /,\imicolans и Т. оппиппсиБ), а также ДНК-лигаза из близкородственной им археи

Pyrococcus abyssi. Мы также исследовали возможность использования LigThl519 и LigAcl904 в качестве кофактора НАД4'. Однако, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что если эти ферменты и используют НАД+ в качестве кофактора, то, как минимум, на порядок менее эффективно, чем АТФ.

АТФ- и НАД - зависимые ДНК-лигазы обладают низкой гомологией аминокислотных последовательностей, но имеют общее каталитическое ядро. На основании этого было выдвинуто предположение, что АТФ-зависимые лигазы архей и эукариот, и НАД+ - зависимые ДНК-лигазы бактерий могли эволюционировать от общего «универсального» предкового фермента посредствам приобретения структурных элементов белка, взаимодействующих либо с у-фосфатом АТФ, либо с никотинамидрибонуклеозидом НАД+ (Keppetipola and Shuman, 2005).

Наиболее близкими к «универсальным» ферментам могут быть лигазы с двойной кофакторной специфичностью (АТФ/НАД+). Все ранее охарактеризованные ДНК-лигазы эуриархей рода Thermococcus являлись такими «АТФ/НАД+» ферментами, что позволяло рассматривать их как предка бактериальных НАД+ - зависимых ДНК-лигаз (Sun et al., 2008). Мы показали, что ДНК-лигаза Thermococcus sp. 1519 не использует НАД+, т.е. способность использовать этот кофактор не является общим свойством ДНК-лигаз архей рода Thermococcus. Анализ построенного нами филогенетического дерева ДНК-лигаз архей (Рис. 15) показывает, что лигазы с двойной кофакторной специфичностью (АТФ/НАД+) встречающиеся в двух линиях эуриархей, - Thermoplasmatales и Thermococcales, не образуют отдельных филогенетических ветвей, соответствующих использованию или не использованию НАД+, а встречаются в различных группах, включающих как «только АТФ», так и «АТФ/НАД+» лигазы. Такое распределение предполагает либо неоднократное независимое возникновение способности использовать НАД+ в разных линиях эуриархей, либо наличие такой способности у их

общего предка, которая была потеряна в ходе эволюции ДНК-лигаз архей по направлению к специализированным АТФ-зависимьш ферментам, и сохранилась лишь у отдельных организмов. В пользу второго объяснения свидетельствуют также данные о том, что потеря способности использовать НАД* наряду с АТФ может быть следствием даже единичных мутаций (Ferrer et al2008), а также то, что Thermococcales являются одной из "базовых" ветвей эуриархей, наиболее близких к общему предку крен- и эуриархей (Brochier-Armanet et al 2008).

Thermococcales

Thermococcus sp AM4 Thermococcus gammatolerans Thermococcua *p 1519 j

jThermococcue kodakaiiensf* Thermacoccye onnurineu« the rm oc oc cu e^um icp (a ñf Thermococcus »ibiricus Thermococcus barophilis Pyrococcus furiosus Pyrococcus horlkosh»"] Pyrococcus abyss] _

Arachaeoglobus fulgldus

l00 i-Methanosarelna barker!

Methanosarelna mazel Methanosarelna acetlvorans Methan ору rus kandier!

Methanosphaera stadtmanae Methanothermobacterthemiautotrophíe Methanococcus miripaludis Methanocaldococcus jannasehil MethanospWHum hungatel Haloircula marismortui Natromonas pharaon!»

Ferroplasma acidophilus

Plcrophllus torridua Jl) erniopla »m a'àcl dó'p^líúm

Thermo-plasmatales

Oesutfurococcus kamchatkensis Aeropynim pernfat Acldilobussp 1904 j Surtotobus tokodaü

Sulfolobus acidocaldarius AtWianus ambivalent 100 j— Sulfolobus shibatae '— Sulfolobus solfataricus

Рисунок 15. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей ДНК-лигаз архей построено методом присоединения соседей с использованием пакета программ ТЯЕЕССЖ. В качестве внешней группы использована ДНК-лигаза крысы. Названия архей порядков ТЪегтососса\е$ и ТНегтор1а$та1а1е$, ДНК-лигазы которых способны использовать как АТФ, так и НАД+, выделены серым; способных использовать АТФ, но не НАД+, - отмечены рамкой.

выводы

1. Проведена молекулярная идентификация штамма 1519 термофильных архей, в результате которой показана его принадлежность к роду Thermococcus.

2. Клонированы и секвенированы гены ДНК-лигазы LigThl519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAcl904 из Acidilobus aceticus 1904.

3. Созданы штаммы Escherichia coli - продуценты рекомбинантных ДНК-лигаз LigThl519 и LigAcl904, выделены и очищены препараты ферментов.

4. Установлено, что рекомбинантная ДНК-лигаза LigThl519 может осуществлять АТФ-зависимое лигирование однонитевых разрывов в ДНК. Оптимальные условия лигазной реакции достигались при концентрации NaCl - 75 мМ, MgCh - 50 мМ, АТФ в диапазоне 10-100 мкМ, рН в диапазоне 7.0-10.0 и температуре 70°С. Лигаза теряет около половины своей активности за 5 минут при 94°С.

5. Установлено, что рекомбинантная ДНК-лигаза LigAcl904 может осуществлять АТФ-зависимое лигирование однонитевых разрывов в ДНК. Оптимальные условия лигазной реакции достигались при концентрации NaCl - 25 мМ, MgCl2 - 10 мМ, АТФ в диапазоне 1-ЮОмкМ, рН в диапазоне 6.8-7.0 и температуре 65°С. Лигаза теряет около половины своей активности за 30 минут при 94°С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2008) Выделение и характеристика новой термостабильной ДНК-лигазы из архей рода Themococcus. Прикладная биохимия и микробиология, т.45, №5, с. 523-528.

2. Bezsudnova E.Y., Kovalchuk M.V., Mardanov A.V., Poliakov K.M., Popov V.O., Ravin N.V., Skiyabin K.G., Smagin V.A., Stekhanova T.N., Tikhonova T.V. (2009) Overexpression, purification and crystallization of a thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus sp. 1519. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65(Pt4), 368-371.

3. Смагин B.A., Марданов A.B., Бонч-Осмоловская E.A., Равин Н.В. (2010) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Thermococcus, способ ее получения и нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая эту ДНК-лигазу. Патент РФ № 2405823 от 10.12.2010г.

4. Смагин В.А., Марданов А.В., Прокофьева М.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2011) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Acidilobus. Патент РФ № 2413767 от 10.03.2011г.

5. Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2007) Новая термостабильная ДНК-лигаза из гипертермофильной археи рода Themococcus. Тезисы Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва.

6. Ravin N.V., Smagin V.A., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovkaya E.A. (2007) Molecular cloning and characterization of thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus. Abstracts of the International conference "Thermophiles-2007", Bergen, Norway.

7. Mardanov A.V., Smagin V.A., E.A. Bonch-Osmolovskaya, N.V. Ravin (2007) Isolation of new thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus. Abstracts of the II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2007), Seville, Spain.

Отпечатано в типографии города Новошахтинска: г. Новошахтинск, ул. Горняцкая, 5-а, тел.: {86369} 214-65, e-mail: tipo8@mail.ru, Зак. 431. Тир. 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смагин, Владимир Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ДНК-лигазы: структура, механизм реакции и функции.

2. Археи: особенности метаболизма и реализации генетической информации.

3. ДНК-лигазы архей.

4. Практическое применение термостабильных ДНК-лигаз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи штамма 1519.

1.1 Определение филогенетического положения штамма 1519.

1.2 Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена

§ТЫ519.

1.3. Клонирование гена Ь^ТЫ519. экспрессия и очистка рекомбинантного белка.

1.4. АТФ-зависимос лигирование когезивных концов ДНК фага X лигазой ]^ТЫ519.

1.5. Влияние температуры, рН и концентрации солей на активность ДНК лигазы

§ТЫ519.

1.6 Термостабильность лигазы 1л£ТЬ 1519.

1.7 Определение специфичности ДНК-лигазы Ь^ТИ 1519 в отношении кофактора.

2. Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи рода АасШоЬиэ.

2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена ^Ас1904.

2.2. Клонирование гена

§Ас1904, экспрессия и очистка рекомбинантного белка.

2.3. Лигирование когезивных концов ДНК фага X лигазой 1^Ас1904.

2.4. Влияние температуры, рН, концентрации солей на активность ДНК лигазы

§Ас1904.

2.5. Определение специфичности ДНК-лигазы Ь^Ас1904 в отношении кофактора.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Аминокислотные последовательности ДНК-лигаз 1^ТЬ 1519 ТЬегтососсия эр. 1519 и 1^Ас1904 АасШоЬиБ ер 1904.

2. Биохимические характеристики выделенных ДНК-лигаз.

3. Зависимость от кофактора и эволюция ДНК-лигаз.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей"

ДНК-лигазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма ДНК и принимают участие в процессах репликации, репарации и рекомбинации у всех живых организмов (Lehman, 1974; Li et al., 1984; Wood et al., 1988; Jessberger et al., 1991; Doherty et al.,2000; Shuman et al.,2004; Tomkinson et al.,2006; Wilkinson et al.,2001). Эти ферменты катализируют связывание 5'-фосфатного с З'-гидроксильным концов в одноцепочечпом разрыве двухцепочечной ДНК или же в двух фрагментах ДНК, содержащих либо комплементарные одноцепочечные, либо тупые концы.

Вместе с РНК-лигазами и мРНК-кэпирующими ферментами, ДНК-лигазы формируют группу ковалентных нуклеотидилтрансфераз. ДНК-лигазы могут быть разделены на два семейства в соответствии с используемыми кофакторами — источниками энергии, - АТФ-зависимые (ЕС 6.5.1.1) и НАД - зависимые лигазы (ЕС 6.5.1.2) (Timson et al., 1999; Sriskanda et al., 2000). На данный момент изучены функции ДНК-лигаз и получены кристаллические структуры представителей обоих семейств (Subramanya et al., 1996; Lee et al., 2000; Odell et al, 2000; Pascal et al., 2004). Осуществляемая ДНК-лигазами ферментативная реакция состоит из трех этапов. На первом этапе ДНК-лигаза атакует а-фосфат нуклеотидного кофактора с образованием ковалентного интермедиата фермент-аденилат, в котором АМФ связан фосфоамидной связью с с-аминогруппой лизина. Для АТФ-зависимого типа ДНК-лигаз основным источником АМФ группы является АТФ, в то время как для НАД+-зависимых — НАД+ (Wilkinson et al., 2001). В случае если в качестве кофактора используется АТФ, образование интермедиата фермент-аденилат сопровождается высвобождением пирофосфата, если же НАД+ - то никотинамидмононуклеотида. На втором этапе АМФ переносится на 5'-конец 5'-концевого фосфата ДНК-цепи с формированием ДНК-аденилата (AppN). На завершающем этапе ДНК-лигаза катализирует атаку 3'- ОН гидроксильной группы в однонитевом разрыве на ДНК-аденилат с соединением двух полинуклеотидов и высвобождением АМФ (Lehman, 1974; Doherty and Suh 2000; Lehman 1974; Shuman and Lima 2004; Timson et al., 2000; Wilkinson et al., 2001). Структуры нескольких ДНК-лигаз, полученные с высоким разрешением, показали наличие модульной структуры, с общим аденилтрансферазным кором, связанным с другими доменами, связывающими субстрат (Doherty and Suh, 2000; Shuman and Lima, 2004; Tomkinson et al, 2006).

АТФ-зависимые ДНК-лигазы найдены в бактериофагах, некоторых бактериях, археях, эукариотах и эукариотических вирусах, в то время как НАД+-зависимые ДНК-лигазы встречаются в основном у бактерий (Martin and MacNeill, 2002; Luo et al., 1996;

Gerry et al., 1999; Singleton et al. 1999; Timson etal., 1999; Tong et al., 1999; Sriskanda et al., 2000; Sriskanda et al., 2001; Wilkinson et al. 2001). Наряду с эукариотами и бактериями, археи образуют отдельный домен живых организмов (Woese, 1977). Археи являются одноклеточными организмами, обитающими, как правило, в экстремальных условиях окружающей среды, характеризующихся высокой или низкой температурой, экстремальными значениями рН и т.п. Основные пути метаболизма у археи и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации, включая ДНК лигазы, более близок к эукариотическому (Kelman and White 2005; White 2003).

Геномы практически всех архей содержат единственный ген ДНК-лигазы АТФ-зависимого типа. Так. анализ аминокислотной последовательности первой охарактеризованной архейпоп ДНК-лигазы, из Desulfurolobus ambivalens, показал ее сходство с АТФ-зависимыми ДНК-лигазами эукариот и эукариотических вирусов (Kletzin, 1992; Nakatani et al., 2000). Позднее было охарактеризовано несколько других архейных ДНК-лигаз (Nakatani et al., 2000; 2002; Sriskanda et al., 2000; Lai et al. 2002; Jeon and Ishikawa, 2003; Rolland et al, 2004; Keppetipola and Shuman, 2005; Kim et al., 2006; Sun et al., 2008; Ferrer et al., 2008; Jackson et al., 2007; Zhao et al., 2006; Seo et al, 2007 и др.). В основном, ДНК-лигазы архей очень схожи по своим размерам и консервативны по первичной структуре. Последующие исследования ДНК-лигаз архей в отношении специфичности к нуклеотидному кофактору показали, что архейные лигазы используют исключительно АТФ (Bult et al., 1996; Klenk et al., 1997; Timson et al., 1999; Lai et al., 2002; Keppetipola et al., 2005). Это представление подтверждалось характеристикой ДНК-лигаз из архей Methanobacterium thermoautotrophicum (Timson et al, 1999), Archaeoglobus fulgidus (Klenk et al, 1997), Methanocoecus jannaschii (Bult et al., 1996), Sulfolobus shibatae (Lai et al, 2002) and Pyroeoecus horikoshii OT3 (Keppetipola et al, 2005). Однако, недавно были получены данные о том, что архейные ДНК-лигазы могут использовать и другие кофакторы. Так, использовать НАД+ наряду с АТФ могут ДПК-лигазы Thermoeocciis fumicolans (Rolland et al, 2004). Thermoeocciis. kodakaraensis KOD1 (Nakatani et al., 2000), Thermococcus onnurineus NA1 (Kim et al., 2006), Pyrococcus abyssi (Rolland et al, 2004). Специфичностью к АТФ и АДФ обладают лигазы из Aeropyrum pernix (Jeon et al, 2003) и Staphylothermns marinus (Seo et al., 2007). Эти данные позволяют предположить, что некоторые архейные ДНК-лигазы могут представлять неспециализированные предковые ферменты, являющиеся эволюционными предшественниками кофактор-специализированных ДНК-лигаз (Seo et al, 2007). Эту точку зрения поддерживает недавнее открытие архей ной ДНК-лигазы из Siilfophobocoecus zilligii, которая обладает широкой кофакторной специфичностью и, наряду с АТФ, способна использовать АДФ и ГТФ (Sun et al, 2008).

ДНК-лигазы термофильных и архей, являющиеся эволюционно-древними организмами, представляют собой интересную модель для изучения фундаментальных проблем эволюции семейства ДНК лигаз, в частности, их специализации в использовании различных энергетических кофакторов, а также являются объектами структурных исследований.

Практический интерес к термостабильным ДНК лигазам, выделенным из термофильных архей, обусловлен перспективностью их применения в различных аналитических методах, например методе лигазной цепной реакции (ЛЦР) и его многочисленных модификациях, используемых для детекции и амплификации специфических последовательностей ДНК (Вагапу, 1991; Qi et al., 2001). Несмотря на то, что метод ЛЦР известен давно и активно применяется в диагностической практике, например в США, в России он практически не используется, в значительной степени из-за отсутствия термостабильных ДНК-лигаз на Российском рынке. Другой областью использования термостабильных лигаз является их использование для «сборки» синтетических генов из олигонуклеотидов проводимой при повышенной температуре для снижения вероятности образования неспецифических продуктов лигирования.

Эволюционно и филогенетически архей разделяются на два царства, кренархей (Crenarchaeota) и эуриархей (Euryarchaeota), в обеих из которых имеются термофильные представители. Несмотря на общую схожесть ДНК-лигаз представителей Crenarchaeota и Euryarchaeota, они различаются по последовательностям одного из консервативных мотивов (мотив V) и по расстоянию между этими мотивами (Lai et al., 2002). В данной работе выделены и охарактеризованы две новые ДНК-лигазы гипертермофильных архей, -LigThl519 из эуриархеи штамма 1519 и LigAcl904 из кренархей штамма Acidilobas aceticus 1904 из коллекции лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН. Охарактеризована зависимость активности этих ферментов от температуры и значения рН, концентрации солей, термостабильность, определены используемые нуклеотидные кофакторы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Основная цель работы состояла в выделении и характеристике новых ДНК-лигаз из двух эволюционно удаленных друг от друга гипертермофильных архей, - эуриархеи штамма 1519 и кренархеи штамма Acidilobus aceticus 1904.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

1. Молекулярная идентификация и определение филогенетического положения штамма термофильных архей 1519.

2. Выделение и секвенирование генов ДНК-лигазы LigThl519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAcl904 viz Acidilobus aceticus 1904.

3. Создание штаммов Escherichia coli — продуцентов рекомбинантных ДНК-лигаз LigThl519 и LigAcl904, выделение и очистка ферментов.

4. Проведение биохимической характериетки рекомбинантных ДНК-лигаз, включающей определение зависимости активности от температуры и значения pH, концентрации солей, термостабильности, определение используемых нуклеотидных кофакторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Смагин, Владимир Анатольевич

выводы

2. Клонированы и секвенированы гены ДНК-лигазы LigThl519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAcl904 из Acidilobus aceticus 1904.

4. Установлено, что рекомбинантная ДНК-лигаза LigThl519 может осуществлять АТФ-зависимое лигирование однонитевых разрывов в ДНК. Оптимальные условия лигазной реакции достигались при концентрации NaCl - 75 мМ, MgCb - 50 мМ, АТФ в диапазоне 10-100 мкМ, рН в диапазоне 7.0-10.0 и температуре 70°С. Лигаза теряет около половины своей активности за 5 минут при 94°С.

5. Установлено, что рекомбинантная ДНК-лигаза LigAcl904 может осуществлять АТФ-зависимое лигирование однонитевых разрывов в ДНК. Оптимальные условия лигазной реакции достигались при концентрации NaCl - 25 мМ, MgCb - 10 мМ, АТФ в диапазоне 1- ЮОмкМ, рН в диапазоне 6.8-7.0 и температуре 65°С. Лигаза теряет около половины своей активности за 30 минут при 94°С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

2. Bezsudnova E.Y., Kovalchuk M.V., Mardanov A.V., Poliakov K.M., Popov V.O., Ravin N.V., Skryabin K.G., Smagin V.A., Steklianova T.N., Tikhonova T.V. (2009) Overexpression, purification and crystallization of a thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus sp. 1519. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Ciyst Commun. 65(Pt 4), 368-371.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смагин, Владимир Анатольевич, Москва

1. Морозова О.В. 2005. Загадки архей и их фагов. Вестник ВОГиС, 9, 55-66.

2. Шаталкии А.И. 2004. Высший уровень деления в классификации организмов. 2. Архебактерии, эубактерии и эукариоты. Журн. общ. биологии, 65, 99-115.

3. Шаталкин А.И. 2004. Высший уровень деления в классификации организмов. 3. Одноплёночные (Monodermata) и двуплёночные (Didermata) организмы. Жури, общ. биологии, 65, 195-210.

4. Adul Rahman R.N., Jongsareejit В., Fujiwara S., Imanaka Т. 1997. Characterization of recombinant glutamine synthetase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp. strain KOD1. Appl Environ Microbiol. 63, 2472-2476.

5. Aravind L. and Koonin, E.V. 1999. Gleaning non-trivial structural, functional and evolutionary information about proteins by iterative database searches. J. Mol. Biol., 287, 1023-1040.

6. Aravind L., Tatusov R.L., Wolf Y.I., Walker D.R., Koonin E.V. 1998. Evidence for massive gene exchange between archaeal and bacterial hyperthermophiles. Trends Genet. 14, 442-444.

7. AtenciaE. A., Madrid O., Gu'nther Sillero M. A., Sillero A. 1999. T4 RNA ligase catalyzes the synthesis of dinucleoside polyphosphates. Eur. J. Biochem. 261, 802—811.

8. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R. E., Moore D.D., Seidman G., Smith J.A., Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York, 1997.

9. Barany, F. 1991. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proc Natl Acad Sci USA 88, 189-193.

10. Barnes D. E.; Johnston L. H.; Kodama K.; Tomkinson A. E.; Lasko D. D.; Lindahl T. 1990. Human DNA ligase I cDNA: cloning and functional expression in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6679 6683.

11. Barnes D. E.; Lindahl T. 2004. Repair and genetic consequences of endogenous DNA base damage in mammalian cells. Annu. ReY. Genet. 38, 445 476.

12. Barnes D. E.; Tomkinson A. E.; Lehmann A. R.; Webster A. D. В.; Lindahl Т. 1992. Mutations in the DNA ligase 1 gene of an individual with immunodeficiencies and cellular hypersensitivity to DNA-damaging agents. Cell. 69, 495 503.

13. Bassing С. H.; Alt F. W. 2004. The cellular response to general and programmed DNA double strand breaks. DNA Repair. 3, 781 796.

14. Baymiller J., Jennings S., Kienzle B., Gorman J. A., Kelly R.,McCullough J. E. 1994. Isolation and sequence of the t-RNA ligase-encoding gene of Candida albicans .Gene 142, 129-134.

15. Bettstetter M., Peng X., Garrett R.A., Prangishvili D. 2003. AFV1, a novel virus infecting hyperthermophilic archaea of the genus Acidianus. Virology. 315, 68—79.

16. Brochier-Armanet C., Boussau B., Gribaldo S., Forterre P. 2008. Mesophilic crenarchaeota: Proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarchaeota. Nat Rev Microbiol 6, 245-252.

17. Bult, C.J., White, O., Olsen, G.J., Zhou, L., Fieischmann, R.D., Sutton, G.G., et al. 1996. Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273, 1058-1073.

18. Cavalier-Smith T. 1998. A revised six-kingdom system of life. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc.73, 203-266.

19. Cheng C., Shuman S. 1997. Characterization of an ATP-dependent DNA ligase encoded by Haemophilus influenzae. Nucleic Acids Res. 25, 1369-1374.

20. Doherty A. J., Suh S. W. 2000. Structural and mechanistic conservation in DNA ligases. Nucleic Acids Res. 28, 4051-4058.

21. Doherty A. J.; Dafforn T. R. 2000. Nick recognition by DNA ligases. J. Mol. Biol. 296, 43-56.

22. Doherty, A. J.; Wigley, D. B. 1999. Functional domains of an ATP-dependent DNA ligase. J. Mol. Biol. 285, 63-71.

23. Engler M. J.; Richardson C. C. 1982. DNA ligases. Academic Press: New York.

24. Barany F. 1991 The ligase chain reaction in a PCR world. Genome Res.l, 5-16.

25. Fabrega C., Shen V., Shuman S., Lima C. D. 2003. Structure of an mRNA capping enzyme bound to the phosphorylated carboxy-terminal domain of RNA polymerase II. Mol. Cell. 11, 1549-1561.

26. Ferrer M., Golyshina O. V., Beloqui A., L. H. Bottger, J. M. Andreu, J. Polaina, A. L. Lacey, A. X. Trautwein, K. N. Timmis, P. N. Golyshin. 2008. A purple acidophilic di-ferric DNA ligase from Ferroplasma. Proc Natl Acad Sci USA. 26, 8878-8883.

27. Finn R. D. Mistry J., Schuster-Bockler B., Griffiths-Jones S., Hollich V., Lassmann T., Moxon S., Marshall M., Khanna A., Durbin R., Eddy S. R., Sonnhammer E. L., Bateman A. 2006. Pfam: clans, web tools and services. Nucleic Acids Res. 34, 247-251

28. Frank K. M., Sekiguchi J. M., Seidl K. J., Swat W., Rathbun G. A., Cheng H. L., Davidson L., Kangaloo L., Alt F. W. 1998. Late embryonic lethality and impaired V(D)J recombination in mice lacking DNA ligase IV. Nature. 396, 173-177.

29. Fresco L. D. and Buratowski S. 1994. Active site of the mRNA-capping enzyme guanylyltransferase from Saccharomyces cerevisiae: similarity to the nucleotidyl attachment motif of DNA and RNA ligases. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 91, 6624-6628.

30. Fujiwara S., Lee S., Haruki M., Kanaya S., Takagi M., Imanaka T. 1996. Unusual enzyme characteristics of aspartyl-tRNA synthetase from hyperthermophilicarchaeon Pyrococcus sp. KOD1. FEBS Lett. 394, 66-70

31. Fukui T., Atomi H., Kanai T., Matsumi R., Fujiwara S., Imanaka T. 2005. Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes. Genome Res. 15, 352-363.

32. Gajiwala K. S.; Pinko C. 2004. Structural rearrangement accompanying NAD+ synthesis within a bacterial DNA ligase crystal. Structure (Cambridge). 12, 1449 -1459.

33. Gerry N. P., Witowski N. E., Day J. Hammer R. P., Barany G., Barany F. 1999. Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. JMol Biol 292: 251-262.

34. Gong C., Martins A., Bongiorno P., Glickman M., Shuman S. J. 2004. Biochemical and genetic analysis of the four DNA ligases of mycobacteria. Biol. Chem. 279, 20594 -20606.

35. Grant S. G., Jessee J., Bloom F. R., Hanahan D. 1990. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 4645-4649.

36. Grawunder U., Zimmcr D., Kulesza P., Lieber M. R. 1998.Requirement for an interaction of XRCC4 with DNA ligase IV for wild-type V(D)J recombination and DNA double-strand break repair in vivo.J. Biol. Chem. 273, 24708-24714.

37. Gunther S., Montes M„ de Diego A., del Valle M., Atencia E. A., Sillero A. 2002. Thermostable Pyrococcus furiosus DNA ligase catalyzes the synthesis of (di)nucleoside polyphosphates. Extremophiles. 6,45-50.

38. Gupta R. S. 1998. Protein phylogenies and signature sequences: a reappraisal of evolutionary relationships among Archaebacteria, Eubacteria, and Eukaryotes. Microbiol. Mol Biol. Rev. 62, 1435-1491.

39. Hakansson K., Doherty A. J., Shuman S., Wigley D. B. 1997. X-ray crystallography reveals a large conformational change during guanyl transfer by mRNA capping enzymes. Cell 89, 545-553.

40. Heaphy S., Singh M., Gait M. J. 1987. Effect of single amino acid changes in the region of the adenylylation site of T4 RNA ligase. Biochemistry. 26, 1688-1696.

41. Ho C. K., Van Etten J. L., Shuman S. 1997. Characterization of an ATP-dependent DNA ligase encoded by Chlorella virus PBCV-1. J. Virol 71, 1931-1937.

42. Jackson B. R., Noble C., Lavesa-Curto M., Bond P. L., Bowater R. P. 2007. Characterization of an ATP-dependent DNA ligase from the acidophilic archaeon "Ferroplasma acidarmanus" Ferl. Extremophiles. 11, 315-327.

43. Jeon H. J., Shin H.J., Choi J. J., Hoe H. S., Kim H. K., Suh S. W., Kwon S. T. 2004. Mutational analyses of the thermostable NAD+-dependent DNA ligase from Therm us filiformis. FEMS Microbiol Lett 237, 111.

44. Jeon S. J., Ishikawa,K. 2003. A novel ADP-dependent DNA ligase from Aeropyrum pernix K1. FEES Lett 550, 69-73.

45. Jessberger R. and Berg P. 1991. Repair of deletions and double-strand gaps by homologous recombination in a mammalian in vitro system. Mol. Cell Biol 11, 445457.

46. Kelman Z., White M. F. 2005. Archaeal DNA replication and repair. Curr Opin Microbiol. 8, 669-676.

47. Keppetipola N., and Shuman S. 2005. Characterization of a thermophilic ATP-dependent DNA ligase from the euryarchaeon Pyrococcus horikoshii. JBacteriol 187, 6902- 6908.

48. Kim Y. J., Lee H. S, Bae S. S., Jeon, J. H., Yang S. H., Lim J. K., et al. 2006. Cloning, expression, and characterization of a DNA ligase from a hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. Biotechnol Lett 28, 401-407.

49. Klenk H. P., Clayton R. A., Tomb J. F., White O., Nelson K. E., Ketchum K. A., et al. 1997. The complete genome sequence of the hyperthermophilic, sulphate-reducing archaeon Archaeoglobusfidgidus. Nature 390, 364—370.

50. Kletzin A. 1992. Molecular characterisation of a DNA ligase gene of the extremely thermophilic archaeon Desulfurolobus ambivalem shows close phylogenetic relationship to eukaryotic ligases. Nucleic Acids Res. 20, 5389-5396.

51. Koch A. 1998. How did bacteria come to be? Adv Microb Physiol. 40, 353-399.

52. Kodama K., Barnes D.E. and Lindahl T. 1991. In vitro mutagenesis and functional expression in Escherichia coli of a cDNA encoding the catalytic domain of human DNA ligase I. Nucleic Acids Res. 19, 6093-6099.

53. Kyrpides N.C., Ouzounis C.A. 1999. Transcription in Archaea. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 8545-8550.

54. Lai X., Shao H., Hao F., Huang L. 2002. Biochemical characterization of an ATP-dependent DNA ligase from the hyperthermophilic crenarchaeon Sulfolobus shibatae. Extremophiles. 6, 469-477.

55. Lakshmipathy U.; Campbell C. 1999. The human DNA ligase III gene encodes nuclear and mitochondrial proteins. Mol. Cell Biol., 19, 3869 3876.

56. Lehman, I.R. 1974. DNA ligase: structure, mechanism, and function. Science 186, 790797.

57. Lepp P. W., Brinig M. M., Ouverney C. C., Palm K., Armitage G. C., Relman D. A. 2004. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 101, 6176-6181.

58. Li J. J., and Kelly T. J. 1984. Simian virus 40 DNA replication in vitro. Proc Natl Acad Sei USA 81, 6973-6977.

59. Luo J., and Barany F. 1996. Identification of essential residues in Thermus thermophilus DNA ligase. Nucleic Acids Res 24, 3079-3085.

60. Luo J.; Bergstrom D. E.; Barany F. 1996. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 24. 3071 3078.

61. Madigan M. T., Marrs B. L. 1997. Extremophiles. Sci. Amer., 4, 82-87.

62. MadridO., MartinD., AtenciaE. A., Sillero A., and Gu'nther Sillero M. A. 1998. T4 DNA ligase synthesizes dinucleoside polyphosphates. FEBS Lett. 433, 283-286.

63. Martin W. 2004. Pathogenic archaebacteria: do they not exist because archaebacteria use different vitamins? BioEssays. 26, 592-593.

64. Martin, I. V., and MacNeill, S. A. 2002. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol 3, 3005.1-3005.7.

65. Mueller-Cajar O, Badger M. R. 2007. New roads lead to Rubisco in archaebacteria. Bioessays 29, 722-724.

66. Muerhoff A. S., Dawson G. J., Desai S. M. 2004. A non-isotopic method for the determination of activity of the thermostable NAD-dependent DNA ligase from Thermus thermophilus HB8. J. Virol. Methods. 119, 171-176.

67. Murzin, A. G. 1993. OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J. 12, 861 -867.

68. Nakatani M., Ezaki S., Atomi H., Imanaka T. 2002. Substrate recognition and fidelity of strand joining by an archaeal DNA ligase. Eur. J. Biochem. 269, 650 — 656.

69. Nakatani M., Ezaki S., Atomi H., and Imanaka T. 2000. A DNA ligase from a hyperthermophilic archaeon with unique cofactor specificity. JBacteriol 182, 64246433.

70. Nasmyth K. A. 1977. Temperature-sensitive lethal mutants in the structural gene for DNA ligase in the yeast Schizosaccharomycespombe. Cell. 12, 1109 -1120.

71. Nishida H., Kiyonari S., Ishino Y., Morikawaa K. 2006. The Closed Structure of an Archaeal DNA Ligase from Pyrococcusfuriosus. J. Mol. Biol. 360, 956-967.

72. Nishida H., Tsuchiya D., Ishino Y., Morikawaa K. 2005 Overexpression, purification and crystallization of an archaeal DNA ligase from Pyrococcusfuriosus. Acta Cryst. F61, 1100-1102.

73. Odell M., Sriskanda V., Shuman S., and Nikolov D.B. 2000. Crystal structure of eukaryotic DNA ligase-adenylate illuminates the mechanism of nick sensing and strand joining. Mol Cell 6, 1183-1193.

74. Pascal J. M., O'Brien P. J., Tomkinson A.E., and Ellenberger T. 2004. Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA. Nature. 432, 473^478.

75. Petit M.A., Ehrlich S.D., and Journals O. 2000. The NAD+- dependent ligase encoded by yerG is an essential gene of Bacillus subtilis. Nucleic Acids Res. 28,4642-4648.

76. Qi X., Bakht S., Devos K. M., Gale M. D., and Osboura A. 2001. L-RCA (ligation-rolling circle amplification): a general method for genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs). Nucleic Acids Res. 29, El 16.

77. Qureshi S. A., Bell S. D., Jackson S. P. 1997. Factor requirements for transcription in the Archaeon Sulfolobus shibatae. EMBO. 16, 2927-2936.

78. Robb F. T., Maeder D. L., Brown J. R., DiRuggiero J., Stump M. D., Yeh R. K., Weiss R. B., Dunn D. M. 2001. Genomic sequence of hyperthermophile, Pyrococcus furiosus: implications for physiology and enzymology. Methods Enzymol. 330,134-157.

79. Robichaux M., Howell M., Boopathy R. 2003. Growth and activities of sulfate-reducing and methanogenic bacteria in human oral cavity. Curr. Microbiol. 47, 12-16.

80. Rolland J., Gueguen Y., Persillon C., Masson J., Dietrich J. 2004. Characterization of a thermophilic DNA ligase from the archaeon Thermococcus fumicolans. FEMS Microbiology Letters. 236, 267-273.

81. SaitouN., Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.

82. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

83. Sawaya R., Shuman S. 2003. Mutational analysis of the guanylyltransferase component of Mammalian mRNA capping enzyme. Biochemistry. 42, 8240-8249.

84. Schalling M., Hudson T. J., Buetow K. H., and Housman D. E. 1993. Direct detection of novel expanded trinucleotide repeats in the human genome. Nat. Genet. 4, 135-139.

85. Sekiguchi J. and Shuman,S. 1997. Nick sensing by vaccinia virus DNA ligase requires a 5' phosphate at the nick and occupancy of the adenylate binding site on the enzyme. J. Virol. 71, 9697-9684.

86. Sekiguchi J.; Shuman S. 1997. Domain structure of vaccinia DNA ligase Nucleic Acids Res. 25, 727 734.

87. Seo M. S., Kima Y. J., Choi J. J., Lee M. S., Kima J. H., Lee J., Kwon S. 2007. Cloning and expression of a DNA ligase from the hyperthermophilic archaeon Staphylothermus marinus and properties of the enzyme. J. Biotechnol. 128, 519-530.

88. Shuman S, Lima C. D. 2004. The polynucleotide ligase and RNA capping enzyme superfamily of covalent nucleotidyltransferases. Curr Opin Struct Biol. 14, 757—764

89. Shuman S. 1995. Vaccinia virus DNA ligase: specificity, fidelity, and inhibition. Biochemistry. 34, 16138-16147.

90. Shuman S. and Ru X. 1995. Mutational analysis of vaccinia DNA ligase defines residues essential for covalent catalysis. Virology. 211, 73-83.

91. Shuman S., Schwer B. 1995. RNA capping enzyme and DNA ligase: a superfamily of covalent nucleotidyl transferases. Mol. Microbiol. 17, 405 410.

92. Singleton M. R., Hansson K., Timson D. J., and Wigley D. B. 1999. Research article structure of the adenylation domain of an NAD+-dependent DNA ligase. Structure. 7, 35-42.

93. Soderhall S.; Lindahl T. 1973. Two DNA ligase activities from calf thymus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 53, 910 916.

94. Soderhall S.; Lindahl T. 1976. DNA ligases of eukaryotes. FEBSLett. 67, 1 -8.

95. Sriskanda V., Shuman S. 1998. Specificity and fidelity of strand joining by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 26, 3536-3541.

96. Sriskanda V., Kelman Z., Hurwitz J., and Shuman S. 2000. Characterization of an ATP-dependent DNA ligase from the thermophilic archaeon Methanobacterium thermoautotrophicum. Nucleic Acids Res 28, 2221—2228.

97. Sriskanda V., Moyer R. W. and Shuman S. 2001. NAD- dependent DNA ligase encoded by a eukaryotic virus. J Biol Chem. 276, 36100-36109.

98. Sriskanda V., Shuman S. 2001. A second NAD(+)-dependent DNA ligase (LigB) in Escherichia coYuNucleic Acids Res. 29, 493-494.

99. Stechmann A., Cavalier-Smith T. 2004. Evolutionary origins of Hsp90 chaperones and a deep paralogy in their bacterial ancestors. J. Eukaryot. Microbiol. 51, 364—373.

100. Subramanya H. S., Doherty A. J., Ashford S. R. and Wigley D. B. 2004. Crystal structure of an ATP-dependent DNA ligase from Bacteriophage T7. Mol Cell 16, 211221.

101. Subramanya H. S., Doherty A. J., Ashford S. R. and Wigley D. B. 1996. Crystal structure of an ATP-dependent DNA ligase from bacteriophage T7. Cell. 85, 607-615.

102. Triglia Т., Peterson M. G.and Kemp D. J. 1988. A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16, 8186.

103. Takahashi M., Yamaguchi E., Uchida T. 1984. Thermophilic DNA ligase. Purification and properties of the enzyme from Thermus thermophilus HB8. J. Biol. Chem. 259, 10041-10047.

104. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. 1997. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 24, 4876-4882.

105. Timson D. J. and Wigley D. B. 1999. Functional domains of an NAD+-dependent DNA ligase. JMol Biol 285, 73-83.

106. Tomkinson A. E., Vijayakumar S, Pascal J. M., Ellenberger T. 2006. DNA ligases: structure, reaction mechanism, and function. Chem Rev. 106, 687-699.

107. Tomkinson A. E., Roberts E., Daly G., Totty N. F., Lindahl T. 1991. Three distinct DNA ligases in mammalian cells. J. Biol. Chem. 266, 21728- 21735.

108. Tomkinson A. E„ Tappe N. J., Friedberg E.C. 1992. DNA ligase I from Saccharomyces cerevisiae: physical and biochemical characterization of the CDC9 gene product. Biochemistry. 31, 11762-11771.

109. Tong J., Barany F., Cao W. 2000. Ligation reaction specificities of an NAD+-dependent DNA ligase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus. Nucleic Acids Res. 28, 1447-1454.

110. Tong J., Cao W., Barany F. 1999. Biochemical properties of a high fidelity DNA ligase from Thermus species AK16D. Nucleic Acids Res. 27, 788-794.

111. Valentine D. L. 2007. Adaptations to energy stress dictate the ecology and evolution of the Archaea. Nat. Rev. Microbiol. 5, 316—323.

112. Van De Peer Y., De Wachter R. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci. 10, 569-570.

113. Verhees С. H., Tuininga J. E., Kengen S. W. M., Stams A. J. M., van der Oost J., de Vos W. M. 2001. ADP-dependent phosphofructokinases in mesophilic and thermophilic methanogenic archaea. J Bacterial. 183, 7145-7153.

114. Warbrick E. 2000. The puzzle of PCNA's many partners. Bioessays. 22, 997-1006.

115. Ward J. F. 1988. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities, mechanisms of formation, and reparability. Prog. Nucleic Acids Res. 35, 95 -125.

116. Waters E. 2003. «The genome of Nanoarchaeum equitans: insights into early archaeal evolution and derived parasitism», PNAS, 100, 12984-12988.

117. White M. F. 2003 Archaeal DNA repair: paradigms and puzzles. Biochem Soc. Trans. 31, 690-693.

118. Wiedmann M., Wilson W. J., Czajka J., Luo J., Barany F., Batt C. A. 1994. Ligase chain reaction (LCR)-Overview and applications. PCR Methods Appl. 3, 51-64.

119. Wilkinson A., Day J, Bowater R. 2001. Bacterial DNA ligases. Mol Microbiol. 40, 1241-1248.

120. Wilkinson A., Smith A., Bullard D., Lavesa-Curto M., Sayer H., Bonner, A., et al. 2005. Analysis of ligation and DNA binding by Escherichia coli DNA ligase (LigA). Biochim Biophys Acta. 1749, 113-122.

121. Wilson T. E., Grawunder U„ Lieber, M. R. 1997. Yeast DNA ligase IV mediates non-homologous DNA end joining. Nature. 388, 495-498.

122. Woese C. R., Fox G. E. 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5088-5090.

123. Wood R. D., Robins P. and Lindahl T. 1988. Complementation of the xeroderma pigmentosum DNA repair defect in cell-free extracts. Cell. 53, 97—106.

124. Yoshinori Kohwi. 2004. Trinucleotide repeat protocols. Humana Press. 342.

125. Zander C., Thelaus J., Lindblad K., Karlsson M., Sjoberg K. and Schalling M. 1998. Multivariate analysis of factors influencing repeat expansion detection. Genome Res. 8, 1085-1094.

126. Zhao A, Gray F. C, MacNeill S. A. 2006. ATP- and NAD+-dependent DNA ligases share an essential function in the halophilic archaeon Haloferax volcanii. Mol. Microbiol. 59, 743-752.

Информация о работе

Смагин, Владимир Анатольевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы