Молекулярная детекция и разнообразие Crenarchaeota в наземных горячих источниках

Перевалова, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная детекция и разнообразие Crenarchaeota в наземных горячих источниках
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная детекция и разнообразие Crenarchaeota в наземных горячих источниках"

На правах рукописи

ПЕРЕВАЛОВА Анна Александровна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И РАЗНООБРАЗИЕ СКЕМКСНАЕОТА В НАЗЕМНЫХ ГОРЯЧИХ ИСТОЧНИКАХ

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3174428

Москва - 2007

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Бонч-Осмоловская Е.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Дедыш С.Н.

кандидат биологических наук Акимов В.Н.

Ведущая организация: кафедра микробиологии

Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 24 октября 2007 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан « » сентября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Хижняк Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Археи филума Crenarchaeota представляют одну из наиболее глубоких филогенетических ветвей прокариот С момента пионерских исследований Т Брока (Brock, 1978) в Йеллоустонском Национальном парке в 70-х гг и последующих работ В Циллига и К Штеттера (Zillig et al, 1982, Stetter, 1996) до середины 90-х гт XX века все представители этого филума формировали небольшую гомогенную группу, представленную гипертермофилами с серным метаболизмом, обитающими только в зонах вулканической активности В течение последних двух десятилетий в связи с развитием новых молекулярно-биологических подходов, позволяющих детектировать микроорганизмы в природных экосистемах без предварительного культивирования, огромное количество "филотипов" Crenarchaeota было найдено как в "холодных" местообитаниях, так и в морских и наземных гидротермах В связи с таким широким распространением в природных экосистемах представители Crenarchaeota могут вносить значительный вклад в глобальные энергетические циклы (Schleper et al, 2005) Однако физиологические свойства и метаболизм новых линий Crenarchaeota остаются неясными, так как лишь единичные виды удается выделить в чистую культуру или хотя бы получить стабильный рост в лабораторных условиях

Большой интерес к термофильным прокариотам, и, в частности, к термофильным Crenarchaeota как к представителям наиболее древних филогенетических линий, связан с теориями о происхождении жизни на Земле и с исследованиями механизмов приспособления к существованию при высоких температурах Фундаментально-научный интерес к уникальным по стабильности биополимерам термофильных прокариот сопровождается интенсивным изучением возможности их практического применения в различных областях биотехнологии и индустрии

В связи с этим изучение распространения и биоразнообразия термофильных Crenarchaeota, а также поиск новых культивируемых представителей этой группы, представляет научный и практический интерес

Дели и задачи исследования Целью настоящей работы была молекулярная детекция и идентификация представителей царства Crenarchaeota с помощью олигонуклетидных праймеров и зондов, специфичных к генам 16S рРНК, а также выделение и характеристика новых представителей Crenarchaeota Основные задачи исследования состояли в следующем

1. Разработка методов молекулярной детекции представителей филума Crenarchaeota

2 Проведение детекции представителей Crenarchaeota в накопительных культурах и природных образцах

3. Мониторинг накопительных культур Crenarchaeota

4. Выделение в чистую культуру новых термофильных представителей Crenarchaeota

5 Фенотипическая и филогенетическая характеристика новых изолятов

Научная новизна и практическая значимость работы Разработаны олигонуклеотидные праймеры для детекции представителей архей филума Crenarchaeota и зонды для детекции представителей рода Desulfurococcus Высокая специфичность праймеров позволяет делать выводы о наличии представителей Crenarchaeota в накопительных культурах и природных образцах непосредственно по результатам ПЦР-амплификации С использованием разработанных подходов изучен состав Crenarchaeota, населяющих горячие источники полуострова Камчатка, Байкальского региона, о Кунашир и Исландии В числе детектированных организмов были близкие как к культивируемым представителям царства Crenarchaeota пор. Desulfurococcales, Thermoproteales, Sulfolobales, так и к некультивируемым Crenarchaeota Предлагаемый нами метод молекулярно-биологической детекции гипертермофильных архей рода Desulfurococcus позволил провести быстрый и достоверный скрининг этих организмов в культурах и природных образцах На основании совокупности физиологических и филогенетических признаков описан новый вид Desulfurococcus fermentons и дана его полная фенотипическая характеристика Применение комбинации молекулярно-биологических и культуральных методов позволило культивировать и дать первичную фенотипическую характеристику "Fervidococcus fontis" - представителя новой филогенетической ветви Crenarchaeota, ранее включавшей лишь некультивируемые организмы Полученные результаты расширяют представления о биоразнообразии термофильных представителей филума Crenarchaeota Новые организмы могут являться источниками новых ферментов для различных областей биотехнологии

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "ГИ1 International Congress on Extremophiles", 2002, "1st FEMS Congress of European Microbiologists", 2003, "International Congress on Thermophiles", 2003, "V International Congress on Extremophiles", 2004, "International conference "Archaea", 2005; "International workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", 2005, "2nd FEMS Congress of European Microbiologists", 2006, "International Congress on Thermophiles 2007", а также на XV международной молодежной зимней школе-конференции, 2003

Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ 2 экспериментальные статьи, 9 тезисов конференций, 2 статьи находятся в печати

Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования с обсуждением, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 188 наименований работ Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают 21 рисунок и 10 таблиц

Место проведения работы и благодарности Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. CH. Виноградского РАН. Некоторые этапы работы были выполнены во время стажировки по программе для молодых ученых INTAS в

лаборатории микробиологии Бергенского Университета под научным руководством Нильса-Коре Биркеланда (Берген, Норвегия)

Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов был проведен совместно с к б н А В Лебединским (ИНМИ РАН) Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполняли совместно с кбн А.М Лысенко (ИНМИ РАН) и к б н. Н А Черных (ИНМИ РАН) Анализ последовательностей 16S рРНК проводили совместно с к б н Б Б Кузнецовым, к.б н ТВ Колгановой (Центр Биоинженерии РАН) и кбн ТП Туровой (ИНМИ РАН) Электронную микроскопию чистых культур микроорганизмов выполнила Н.А Кострикина (ИНМИ РАН)

Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам и друзьям, принимавшим участие на разных этапах работы Автор выражает глубокую признательность научному руководителю дбн ЕА Бонч-Осмоловской за интересную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания на разных этапах работы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили пробы из наземных горячих источников полуострова Камчатка, Байкальского региона, Исландии и мелководных гидротерм Курильских островов Также в работе были использованы неидентифицированные штаммы гипертермофильных микроорганизмов из коллекции лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им СН Виноградского РАН

В качестве реперных штаммов в тестах на специфичность праймеров и зондов использовали типовые штаммы микроорганизмов, полученные из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) или из коллекции культур лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН

Культивирование микроорганизмов проводили на пресной среде Пфеннига, которая имела следующий минеральный состав (мг/л дистиллированной воды) KCl, 330, NH4CI, 330, КН2Р04, 330, MgCl2 х 6Н20, 330, СаСЬ х 2Н20, 330, 1 мл раствора микроэлементов (Кевбрин, Заварзин, 1992) Среду готовили анаэробно, с кипячением и последующим охлаждением под током газа (N2 или смесь N2/CO2 80 20), с добавлением резазурина (1 мг/л) После охлаждения в среду добавляли 1 мл раствора витаминов (Wolin et al, 1963), NaHC03, 500 мг/л, в качестве восстановителя Na2S х 9Н20, 500 мг/л, дрожжевой экстракт (Difco), 200 мг/л; а также различные энергетические субстраты (2 г/л) и акцепторы электронов (2 г/л, элементная сера 10 г/л). Автоклавировали среды при 1 или 0.5 избыточных атмосферах

Колонии новых Crenarchaeota получали в агаровых столбиках (60°С, pH 6 0), для чего стандартную среду анаэробно разливали в пенициллиновые флаконы с добавлением 1 5% агара

Наблюдение и подсчет клеток проводили с помощью светового фазово-контрастного микроскопа (ЛОМО АУ-12, Россия) Тонкое строение клеток

изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием ультрамикротома LKB 3R и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Tokyo, Japan)

Олигонуклеотидные праймеры и зонды, специфичные к генам 16S рРНК Crenarchaeota, а также к отдельным представителям этого филума (рис 1, 3), были подобраны с помощью компьютерной программы "ProbeDesigner" (Субботина и др, 2003, Перевалова и др, 2003).

Молекулярно-биологические методы Геномную ДНК выделяли стандартным методом Мармура (Marmur, 1961), в некоторых случаях с небольшими модификациями (Перевалова и др, 2003) Определение содержания гуанина и цитозина в Д НК проводили с помощью кривых плавления (Герхардт и др, 1984) ПЦР-амплификацию, гель-электрофорез, гибридизацию на мембранах с флюоресцентно мечеными зондами, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) проводили согласно общепринятым методикам ([https.//www.roche-applied~science com/], Маниатис и др, 1984, Muyzer et al, 1993) Условия проведения ПЦР и гибридизации с олигонуклеотидными зондами подбирали экспериментально Нуклеотидные последовательности 16S рРНК определяли методом ферментативного секвенирования с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3 1 на автоматическом секвенаторе ABI 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) согласно инструкциям производителя Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI BLAST [http.//www.ncbi nlm.mh.gov/blast1 Редактирование полученных сиквенсных спектрограмм проводили с помощью программы Chromas, версия 1.45 (http //www.techelysium com au /chromas МтП.Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы Multalin (Corpet, 1988) Филогенетические деревья были построены с помощью программ TREECONW (Van de Peer and De Wächter, 1994) и PHYLEP (Felsenstein, 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Молекулярная идентификация представителей Crenarchaeota 1.1Детекция представителей Crenarchaeota в природных пробах

Проверка специфичности праймеров Cren7F - Cren518R Для ПЦР

идентификации представителей царства Crenarchaeota при помощи программы "ProbeDesigner" были созданы олигонуклеотидные праймеры Cren7F - Cren518R (Рис. 1). Дискриминирующая способность этой пары праймеров по отношению ко всем другим организмам, не родственным Crenarchaeota, основана на наличии в 16S рРНК кренархеот очень сильных уникальных сигнатур в позициях 27, 28 и 518 (нумерация по Е coli).

Для проверки специфичности разработанной пары праймеров и оптимизации условий ПЦР была использована ДНК представителей рода Desulfurococcus, а также других культивируемых представителей Crenarchaeota: Staphylothermus marmus, Sülfophobococcus zilhgii, Igmcoccus paciflcus, Acidianus

infermis, Thermoproteus tenax, Sulfolobus sólfataricus В качестве отрицательных контролей использовалась ДНК представителей Euryarchaeota и Bacteria (таблица 1)

Праймер Cren 7F, б1-^'

Crenarchaeota 90%, +, 3'->5' другие Archaea 90%, +, 3'->5'

TTCCGGTTGATCCYGCCGGACC I I I I М I I I I I I I I I I I I I I I I RAGGCCAACTAGGRCGGCCTGG DAGRCMAACTAGGRCSGYCTcc

Праймер Cren 518R, 3'->5х

Crenarchaeota 95%, -, 5 * —>31 другие Archaea, 95%, -, 5'->3'

AGTCGGCGGCGCCATTWTGGTCG I i I II I I I II I III I I I I II I I I TCAGCCGCCGCGGTAAWACCAGC sCAGCCGCCGCGGTAAYACCVGC

Рис 1 Подобранные праймеры и целевые сайты представителей Сгепагскаеога и АгсЬаеа Мисмэтчи показаны строчными буквами

Таблица 1 Результаты ПЦР с кренархеотными праймерами Cren7F - Cren518 представителей Crenarchaeota, Archaea и Bacteria при разных температурах

Микроорганизм ПЦР с праймерами Cren7F - Cren518R при разных температурах отжига

60°С 65°С 70°С 75°С 80°С 85°С

Stapkylothermus marimis, DSMZ 3639 + + + + - -

Sulfophobococcus zilligii, DSMZ 11193 + + + + - -

Desulfurococcus mobilis, DSMZ 2161 + + + +- - -

Thermoproteus tenax, DSMZ 2078 + + + + + +

Sulfolobus solfataricus, DSMZ + + + + + +

Igmcoccits pacijicus, DSMZ 13166 + + + + - -

Acidiarms infernus, DSMZ 3191 + + + + - -

Thermococcusfumicolans, DSMZ 12820 не специф продукты - - - - -

Thermococcus peptonophilus, DSMZ 10343 -//- - - - Но Но

Methanosarcina barkeri, DSMZ 800 -II- - - - Но Но

Methanococcusjannaschn, DSMZ 2661 + - - - Но Но

Thermoanaerobacter siderophilus, DSMZ 12299 Но Но - - Но Но

контроль без ДНК - - - - - -

Но - не определяли

В результате проведенных экспериментов было показано, что при 60°С (заведомо низкой температуре отжига для разработанных праймеров) некоторые отрицательные контроли давали положительные или неспецифические продукты в реакции ПЦР Дальнейшее повышение температуры отжига праймеров до 65°С (примерная Тш праймеров) и выше приводило к исчезновению сигнала на отрицательных контролях, а для положительных контролей был получен

единственный продукт амплификации, размером около 500 по Во всех экспериментах в контроле без ДНК каких-либо сигналов не обнаруживалось. В качестве рабочей температуры отжига в реакции ПЦР с праймерами Cren7F -Cren518R была выбрана температура 72°С - 72 4°С

Результаты ПЦР с праймерами Cren7F - Cren518R на ДНК различных представителей домена Archaea и бактерий послужили основанием для использования этого метода при анализе природных проб и накопительных культур

Нами впервые было предложено использовать кренархеотные праймеры для DGGE (денатурирующий градиентный гель-электрофорез) анализа продуктов ПЦР-амплификации. Для этого к праймеру Cren7F с 5' конца был прикреплен ГЦ - обогащенный участок (GC clamp), длиной 40 нуклеотидов. Нами также были подобраны условия для эффективной работы такой системы праймеров -DGGECren7F- Cren518R При проведении денатурирующего градиентного гель-электрофореза такие праймеры позволяют добиться условий разделения равнодлинных ПЦР-фрагментов и их последующей идентификации с помощью секвенирования и сравнения с имеющимися базами данных

Распространение Crenarchaeota в наземных гидротермах Предложенные нами праймеры Cren7F - Cren518R были использованы для детекции представителей Crenarchaeota в природных пробах (таблица 2) Было проанализировано 78 проб из горячих источников региона озера Байкал (Гусихинский и Уринский источники), острова Кунашир (Горячий Пляж), разных регионов Камчатки (кальдера Узон, Долина гейзеров, Карымский и Мутновский вулканы), Исландии (район Кверагарди). В результате амплификации ДНК из природных образцов с Crenarchaeota-специфичными праймерами Cren7F -Cren518R 57 проб дали положительный сигнал

Из семи проанализированных природных проб из Байкальского региона только в одной, с температурой 59 ГС и рН 8 8 (проба BL1017), был получен положительный сигнал с кренархеотными праймерами Cren 7F- Cren 518R

Представители Crenarchaeota также были детектированы в двух природных пробах, отобранных из прибрежных морских гидротерм острова Кунашир Одна из проб (402) была использована в дальнейшем анализе по идентификации представителей рода Desuljurococcales с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами

Представители Crenarchaeota были детектированы в 38 пробах, отобранных на полуострове Камчатка (кальдера Узон, Долина гейзеров, вулканы Карымский и Мутновский) и в 16 пробах из Исландии Четыре камчатские пробы (801, 803, 804, 805) были использованы в дальнейшем анализе по идентификации представителей рода Desuljurococcales с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами.

Идентификация обнаруженных Crenarchaeota Прямой сиквенс ПЦР-продукта из пробы BL1017 (источник Уринский, Баргузинская долина) показал присутствие только одного представителя Crenarchaeota, филогенетически относящегося к глубокой ветви некультивируемых Crenarchaeota, ранее

детектированной в источнике Обсидиан (74-93°С, рН 6 7-7.6), Йеллоустонский Национальный парк, и представленной клоном pJP41 (Barns et al, 1996) (рис 2)

Таблица 2 Характеристика природных проб, содержавших новые Crenarchaeota

Проба Место отбора Название источника Т°С рн Описание пробы Eh, мВ

BLr 1017 Долина р Баргузин, Байкальский регион Уринский 591 88 осадок со дна ручья -130

Кат 1506 Восточное термальное поле, кальдера Узон, Камчатка Белый 57 57 осадок, нитевидные обрастания -160 (верх) -300 (2см)

Кат 1509 -II- грифон Заварзина 58 62 мат -296

Кат 1523 грифон Зацепина 70 70 мат с нитевидными обрастаниями Но

Кат 1521 -II- Вертолетный 68 70 серые нитевидные обрастания Но

Кат 1514 Центральное термальное поле, кальдера Узон, Камчатка Бн 80-82 5 5 черные нитевидные обрастания -180

Кат 1529 Оранжевое термальное поле, кальдера Узон, Камчатка Оранжевый Нейтральный 65-71 5 8-6 0 осадок -316

Кат 1615 Центральное термальное поле, кальдера Узон, Камчатка Извилистый-1 75 55 черный осадок с белыми нитями -250

Is 2 долина Кверачалки, район Кверагарди, Исландия Бн 72 70 черный осадок Но

Is 3 -II- -II- 94 25 осадок -II-

Is 5 долина Рекьядалюр, район Кверагарди, Исландия -II- 73 Но осадок -II-

Is 6 -II- -II- 55 60 серые нитевидные обрастания -11-

Is 9 -II- -II- 68 6 65 серые нитевидные обрастания

V3 долина Гриндалюр, район Кверагарди, Исландия -II- 69 75 белые нитевидные обрастания -II-

V4 -II- -II- 71 70 серые нитевидные обрастания -II-

V6 -II- -II- 71 65 желтый осадок

014 -II- -II- 70 50 серые нитевидные обрастания

Н о - не определяли, Б н - без названия

ПЦР-продукты, полученные с праймерами Cren7F - Cren518R из семи проб кальдеры Узон/Камчатка и девяти проб из Исландии (таблица 2) с температурами 55-82°С были проанализированы методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) Четыре пробы (Kaml506, Kaml509, Каш 1523, Kaml529) из кальдеры Узон/Камчатка и одна проба (Is2) из долины Кверачалки/Исландия с температурами 57-72°С (ниже интервала роста известных гипертермофильных Crenarchaeota) содержали организмы, филогенетически родственные (с уровнем сходства 16S рРНК от 96 до 98%) клонам глубокой филогенетической группы pSL12, обнаруженной в источнике Обсидиан, Йеллоустонский Национальный парк (Barns et al, 1996) Группа pSL12 близка к группе морских "холодных" некультивируемых Crenarchaeota, но представляет отдельную филогенетическую ветвь (рис 2). В пробе Kaml509 (58°С, рН 6 2) был найден еще один кренархеотный компонент, филогенетически родственный "Caldisphaera dracosis " (уровень сходства 93%) В трех пробах из кальдеры Узон (68-82°С, рН 5.5-7 0) Kaml514, Kaml615 и Kaml521 были обнаружены кренархеоты, относящиеся к группе Thermoproteales Представитель Crenarchaeota, присутствующий в пробе Kami514 (80-82°С, рН 5 5) оказался родственником Thermoproteus neutrophilia (уровень сходства 16S рРНК 95%) «Филотип» из пробы Кат1615 попал в группу, содержащую Thermofilum sp (уровень сходства 93%) Кренархеотный компонент из пробы Kami 521 был лишь отдаленно родственен пор Thermoproteales, сиквенс не показал значительного сходства с последовательностью 16S рРНК какого-либо культивируемого представителя этого порядка

Два «филотипа» из исландских проб V4 и Is6 попали в группу так называемых "некультивируемых Desulfurococcales" (с уровнем сходства с ближайшими культивируемыми представителями <86%) «Филотип» из пробы G14 оказался филогенетически близок группе Thermoproteales и был отдаленно родственен Thermocladium modestius (уровень сходства 91%) Другие четыре кренархеотных компонента из проб V3, Is5, Is9, V6 попали в различные группы некультивируемых Crenarchaeota, «Филотип» из пробы V6 был филогенетически близок клону SUBT-13, который был детектирован в подземной горячей скважине Исландии (Martemsson et al., 2001). В высокотемпературной пробе Is3 (94°С, 2 5) был обнаружен кренархеотный компонент, филогенетически родственный Sulfolobus solfataricus (уровень сходства 99%) (рис 2)

Так, с помощью ПЦР и DGGE анализа с Crenarchaeota-спвцифичными праймерами нам удалось показать, что представители Crenarchaeota широко распространены в гидротермах Камчатки, подтвердить эти данные для гидротерм Исландии, а также впервые показать присутствие кренархеот в горячих источниках Байкальского региона Среди детектированных нами сиквенсов были филогенетически родственные культивируемым представителям порядков Thermoproteales, Desulfurococcales и Sulfolobales Однако, большинство сиквенсов были филогенетически близки "некультивируемым" Crenarchaeota, причем последние наиболее часто встречались при умеренных температурах (55-70°С)

"Fervidococcus foiUis ", EFS52404

-Kam920

s№

55]

42\50r hot env. clone SK213.AY882767 100 \ env. clone YNP_SSp_ASl, DQ24377S ! env. clone YNP_ObP_A25, DQ243754

4S |-hot env clone Hverd031N,DQ441511

[J 00,— Icelandic V4 - Icelandic Is6

-Acidilobus aceticus, AF191225

100,-Kaml509

70, 9J6\

59Г \100

- Caldisphaeralagunemis,AB087499

Pyrodictium abyssi, X99559 Desulfurococcus mobihs, M36474 Ignicoccuspaaficus,AJ271794

'i Stetteria hydrogenophila, У07784 '— Aeropy>rumpernix,AB008745 Icelandic Is3

- Sulfolobus solfataricus, AE006720

ЮОг

Kami 615

37 51

100

86\ 92

— Thermoftlum pendens, CP000505 100,— Kaml514

ч—

T_ T

Sir

Thermoproteus neutrophilia, AB009618

-Vulcanisaeta souniana, AB063645

Ю0Г~ Thermocladiummodesttus,AB005296 ~ 84,-Icelandic G14

hot env clone Hrerdl98A, DQ441496 -Kami 521

культивируемые Desulfurococcales

J~ Sulfolobales

Thermoproteales

hot env clone pJP33, L25300

52,-hot env clone 0SL1O9, U63366

79 П- hot env clone Hrerd066N,DQ441517

JM\ I-Icelandic V3

54[ L env cl0Ile YNP ObP_A97, DQ243761

98]-BL1017

hot env. clone env. pJP41, L25301

--Icelandic Is 5

- freshwater env clone pGrfC26,159986

hot env clone env pJP89,125305 94l 99i hot env clone pSL123, «53345 75] 1 env clone YNP_ObP_A5, DQ243757

g7i-Icelandic Is9

71 j- hot env clone Hwrd033N,DQ441512 '— hot env. clone Hrerd044N, DQ441515 - Icelandic V6 subter env. clone SlIBT-13, AF361212 „,,- Icelandic Is2

7I1

100 г

Miscellaneous Crenarchaeota

100

Kaml506 79r- Kami529 ijjr— Kaml523 I 1 Kaml509 L 1

1001

hot env. clone Hverd014N, DQ441506 64, env clone YNP_OhP_A62, DQ243758 1- hot env clone pSL12, Ü63343

--soil env. clone SCA1170, U62817

--marine env clone 4B7, U40238

Group 12

- korarchaeotal clone pJP27,125852

99,

77r

99,

Thermococcus hydrothermahs,Z70244 — Archaeglobm fiilgtdus, AE000782 -— Halobactenum halobium, X03407

Group 1 lb

Euryarchaeota

- Methunosarcmu barken, AJ012094

'■-E coh, AP009048

Рис 2 Филогенетическое положение детектированных Archaea

"филотипов" среди представителей

1.2 Детекция гипертермофильных архей рода Desulfurococcus путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами

В коллекции культур Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН хранились штаммы гипертермофильных архей, ранее выделенные из наземных гидротерм дальнего Востока и предварительно отнесенные к роду Desulfurococcus (Бонч-Осмоловская, Светличный, 1988). С целью идентификации этих штаммов, а также поиска новых представителей Crenarchaoeta, нами были разработаны зонды, специфичные к роду Desulfurococcus и к отдельным видам этого рода

Подбор олигонуклеотидных зондов Зонд Dco 198, специфичный для представителей рода Desulfurococcus, был подобран с помощью компьютерной программы ProbeDesigner При подборе этого зонда мы использовали нуклеотидные последовательности 16S рРНК Desulfurococcus mobihs, Desulfurococcus amylolyticus и Desulfurococcus Z-1312. Для двух первых видов были подобраны видоспецифичные зонды Dco_mob 198 и Dco_amy 198 Компьютерный анализ показал, что все эти зонды имеют не менее двух нетерминальных мисмэгчей с последовательностями 16S рРНК нецелевых организмов Зонды и целевые сайты наиболее важных отрицательных контролей показаны на рис 3

Dco 198, зонд

Staphylothermus marmus, сайт

Dco_mob 198, зонд D amylolyticus

Desulfurococcus sp. 1312, сайт Dco_amy 198, зонд D mobilis

Desulfurococcus sp. 1312, сайт

Рис 3 Подобранные зонды и целевые сайты наиболее адекватных отрицательных контролей Мисмэтчи показаны строчными буквами

Проверка специфичности олигонуклеотидных зондов Для проверки специфичности гибридизации олигонуклеотидных зондов использовали ДНК типовых штаммов рода Desulfurococcus - D amylolyticus, D mobilis, Desulfurococcus mucosus и Desulfurococcus sp Z-1312, а в качестве отрицательных контролей на родовой зонд - Staphylothermus marmus, Pyrodictium abyssi и Acidilobus aceticus

Родовой зонд на Desulfurococcus прореагировал со всеми ПЦР-продуктами, полученными с помощью праймеров Cren7F - Cren518R на ДНК всех представителей этого рода (рис 5) С ПЦР-продуктами Staphylothermus marinus,

5'-CGTTAACYCCYGCCACACC-3'

II IMIMM II INI 3'-GCtATTGGGGGtGGcGTGG-5'

5'-CGTTAACCCCTGCCACACC-3'

I I I II I I I I I II I II I I I 3'-GCAATTGGGGgCGGTGTGG-5' 3'-GCAATTGaGGACGGTGTGG-5'

5'-CGTTAACCCCCGCCACACC-3'

I I I I I II I II II I I I II I 3'-GCAATTGGGGaCGGTGTGG-5' 3'-GCAATTGaGGaCGGTGTGG-5'

Pyrodictium abyssi и Acidilobus aceticus, взятыми в качестве отрицательных контролен, зонд не реагировал (рис. 5).

Видовой зонд Dco_amy дал положительный сигнал с ампликоном D. amylolyticus. С ПЦР-продуктами других видов Desulfurococcus и другими отрицательными контролями зонд не реагировал (рис. 4Ь).

Видовой зонд на Dcojnob прореагировал с ампликонами 16S рРНК D. mobilis и D. mucosus (рис. 4с). На момент подбора олигонуклеотидных зондов, последовательность 16S рРНК D. mucosus была неизвестна; ее определение показало, что уровень сходства 16S рРНК D. mobilis и D. mucosus составляет 99.5% (на участке сайта, к которому были подобраны зонды - 100%); этим и объясняется положительная реакция 16S рДНК D. mucosus с зондом Dco_mob.

Рис. 4. Идентификация представителей D. amylolyticus и D. mobilis: электрофорез ПЦР-продуктов, полученных с праймерами Cren 7F -Сгеп 518R (а) и последующая гибридизация с видоспецифичными зондами Dcoamy 198 (b) и Dco mob 198 (с). Дорожки: 1, 16 ■ маркер GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder ("Fermentas"); 2 - штамм 204; 3 - штамм 313; 4 - штамм 603; 5 - D. amylolyticus; 6 - D. mucosus; 7 - Desulfurococcus sp. 1312; 8 - D. mobilis; 9 - Staphylothermus marinus; 10 - Pyrodictium abyssi; 11 -Acidilobus aceticus; 12 - Thermococcus peptonophilus; 13 - Methanosarcina barkeri; 14 - Thermoanaerobacter siderophilus; 15 - H20.

Идентификация чистых культур гипертермофильных прокариот

Разработанные праймеры и зонды были использованы для идентификации штаммов гипертермофильных органотрофных архей с кокковидными клетками, выделенных из наземных гидротерм Камчатки и о. Кунашир. Штаммы 204, 313, 603, 2601 были идентифицированы как Сгепагскаео1а и представители рода Ое5и1/игососс№ (рис. 5Ь). При гибридизации этих штаммов с видовым зондом на О. ату1о1уисш все они дали положительный сигнал (рис. 4Ь), тогда как при гибридизации с зондом, специфичным к виду £>. тоЫШ, положительного сигнала

(а>

1 2 3 4 5 6 7 S 9 ¡01112131415 Í6

■ 500 bp

(Ь)

1234567S9 10111213141516

(с)

1 2 3 4 5 6 7 S 9 ¡0111213141516

Jg.

_____

гибридизации не было (рис. 4с). Таким образом, все четыре изолята являются штаммами Оеви^игососст атуШуйсиз.

Детекция представителей рода Desulfurococcus в накопительных культурах и природных пробах Родовой зонд на Desulfurococcus был использован для обнаружения представителей этого рода в первичных накопительных культурах Каш920 и Кат940 из кальдеры Узон, Камчатка. Накопительные культуры, полученные И.В. Кублановым из источников Трещинный (85°С) и Безымянный (68СС), анаэробно росли на хитине при температуре 85°С и рН 6.0 и содержали клетки кокковидной формы. Путем амплификации со специфичными праймерами в этих накопительных культурах были детектированы Crenarchaeota. Однако гибридизация с родовым зондом на Desulfurococcus не дала положительных результатов. Это послужило основанием для выделения из этих накопительных культур новых представителей Crenarchaeota.

Родовой зонд на Desulfurococcus был использован для обнаружения представителей этого рода в пресноводных гидротермах Камчатки (пробы 801, 803, 804, 805) и прибрежном горячем источнике о. Кунашир (проба 402). Во всех этих пробах были обнаружены представители p. Desulfurococcus (рис. 5Ь).

Таким образом, предлагаемый нами метод молекулярно-биологической детекции гипертермофильных архей рода Desulfurococcus позволил провести быстрый и достоверный скрининг представителей этого рода в чистых и накопительных культурах, а также в природных образцах. Эти результаты указывают на широкое распространение рода Desulfurococcus, и, в частности, D. amylolyticus, в высокотемпературных гидротермах Дальнего Востока России. В некоторых накопительных культурах представители этого рода обнаружены не были, что послужило основанием для выделения новых Crenarchaeota.

(а)

3 4 5 6 7 8 9 JO/! 121314

' • - - ■ ; : " -

■ 5(10 bp

1 2 3 4 5 6

(b)

7 S 9 1011121314

Рис. 5. Идентификация и детекция представителей рода Desulfurococcus: электрофорез ПЦР-продуктов, полученных с праймерами Cren7F -CrenS 18R (а) и последующая гибридизация с родоспецифичным зондом Deo 198 (b). Дорожки: 1 - маркер GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder ("Fermentas"); 2 - штамм 204; 3 - штамм 313; 4 - штамм 603; 5 - штамм 2601; 6 -проба 803; 7 - проба 801 ; 8 - проба 402; 9 - D. amylolyticus: 10 - D. mucosus; 11 -Desulfurococcus sp. 13 3 2; 12 - D. mobilis; 13 - Staphylothermus marinus; 14 -Pyrodictium abyssi.

2. Выделение и характеристика новых представителей Crenarchaeota

Характеристика РетКигососст fermentans 8Г). поу Штамм '¿-\312Т был выделен В.А. Светличным из пробы горячего источника кальдеры Узон в 1990 г. Клетки штамма Ъ-1312 представляют собой правильные кокки диаметром 2-4 мкм. Имеется один жгутик. Клеточная стенка состоит из Б-слоя, прикрепленного к цитоплазматической мембране (рис. 6).

Рис. 6. Электронные фотографии штамма Х-\312т. а - препарат целой клетки (окраска ФВК), б - ультратонкий срез (окраска уранилацетатом). Масштаб 0.5 мкм.

Штамм Z-1312 рос при температурах 63-89°С (оптимум 80-82°С), и в диапазоне pH 4.8-6.8 (оптимум 6.0). Он является строгим анаэробом, органогетеротрофом, способным расти в присутствии 0.02% дрожжевого экстракта на различных сахарах и полисахаридах, образуя при этом ацетат, Нг и С02-

Филогенетический анализ гена 16S рРНК показал, что штамм Z-1312 является представителем семейства Desulfurococcaceae (Burggraf et al., 1997) (филум Crenarchaeota, домен Archaeä) и наиболее близок к роду Desulfurococcus (уровень сходства 95.5-96.4%). На филогенетическом дереве новый штамм формирует отдельную ветвь с представителями этого рода (рис. 7).

Ряд фенотипических признаков штамма Z-13121 является общим для рода Desulfurococcus (таблица 3). Однако по ряду признаков он отличается от других видов рода Desulfurococcus'. использует значительно более широкий ряд субстратов; его рост не стимулируется серой и не ингибируется водородом. Уникальным свойством нового штамма Z-13121 является способность к росту на целлюлозных субстратах (микрокристаллическая целлюлоза,

карбоксиметилцеллюлоза, фильтровальная бумага; рис. 8). В настоящее время штамм Z-13121 является единственной гипертермофильной археей, обладающей этой способностью.

Desulfurococcus fermentans Z-1312T (AY264344)

Desulfurococcus amylolyticus DSM 3822T (AF250331) Desulfurococcus mobilis DSM 2161т (M36474) Desulfurococcussaccharovorans" V24K Thermosphaera aggregans Ml 1TLT (X99556) Sulfophobococcus zilhgti K1T(X98064) Staphylothermus mannus DSM 3639т (X99560) юо1 Staphylothermus hellemcus P8T (AJ012645) Igmcoccus paciflcus LPC33T (AJ271794)

юо I— Igmcoccus islandicus Kol 8T (X99562) ■ Acidilobus aceticus DSM 11585T ■ Stetterm hydrogenophila 4ABCT(Y07963) ■ Thermodiscus maritimus S2T (X99554) I "Aeropyrum camim" SY1 (AB109559) ioir Aeropyrum permx K1T (D83259) ■ Methanococcus vannielu DSM 1224T (AY196675)

Рис 7 Филогенетическое положение ОезиЦигососст fermentans среди представителей порядка Desulfilrococcales

Таблица 3 Характеристика штамма 2-1312т и других видов рода Оеяи^игососсш

Характеристика D mucosus D mobilis О атуЫуПсш г-1312т

Форма и размер клеток кокки кокки неправильные кокки правильные кокки, 2-4 мкм

Наличие жгутиков нет один жгутик нет один жгутик

Температура, °С (мин/опт/макс) Ho/85/Ho НоУ 85/Но 68/90-92/97 63/80-82/89

РН (мин /опт /макс ) 4 5/6 0/7 0 4 5/6 0/7 0 5 7/64/75 4 8/60/68

Субстраты пептиды пептиды пептиды, крахмал пептиды, моносахара, полисахариды, включая целлюлозу

Влияние серы на рост стимулирует стимулирует стимулирует не стимулирует

Влияние водорода на рост ингибирует* Но ингибирует* не ингибирует

Г+Ц состав ДНК, мол % 51 3 52 9 412 42 5

*Слободкин и Бонч-Осмоловская, 1994, Н о - не определяли

Рис. 8. Рост штамма г-1312т на среде, содержащей только 0.2 г/л дрожжевого экстракта (Д), или содержащей дополнительно 5 г/л крахмала (□) или 5 г/л микрокристаллической целлюлозы (о). Температура инкубации 82°С, рН 6.0.

100

150

время, ч

По совокупности фенотипических и генотипических признаков штамма Z-2312т, а также его отличий от других видов Desulfurococcus, мы отнесли выделенный штамм к новому виду Desulfurococcus fermentans sp. nov. Типовой штамм Z-1312T (DSM 16532T =VKM V-23161). Его выделение также позволило нам изменить диагноз рода Desulfurococcus.

Уточнение описания рода Desulfurococcus Desulfurococcus (De.sul.ñi.ro.coc'cus. N.L. pref. de from; L. n. sulfur cepa; Gr. п. coccus ягода; N.L. mase. n. Desulfurococcus серовосстанавливающие кокки).

Археи филума Crenarchaeota. Клетки - правильные или неправильные кокки, без жгутика или с одним жгутиком, с клеточной стенкой глобулярной структуры. Гипертермофилы с оптимальной температурой роста 80-90°С. Нейтрофилы или умеренные ацидофилы с оптимумом pH 6.0-6.5. Облигатные анаэробы. Органотрофы, способные к росту на широком спектре органических субстратов: пептиды, мономерные и полимерные углеводороды. Бродильный тип метаболизма. Рост представителей некоторых видов ингибируется молекулярным водородом и стимулируется в присутствии элементной серы. Г+Ц состав ДНК -41-51 мол%. Представители рода обитают в наземных горячих источниках. Типовой вид Desulfurococcus mucosus Zillig and Stetter 1983 (типовой штамм ATCC 35584T=DSM 2162T=JCM9187т).

Выделение и характеристика "Fervidococcus fontis" gen. nov., sp. nov

DGGE-анализ ПЦР-продуктов накопительных культур Kam920 и Kam940 (анаэробный рост на хитине при 85°С, pH 6.0), полученных с Crenarchaeota-специфичными праймерами, показал, что организмы, присутствующие в обеих культурах, относятся к группе "некультивируемых" Desulfurococcales с уровнем сходства с ближайшими культивируемыми представителями этого семейства

менее 90% (рис. 2). Мониторинг накопительных культур с СгепагсИаеоШ-специфичными праймерами позволил оптимизировать условия культивирования новых организмов, относящихся к глубокой ветви Сгепагскаеога.

Штамм Кат940 был выделен в чистую культуру. Его клетки представляли собой правильные кокки диаметром 1-3 мкм. Клеточная стенка состоит из Б-слоя, прикрепленного к цитоплазматической мембране (рис. 9).

Штамм Кат940 рос в интервале температур 55-85°С, оптимум 70°С и в диапазоне рН 6.0-6.5. Он является строгим анаэробом и органогетеротрофом, способным расти на пептоне, крахмале, дрожжевом экстракте. Элементная сера не стимулировала рост, однако Н2 (100% в газовой фазе) ингибировал рост нового организма.

Рис. 9. Электронные фотографии штамма Kam940. а - препарат целой клетки (окраска ФВК), б -ультратонкий срез (окраска уранилацетатом). Масштаб 1 мкм.

Анализ гена 16S рРНК показал, что штамм Каш940 является представителем филума Crenarchaeota (домен Archaea) и филогенетически значительно удален от ближайших культивируемых представителей этого филума (с уровнем сходства 87-89%). На филогенетическом дереве новый штамм формирует отдельную ветвь с некультивируемыми клонами из Йеллоустонского Национального парка (США) и Исландии. Мы предлагаем создать новый род | 'Fervidococcus' gen. nov., вид 'Fervidococcus fontis' sp. nov. (рис. 10) с типовым штаммом Каш940.

3. Характеристика новых Crenarchaeota путем мониторинга накопительных

культур

Характеристика Crenarchaeota из ист. Уринский (Байкальский регион)

ПЦР-анализ ДНК из природной пробы BL1017 (источник Уринский) показал присутствие в ней представителей глубокой филогенетической ветви Crenarchaeota, родственной клону pJP41 из Йеллоустоунского Национального Парка (Barns et al., 1996). Из этой же пробы были получены накопительные культуры, растущие на пептоне в аэробных и анаэробных условиях при рН 7.0 и температуре: 40, 50, 60, 70 и 82°С. Только в одной накопительной культуре (60°С, рН 7.0) при анализе ПЦР с праймерами Cren7F - Cren518R был обнаружен

положительный сигнал. Сиквенс ПЦР-продукта подтвердил присутствие в накопительной культуре ВЫ 017 единственного представителя филума Сгепагскаеога, по филогенетическому положению имеющего 90% сходства с клоном р 1Р41. Десятикратные разведения ДНК из исходной пробы 1017 и из первичной накопительной культуры ВЫ 017 с последующей ПЦР с кренархеотными праймерами Сгеп7Р-Сгеп518К показали, что количество клеток Сгепагскаео1а возрастало на три порядка за период инкубации. Таким образом, новый организм не просто переносился в культуру из пробы, а рос в ней. ПЦР-детекция присутствия Сгепагскаеога при культивировании ВЫ 017 на различных энергетических субстратах, при разных температурах, рН и восстановительных условиях позволила охарактеризовать условия роста кренархеотного компонента (таблица 4).

Таблица 4. Условия роста кренархеотного компонента накопительной культуры BL1017.

Субстрат (60°С) Восстановительные условия рН Присутствие Crenarchaeota

пептон (2 г/л) + дрожжевой экстракт (200 мг/л) анаэробно с восстановителем 6.0

-II- -II- 6.5 -

■-Г1- ;; 7.5

-н- -II- 8.0 -

-и- -II- 8.5 -

-н- анаэробно без восстановителя 7.0 -

аэробно -II- -

-н- микроаэробно (2% Ог) -II- -

дрож-даок эко р ( аНаэробда с восстановите леи - г * ty ^ ^or'i ; - те

пептон + S0 -II- -II- -

сахароза + мальтоза -II- -II- -

крахмал (2 г''л) -17' " ' 1 ,. * ^ ■ ■ ■ . г :.: V ?"~ ■

аминокислоты I -II- -II- -

аминокислоты II -II- -II- -

аминокислоты III -II- -II- -

аминокислоты IV -II- -II- -

аминокислоты V -II- -II- -

I - глицин (Г), триптофан (Т), аргинин (А), пролин + аланин; II - ГТА + изолейцин; III - ГТА + метионин; IV - ГТА + валин; V - ГТА + лейцин

Таким образом, представитель глубокой ветви Сгепагскаео1а является строгим анаэробом, органотрофом, не зависящим от присутствия Б0, растущим в довольно узких диапазонах температур (от 60°С до 65°С) и рН (от 7.0 до 7.5).

Характеристика новых Оеидгс/шео/а из горячих источников кальдеры Узон Из источников с температурами 57-71°С были получены накопительные

культуры Kam55 и Kam70, растущие в анаэробных условиях на пептоне при 55°С и 70°С и рН 6 0 DGGE-анализ ПЦР продуктов, полученных с кренархеотными праймерами (DGGECren7F-Cren518R), показал, что присутствующие в них Crenarchaeota были филогенетически близки новому роду "Fervidococcus" (рис 10)

С помощью ПЦР и DGGE анализа нами также были исследованы накопительные культуры, полученные И В Кублановым в присутствии различных полимерных субстратов, которые инкубировались непосредственно в источниках кальдеры Узон Были исследованы первичные накопительные культуры из источников 1507 (75°С, 6 5) на казеине, агарозе, р-кератине, 1510 (77°С, 6.4) на Р-кератине, 1521 (68°С, 7.0) на карбоксиметилцеллюлозе и 1523 (70°С, 7.0) на веревке из хлопка DGGE-анализ ПЦР-продуктов, полученных с Стгагсйаео/а-специфичными праймерами показал, что большинство кренархеотных сиквенсов были филогенетически близки и попадали в новую группу, сформированную новым родом "Fervidococcus" и другими филотипами, обнаруженными нами в природных образцах Исландии (Is6 и V4) и накопительных культурах из кальдеры Узон/Камчатка (Кат55 и Кат70) (рис 2, 10)

66, "Fervidococcus fontis", EF552404 Л -J0P— 151 Ob-keratin — Кат920

92,— Icelandic V4 WO'y- Icelandic Is6

^ hot env. clone H\crd031N,DQ441511

6„ KamAP25f70) ie«r Kaml507casem

L Kaml514(60) Kaml521cmc Kaml523cell

9«

10„, env. clone ¥NP_ObP_A25, DQ243754 44\ env clone YNP_SSp_A51,DQ243775 L hot env clone SK213, AY882767 2S\ 98, KamAP17(70)

j, — KamAP15(55) ¡71 - Staphylothermusmarmus,X99560

2f \ I'-Desuljurococcus mobilis, M36474

I I— Stettena hydrogenophila, Y07784

21l I-Pyrodictium abyssi, X99559

-Caldispkaera lagunensis, AB087499

1 '-j

100

Acidilobits aceticus, AF191225 100 j—-Aadianus mfermis, X89852

1001— 92r

- Sulfolobus solfatancus, AE006720

----Thermocladium modestius, AB005296

Vulcamsacta soumana,AB063645

-Thermoproteus neutrophilia, AB009618

korarchaeotal clone pJP27, L25852

группа"Fervidococcus"

кул ьти ви руемые besulfurococcales

"Acidilobales"

Sulfolobales

Thermoproteales

- Methanosarcina barken, AJ012094

Рис 10 Филогенетическое положение "Гегу1с1ососси.5 ¡оШк" и родственных ему филотипов среди представителей Сгепагс!гаео1а

Таким образом, группа ТеппсЬсоссш' широко распространена в вулканических местообитаниях с умеренными температурами, где участвует в гидролизе биополимеров

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В течение многих лет горячие источники Камчатки, Байкальского региона, Курильских островов и Исландии были источником выделения термофильных микроорганизмов В разные годы из гидротерм Камчатки и о. Кунашир сотрудниками ИНМИ РАН были выделены органотрофные анаэробные представители Сгепагскаеога ВевиЩгососст атуЫуПсш (ВопсЬ-ОэтоЬуБкауа е1 а1,1988), ТЬегторШеш иготети (ВопсЬ-Озтокл^кауа е1 а1, 1990), АсгМоЬш асеПсш (Ргоко1ёуа ег а1., 2000). В последние годы молекулярно-биологических подходы к исследованию микробного разнообразия были применены и к микробным сообществам гидротерм. Довольно подробно было изучено биоразнообразие наземных и подземных гидротерм Исландии (Майеишоп е1 а1, 2001, К^ et а1, 2006) Однако молекулярно-биологические данные, характеризующие микробное разнообразие в горячих источниках Камчатки, Байкальского региона и о Кунашир отсутствовали.

В ходе нашей работы были разработаны новые способы детекции гипертермофильных архей филума СгепагсЬаеМа и в частности рода ОейтЛ/игососсш, которые позволили нам детектировать эти микроорганизмы в природных местообитаниях Так, с помощью ПЦР с СгепагскаШа-специфичными праймерами нам удалось показать, что представители Сгепагскаеога широко распространены в гидротермах Камчатки, Байкальского региона, Курильских островов, и подтвердить эти данные для гидротерм Исландии Кроме того, в горячих источниках Камчатки, Исландии и Байкальского региона были детектированы представители глубоких филогенетических ветвей Сгепагскаео1а, которые были приурочены к источникам с температурными характеристиками (57-75°С) слишком низкими для большинства анаэробных гипертермофильных культивируемых СгепагсИаео1а

С помощью нового способа детекции представителей рода Ве$и1/игососсш нам удалось идентифицировать четыре новых штамма этого рода, выделенные из наземных гидротерм Камчатки и о Кунашир, которые были отнесены нами к виду В ату\о1уПсж Также с помощью нового молекулярно-биологического подхода нами были обнаружены представители этого рода непосредственно в наземных гидротермах Камчатки и прибрежной морской гидротерме о Кунашир Эти данные подтверждают сведения о широком распространении органотрофных гипертермофильных архей с кокковидными клетками в наземных гидротермах Дальнего Востока России (Бонч-Осмоловская, Светличный, 1988, Бонч-Осмоловская, Заварзин, 1989) Кроме того, нами был описан новый вид Оет1]игососсш /егтеЫат, который оказался способен к росту на ряде полимерных субстратов, таких как целлюлоза и пектин При этом способность к росту на целлюлозе является уникальным свойством нового организма, т к среди гипертермофильных архей не было ранее обнаружено организмов, растущих на целлюлозных субстратах (Билла, 1997). Таким образом, оказалось, что в род

Desulfurococcus, исходно описанный как включающий гипертермофильных архей с серным дыханием, использующих пептиды (Zilhg et al, 1982), входят также вид(ы), не нуждающиеся в сере и использующие широкий круг полисахаридов.

Нами был выделен в чистую культуру новый организм "Fervidococcus fontis", филогенетически удаленный от ближайших культивируемых представителей порядка Desulfurococcales (уровень сходства 87-89%), который также оказался органотрофом, способным к росту при температурах значительно ниже нижнего температурного предела роста ранее известных гипертермофильных Crenarchaeota Эти данные, как и результаты наших исследований природных сообществ горячих источников, говорят о том, что многие «некультивируемые» Crenarchaeota относятся к новой группе "умеренных термофилов"

Комбинация методов культивирования с новыми молекулярно-биологическими подходами в приложении к пробам и накопительным культурам из горячего источника Уринской группы (Байкальский регион) позволила дать первичную фенотипическую характеристику организма, являющегося представителем глубокой филогенетической ветви некультивируемых Crenarchaeota, ранее представленную клоном pJP41 из Йеллоустонского Национального Парка, также оказавшегося умеренным термофилом и органотрофом

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что представители новой группы умеренно-термофильных Crenarchaeota являются органотрофами, участвующими в анаэробной деструкции органического вещества в гидротермах

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод обнаружения архей филума Crenarchaeota, основанный на ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров.

2. Разработан метод идентификации архей рода Desulfurococcus, основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов

3 Описан новый вид Desulfurococcus fermentons sp nov. и изменен диагноз рода Desulfurococcus

4 Установлено, что в источниках с температурами 55-75°С присутствуют представители глубоких филогенетических ветвей филума Crenarchaeota Культивируемые умеренно-термофильные Crenarchaeota являются анаэробными органотрофами, использующими сложные полимерные субстраты

5. Путем сочетания молекулярно-биологических подходов и методов культивирования, выделен представитель нового рода и вида 'Fervidococcus fontis' gen nov, sp nov, относящийся к глубокой филогенетической ветви, до сих пор представленной лишь некультивируемыми организмами. Организмы группы 'Fervidococcus' широко распространены в вулканических местообитаниях с умеренными температурами, где участвуют в деструкции органического вещества в анаэробных условиях

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 А.А Перевалова. А В Лебединский, ЕА Бонч-Осмоловская, Н.А Черных. 2003. Детекция гипертермофильных архей рода Desulfurococcus путем гибридизации с олигонукяеотидными зондами Микробиология, 72 (3) 383-389. 2. A A Perevalova. V.A Svetlichny, IV Kublanov, N A Chernyh, N A Kostnkma, T.P Tourova, BB. Kuznetsov, EA Bonch-Osmolovskaya 2005 Desulfurococcus fermentans sp nov., a new hyperthermophihc archaeon from a Kamchatka hot spring, with an emended description of the genus Desulfurococcus Int J Syst Evol Microbiol 55. 995-999

3 A A Perevalova. A.V Lebedinsky, T V Kolganova, N -K. Birkeland, С Schleper, and E A Bonch-Osmolovskaya The distribution of representatives of Crenarchaeota deep branches in terrestrial hot springs Applied and Environmental Microbiology, submitted

4 IV Kublanov, A A Perevalova, G B. Slobodkma, S.K Bidzhieva, T.V Kolganova, E N Kaliberda, L D Rumsh, T Haertle, E A Bonch-Osmolovskaya Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activity m Uzon Caldera hot springs studied by in situ enrichment method Applied and Environmental Microbiology, submitted.

5 A A Perevalova, AV. Lebedinsky, N.A. Chernyh, EA Bonch-Osmolovskaya Molecular detection of hyperthermophihc Crenarchaeota of the genus Desulfurococcus The 4th International congress "Extremophiles 2002", 22-26 September, Naples, Italy Abstract P38

6 Перевалова А А, Лебединский А В , Черных H A , Бонч-Осмоловская E A. Детекция гипертермофильных архей рода Desulfurococcus с помощью молекулярно-биологаческих методов XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 10-14 февраля, 2003, Москва Тезис 58

7 А.А. Perevalova, A.V Lebedinsky, N.A Chernyh, E.A Bonch-Osmolovskaya Detection of hyperthermophihc Crenarchaeota of the genus Desulfurococcus by hybridization with oligonucleotide probes The 1st FEMS congress of european microbiologists 2003,29-3 June-July, Ljubljana, Slovenia Abstract P4-6

8 A A Perevalova, A.V. Lebedinsky, NA Chernyh, E.A Bonch-Osmolovskaya Desulfurococcus fermentans sp nov., a new hyperthermophihc archaeon from Kamchatka hot spring The International congress "Thermophiles 2003", 15-19 September, Exeter, England. Abstract 109

9 A A Perevalova. A.V Lebedinsky, N.A Chernyh, EA Bonch-Osmolovskaya Cultivation of a representative of novel Crenarchaeota from samples of Lake Baikal region The 5th International congress "Extremophiles 2004", 19-23 September, Baltimore, USA Abstract P124

10 A A Perevalova, AV. Lebedinsky, NA Chernyh, EA Bonch-Osmolovskaya Cultivation of a representative of novel Crenarchaeota from samples of Lake Baikal region Book of abstracts International conference "Archaea 2005", 2-4 June, Hohenkammer Castle Academy, Munich, Germany

11. A A Perevalova, A.V Lebedinsky, N.A. Chernyh, E.A Bonch-Osmolovskaya Detection and cultivation of new Crenarchaoeta from thermal habitats of Russia Book of

abstracts International workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry thermophiles", 2005,20-26 august, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia.

12 A A Perevalova. AV Lebedmsky, N-K Birkeland, EA Bonch-Osmolovska Detection and cultivation of new Crenarchaeota from hot springs of Kamchatka, Russ 2nd FEMS Congress of European Microbiologists, 2006, Madrid, Spain

13 A A Perevalova, A.V Lebedmsky, C Schleper, N-K. Birkeland and EA Bone Osmolovskaya Detection and cultivation of new Crenarchaeota from terrestrial springs The 7th International congress "Thermophiles 2007", 24-27 September 20 Bergen, Norway, oral presentation

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДИ 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 19 09 2007 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ447 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Перевалова, Анна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная детекция и разнообразие Crenarchaeota в наземных горячих источниках"

Актуальность проблемы. Археи филума Crenarchaeota представляют одну из наиболее глубоких филогенетических ветвей прокариот. С момента пионерских исследований Т. Брока (Brock, 1986) в Йеллоустонском Национальном парке в 70-х гг. и последующих работ В. Циллига и К. Штеттера (Zillig et al., 1982; Stetter, 1996) до середины 90-х гг. XX века все представители этого филума формировали небольшую гомогенную группу, представленную гипертермофилами с серным метаболизмом, обитающими только в зонах вулканической активности. В течение последних двух десятилетий в связи с развитием новых молекулярно-биологических подходов, позволяющих детектировать микроорганизмы в природных экосистемах без предварительного культивирования, огромное количество "филотипов" Crenarchaeota было найдено как в "холодных" местообитаниях, так и в морских \ и наземных гидротермах. В связи с таким широким распространением в природных экосистемах представители Crenarchaeota могут вносить значительный вклад в глобальные энергетические циклы (Schleper et al., 2005). Однако физиологические свойства и метаболизм новых линий Crenarchaeota остаются неясными, так как лишь единичные виды удается выделить в чистую культуру или хотя бы получить стабильный рост в лабораторных условиях.

Большой интерес к термофильным прокариотам, и, в частности, к термофильным Crenarchaeota как к представителям наиболее древних филогенетических линий, связан с теориями о происхождении жизни на Земле и с исследованиями механизмов приспособления к существованию при высоких температурах. Фундаментально-научный интерес к уникальным по стабильности биополимерам термофильных прокариот сопровождается интенсивным изучением возможности их практического применения в различных областях биотехнологии и индустрии.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы была молекулярная детекция и идентификация представителей филума Crenarchaeota с помощью олигонуклетидных праймеров и зондов, специфичных к генам 16Б рРНК, а также выделение и характеристика новых представителей Сгепагскаео1а. Основные задачи исследования состояли в следующем:

1. Разработка методов молекулярной детекции представителей филума Сгепагскаео1а.

2. Проведение детекции представителей Сгепагскаео1а в накопительных культурах и природных образцах.

3. Мониторинг накопительных культур Crenarchaeota.

4. Выделение в чистую культуру новых термофильных представителей Сгепагскаео1а,

5. Феноттщическая и филогенетическая характеристика новых изолятов. Научная новизна и значимость работы. Разработаны олигонуклеотидные праймеры для детекции представителей архей филума Сгепагскаео1а и зонды для детекции представителей рода ВеБгй/игососсш. Высокая специфичность праймеров позволяет делать выводы о наличии представителей Сгепагскаеога в накопительных культурах и природных образцах непосредственно по результатам ПЦР-амплификации. С использованием разработанных подходов изучен состав СгепагсНаео1а, населяющих горячие источники полуострова Камчатка, Байкальского региона, о. Кунашир и Исландии. В числе детектированных организмов были близкие как к культивируемым представителям филума Crenarchaeota порядков ОеБи^игососсаШ, Ткегторго1еа1е8, 8иЦо1оЪа\еБ, так и к некультивируемым Сгепагскаео1а. Предлагаемый нами метод молекулярно-биологической детекции гипертермофильных архей рода ОеБШ/июсоссш позволил провести быстрый и достоверный скрининг этих организмов в культурах и природных образцах. На основании совокупности физиологических и филогенетических признаков описан новый вид Desulfurococcus fermentans и дана его полная фенотипическая характеристика. Применение комбинации молекулярно-биологических и культуральных методов позволило культивировать и дать первичную фенотипическую характеристику "Fervidococcus fontis" -представителя новой филогенетической ветви Crenarchaeota, ранее включавшей лишь некультивируемые организмы. Полученные результаты расширяют представления о биоразнообразии термофильных представителей филума Crenarchaeota. Новые организмы могут являться источниками новых ферментов для различных областей биотехнологии.

Практическая значимость. Предложен простой, надежный и чувствительный метод обнаружения архей Crenarchaeota, основанный на ПЦР амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Также предложен надежный и чувствительный метод детекции кренархеот рода Desulfurococcus, основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с олигонуклеотидными зондами. Методы ^спешно применены для детекции и идентификации чистых культур микроорганизмов, детекции Crenarchaeota и, в частности, рода Desulfurococcus в природных образцах и накопительных культурах.

Расширено представление о составе микробных сообществ, участвующих в процессе анаэробного разложения биополимеров в вулканических местообитаниях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: "IVth International Congress on Extremophiles", 2002; "1st FEMS Congress of European Microbiologists", 2003; "International Congress on Thermophiles", 2003; "Vth International Congress on Extremophiles", 2004; "International conference "Archaea", 2005; "International workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", 2005; "2nd FEMS Congress of European Microbiologists", 2006; "International Congress on Thermophiles", 2007; а также на XV международной молодежной зимней школе-конференции, 2003.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ: 2 экспериментальные статьи, 9 тезисов конференций, 2 статьи находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования с обсуждением, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 207 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 171 странице машинописного текста и включают 21 рисунок и 12 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Перевалова, Анна Александровна

134 ВЫВОДЫ

2. Разработан метод идентификации архей рода Desulfurococcus, основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов.

3. Описан новый вид Desulfurococcus fermentans sp. nov. и изменен диагноз рода Desulfurococcus.

4. Установлено, что в источниках с температурами 55-75°С присутствуют представители глубоких филогенетических ветвей филума Crenarchaeota. Культивируемые умеренно-термофильные Crenarchaeota являются анаэробными органотрофами, использующими сложные полимерные субстраты.

5. Путем сочетания молекулярно-биологических подходов и методов культивирования, выделен представитель нового рода и вида lFervidococcus fontis' gen. nov., sp. nov., относящийся к глубокой филогенетической ветви, до сих пор представленной лишь некультивируемыми организмами. Организмы группы lFervidococcus' широко распространены в вулканических местообитаниях с умеренными температурами, где участвуют в деструкции органического вещества в анаэробных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В течение многих лет горячие источники Камчатки, Байкальского региона, Курильских островов и Исландии были источником выделения термофильных микроорганизмов. В разные годы из гидротерм Камчатки и о. Кунашир сотрудниками ИНМИ РАН были выделены органотрофные анаэробные представители Сгепагскаео1а\ ОеяЫ/игососсш атуЫуИсиБ (Бонч-Осмоловская и др., 1988), Ткегтор^еш иготетк (ВопсЬ-Озшо1оузкауа е! а1., 1990), АЫсШоЬш асеИсш (Ргок^еуа е! а1., 2000). В последние годы молекулярно-биологических подходы к исследованию микробного разнообразия были применены и к микробным сообществам гидротерм. Довольно подробно было изучено биоразнообразие наземных и подземных гидротерм Исландии (МагТетзБОп еХ а1., 2001; Ку1з1 е! а1., 200?). Однако молекулярно-биологические данные, характеризующие микробное разнообразие в горячих источниках Камчатки, Байкальского региона и о. Кунашир отсутствовали.

В ходе нашей работы были разработаны новые способы детекции гипертермофильных архей филума Сгепагскаео1а и представителей рода ОейиЩгососсш, которые позволили нам обнаружить эти микроорганизмы в различных природных местообитаниях. Так, с помощью ПЦР с Сгепагскаео1а-специфичными праймерами нам удалось показать, что представители Сгепагскаео1а широко распространены в гидротермах Камчатки, Байкальского региона, Курильских островов, и подтвердить эти данные для гидротерм Исландии. Кроме того, в горячих источниках Камчатки, Исландии и Байкальского региона были детектированы представители глубоких филогенетических ветвей Сгепагскаео1а, присутствие которых приурочено к источникам с температурными характеристиками (57-75°С) слишком низкими для большинства анаэробных гипертермофильных культивируемых Сгепагскаео1а.

С помощью нового способа детекции представителей рода Оеяи1/игососсш нам удалось идентифицировать четыре новых штамма этого рода, выделенные из наземных гидротерм Камчатки и о. Кунашир, которые были отнесены нами к виду D. amylolyticus. Также с помощью нового молекулярно-биологического подхода нами были обнаружены представители этого рода непосредственно в наземных гидротермах Камчатки и прибрежной морской гидротерме о. Кунашир. Эти данные подтверждают сведения о широком распространении органотрофных гипертермофильных архей с кокковидными клетками в наземных гидротермах Дальнего Востока России (Бонч-Осмоловская, Светличный, 1988; Бонч-Осмоловская, Заварзин, 1989). Кроме того, нами был описан новый вид Desulfurococcus fermentans, который оказался способен к росту на ряде полимерных субстратов, таких как целлюлоза и пектин. При этом способность к росту на целлюлозе является уникальным свойством нового организма, т.к. среди гипертермофильных архей не было ранее обнаружено организмов, растущих на целлюлозных субстратах (Sunna, 1997). Таким образом, оказалось, что в род Desulfurococcus, исходно описанный как включающий гипертермофильных архей с серным дыханием, использующих пептиды (Zillig et al., 1982), входят также вид(ы), не нуждающиеся в сере и использующие широкий круг полисахаридов.

Нами был выделен в чистую культуру новый организм "Fervidococcus fontis", филогенетически удаленный от ближайших культивируемых представителей порядка Desulfurococcales (уровень сходства 87-89%), который также оказался органотрофом, способным к росту при температурах значительно ниже нижнего температурного предела роста ранее известных гипертермофильных Crenarchaeota. Эти данные, как и результаты наших исследований природных сообществ горячих источников, говорят о том, что многие «некультивируемые» Crenarchaeota относятся к новой группе "умеренных термофилов".

Комбинация методов культивирования с новыми молекулярно-биологическими подходами в приложении к пробам и накопительным культурам из горячего источника Уринской группы (Байкальский регион) позволила дать первичную фенотипическую характеристику организма, являющегося представителем глубокой филогенетической ветви "некультивируемых" СгепагсИаео1а, ранее представленную клоном рЛЧ1 из к*

Иеллоустонского Национального Парка, также оказавшегося умеренным термофилом и органотрофом.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что представители новой группы умеренно-термофильных СгепагсИаео1а являются органотрофами, участвующими в анаэробной деструкции органического вещества в гидротермах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перевалова, Анна Александровна, Москва

1. Басков Е.А., Суриков С.Н. Гидротермы Земли. Д.: Недра, 1989.

2. Бонч-Осмоловская Е.А., Светличный В.А. 1988. Экстремально-термофильные сероредуцирующие архебактерии // Архебактерии. Сборник научных трудов. Пущино. С. 50-60.

3. Бонч-Осмоловская Е.А., Заварзин Г.А. 1989. Термофильные бактерии, восстанавливающие серу, и формирование ими геохимического барьера. Кальдерные микроорганизмы. М.: Наука. С. 98.

4. Брянская А.В., Намсараев З.Б., Калашникова О.М., Бархутова Д.Д., Намсараев Б.Б., Горленко В.М. 2006. Биогеохимические процессы в альгобактериальных матах щелочного термального Уринского источника //Микробиология 75(5): 702-712.

5. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии. М.: Наука. 1984.

6. Заварзин Г.А. Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука. 1984.

7. Заварзин Г.А., Карпов Г.А. Деятельность микроорганизмов в кальдерах. Кальдерные микроорганизмы. М.: Наука. 1989. С. 3-29.

8. Карпов Г.А. В кальдере вулкана. М.: Наука. 1980.

9. Карпов Г.А. Узон земля заповедная. М.: Логата. 1998. 64 с.

10. Короновский Н.В., Якушова А.Ф. Основы геологии. М. Высшая школа. 1991.420 стр.

11. Майерс Р., Шеффилд В., Кокс Д. Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез. Анализ генома: Методы. М.: Мир, 1990.- С. 123-175.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии. Пер. с англ. М.: Мир, 1984.

13. Милановский Е.Е., 1999. Рифтогенез и его роль в развитии Земли // Соросовский образовательный журнал 8: 60-70.

14. Намсараев З.Б., Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Бархутова Д.Д. 2006. Микробные сообщества щелочных гидротерм. Новосибирск. Издательство сибирского отделения РАН.

15. Семенов В. 1988. В краю горячих источников. Дальневосточное книжное издательство, Камчатское отделение.

16. Слободкин А.В., Бонч-Осмоловская Е.А. 1994. Рост и образование продуктов метаболизма экстремально-термофильными археями рода Desulfurococcus в присутствии и в отсутствие элементной серы // Микробиология 63: 981-985.

17. Слободкина Г.Б., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Бонч-Осмоловская Е.А. 2004. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи рода Sulfophobococcus в метантенке, работающем в термофильном режиме // Микробиология 73: 716-720.

18. Шаталкин А.И. 2004. Высший уровень деления в классификации организмов. Архебактерии, эубактерии и эукариоты // Журнал общей биологии 65:99-115.

19. Allers Т., Mevarech М. 2005. Archaeal genetics the third way // Nat. Rev. Gen. 6: 58-73.

20. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiological Reviews 59: 143-169.

21. Amann R., Ludwig W. 2000. Ribosomal RNA targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology // FEMS Microbiology Review 24: 555-565.

22. Ando S., Ishida H., Kosugi Y., Ishikawa K. 2002. Hyperthermostable endoglucanase from Pyrococcus horikoshii // Applied and Environmental Microbiology 68:430-433.

23. Ashkin A., Dziedzic J.M. 1987. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria // Science 235: 1517-1520.-

24. Barbier G., Godfroy A., Meunier J.-R., Querellou J., Cambon M.-A., Lesongeur F., Grimont P. A. D. & Raguenes G. 1999. Pyrococcus glycovorans sp. nov., a hyperthermophilic archaeon isolated from the East Pacific Rise // Int J Syst Bacterid 49:1829-1837.

25. Barns S.M., Fundyga R.E., Jeffries M.W., and Pace N.R. 1994. Remarkable archaeal diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring environment // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91:1609-1613.

26. Barns, S., Delwiche, C., Palmer, J.D. and Pace, N. 1996. Perspectives on archaeal diversity, thermophily and monophyly from environmental rRNA sequences // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 93 : 9188-9193.

27. Barton H.A., Taylor N.M., Lubbers B.R., Pemberton A.C. 2005. DNA extraction from low-biomass carbonate rock: An improved method with reduced contamination and the low-biomass contaminant database // Journal of Microbiological Methods 66(1): 21-31.

28. Bauer M. W., Driskill L. E., Callen W., Snead M. A., Mathur E. J., Kelly R. M. 1999. An endoglucanase, EglA, from the hyperthermophilic archaeon

29. Pyrococcus furiosus hydrolyzes ß-1,4 bonds in mixed-linkage (1—>3), (1—>4)-ß-D-glucans and cellulose I IJ Bacteriol 181:284-290.

30. Bintrim S.B., Donohue T.J., Handelsman J., Roberts G.P., Goodman R.M. 1997. Molecular phylogeny of archaea from soil // Proceeding of the national Academy of Sciences of the United states of America 94:277-282.

31. Blöchl E., Burggraf S., Fiala G., Lauere G., Huber G., Huber R., Rachel R., Segerer A., Stetter K.O. and Völkl P. 1995. Isolation, taxonomy and phylogeny of hyperthermophilic microorganisms // World Journal of Microbiology & Biotechnology 11: 9-16.

32. Blöchl E., Rachel R., Burggraf S., Hafenbradl D., Jannasch H. W., and Stetter. K. O. 1997. Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of Archaea, extending the upper temperature limit for life to 113°C // Extremophiles 1:14-21.

33. Bonch-Osmolovskaya E.A. 2004. Studies of thermophilic microorganisms at the Institute of Microbiology, Russian Academy of Sciences // Microbiology 73: 551-564. Translated from Mikrobiologiya 73: 644-658.

34. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., van der Noordaa J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // Journal of Clinical Microbiology 28(3): 495-503.

35. Brock T.D. 1986.Thermophiles: General, molecular and applied microbiology // By John Willey & Sons, Inc. USA.

36. Buckley D.H., Graber J.R., Schmidt T.M. 1998. Phylogenese analysis of nonthermophilic members of the kingdom Crenarchaeota and their diversity and abundance in soils // Applied and Environmental Microbiology 64:43334339.

37. Burggraf S., Huber H., & Stetter K.O. 1997. Reclassification of the crenarchaeal orders and families in accordance with 16S rRNA sequence data // Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 657-660.

38. Burns B.P., Goh F., Allen M., Neilan B.A. 2004. Microbial diversity of extant stromatolites in the hypersaline marine environment of Shark Bay, Australia // Environmental Microbiology 6: 1096-1101.

39. Chandler D.L., Stults J.R., Cebula S. et al. 2000. Affinity purification of DNA and RNA from environmental samples with peptide nucleic acid clamps // Applied Environmental Microbiology 66(8): 3438-3445.

40. Chapelle, F.H., O'Neill, K., Bradley, P.M., Methe, B.A., Ciufo, S.A., Knobel, L.L., Lovley, D.R. 2002. A hydrogen-based subsurface microbial community dominated by methanogens // Nature 415:312-315.

41. Cole S.T., Girons I.S. 1994. Bacterial genomics // FEMS Microbial Reviews 14: 139-160.

42. Corpet F. 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering // Nucl. Acids. Res. 16(22): 10881-10890.

43. Dawson S.C., DeLong E.F., Pace N.R. 2006. Phylogenetic and Ecological Perspectives on Uncultured Crenarchaeota and Korarchaeota U The Prokaryotes. V.3. Archaea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Springer New York.

44. Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Liesack W. 2006. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Applied and Environmental Microbiology 72(3): 2110-2117.

45. Degrange V. and Bardin R. 1995. Detection and counting of Nitrobacter population in soil by PCR // Applied and Environmental Microbiology 61(6): 2093-2098.

46. DeLong, E. F., G. S. Wickham, and N. R. Pace. 1989. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells // Science 243: 1360-1363.

47. DeLong, E.F. 1992. Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89: 56855689.

48. Dickson E.M., Riggio M.P., Macpherson L. 2005. A novel species-specific PCR assay for identifying Lactobacillus fermentum II Journal of Medical Microbiology 54:299-303.

49. Farrelly V., Rainey F.A., Stackebrandt E. 1995. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species // Applied Environmental Microbiology 61:2798-2801.

50. Fiala, G., Stetter, K. 0.1986. Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of extremely thermophilic submarine heterotrophic archaeobacteria growing optimally at 100°C // Systematic and Applied Microbiology 8:106— 113.

51. Fisher S.G., Lerman L.S. 1979. Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis// Cell 16:191200.

52. Forterre P. 1996. A hot topic: the origin of hyperthermophiles // Cell 85: 789792.

53. Fox G.E., Magrum L.J., Balch W.E., Wolfe R.S., Woese C.R. 1977. Classification of methanogenic bacteria by 16S ribosomal RNAcharacterization // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:4537-4541.

54. Fuchs, T., Huber, H., Teiner, K., Burggraf, S., Stetter, K. O. 1995. Metallosphaeraprunae sp. nov., a novel metal-mobilizing, thermoacidophilic Archaeum, isolated from a uranium mine in Germany I I Systemataic Applied Microbiology 18, 560-566.

55. Fuhrman J.A., McCallum K., Davis, A.A. 1992. Novel major archaebacterial group from marine plankton // Nature 356:148-149.

56. Fuhrman J.A., Davis A.A. 1997. Widespread archaea and novel bacteria from the deep sea as shown by 16S rRNA gene sequences // Marine Ecology-Progress Series 150: 275-285.

57. Garcia-Martinez J., Rodriguez-Valera F. 2000. Microdiversity of uncultured marine prokaryotes: the SARI 1 sluster and the marine Archaea of Group I // Molecular Ecology 9:935-948.

58. Garrity G.M., Boone D.R., Castenholz R.W. (eds). Bergey's manual of systematic bacteriology. 2nd ed. 2001. // Springer-Verlag. New York, Berlin, Heidelberg.

59. Giovannoni, S.J., DeLong E.F., Olsen G.J., Pace N.R. 1988. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells//Journal of Bacteriology 170: 720-726.

60. Glöckner F.O., Amann R., Alfreider A., Pernthaler J., Psenner R., Trebesius K., Schleifer K.-H. 1996. An in situ hybridization protocol for detection and identification of planktonic bacteria // Systematic and Applied Microbiology 19,403-406.

61. Godon, J.J., Zumstein, E., Dabert P., Habouzit, F., Molettta, R. 1997 Molecular microbial diversity of an anaerobic digestor as determined by small-subunit rDNA sequence analysis // Applied and Environmental microbiology 63:2802-2813.

62. Golovacheva R.S., Karavaiko G.I. 1978. A new genus of thermophilic spore-forming bacteria, Sulfobacillus II Microbiology (Engl. Transl. of Microbiologiia) 47: 658-664.

63. Grosskopf R., Stubner S., Liesack W. 1998. Novel euryarchaeotal lineages detected on rice roots and in the anoxic bulk soil of flooded rice microcosms // Applied and Environmental Microbiology 65: 4983-4989.

64. Gutell R.R. Larsen N., Woese C.R. 1994. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23 S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiological Reviews 58:10-26.

65. Head I.M., Saunders J.R., Pickup R.W. 1998. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms // Microbial Ecology 35: 1-21.

66. Hershberger K.L., Barns S.M., Reysenbach A.-L., Dawson S.C., Pace N.R. 1996. Wide diversity of Crenarchaeota II Nature 384: 420.

67. Hjorleifsdottir S., Skienisdottir S., Hreggvidsson G.O., Hoist O., Kristiansson J.K. 2001. Species composition of cultivated and concultivated bacteria from short filaments in an Icelandic hot spring at 88°C // Microbial Ecology 42: 117-125.

68. Hohn M.J., Hedlund B.P., Huber H. 2002. Detection of 16S rDNA sequences representing the novel phylum "Nanoarchaeota": Indication for a wide distribution in high temperature biotopes // Systematic Applied Microbiology 25:551-554.

69. Huber R., Stoffers P., Cheminee J. L., Richnow H. H., and Stetter. K. O. 1990. Hyperthermophilic archaebacteria within the crater and open-sea plume of erupting Macdonald Seamount // Nature 345: 179-182.

70. Huber G., Stetter K.O. 1991. Sulfolobus metallicus sp. nov., a novel strictly chemolithotrophic thermophilic archaeal species of metal-mobilizers // Syst. Appl. Microbiol 14: 372-378.

71. Huber R., Huber H., Stetter K. O. 2000. Towards the ecology of hyperthermophiles: biotopes, new isolation strategies and novel metabolic properties // FEMS Microbiology Review 24: 615-623.

72. Huber, H., and K. O. Stetter. 2001. Order II: Desulfiirococcales. In: G. Garrity (Ed.) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. SpringerVerlag. New York, NY. 1:179-180.

73. Huber, H., Hohn, M. J., Rachel, R., Fuchs, T., Wimmer, V.C., Stetter, K. O. 2002. A new phylum of Archaea represented by a nanosized hyperthermophilic symbiont // Nature 417: 63-67.

74. Huber J.A., Butterfield D.A., Barossi J.A. 2002. Temporal changes in archaeal diversity and chemistry in a Mid-Ocean Ridge subseafloor habitat // Applied and Environmental Microbiology 68: 1585-1594.

75. Huber H., Hohn M.J., Stetter K.O., and Rachel R. 2003. The phylum Nanoarchaea: present knowledge and future perspectives of a unique form of life // Research in Microbiology 154: 165-171.

76. Huber H., Stetter K.O. 2006. Desulfurococcales II The Prokaryotes. V.3. Archaea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Springer New York.

77. Huber H., Prangishvili D. 2006. Sulfulobales II The Prokaryotes. V.3. Archaea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Springer New York.

78. Hugenholtz P., 2002. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biology 3(2): reviews0003.1-0003.8.

79. Jackson C.R., Langner H.W., Donahoe-Christiansen J., Inskeep W.P., McDermott T.R. 2001. Molecular analysis of microbial community structure in an arsenite-oxidizing acidic thermal spring // Environmental Microbiology 3:532-542.

80. Jannasch H.W., Wirsen C.O., Molyneaux S.J., Langworthy T.A. 1988. Extremely Thermophilic Fermentative Archaebacteria of the Genus Desulfurococcus from Deep-Sea Hydrothermal Vents II Applied and Environmental Microbiology 54: P. 1203.

81. Jukes T.H., Cantor C.R. 1969. Evolution of protein molecules. Pp. 21-123 in H. N. Munro, ed. Mammalian protein metabolism II Academic Press, New York.

82. Jurgens G., Lindstrom K., Saano A. 1997. Novel group within the kingdom Crenarchaeota from boreal forest soil // Applied and Environmental Microbiology 63: 803-805.

83. Kanakratana P., Chanapan S., Pootanakit K., Eurwilaichitr L. 2004. Diversity and abundance of Bacteria and Archaea in the Bor Khlueng hot Spring in Thailand // Journal of Basic Microbiology 44: 430-444.

84. Karavaiko G.I. Golyshina O.V., Troitskii A.V., Valieho-Roman K.M., Golovacheva R.S., Pivovarova T.A. 1994. Sulfurococcus yellowstonii sp. nov., a new species of iron- and sulfur-oxidizing thermoacidophilic archaebacteria // Microbiologiya 63: 668-682.

85. Keough B.P., Schmidt T.M., Hicks R.E. 2003. Archaeal nucleic acids in picoplankton from Great Lakes on three continents // Microbial Ecology 46: 238-248.

86. Kimura H., Sugihara M., Yamamoto H., Patel Bharat K.C., Kato K., Hanada S. 2005. Microbial community in a geothermal aquifer associated with the subsurface of the Great Artesian Basin, Australia // Extremophiles 9:407-414.

87. Klenk H.-P., Spitzer M., Ochsenreiter T., Fuellen G. Phylogenomic of hyperthermophilic Archaea and Bacteria // Biochemical Society Transaction 32: 175-178.

88. Knittel K., Losekann T., Boetius A., Kort R., Amann R. 2005. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps // Applied and Environmental Microbiology 71(1): 467-479.

89. Koch M., Rudolph C., Moissl C., Huber R. 2006. A cold-loving crenarchaeon is a substantial partofa novel microbial community in cold sulphidicmarshwater// FEMS Microbiological Ecology 57: 55-66.

90. Könneke M., Bernhard A.E., de la Torre J.R., Walken C.B., Waterbury J.B., Stahl D.A. 2005. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon // Nature Letters 437: 543-546.

91. Kvist T., Mengewein A., Manzei S., Ahring B.K., Westermann P. 2005. Diversity of thermophilic and non-thermophilic crenarchaeota at 80°C //

92. FEMS Microbiology Letters 244: 61-68. 50./ 7c>0 * / \j 105. Kvist T., Ahring B.K., and Westermann P. 2006: Archaeal diversity in1.elandic hot springs // FEMS Microbial Ecology 59: 71-80.

93. Lane, D. J. 1991. 16S/23 S rRNA sequencing, In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. pp. 115-175.

94. Limauro D., Cannio R., Fiorentino G., Rossi M., Bartolucci S. 2001. Identification and molecular characterization of an endoglucanase gene, celS, from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus // Extremophiles 5:213-219.

95. Makarova K.S., Wolf Y.I., Koonin E.V. 2003. Potential genomic determinants of hyperthermophily//TRENDS in Genetics 19:172-176.

96. Marteinsson, V.T., Hauksdottir, S., Hobel, C.F.V., Kristmannsdottir, H., Hreggvidsson, G.O., and Kristjansson, J.K. 2001a. Phylogenetic diversity analysis of subterranean hot springs in Iceland // Applied and Environmental Microbiology 67:4242-4248.

97. Massana R., DeLong E.F., Pedros-Alio C. 2000. A few cosmopolitan phylotypes dominate planktonic archaeal assemblages in widely different oceanic provinces // Applied and Environmental Microbiology 66: 1777-1787.

98. Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R. 2003. Genus- and species-specific PCR primers for the detection and identification of Bifidobacteria // Current Issues Intest. Microbiology 4: 61-69.

99. McCliment E.A., Voglesonger K.M., O'Day P.A., Dunn E.E., Holloway J.R., and Cary S.C. 2006. Colonization of nascent, deep-sea hydrothermalvents by a novel Archaeal and Nanoarchaeal assemblage // Environmental Microbiology 8:114-125.

100. Mclnerney J.O., Wilkinson M., Patching J.W., Embley T.M., and Powell R. 1995. Recovery and phylogenetic analysis of novel archaeal ribosomal RNA sequences from a deep-sea deposit feeder // Applied and Environmental Microbiology 61:1646-1648.

101. Mehling, A., Wehmeier, U. F., Piepersberg, W. 1995. Nucleotide sequences of Streptomycete 16S ribosomal DNA: towards a specific identification system for Streptomycetes using PCR // Microbiology 141: 2139-2147.

102. Meyer-Dombard D.R., Shock E.L., and Amend J.P. 2005. Archaeal and bacterial communities in geochemically diverse hot springs of Yellowstone National Park, USA // Geobiology 3: 211-227.

103. Miller S.L., Lazcano A. 1996. The origin of life-did it occur at high temperatures? // J. Mol. Evol 41: 689-692.

104. Moré M.I., Herrick J.B., Silva M.C., Ghiorse W.C., Madsen E.L. 1994. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of DNA from sediment // Applied and Environmental Microbioology 60: 15721580.

105. Moyer, C.L., Tiedje, J.M., Dobbs, F.C., and Karl, D.M. 1998. Diversity of deep-sea hydrothermal vent Archaea from Loihi seamount, Hawaii // Deep-Sea Research Part Ii-Topical Studies in Oceanography 45: 303-317.

106. Munson M.A., Nedwell D.B., and Embley M.T. 1997. Phylogenetic diversity of Archaea in sediment samples from a coastal salt marsh // Applied Environmental Microbiology 63: 4729-4733.

107. Muyzer G. 1999. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems // Current Opinion in Microbiology 2: 317-322.

108. Nakagawa S., Takai K., Horikoshi K., Sako Y. 2004. Aeropyrum caminí sp. nov., a strictly aerobic, hyperthermophilic archaeon from a deep-sea hydrothermal vent chimney I I International Journal of Systematic Microbiology 54: 329-335.

109. Nercessian O., Reysenbach A.L., Prieur D., and Jeanthon C. 2003. Archaeal diversity associated with in situ samplers deployed on hydrothermal vents on the East Pacific Rise (13°N) // Environmental Microbiology 5:492502.

110. Niederberger T.D., Ronimus R.S., Morgan H.W. 2007. The microbial ecology of a high-temperature near neutral spring situated in Rotorua, New Zealand // Microbiological Research. In press.

111. Niemi R.M., Heiskanen I., Wallenius K., Lindstrom K. 2001. Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGE analysis of bacterial consortia//Journal of Microbiological Methods 45:155-165.

112. Nikol G.W., Tscherko D., Embley T.M., Prosser J.I. 2005. Primary succession of soil Crenarchaeota across a receding glacier foreland // Environmental Microbiology 7(3): 337-347.

113. Nomura M., Mizushima S., Ozaki M., Traub P., Lowry P.E. 1969. Structure and function of ribosomes and their molecular components // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34: 49-61.

114. Ochsenreiter T., Pfeifer F., Schleper C. 2002. Diversity of Archaea in hypersaline environments characterized by molecular-phylogenetic and cultivation studies // Extremophiles 6(4): 267-274.

115. Ochsenreiter T., Selezi D., Quaiser A., Bonch-Osmolovskaya L., and Schleper C. 2003. Diversity and abundance of Crenarchaeota in terrestrial habitats studied by 16S RNA surveys and real time PCR // Environmental Microbiology 5: 787-797.

116. Pearson A., Huang Z., Ingalls A.E., Romanek C.S., Wiegel J., Freeman K.H., Smittenberg R.H., and Zhang C.L. 2004. Nonmarine crenarchaeol in Nevada hot springs // Applied and Environmental Microbiology 70: 52295237.

117. Pernthaler J., Glöckner F.O., Schönhuber W., Amann R. ? Fluorescence in situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes // In J. Paul (ed.), Methods in Microbiology: Marine Microbiology, vol. 30. Academic Press Ltd, London.

118. Pernthaler A., Pernthaler J., Amann R. 2002. Fluorescence in situ hybridization and catalysed reporter deposition for the identification of marine bacteria // Applied and Environmental Microbiology 68(6): 3094-3101.

119. Pichler T., Amend J., Garey J., Hallock P., Hsia N., Karlen D., McCloskey B., Meyer-Dombard D., Price R. 2006. A natural laboratory to study arsenic geobiocomplexity // EOS 87(23): 221-225.

120. Pley U., Schipka J., Gambacorta A., Jannasch H. W., Fricke H., Rachel R., and Stetter K. O. 1991 .Pyrodictium abyssi sp. nov. represents a novel heterotrophic marine archaeal hyperthermophile growing at 110°C // Syst. Appl. Microbiol. 14:245-253.

121. Preston C.M., Wu K.Y., Molinski T.F., DeLong E.F., 1996. A psychrophilic crenarchaeon inhibits a marine sponge: Cenarchaeum symbiosum gen. nov., sp. nov // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 6241-6246.

122. Reynolds, G. S. 1963.The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electronic microscopy // Journal of Cell Biology 17: 208-212.

123. Reysenbach A.-L., Giver L.J., Wickham G.S., Pace N.R. 1992. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction // Applied Environmental Microbiology 58: 3417-3418.

124. Reysenbach, A.-L., Ehringer, H., and Hershberger, K. 2000a. Microbial diversity at 83 degrees Celsius in calcite springs, Yellowstone National Park:another environment where the Aquificales and "Korarchaeota" coexist // Extremophiles 4: 61-67.

125. Reysenbach, A.-L., Longnecker, K., and Kirshtein, J. 2000b. Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber deployed at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent // Applied and Environmental Microbiology 66:3798-3806.

126. Rieu-Lesme F., Delbés C., Sollelis L. 2005. Recovery of partial 16S rDNA sequences suggests the presence of Crenarchaeota in the human digestive ecosystem // Current Microbiology 51:317-321.

127. Rochelle P.A., Fry J.C., Parkes R.J., Weightman A.J. 1992. DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities // FEMS Microbiological Letters 100: 59-66.

128. Rogers K.L., and Amend J.P. 2005. Archaeal diversity and geochemical energy yields in a geothermal well on Vulcano island, Italy // Geobiology 3: 319-332.

129. Saitou N., Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 4(4): 406-425.

130. Sako, Y., Nomura N., Uchida A., Ishida Y., Morii H., Koga Y., Hoaki T., and Maruyama T. 1996. Aeropyrum pernix gen. nov., sp. nov., a novel aerobic hyperthermophilic archaeon growing at temperatures up to 100°C // Int. J. Syst. Bact. 46:1070-1077.

131. Schäfer T., Schönheit P. 1992. Maltose fermentation to acetate, C02 and H2 in the anaerobic hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus: evidence for the operation of a novel sugar fermentation pathway // Arch Microbiol 158:188-202.

132. Schleper, C„ Holben, W., and Klenk, H.P. 1997. Recovery of Crenarchaeotal ribosomal DNA sequences from freshwater lake sediments // Applied and Environmental Microbiology 63:321-323.

133. Schleper C., Jürgens G., and Jonuscheit M. 2005. Genomic studies of uncultured archaea // Nature Reviews Microbiology 3:479-488.

134. Schönheit, P. and Schäfer, T. 1995. Metabolism of hyperthermophiles // World Journal of Microbiological Biotechnology 11: 26-57.

135. Shrenk M.O., Kelley D.S., Delaney J.R., and Baross J.A. 2003. Incidence and diversity of microorganisms within the walls of an active deep-sea sulfide chimney // Applied and Environmental Microbiology 69: 35803592.

136. Simon H.M., Dodsworth J.A., Goodman R.M. 2000. Crenarchaeota colonize terrestrial plant roots. Environmental Microbiology 2:495-505.

137. Spear J.R., Walker J.J., McCollom T.M., and Pace N. 2004. Hydrogen and bioenergetics in the Yellowstone geothermal ecosystem // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102:25552560.

138. Speksnijder A.G.C.L., Kowalchuk G.A., De Jong S. et al. 2001. Microvariation artifacts introduced be PCR and cloning of closely related 16S rRNA gene sequences // Applied Environmental Microbiology 67(1): 469472.

139. Spiegelman D., Whissell G., Greer C. W. 2005. A survey of the methods for the characterization of microbial consortia and communities // Can. Journal Microbiology 51: 355-386.

140. Stackebrandt E., and Woese C. 1981. The evolution of prokaryotes. // In Molecular and cellular aspects of microbial evolution. Carlise M.J., Collins J.R., and Moseley B.E.B. (eds). Cambridge: Cambridge University press 1-31.

141. Stackenbrandt E., Woese C. R. 1981. Towards a phylogeny of the actinomycetes and related organisms // Curr. Microbiol 5:197-202.

142. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. 1985. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial community by 5S rRNA sequences // Applied and Environmental Microbiology 49: 1379-1384.

143. Stahl D., and Amann R. 1991. Development and application of nucleic acid probes // In: E. Stackebrandt and M. Goodfellow (Eds.), Nucleic acidtechniques in bacterial systematics, John Wiley and Sons, New York, NY, pp. 205-248.

144. Steffan R.J., Goksoyr J., Asim K.B., Atlas R.M. 1988. Recovery of DNA from soils and sediments // Applied and Environmental microbiology 54: 2908-2915.

145. Stein J.L., Marsh T.L., Wu K.Y., Shizuya H., DeLong E.F. 1996. Characterization of incultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment front a planktonic marine archaeon // Journal of Bacteriology 178: 591-599.

146. Stetter K. O., Konig H., and Stackebrandt E. 1983. Pyrodictium gen. nov., a new genus of submarine disc-shaped sulphur reducing archaebacteria growing optimally at 105°C // Syst. Appl. Microbiol. 4:535-551

147. Stetter K. O., and Zillig W. 1985. Thermoplasma and the thermophilic sulfur-dependent archaebacteria II In: C. Woese, and R. S. Wolfe (Eds.) The Bacteria. Academic Press. New York, NY. 8: 100-201.

148. Stetter K.O. Diversity of extremely thermophilic archaebacteria. 1986. // Thermophiles: General, Molecular and Appl. Microbiol, ed Brock T.D. New York: John Wiley & Sons. pp. 40-74.

149. Stetter K.O. 1996. Diversity of extremely thermophilic archaebacteria // Thermophiles. General, molecular, and applied microbiology, edited by T. D. Brock.

150. Sunna A., Moracci M., Rossi M., Antranikian G. 1997. Glycosyl hydrolases from hyperthermophiles // Extremophiles 1:2-13.

151. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. 1996. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR // Applied Environmental Microbiology 62:625-630.

152. Takai, K. and Sako, Y. 1999. A molecular view of archaeal diversity in marine and terrestrial hot water environments // Fems Microbiology Ecology 28:177-188.

153. Takai, K. and Horikoshi, K. 1999. Genetic diversity of archaea in deep-sea hydrothermal vent environments // Genetics 152: 1285-1297.

154. Takai, K., Komatsu, T., Inagaki, F., and Horikoshi, K. 2001. Distribution of archaea in a black smoker chimney structure // Applied and Environmental Microbiology 67: 3618-3629.

155. Triverdi S., Satyawada Rama Rao and Hukam Singh Gehlot. 2005. Nucleic acid stability in thermophilic prokaryotes: a review // Journal of Cell and Molecular Biology 4: 61-69.

156. Ueda T., Suga Y., Matsuguchi T. 1995. Molecular phylogenetic analysis of a soil microbial community in a soybean field // European Journal of Soil Sciences 46:415-421.

157. Van de Peer Y., Chapelle S., Wächter R.D. 1996. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA // Nucleic Acids Research 24: 3381-3391.

158. Van de Peer Y. & De Wächter R. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput Appl Biosci 10,569-570.

159. Van der Maarel M.J., Artz R.R., Haanstra R., Forney L.J. 1998. Association of marine archaea with the digestive tracts of two marine fish species // Applied and Environmental Microbiology 64: 2894-2898.

160. Vetriani C., Jannasch H.W., MacGregor B.J., Stahl D.A., Reysenbach A.L. 1999. Population structure and phylogenetic characterization of marine benthic archaea in deep-sea sediments // Applied and Environmental Microbiology 65: 4375-4384.

161. Wang P., Xiao X., and Wang F. 2005. Phylogenetic analysis of Archaea in the deep-sea sediments of west Pacific Warm Pool // Extremophiles 9:209217.

162. Ward D.M., Bateson M.M., Weller R., Ruff-Roberts A.L. 1992. Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature // Advanced Microbial Ecology 12:219-286.

163. Whitaker R.J., Grogan D.W., Taylor J.W. 2003. Geographic barriers isolate endemic populations of hyperthermophilic archaea // Science 301: 976978.

164. Wiegel J. 1998. Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles // Extremophiles V.2. P. 257-267.

165. Winker, S., Woese, C.R., 1991. A Definition of the domains Archaea, Bacteria and Eucarya in terms of small subunit RNA characteristics // Syst. Appl. Microbiol, vol. 14, no. 4, pp. 305-310.

166. Woese, C.R., and Fox, G.E. 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 74: 5088-5090.

167. Woese C.R. 1987. Bacterial evolution // Microbiological reviews 51(2): 221-271.

168. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. 1990. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya // Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 87:4576-4579.

169. Zillig W., Holz I., and Wunderl S. 1991. Hyperthermus butylicus gen. nov., sp. nov., a hyperthermophilic, anaerobic, peptide-fermenting, facultatively H2S-generating archaebacterium // Int. J. Syst. Bact. 41:169-170.

170. Zuckerkandl E., Pauling L. 1965. Molecules as documents of evolutionary history // Journal of Theoretical Biology 8(2): 357-66.159

Информация о работе

Перевалова, Анна Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярная детекция и разнообразие Crenarchaeota в наземных горячих источниках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы