Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части России

Черобаева, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части России
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части России"

Черобаева Анна Сергеевна

АММОНИЙОКИСЛЯЮЩИЕ БАКТЕРИИ И АРХЕИ В ПОЧВАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ.

Специальность 03.02.03. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з ноя 2011

Москва-2011

4859366

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, молекулярно-биологические исследования проводились в институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и Абердинском университете.

Ведущее учреждение: Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева (РГАУ - МСХА)

Защита диссертации состоится 15 ноября 2011 года в 4 5 ■ аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, д.1, корп. 12, факультет Почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «/У »ОКТЗ2011 года. • .

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, д.1, корп. 12, факультет Почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета:

Научный руководитель:

доктор биологических наук А. Л. Степанов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. Д. Ананьева

доктор биологических наук А. X. Тамбиев

доктор биологических наук, профессор

Г.М. Зенова

Актуальность темы. Деятельность нитрифицирующих микроорганизмов во многом определяет характер протекания других процессов биологического цикла азота в почвах, их активность является одним из важнейших источников нитратов в почве (Кудеяров, 1999).

Последние достижения молекулярной биологии изменили сложившиеся представления о цикле азота, протекающем в почвах и океанах. Есть основание полагать, что существенный вклад в процесс нитрификации вносят не только автотрофные нитрифицирующие бактерии и гетеротрофные микроорганизмы, но также и недавно открытые аммонийокисляющие археи (Коппеке е( а]., 2005). Способность к органотрофному и миксотрофному росту свидетельствует о наличии у них более гибкого механизма адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды по сравнению с нитрифицирующими бактериями, что определяет широкое распространение архей в почвах и морских экосистемах (Ьешш§ег е1 а1., 2006, №со1 е! а1., 2006). Из-за сложности методических приемов идентификации, аммонийокисляющие археи в почвах России до настоящего времени остаются мало исследованы.

Целью работы являлось изучение разнообразия нитрифицирующих бактерий, определение численности аммонийокисляющих бактерий и архей в основных типах почв европейской части России методами молекулярной биологии. Задачи исследования:

• сравнить эффективность известных методов выделения ДНК из почв и разработать собственные модификации. Адаптировать ПЦР и ДГГЭ методы для анализа аммонийокисляющих бактерий и архей в разных типах почв.

• проанализировать разнообразие микробных сообществ аммонийокисляющих бактерий в накопительных культурах и почвенных образцах.

• провести сравнительный анализ численности аммонийокисляющих бактерий и архей в почвах разных типов.

• определить влияние температуры на нитрифицирующую активность в ходе длительной инкубации почвенных микрокосмов.

Научная новизна. С помощью филогенетического анализа сообщества нитрифицирующих бактерий установлено близкое родство клонов из дерпово-

подзолистой и серой лесной почв к роду ИИгояойр^а, из каштановой почвы -Л'/7га90.гр/га и Л';>о,гоу/А/7о| из чернозема типичного - ^'¡(гояотопаз. На основании анализа реал-тайм ПЦР обнаружена тенденция к увеличению количества нитрифицирующих архей в кислых почвах, а бактерий - в почвах с нейтральным и слабощелочным значениями рН. Впервые показано, что во всех исследованных почвах европейской части России доминирует сообщество аммонийокисляющих архей, причем в ненарушенных экоценозах их количество заметно увеличивается; в агроценозах возрастает доля нитрифицирующих бактерий. Показано, что независимо от значений рН среды, в почвах всегда обнаруживаются алкалофильные и ацидофильные архей, но в разных соотношениях. Согласно температурному эксперименту, длительные заморозки влияют на нитрифицирующую активность, в то время как кратковременные заморозки не оказывают существенного воздействия на уровень нитрифицирующей активности почв. Установлено, что бактерии более устойчивы к действию низких температур, а состав сообщества архей резко изменяется после длительных заморозков.

Практическая значимость. Отработаны основные методы детекции ключевого функционального гена нитрифицирующих бактерий и архей с помощью спектра молекулярно-биологических методов. Модифицированы ПЦР и ДГГЭ протоколы для анализа сообщества нитрификаторов в разных типах почв европейской части России. Полученные в настоящей работе последовательности генов атоА депонированы в базе данных СепВапк под номерами 496679-.1Р 496706. Предложенный методический подход позволяет уточнить составляющие баланса биологического азота в почвах, а также изменения характера трансформации азота в почве в условиях меняющегося климата и высокого антропогенного воздействия на почвы, что необходимо при составлении региональных прогнозов устойчивого развития сельского хозяйства. Результаты работы используются в курсах лекций по микробной трансформации азота, читаемых на факультете почвоведения МГУ.

2011), молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 2009), Международной конференции по общей и прикладной микробиологии «ВюМ1сп^огШ2009» (Португалия, 2009).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 3 публикациях, все статьи в реферируемых журналах из списка ВАК, 4 тезисов докладов.

Объем работы: Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из 3 глав, сопровождается 23 иллюстрациями и 6 таблицами. Список литературы включает 156 наименований, из которых 135 на иностранном языке.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. А.Л. Степанову за ценные рекомендации и повседневное внимание к работе, к.б.н. И.К. Кравченко и к.б.н. А.К. Кизиловой за научные консультации и помощь в выполнении работы, сотрудникам Абердинского университета (Шотландия, г. Абердин) - проф. Д. ГТроссеру и Г. Николь за помощь в освоении молекулярно-биологических методов. Отдельная благодарность к.б.н. Е.В. Лебедевой за предоставление культуры СашМаЩв М^озоярИагга gargensís и научно-практические рекомендации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. Объекты и методы исследования.

Работа проводилась на четырех типах почв - дерново-подзолистая, серая лесная, каштановая и чернозем типичный (табл. 1). Образцы отбирались в ненарушенных экоценозах лесной зоны (дерново-подзолистая, серая лесная), степной зоны (чернозем, каштановая) и агроценозах (для всех типов почв).

Для поддержания накопительных культур автотрофпых нитрифицирующих бактерий вносили 0,1 г почвы в стеклянную колбу объемом 200 мл с 50 мл минеральной среды следующего состава (г/л): (МН4)304 - 2; К2НР04 -0,5; №С1 - 2; Ме504-7Н20 - 0,2; Ре504-7Н20 - 0,05; СаС03 - 6; раствор микроэлементов (10.00 мл/100 мл) [19], рН 7,6 (А1е1", 1998). Колбы инкубировали в статических условиях при температуре 25°С в течение 2-4 недель.

Часть экспериментов проводили с почвенными микрокосмами. Для этой этого 10 г предварительно просеянной почвы помещали в 30-ти мл универсальные

флаконы с закручивающимися крышками и увлажняли дистиллированной водой до 30% от ПВ.

Таблица 1. Некоторые характеристики образцов почв, использованных в настоящей работе.

Код образца Место отбора образцов, координаты Срок отбора, глубина Название почвы, материнская порода Растительность рН ВОД С0б Щ. %

Дерново-подзолистая лесной экоценоз (ДПэко) Лесная опытная дача .РГАУМСХА им. К.А.Тимирязева, Москва Сентяб рь 2008 г. 5-10 см Мощнодерновая слабо - и среднеподзолиста я на моренном песке и супеси Смешанный лес 4.6 2.1

Дерново-подзолистая агроценоз (ДП arpo) Полевая станция РГАУМСХА им. К. А. Тимирязева, Москва Мощнодерновая среднеподзолиста я на моренном песке и супеси Бессменный яровой ячмень с 1912 г. 5.3 1.2

Серая лесная лесной экоценоз (СЛ эко) Опытно-полевая опытная станция ИФХиБПП РАН, Пущино,Москов екая область Ноябрь 2008 г. 7-10 см Серая лесная среднесуглиниста я на лессовидном суглинке Вторичный лиственный лес 6.5 2.7

Серая лесная агроценоз (CJI arpo) Пшеница, вариант полевого опыта без удобрений 6.0 1.1

Чернозем степной экоценоз (43 эко) Воронежская область, Таловский район Июнь 2008 г. 5-10 см Типичный чернозем на карбонатных лессовидных суглинках Ковыльно-разнотравно-злаковая степь 6.7 7.2

Чернозем агроценоз (43 arpo) Воронежская область, Таловский район Пшеница, поле без внесения удобрений 6.2 6.5

Каштановая степной экоценоз (КШ эко) Волгоградская область, Ольховс кий р-н,с. Зензеватка, Июль 2008 г. 5-10 см Лугово-каштановая почва на легком суглинке Залежь луговая 6.9 4.1

Каштановая агроценоз (КШ arpo) Волгоградская область,Ольховс кий р-н, с. Зензеватка Каштановая почва на легком суглинке Бессменная пшеница с 2003 г. 5.5 3.4

Температурный эксперимент с заморажнваннем-разморажнваннем микрокосмов проводили с образцами двух почв разного физико-химического состава, сходного рН-7,2, из разных климатических зон. Умеренно-континентальный климат каштановой почвы (2,89 мкг N-N03'/r сут, 0,02 мкг N-NH4+/r, С0бщ 4,9%) характеризуется резким колебанием дневных и ночных температур, а также большой амплитудой колебаний между летними и зимними температурами. Дерновая почва (15,1 мкг N-N037r сут , 1,5 мкг N-NH47r, С01-щ 5,7%) - из умеренного океанического климата с ровным температурным режимом и редкими заморозками (Шотландия, г. Абердин). Проводили два эксперимента, различающихся длительностью инкубации при низкой температуре. 1) Длительное замораживание (2 недели при -10°С) (рис. 1, А). Отбор проб для анализа: до замораживания микрокосмов на 1-е, 5-е, 7-е сутки, после размораживания -трижды в течение 1-х суток, а затем на 2-е, 3-е, 5-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки. 2) Короткие циклы замораживания-размораживания (три последовательных цикла: сутки при -10°С и 2-е суток при +30°С) (рис. 1, Б). Отбор проб для анализа: до замораживания микрокосмов на 1-е, 5-е, 7-е сутки, затем на 1-е и 2-е сутки после размораживания для каждого цикла, и на 7-е, 14-е, 21-е сутки завершающей инкубации.

15 7 1 2 3 5 7 14 21

1 неделя +30°С

3 недели +30°С

2 недели, -10°С

1 неделя +30°С

i i i i / i / i

-10°C

3 недели +30°C

Рис. 1. Схема эксперимента с длинными (А) и короткими (Б) циклами замораживания-размораживания микрокосмов. На рисунке: 1,5,7,... - указаны сроки отбора образцов (сутки) для проведения последующего химического и молекулярного анализа почвы из микрокосмов.

Для определения интенсивности нитрификации, образцы почвы (4 г) помещали в пробирки (50 мл, "Labcare", Великобритания) и добавляли раствор KCl (IM) в соотношении 1:8. Концентрацию нитритов и аммония определяли колориметрически с помощью поточного инъекционного анализа ("FIA star Analyzer", США).

Для выделепня ДНК из накопительных культур микроорганизмов применяли Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). Суммарную ДНК из почв экстрагировали с помощью PowerSoil DNA, руководствуясь инструкциями производителя.

В работе использованы пять методов выделения ДНК из почвенпых образцов, два из которых соответствуют коммерческим протоколам, два -разработкам авторов, в один авторский метод внесены собственные модификации. Метод 1 - коммерческий набор реактивов: ДНК выделяли из почвенного образца массой 0,5 г в соответствии с протоколом производителя Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit («MoBio», США).

Метод 2 - коммерческий набор реактивов. Экстрагировали ДНК из почвенного образца 0,5 г согласно рекомендациям производителя FastDNA spin kit for soil. («Qbiogene», Канада).

Метод 3 - авторский протокол С.Итиса с соавт. (Yeates et al., 1998). Основные положения протокола: Масса почвенного образца - 100 г. Объем экстракционного буфера Tris-HCl (ЮОмМ Tris-HCL, ЮОмМ EDTA, 1,5М NaCl, pH 8,0) - 100 мл. Механическая обработка: 100 г стеклянных шариков (1мм). Центрифугирование на скорости 5,5 об/мин, 2 мин. Химический лизис: 10 мл 10% раствора SDS, при +65°С , 1 час; Tris-HCl 10 мин при 65°С. Преципитация: полиэтиленгликоль (PEG) и 1,6 M NaCl, при комнатной температуре 2 часа. 5 мин на льду, центрифугирование - 30 мин, 16.000 g.

Метод 4 - авторская разработка Р. Гриффитса с соавт. (Griffiths et.al., 2000). Для выделения ДНК использовали почвенный образец массой 0,5 г. Экстракционный СТАВ-буфер - 0,5 мл. Для механической обработки применяли 0,5 г силиконовых шариков (0,5 мм) и центрифугирование на скорости 4,0 об/мин, 30 сек. Очистка от белков: фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1). Преципитация: 1,6 M

полиэтиленгликоль-бООО/NaCl, инкубация в течение ночи при 4°С. Метод 5 - метод Р. Гриффитса с соавт. (Griffiths et.al., 2005) в собственной модификации. К оригинальному протоколу (Griffiths et.al., 2005) добавили этап начальной инкубации почвы и СТАВ-экстракционного буфера - 2 часа на льду (для улучшения качества преципитации ДНК и РНК). Для почв с высоким содержанием гуматов увеличили объем СТАВ-экстракционного буфера до 0,7 мл. Увеличили время механической обработки образцов на центрифуге до 40 сек, на 5,5. об/мин. Использовали коммерческий набор MaxTract High Density ("Qiagen", Великобритания) для улучшения выхода ДНК.

Выделенные препараты почвенной ДНК использовали для амплификации фрагментов 16S рРНК и атоА генов аммонийокисляющих бактерий (АОБ) и архей (АОА) с помощью специфических праймерных систем (табл. 2). Для всех ПЦР реакций объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал однократный ПЦР буфер (17 мМ (NH4)S04, 67 мМ Трис-ПС\, pH 8,8, 2 мМ MgCI2), 4 мкл dNTP, 30 пмоль каждого из праймеров, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы ("Sigma", Великобритания).

Количественный анализ состава сообщества нитрифицирующих бактерий и архей проводили при помощи метода реал-танм ПЦР. Для определения числа копий генов атоА бактерий и архей использовали праймерные системы атоА-\VlamoA-2K (Rotthauwe et al., 1997) и CrenamoA616r/CrenamoA23f (Nicol et al., 2008), соответственно. Для всех ПЦР реакций объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 0,2 мг/мл BSA ("Invitrogen", Великобритания), 0,9 мкМ каждого праймера и 12,5 мкл 2-х кратного QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix ("Qiagen", Великобритания). В каждую пробирку с реакционной смесью добавляли 5 мкл ДНК анализируемых образцов.

Таблица 2. Описание нуклеотидных праймеров и заданных температурно временных условий ПЦР в данной работе.

Группа организмов, гепм-мпшени ПЦР пранмеры Температурно-временные условия проведения ПЦР Источник

Протеобактери и 16S рРНК 34IF/907R 5 мин при 95°С, следующие 12 циклов - 30 с при 94°С, 30 с при 5б°С, 1 мин при 72°С; 25 циклов - 30 с при 92°С, 30 с при 56°С, 1 мин при 72°С; 10 мин при 72°С Muyzeretal., 1993

АОБ 16S рРНК CT0I89f/CT065 4г РЗ/Р2 5 мин при 95°С, следующие 12 циклов - 30 с при 94°С, 30 с при 56°С, 1 мин при 72°С; 25 циклов - 30 с при 92°С, 30 с при 56°С, 1 мин при 72°С; 10 мин при 72°С Kowalchuk et al., 1997 Muyzeretal., 1993

АОБ фрагмент гена атоА атоА- 1F/ атоА-2К 5 мин при 94°С; следующие 35 циклов - 45 с при 94°С, 30 с при 57°С, 1 мин при 72°С; 7 мин при 72°С Rotthauwe et. al., 1997

Crenarchaeota 16S рРНК A 109f/1492 г 771f/957r 5 мин при 95°С; следующие 12 циклов - 30 с при 94°С, 30 с при 57°С, 1 мин при 72°С; 25 циклов - 30 с при 92°С, 30 с при 57°С, 1 мин при 72°С; 2 мин при 72°С Lane, 1991 Ochsenreiter et al., 2003

АОА фрагмент гена атоА CrenamoA23f/ CrenamoA616r 5 мин при 95°С, следующие 12 циклов - 30 с при 94°С, 30 с при 57°С, 1 мин при 72°С; 25 циклов - 30 с при 92°С, 30 с при 57°С, 1 мин при 72°С; 8 мин при 72°С Nicol et al., 2008

ДГГЭ анализ проводили с ампликонами 16S рРНК и атоА генов

аммонийокисляющих бактерий и архей, использовали гели, содержащие 8% (вес/объем) полиакриламида и разные проценты линейного градиента денатурантов - формамида и мочевины (табл. 3). ДГГЭ анализ выполняли на приборе DCode Universal Mutation Detection System ("Bio-RAD", США). Были заданы следующие условия ДГТЭ: электрофорез в 6,5 л 0,5хТАЕ буфере при постоянной температуре 60°С в течение 900 мин и напряжении 75 В. Дальнейшие процедуры окрашивания нитратом серебра выполняли согласно ранее описанной методике (Kowalchuk et al., 1997), для сканирования использовали сканер Epson GT9600.

Таблица 3: Описание используемых праймеров и условий проведения ДГГЭ для каждой группы микроорганизмов.

Группа организмов, гены-мишени ПЦР праймеры ДГГЭ протокол Процент линейного градиента денатураитов

АОБ 16S рРНК CT0189f/CT0654r P3 (357f-GC)/P2(518r) Muyzer et al.,1993 Kowalchuk et al., 1997 35-70%

АОБ фрагмент гена атоА атоА-Х F/amo/l-2RT-TG Rotthauweet. al., 1997 Okano et al., 2004 45-65%

АОА 16S рРНК A109f/1492r 771f/957r-GC Lane, 1991 Ochsenreiter et al., 2003 35-65 %

АОА фрагмент гена атоА CrenamoA23f/Crenamo A616r (без GC клампа) Nicol et al., 2008 15-60%

Метод молекулярного клонирования применяли для анализа состава сообщества нитрифицирующих бактерий. Предварительно очищенные ПЦР продукты использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DH10B с помощью коммерческого набора реактивов pGEM-T Easy vector system I ("Promega", США). Создание клонотеки проводили путем отбора случайным образом 50 колоний с положительной реакцией. Затем для каждой колонии была поставлена ПЦР реакция с универсальными плазмидными праймерами M13F и M13R и наличие вставки оценивали методом агарозного электрофореза. ПЦР-продукт, полученный после амплификации из колонии, очищали с помощью кита Ultra Clean PCR CleanUp ("MO BIO", США) согласно рекомендациям производителя. Секвенирование проводили в сервисной лаборатории с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v. 3 ("Applied Biosystems Inc.", США). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей был проведен с помощью программного пакета BLAST[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST], Редактирование и выравнивание нуклеотидных последовательностей производили при помощи пакета программ редактора BioEdit [http://jwbrown.mbio.ncsu.cdu/BioEdit.html]. Транслированные белковые последовательности обрабатывали с помощью программы TREECONW [http://bioc-www.uia.ac.be/u/yudp/treeconw.html] для

построения дендрограммы, отражающей степень сходства анализируемых и референтных последовательностей гена атоА.

Полученные в настоящей работе последовательности генов атоА были депонированы в базе данных GenBank под номерами JF 496679-JF 496706.

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждения

1. Оптимизация молекулярно-биологических методов для анализа аммонийокисляющих бактерий и архей в зональных почвах.

С целью подбора оптимального протокола для каждого изучаемого типа

почвы мы проверили пять методов выделения ДНК из почвенных образцов. Использование коммерческих реактивов позволило стабильно получать препараты ДНК из всех образцов почв, причем в лесных и степных экоценозах концентрация ДНК достигала от 20 до 30 мкг/г сухой почвы. Менее эффективным этот метод оказался в отношении чернозема типичного и каштановой почвы (табл.4).

Для повышения выхода препарата ДНК из чернозема типичного, применялся метод С. Итиса с соавт. (Yeates et al., 1998) с использованием большой навески почвы, интенсивной механической обработки и длительного периода преципитации ДНК. Метод повысил концентрацию ДНК в препарате из чернозема типичного, но отличался низкой воспроизводимостью и не использовался в дальнейших исследованиях. С помощью метода Р. Гриффитса (Griffiths et al., 2000), известного как способа более мягкой экстракции ДНК с минимизацией механической обработки и щадящего химического лизиса, были получены препараты с высоким содержанием ДНК только из дерново-подзолистой и серой лесной почвы, также из этих почв удалось выделить РНК. Мы предприняли попытку модифицировать метод Р. Гриффитса (Griffiths et al., 2000), изменив процедуры экстракции, гомогенизации и применили коммерческий набор MaxTract High Density ("Qiagen", Великобритания), что в целом увеличило выход ДНК для ряда почв с высоким содержанием гумуса. Особенно успешной наша модификации оказалась в отношении чернозема типичного и серой лесной почвы из ненарушенных экоценозов.

Таблица 4: Значения концентрации препарата ДНК, выделенного разными методами. ________

Код образца Концентрация препарата ДНК (мкг/г сухого веса)

Метод Ia Метод 2Ь Метод 3" Метод 4Г Метод 5Д

ДПэко 10.4 ±9.3 29.3 ± 1.3 18.3 ±0.2 246.7 ±2.5 25.5 ±5.9

ДП arpo 9.8 ±8.7 12.4 ±11.1 13.4 ±2.5 4.3 ±3.8 30.7 ±8.5

СЛ эко 11.2 ± 9.5 21.4 ± 11.9 20.9 ±4.2 13.5 ±7 104.3 ± 10

СЛ arpo 10.6 ±7.2 12.9 ±11.1 14.6 ±2.8 90.0 ±6.3 15.5 ±6.2

43 эко 8.4 ±5.8 15.6 ±9.5 34.7 ±8.1 0.3 ±0.1 35.2 ±3.7

43 arpo 6.9 ± 7.4 10.3 ±7.6 29.5 ±5.0 0.6 ±0.2 66.4 ±2.5

КШ эко 8.6 ±8.3 16.2 ±9.5 23.7 ± 1 26.2 ±6.3 16.3 ±9.2

КШагро 7.9±7.8 12.6±10.03 24.8±2.3 7.3±0.5 5.8±6.7

Представленные нами результаты по эффективности пяти разных методов выделения ДНК показывают, что с помощью коммерческого набора реактивов FastDNA spin kit for soil («Qbiogene», Канада) можно стабильно получать продукт средней концентрации 10-20 мкг/г из всех изучаемых почв, независимо от количества гуминовых кислот, органических веществ, глинистых минералов и уровня рН.

Первым этапом проверки качества препарата ДНК являлся метод «вложенной» или nested PCR на фрагменты рибосомальных генов, он успешно использовался для детекции аммонийокисляющих бактерий из препаратов ДНК, выделенных коммерческим набором реактивов. Метод Р. Гриффитса (Griffiths et al., 2000) и наша модификация давали стабильные продукты для аммонийокисляющих бактерий (рис. 2, Б, Г), но значительную вариабельность сигнала при анализе сообщества аммонийокисляющих архей в почвах, богатых гумусовыми веществами и глинистыми минералами (Рис.2, Ж).

Более чувствительный метод ПЦР для детекции функциональных генов выявил, что способ выделения ДНК не влияет на качество продуктов гена атоА бактерий (Рис.3,А) однако присутствие гуминовых кислот и глинистых минералов ингибирует амплификацию функционального гена архей в черноземе типичном и каштановой почве, независимо от способа выделения ДНК (рис.3, Б, В, Г).

Рис.2. Результаты 2-х этапного «nested» ПЦР анализа фрагмента гена 16S рРНК АОБ (А,Б,В,Г,Д) и АОА (Е,Ж). (А, В, Е) - 1-й этап ПЦР анализа; (Б, Г, Д, Ж) - 2-й этап ПЦР анализа. Для всех: Ч - чернозем типичный, К - каштановая почва, С - серая лесная почва, Д - дерново-подзолистая почва; 1 - агроценоз, 2 - ненарушенный экоценоз; ОК -отрицательный контроль, М - маркер молекулярного веса ДНК (1000 пн), мет. - метод.

В мет.4 Г мет.5

Рис.3. Результаты ПЦР анализа фрагмента функционального гена атоА АОБ (А) и АОА (Б, В, Г). Ч - чернозем типичный, К - каштановая почва, С - серая лесная почва, Д - дерново-подзолистая почва; 1 - агроценоз, 2 - ненарушенный экоценоз; ОК -отрицательный контроль, М - маркер молекулярного веса ДНК (1000 пн), мет. - метод.

Полученные ПЦР - продукты успешно использовались для ДГГЭ анализа 168 рРНК генов (рис. 4). Оказалось, что способ выделения препарата ДНК

значительно влияет на качество ДГГЭ профиля при анализе аммонийокисляющих архей. На диаграмме четко прослеживается уменьшение числа полос и их интенсивности при использовании метода Р. Гриффитса (Griffiths et а!., 2000), по сравнению с коммерческим набором. С другой стороны, независимо от метода, которым выделяли ДНК, продукты амплификации с бактериальными праймерами всегда давали четкие полосы и максимальное разделение ДНК разных микроорганизмов в образце.

с, сг ч, чг к, к2 д, д2

5 Н S - — 5 Г - Д0А

; — ■ Метод

fc , i . .ж

fi -А-

ал ¿* U

АОА

Метод 4,5

АОБ

Сг сг Kj Кг fli Дг 4i Ч2 Метод

. _._........ 12

.*■*-« ...... "

" ЛАС

AUb

Метод 4.5

г каштановая, агроценоз каштановая, экоценоз

■ чернозем.агроценоз чернозем,экоценоз

■ дерново-подзолистая, агроценоз

дерново-подзолистая, экоценоз

■ серая лесная, агроценоз

:: серая лесная, экоценоз

0 5 10

Число полос (осноьано на анализе ликов интенсивности)

Рис.4. Результаты ДГГЭ анализа фрагмента гена 16S рРНК АОБ и АОА с препаратом ДНК, выделенным разными способами. Слева - ДГГЭ профили, справа -диаграмма, построенная на основании анализа пиков интенсивности ДГГЭ полос с помощью Quantity One (version 4.5.0, BioRad). Ч - чернозем типичный. К - каштановая, С - серая лесная, Д- дерново-подзолистая почвы; I - агроценоз, 2 - экоценоз.

Таким образом, анализ сравнительных характеристик разных протоколов

подтверждает правильность использования единого метода выделения ДНК для

анализа сообществ бактерий и архей в разных почвах. Несмотря на значительную

эффективность авторских протоколов в отношении отдельных почв, стабильным и

универсальным методом выделения ДНК для всех почвенных образцов был

признан коммерческий набор реактивов FastDNA spin kit for soil.

2, Сиквенсный и филогенетический анализ клонотек фрагментов гена атоА бактерий, полученных из почвенных образцов и накопительных культур.

Для ПЦР-продуктов были созданы библиотеки клонов фрагментов гена

атоА методом молекулярного клонирования, полученные фрагменты проанализированы методом ферментативной рестрикции и объединены в рестрикционные группы, представители которых были секвенированы, в результате составлено дерево родства по фрагментам функционального гена атоА (рис.5). Работа проводилась на почвенных образцах зональных почв европейской части России и стабильных накопительных культурах нитрификаторов из этих почв, поддерживаемых в течение 1,5 лет. Полученные результаты продемонстрировали значительные различия в составе нитрифицирующих бактериальных сообществ почв различных почвенно-климатических зон. Интересно отметить, что все клоны, выделенные из агроценоза дерново-подзолистой почвы сосредоточены в одном кластере (Кластер 3), а клоны, выделенные из ненарушенного экоценоза присутствуют сразу в трех кластерах. Это указывает на большее разнообразие нитрифицирующих бактерий в лесных фитоценозах, по сравнению с агроценозами. Другой важный вывод основан на встречаемости клонов из накопительных культур в разных кластерах, не сходных с положением клонов почв, из которых они были выделены (как, например, для серой лесной почвы). Данный факт свидетельствует о том, что для более полного анализа сообщества нитрификаторов необходимо проводить параллельный анализ, как почвенных образцов, так и накопительных культур. Установлено, что нитрифицирующие бактерии, представленные в меньшей концентрации в почвах, и не детектируемые методом молекулярного клонирования, могут быть изучены в накопительных культурах, где они представлены в большей концентрации. На основании филогенетического анализа сделан вывод о том, что в кислых почвах присутствуют бактерии рода ИНгозоярка, в нейтральных и слабощелочных почвах - М/гаим/ига, Nitrosov¡Ьr¡o, ННгозотопаз (причем в каштановой почве преобладают бактерии рода ИНго-чозр^га, ЫИгояочЛгю', в черноземе типичном -ИНгозотопаз). Показано, что состав сообщества нитрификаторов в ненарушенных экоценозах более разнообразный, чем в агроценозах.

o.l

. line ultn rod :iiiimon.ia-oxi<!uing bacterium (А1Х>Л747) J— chcSilnul-4-1 37jclicslj)Uf-4-2

Jhmcullured aminoma-oxuH/.ini* bacterium (AAPHVUlM pfl— CHK-4

1 yifroMmbrio sp. RY.iC <AIU№>.>251

— NHrasospira sp. N US 18 ГЛ1ШГ><ХШ) IKK i il Ui red bac loiiii mi CAZft 64.3 7)

p uncultured Kictoriuni

J—— imcuUured umji»on.i»-i)xitH/i!ix!'""cteriuni iAAR23\)08) Ц r- Nitrasaspira muhifonnis (ЛАС25057)

'•[«I--СПК-6

7 - uncullmix*i.) bact^iium (ACY91SS9)

Ь uncultured be la pmteobacU'iiuni I JerbiO-1 1 (AAG3sK4<))

— iuu.uHu.rod ammonin-oxidi/ing bacterium (Л1Ю6*.)414) Nurosospim sp. 1.11 5 (AAM774U1)

Nimisospira 1 tun is (САС82У.4} I unculiuit'd b.'icfeiium ("ACXKMOJ)) 4 imcullured Mirmsoxpint sp. (AAR1S237) p pod/of-forcs t-3

1-utudenlilied bacterium (AAT77735)

-K/iaovp J

I- chfcrno/em-i

i luncultuied bacleriurn < —4uncultrued amпинии-'chernuzem«2

oxidi/iny bficll*

I и,- — NiiiBMiiHOiuis nUrosu {СЧЛСК225К) NhtiKKo/тто.ч ctyotohram (AACt37810)

— с1КЧПО/.еП1-Л jLJ - Iinculluu'j Hinin(>nui-oxiai/.itu:bacUM iutn (CAU')S>156) — Nilraso.spira sp. Nsp2 (AAM77 406) unculfured iSitrosoiiK/H a U s b а с f e ij i ш > (AAUJ 4J 79) Лirrosontomt.\ лр. I > po(Jzol-foros(-4 Nitrt>Minu>nas sp.2

uncultured NUro.sotnontiiiatc-i bacterium iAAi.'J 4 J8J) pori/oi-foresl-2

uncullurc-if bacterium (АССУ5 ( VI) -Nino.sa.spim ьр. WykeS {A11\154J75> unou tin rod NiinxsiKspira чр. <АШ* 17240)

LJ-CUIW

'- СПК-5

hitrvso.\pira sp, Ns;pr> (MM7741К)

uncultured ammonia-oxidizing bacterium (AC 17,7 73.M) unfulfilled im>m«.)jiia-o\idixiiig bacterium (AAPS8S33) :\iln>xo,spira sp. I-n I 3 (AllMS4173) imcultmed mnim>nia-oxidizing bacterium (ACT55326) CI IK-2

« unctfltmv.-i.l Af/miMpfrcf \p. fAAR IS2 3S>

33 ,......цгсу-Гогеч(-.Ч

gray-foresf-1 pod/ol-anro-4

pt»d/.ol-»ji«'o-l

K.iac iv p 2

[Ichcttiuit 1-3 I — —... podzol-ayro-3

M ............ _ |>оЦ/.о1-ацго-2

<)H |— uncultured bacto ' chcsliiul U2

•iuiii (ИАГ.96559)

m cultured ammonia-oxidi/in^ bacterium (AD D6 3747) • Mtmsmpira sp. 'l YM9 (А1Ш6',)921) Aumsospinj sp. 1-5 (CACH236)

FGiacrvp 3

Рис.5. Дендрограмма, построенная на основе анализа транслированных аминокислотных последовательностей фрагмента гена атоА. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. Масштаб соответствует ]0 аминокислотным заменам на 100 аминокислотных остатков. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap"-анализа 500 альтернативных деревьев (значимые значения более 50): Chestnut 4 (СНЕ-4) - каштановая, степь, Chestnut 1 - агроценоз; Podzol-forest (СНЕ-2) - дерново-подзолистая, лес, Podzol-agro - агроценоз; Chernozem (СНЕ-3) -чернозем типичный, степь; Gray-forest (СНЕ-5) - серая-лесная, лес, Gray-forest (СНЕ-6) -степь. СНЕ (2,3,4,5,6) - накопительные культуры.

3. Количественный анализ сообщества аммонийокисляющих бактерий и архей с помощью метода реал-тайм ПЦР.

Анализ методом ПЦР в режиме реального времени показал, что во всех

основных типах почв европейской части России преобладает сообщество

аммонийокисляющих архей. Причем количество архейных генов атоА на один-два

порядка превосходило число бактериальных (табл. 5). Отмечена тенденция к

увеличению содержания архей в ненарушенных экоценозах, а бактерий - в

агроценозах. Численность аммонийокисляющих бактерий наиболее низкая в

дерново-подзолистой и серой лесной почвах, несколько выше в каштановой почве,

наиболее многочисленны бактерии в черноземе типичном.

Таблица 5: Количество копий гена атоА на 1 г почвы, определенное при помощи реал-тайм ПЦР.

Группа организмов Тип почвы (число копий гена атоА)

ДПэко ДП агро СЛ эко СЛ агро 43 эко 43 агро КШ эко КШ агро

АОА 3.05x10s 1.23x10 7.9x10* 7.03x10 2.45x10* 0.97x10 5.94x10 7.55x10

АОБ 1.82x10' 3.02x10* 1.55х1о" 6 4x10 1.55x10 3.66x10 7.93x106 1.4x10

Представленные нами результаты согласуются с ранее опубликованными данными, приведенными в работе М.М. Умарова, A.B. Куракова и A.JL Степанова «Микробиологическая трансформация азота в почве» (Умаров и др., 2007), где также отмечено возрастание количества автотрофных нитрифицирующих бактерий 1-ой фазы в хорошо окультуренных почвах и низкая плотность бактерий в кислых почвах под лесом. Согласно нашим данным, в кислых почвах, на фоне минимальной численности бактерий, возрастает количество аммонийокисляющих архей, это может объяснить высокий уровень нитрификации в кислых почвах европейской части России (рис.6).

Широкое распространение архей в кислых почвах основано на наличии у них более гибкого механизма адаптации по сравнению с бактериями и способности к миксотрофному росту. Резкое снижение численности архей зафиксировано в сельскохозяйственных почвах чернозема типичного, где бактерии более успешно конкурируют за субстрат. Таким образом, с помощью количественного анализа

реал-тайм ПЦР показано, что количество архей возрастает в ненарушенных экоценозах, а бактерий - в агроценозах, разница в соотношении числа бактерий и архей наибольшая в кислых почвах и затем уменьшается по мере увеличения рН почвы. Впервые показано численное преобладание аммонийокисляющих архей во всех основных типах почв европейской части России. Очевидно, что при дальнейшей оценке нитрифицирующей активности в зональных почвах следует учитывать вклад в этот процесс не только автотрофных бактерий и гетеротрофных организмов, но также аммонийокисляющих архей.

ДП эко ДП arpo СЛ эко СЛ arpo 43 эко 43 arpo КШ эко КШ arpo

Рис.6. Сравнительный анализ числа копий гена атоА АОБ и АОА по результатам метода реал-тайм ПЦР. 43 - чернозем типичный, КШ - каштановая почва, СЛ - серая лесная почва, ДП - дерново-подзолистая почва, arpo - агроценоз, эко - ненарушенный экоценоз.

4. Изучение состава сообщества аммонийокисляющих архей на основе ДГГЭ анализа фрагмента функционального гена атоА.

С помощью ДГГЭ анализа функционального гена архей были получены

интенсивные и четко разделенные полосы на геле (рис.7, А). Проводилось

сравнение положения детектированных полос на геле с положением полос ДГГЭ-

маркера, составленного Г. Николь с соавт. ("Nicol et.al., 2008). Анализ показал, что в

каштановой почве доминируют полосы, соответствующие группе архей,

выделяемых исключительно из щелочных почв, но также здесь в виде минорного

компонента присутствует группа «архей из кислых почв» (рис. 7, Б). В дерново-

подзолистой почве детектируется группа архей, представители которой населяют

исключительно кислые почвы с рН ниже 4,9, но также в дерново-подзолистой почве проявляются полосы, соответствующие группе «архей из щелочных почв». Следовательно, независимо от значений рН среды, в почвах всегда присутствуют гены алкалофильных и ацидофильных архей. но в разных соотношениях: в кислых почвах преобладают строго ацидофильные виды, но также есть алкофилы; в щелочных - доминируют алкофильные виды и встречаются ацидофильные архей.

Кэ С, С, Ч„ Д. Чз Щ к.

v i ¿ | , | . Sí

¿. ¡i 1Á :: I |t Ш

VIГ 5i

M Кэ Сэ Ca Ча Дэ Чэ Да Ka

Рис.7. Результаты ДГГЭ анализа АОА с использованием ПЦР-продуктов фрагмента гена атоА (А). Сравнительный анализ (Б) полученных фингерпринтов с полосами маркера - М (Nicol et al., 2008): i-v¡ - основные филогенетические группы АОА (Nicol et al., 2008): vi,i - кластер архей, выделяемых из почв с рН 7.5, ii - рН от 7.5 до 4.9, iii - рН 7.5, iv-v - рН 4.9. ДПэ- дерново-подзолистая почва, лес, ДПа -агроценоз; ; СЛэ - серая лесная почва, лес, CJla - агроценоз; ЧЗэ - чернозем типичный, степь, ЧЗа - чернозем типичный, агроценоз; Кэ - каштановая почва, степь, Ка - агроценоз.

5. Влияние длительных и коротких циклов замораживания-размораживания почвы на нитрифицирующую активность алшонийокисляющих микроорганизмов.

Отработанные методы применялись для анализа изменений в структуре сообщества бактерий и архей в ходе инкубационного эксперимента с длительными и короткими циклами замораживания-размораживания почвы. Актуальность подобного рода эксперимента продиктована ограниченностью сведений об

откликах аммонийокислящих бактерий и архей на резкие понижения температуры, а также участившимися периодами оттепелей и заморозков вследствие глобального потепления климата. Результаты проведенного эксперимента с каштановой и дерновой почвой из двух разных климатических зон (см. описание эксперимента в гл.1) показали, что замораживание почвы на длительный срок повлияло на уровень нитрификации, в то время как циклическое замораживание-размораживание почвы не оказало существенного воздействия на нитрифицирующую активность (рис.8).

Следовательно, молекулярно-биологический анализ проводился только для эксперимента с длительным замораживанием микрокосмов, так как изменения активности здесь были более явными. Были получены ПЦР-продукты из препарата ДНК двух типов почв, с более четкой детекцией фрагмента гена атоА в дерновой почве. ДГГЭ анализ не выявил различий в составе сообщества бактерий после длительного замораживания почвы (рис.9, А, В). Однако длительная заморозка значительно повлияла на состав сообщества архей, причем только в дерновой почве (рис.9, Г). На ДГГЭ профиле четко прослеживается выпадение целых групп архей после замораживания микрокосмов, также изменяется состав сообщества в контроле на фоне длительной инкубации при положительной температуре. При этом состав сообщества аммонийокисляющих бактерий не изменялся.

П П П Pie Pie Pie Pie Р Р Р Р Р Р 1с 5с 7с (2ч) (6ч| (12ч) (24ч) 2с Зс 5с 7с 14с 21с

почва УКК — почва УОК

кош роль -УОК

Время (сутки)

П П П Ц1 Ц1 Ц2 Ц2 Ц3 Ц3 Р Р Р 1с 5с 7с 1с 2с 1с 2с 1с 2с 7с 14с 21с Время (сутки)

почиа УКК ■ • - почва УОК —•—контроль УКК —•— контроль УОК

Рис.8. Изменение нитрифицирующей активности в ходе эксперимента с длительными (А) и короткими циклами замораживания-размораживания (Б) почвы. УКК - каштановая почва (из умеренного океанического климата), УОК - дерновая почва (из умеренного океанического климата); П - предъинкубационный период до замораживания почвы; Ц - номер цикла замораживания-размораживания; Р -размораживание почвы при +30°С после последнего цикла; 1с, 5с, 7с...-обозначены сроки отбора образцов.

12345 12345

Рис.9. Результаты ДГГЭ анализа фрагментов гена атоА аммонийокисляющих бактерий (А, В) и архей (Б, Г) в микрокосмах каштановой почвы (А, Б) и дерновой почвы (В, Г): 1 - образец, взятый перед началом эксперимента с замораживанием почвы, 2 — первая неделя после воздействия холодом, 3 - две недели после воздействия холодом, 4 - образец, взятый перед началом установки контрольных микрокосмов, 5 - последняя неделя инкубации контрольных микрокосмов.

ВЫВОДЫ

для анализа сообщества нитрифицирующих архей и бактерий в почвах европейской части России.

2. Показано, что в дерново-подзолистой и серой лесной почвах среди аммонийокисляющих бактерий доминируют представители рода Nitrosospira, в каштановой почве - Nitrosospira и Nitrosovibrio, в черноземе типичном -Nitrosomonas.

3. Впервые установлено количественное преобладание генов нитрифицирующих архей в основных типах почв европейской части России. Отмечена тенденция к увеличению количества нитрифицирующих архей в почвах ненарушенных экоценозов, а бактерий - в агроценозах.

4. Доля нитрифицирующих архей наиболее высока в кислых почвах (pH 4.5-5.5); по мере роста pH увеличивается численность аммонийокисляющих эубактерий.

5. Обнаружена разная устойчивость нитрифицирующих архей и бактерий к воздействию низких температур: бактерии более устойчивы к резким колебаниям температуры, а состав сообщества архей в этих условиях значительно меняется, особенно в почвах, не подверженных продолжительным заморозкам.

6. При анализе нитрифицирующей активности в почвах России, предложено наряду с традиционными микробиологическими, применять и молекулярно-биологические методы для оценки вклада в процесс нитрификации не только автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов, но также нитрифицирующих архей. Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Черобаева A.C., Кизилова А.К., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Молекулярный анализ разнообразия нитрифицирующих бактерий в почвах лесной и степной зоны европейской части России // Микробиология, 2011, V. 80, № 3, с. 389-395. 2.Черобаева A.C., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Сравнительный анализ эффективности методов выделения почвенной ДНК для изучения разнообразия аммонийокисляющих бактерий и архей методом ПЦР-ДГГЭ // Вестник Московского университета, 2011, Сер. 17, № 2, с. 9-17.

3. Черобаева A.C., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Отклик аммонийокисляющих бактерий и архей на резкие изменения температуры в почвах разных климатических зон // Проблемы агрохимии и экологии, 2011, № 3, с. 17-24.

4. Черобаева A.C., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Нитрифицирующие микроорганизмы в почвах европейской части России // Материалы V Международной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», изд-во Макс-Пресс, 2009,с. 90-91.

5. Черобаева A.C., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Разнообразие нитрифицирующих микроорганизмов в разных типах почв европейской части России // Материалы III международной конференции окружающей, индустриальной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld», изд-во BioMicroWorld, 2009, с. 224.

6. Черобаева A.C., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Состав сообщества нитрифицирующих микроорганизмов в накопительных культурах и почвах европейской части России // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010», изд-во Макс-Пресс, 2010, с. 80.

7. Черобаева A.C., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Количественный анализ сообщества нитрифицирующих бактерий и архей в почвах европейской части России // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2011», изд-во Макс-Пресс, 2011, с. 90-91.

Подписано в печать:

10.10.2011

Заказ № 6024 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черобаева, Анна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Особенности биохимии, физиологии и экологии нитрифицирующих бактерий и архей.

1.1. Физиолого-биохимические особенности нитрификаторов.

1.2. Филогения и экология нитрифицирующих микроорганизмов.

1.3. Молекулярно-биологические методы исследования аммоний-окисляющих микроорганизмов.

1.4. Влияние экологических факторов среды на активность и состав сообществ аммонийокисляющих бактерий и архей в почвах.

1.5. Роль нитрификации в образовании окислов азота.

1.6. Вклад аммонийокисляющих архей в процесс нитрификации в разных типах почв.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение и поддержание накопительных культур аммонийокисляющие бактерий.

2.2.2. Установка микрокосмов.

2.2.3. Постановка эксперимента с замораживанием-размораживанием микрокосмов.

2.2.4. Определение интенсивности нитрификации в почве.

2.2.5. Методы выделения препарата ДНК из почвенных образцов.

2.2.6. Амплификация фрагментов генов 168 рРНК и атоА.

2.2.7. Количественный ПЦР анализ (реал-тайм ПЦР).

2.2.8. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле (ДГТЭ).

2.2.9. Клонирование и секвенирование

2.2.10. Анализ нуклеотидных и белковых последовательностей.

2.2.11. Депонирование полученных последовательностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Анализ состава и численности аммонийокисляющих бактерий и архей в разных типах почв.

3.1. Оптимизация молекулярно-биологических методов для анализа аммонийокисляющих бактерий и архей в зональных почвах.

3.1.1. Сравнительный анализ концентраций ДНК в препаратах, выделенных разными методами.

3.1.2. ПЦР анализ фрагментов генов 16S рРНК и атоА аммонийокисляющих бактерий и архей.

3.1.3. ДГГЭ анализ фрагментов гена 16S рРНК аммонийокисляющих бактерий и архей из препаратов ДНК, полученных разными методами.

3.1.4. Подбор оптимальных условий ДГГЭ анализа фрагмента функционального гена атоА аммонийокисляющих бактерий.

3.2. Анализ состава сообщества аммонийокисляющих бактерий методом молекулярного клонирования.

3.3. Количественный анализ сообщества аммонийокисляющих бактерий и архей с помощью реал-тайм ПЦР.

3.4. Изучение состава сообщества аммонийокисляющих архей на основе ДГГЭ анализа фрагмента функционального гена amo А.

3.5. Влияние изменения температуры на нитрифицирующую активность и состав сообщества нитрификаторов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части России"

Последние достижения молекулярной биологии изменили сложившиеся представления о цикле азота, протекающем в почвах и океанах. Есть основание полагать, что существенный вклад в процесс нитрификации вносят не только автотрофные нитрифицирующие бактерии и гетеротрофные микроорганизмы, но также и недавно открытые аммонийокисляющие археи (Кбппеке е! а1., 2005). Способность к органотрофному и миксотрофному росту свидетельствует о наличии у них более гибкого механизма адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды по сравнению с нитрифицирующими бактериями, что определяет широкое распространение архей в почвах и морских экосистемах (Ьеншщег е! а1., 2006, №со1 е1 а1., 2006). Из-за сложности методических приемов идентификации, аммонийокисляющие археи в почвах России до настоящего времени остаются мало исследованы.

Задачи исследования:

• провести сравнительный анализ численности аммонийокисляющих бактерий и архей в почвах разных типов. определить влияние температуры на нитрифицирующую активность в ходе длительной инкубации почвенных микрокосмов.

Научная новизна. С помощью филогенетического анализа сообщества нитрифицирующих бактерий установлено близкое родство клонов из дерново-подзолистой и серой лесной почв к роду ЫШ*0505р1га, из каштановой почвы - ЫИгоБОзргга и ЫИгояоу^гю, из чернозема типичного - ЫОгоБотопаБ. На основании анализа реал-тайм ПНР обнаружена тенденция к увеличению количества нитрифицирующих архей в кислых почвах, а бактерий — в почвах с нейтральным^ и слабощелочным значениями рН. Впервые показано, что во всех исследованных почвах европейской части России доминирует сообщество аммонийокисляющих архей, причем в ненарушенных экоценозах их количество заметно увеличивается; в агроценозах возрастает доля нитрифицирующих бактерий. Показано, что независимо от значений рН среды, в почвах всегда обнаруживаются алкалофильные и ацидофильные архей, но в разных соотношениях. Согласно температурному эксперименту, длительные заморозки влияют на нитрифицирующую активность, в то время как кратковременные заморозки не оказывают существенного воздействия на уровень нитрифицирующей активности почв. Установлено, что бактерии более устойчивы к действию низких температур, а состав сообщества архей резко изменяется после длительных заморозков.

Практическая значимость. Отработаны основные методы детекции ключевого функционального гена нитрифицирующих бактерий и архей с помощью спектра молекулярно-биологических методов. Модифицированы ПЦР и ДГГЭ протоколы для анализа сообщества нитрификаторов в разных типах почв европейской части России. Полученные в настоящей работе последовательности генов атоА депонированы в базе данных СепВапк под номерами Л7 496679—Л7 496706. Предложенный методический подход позволяет уточнить составляющие баланса биологического азота в почвах, а 5 также изменения характера трансформации азота в почве в условиях меняющегося климата и высокого антропогенного воздействия на почвы, что необходимо при составлении региональных прогнозов устойчивого развития сельского хозяйства. Результаты работы используются в курсах лекций по микробной трансформации азота, читаемых на факультете почвоведения МГУ.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2011» (МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 2009, 2011), молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 2009), Международной конференции по общей и прикладной микробиологии «ВюМкто\Уогк!2009» (Португалия, 2009).

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. А.Л. Степанову за ценные рекомендации и повседневное внимание к работе, к.б.н. И.К. Кравченко и к.б.н. А.К. Кизиловой за научные консультации и помощь в выполнении работы, сотрудникам Абердинского университета (Шотландия, г. Абердин) -проф. Д. Проссеру и Г. Николь за помощь в освоении молекулярно-биологических методов. Отдельная благодарность к.б.н. Е.В. Лебедевой за предоставление культуры СапсИёаШБ ШЬ'ояоБркаега gargensis и научно-практические рекомендации.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Черобаева, Анна Сергеевна

выводы

1. Адаптированы для работы с почвами разных типов основные методы молекулярно-биологической детекции ключевого функционального гена аммонийокисляющих бактерий и архей. Модифицированы ПЦР и ДГТЭ протоколы для анализа сообщества нитрифицирующих архей и бактерий в почвах европейской части России.

4. Доля нитрифицирующих архей наиболее высока в кислых почвах (pH 4.55.5); по мере роста pH увеличивается численность аммонийокисляющих эубактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черобаева, Анна Сергеевна, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах. Москва: Мир, 1994, Т. 1, с. 517.

2. Виноградский С.Н. Нитрификация. Микробиология почвы. Проблемы и методы. М.: Изд-во Ан СССР, 1952, с. 145-321.

3. Головачева P.C. Термофильные нитрифицирующие бактерии горячих источников // Микробиология, 1976, Т. 45, с. 377-379.

4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002, с. 589.

5. Заварзин Г.А., Литотрофные микроорганизмы. М.: Наука, 1972, с. 322.

6. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия, 1980, Т. 45, с. 644-651

7. Касимов Н.С., Клиге Р.К. современные глобальные изменения природной среды. М.: Научный мир, 2006, Т. 1, с. 695.

8. Кондратьева E.H. Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ, 1996, с.312.

9. Кураков A.B., Попов А.И. Нитрифицирующая активность и фитотоксичность почвенных микроскопических грибов // Почвоведение, 1995, № 3, с.314-322.

10. Кураков A.B., Попов А.И., Евдокимов И.В., Култышева Е.М. Нитрифицирующая активность микроскопических грибов на питательных средах и в почве // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 17, Почвоведение, 1995, № 1,с. 54-62.

11. Кураков A.B., Евдокимов И.В., Попов А.И. // Гетеротрофная нитрификация в почвах // Почвоведение, 2001, № 10, с.45-55.

12. Лебедева Е.В., Ляликова H.H., Бугельский Ю.Ю. Участие нитрифицирующих бактерий в выветривании серпентинизированных ультрабазитов//Микробиология, 1978, Т. 47, № 6, с. 1101-1107.

13. Ляликова Н.Н., Лебедева Е.В. Хемосинтез: К 100-летию открытия С.Н.Виноградским. М.: Наука, 1989, с.32-47.

14. Муравин Э.А. Ингибиторы нитрификации. М.: Агропромиздат, 1989, с. 248.

15. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. М.: Наука, 2005, Т. 1, с. 68-90.

16. Степанов А.Л., Судницын И.И., Умаров М.М, Галиманге Б. Влияние плотности почв и давления почвенной влаги на эмиссию закиси азота и диоксида углерода//Почвоведение, 1996, № 11, с. 1337 1340.

17. Степанов А.Л., Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. М.: МАКС Пресс, 2002, с. 86.

18. Степанов А.Л. Микробное образование и поглощение парниковых газов в почвах. М.: Изд-во МГУ, 2009, с. 225.

19. Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическая трансформация азота в почвах. М.: ГЕОС, 1997, с. 137.

20. Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Отклик аммонийокисляющих бактерий и архей на резкие изменения температуры в почвах разных климатических зон // Проблемы агрохимии и экологии, 2011, № 3, с. 17-24.

21. Adair K.L., Schwartz Е. Evidence that ammonia-oxidizing archaea are more abundant than ammonia-oxidizing bacteria in semiarid soils of Northern Arizona, USA // Microbiol Ecol, 2008, V. 56, № 3, p. 420-426

22. Alef K. Enrichment of physiological groups // Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry/Eds. Alef K., Nannipieri P. Acad. Press, 1998, p.130-132.

23. Arbeli Z., Fuentes C.L. Improved purification PCR amplification of DNA from environmental samples // FEMS Microbiol. Lett, 2007, V 272, № 2, p. 269275.

24. Avrahami S., Conrad R. Patterns of Community Change among Ammonia Oxidizers in Meadow Soils upon Long-Term Incubation at Different Temperatures110

25. Appl. Environ. Microbiol, 2003, V. 69, № 10, p. 6152-6154.

26. Avrahami S., Conrad R., Braker G. Effect of soil ammonium concentration on N20 release and the community structure of ammonia oxidizers and denitrifiers // Appl. Environ. Microbiol, 2002, V. 68, № 11, p. 5685-5692.

27. Avrahami S., Liesack W., Conrad R. Effects of temperature and fertilizer on activity and community structure of soil ammonia oxidizers // Environ. Microbiol, 2003, V. 5, p. 691-705.

28. Avrahami S., Conrad R. Cold-temperate climate: a factor for selection of ammonia oxidizers in upland soil? // Can J Microbiol., 2005, V. 51, № 8, p.709-714.

29. Bartossek R., Nicol G., Lanzen A., Klenk H.-P., Schleper C. Homologues of nitrite reductases in ammonia-oxidizing archaea: diversity and genomic context // Environ. Microbiol, 2010, V.12, № 4, p. 1075-1088.

30. Bell S.D., Jackson S.P. Transcription and translation in Archaea: a mosaic of eukaryal and bacterial features // Trends Microbiol, 1998, V. 6, p. 222-228.

31. Berg I.A., Kockelkom D., Buckel W., Fuchs G. A 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilation pathway in archaea // Science, 2007, V. 318, p. 1782-1786.

32. Berg I.A., Kockelkom D., Buckel W., Fuchs G. Response to comment on "A 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilation pathway in archaea" // Science, 2008, V. 321, p. 342-348.

33. Berg I.A., Kockelkom D., Ramos-Vare W.H., Say R.F., Zarzycki J., Hügler M., et.al. Autotrophic carbon fixation in archaea // Nat. Rev. Microbiol, 2010, V. 8, p. 447-460.

34. Bintrim S.B., Donohue T.J., Handelsman J., Roberts G.P., Goodman R.M. Molecular phylogeny of Archaea from soil // Proc. Natl.Acad. Sci, USA, 1997, V. 94, p. 277-282.

35. Bodelier P., Libochant J.A., Blom C., Laanbroek H.J. Dynamics of nitrification and denitrification in root-oxygenated sediments and adaptation of ammonia-oxidizing bacteria to low-oxygen or anoxic habitats //Appl Environ111

36. Microbiol., 1996, V. 62, № 11, p. 4100-4107.

37. Bodelier PL, Frenzel P. Contribution of methanotrophic and nitrifying bacteria to CH4 and NHU+ oxidation in the rhizosphere of rice plants as determined by new methods of discrimination // Appl Environ Microbiol., 1999, V. 65, № 5, p. 1826-33.

38. Brochier-Armanet C., Boussau B., Gribaldo S., Forterre P. Mesophilic Crenarchaeota: proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarchaeota // Nat. Rev. Microbiol, 2008, V. 6, № 3, p. 245-252.

39. Buckley D.H., Graber J.R. Schmidt T.M. Phylogenetic analysis of nonthermophilic members of the kingdom crenarchaeota and their diversity and abundance in soils // Appl. Environ. Microbiol, 1998, V. 64, p. 4333-4339.

40. Chu H, Fujii T, Morimoto S, Lin X, Yagi K, Hu J, Zhang J. Community structure of ammonia-oxidizing bacteria under long-term application of mineral fertilizer and organic manure in a sandy loam soil // Appl Environ Microbiol., 2007, V. 73, p. 485-491.

41. Crump B.C., Baross J.A. Archaeaplankton in the Columbia River, its estuary and the adjacent coastal ocean, USA // FEMS Microbiol Ecol., 2000, V. 31, p. 231-239.

42. Cultivation of a thermophilic ammonia-oxidizing archaeon synthesizing crenarchaeol // Environ. Microbiol, 2008, V. 10, № 1, p. 810-818.

43. DeLong E.F. Archaea in coastal marine environment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, V. 89, № 12, p. 5685-5689.

44. Di H.J., Cameron K.C., Shen J.P., Winefield C.S., O'Callaghan M., Bowatte S. et al. // Nitrification driven by bacteria and not archaea in nitrogen-rich grassland soils. Nat Geosci, 2009, V. 2, p. 621-624.

45. Di H., Cameron K., Shen J., Winefield C., O'Callaghan M., Bowatte S., He J. Ammonia-oxidizing bacteria and archaea grow under contrasting soil nitrogen conditions // FEMS Microbiol. Ecol, 2010, V. 64, p. 167-174.

46. Dispirito A.A., Lipscomb J.D., Hooper A.B. A three-subunit cytochrome aa3 from Nitrosomonas europaea II J. Biol. Chem, 1986, V. 261, № 36, p. 1704817056.

47. Dorador C., Busekow A., Vila I., Imhoff J.F., Witzel K.P. Molecular analysis of enrichment cultures of ammonia oxidizing from the Salar de Huasco, a high altitude saline wetland in northern Chile // Extremophiles, 2008, V. 12, p. 405-414

48. Erguder T.H., Boon N., Wittebolle L., Marzorati M., Verstraete W. Environmental factors shaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea //FEMS Microb, 2009, V. 33, № 5, p. 855-869

49. Fierer N., Carney K.M., Horner-Devine M.C., Megonigal J.P. The biogeography of ammonia-oxidizing bacterial communities in soil // Microb Ecol., 2009, V. 58, p. 435-445.

50. Fischer S.G., Lerman L.S. Separation of random fragments of DNA according to properties of their sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, V. 77, p. 4420-4424

51. Fischer S.G., Lerman L.S. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, V. 80, p. 1579-1583

52. Fliermans C.B., Bohlool B.B., Schmidt E.L. Autecological study of the113chemoautotroph Nitrobacter by immunofluorescence // Appl. Environ. Microbiol, 1974, V. 27, № 9, P. 124-129.

53. Freitag T.E., Chang L., Prosser J.I. Changes in the community structure and activity of betaproteobacterial ammonia-oxidizing sediment bacteria along a freshwater-marine gradient // Environ Microbiol, 2006, V.8, p. 684-696.

54. Fuhrman J.A., McCallum K., Davis A.A. Novel major archaebacterial group from marine plankton // Nature, 1992, V. 356, p. 148-149.

55. Garrett R.A., Klenk H.P. Archaea: Evolution, Physiology, and Molecular Biology//Blackwell Publishing. Singapore. 2007, p. 95-107.

56. Hastings R.C., Butler C, Singleton I., Saunders J.R., McCarthy A.J. Analysis of ammonia-oxidizing bacteria populations in acid forest soil during conditions of moisture limitation //Appl. Microb, 2000, V.30, № 5, p. 14-18.

57. Hatzenpichler R., Lebecleva E.V, Spieck E., Stoecker K., Richter A., Daims H., Wagner M. A moderately thermophilic ammonia-oxidizing crenarchaeote from a hot spring // P Natl Acad Sci USA, 2008, V. 105, p. 2134-2139.

58. Herndl G.J., Reinthaler T., Teira E., van Aken H., Veth C., Pernthaler A., Pernthaler J. Contribution of Archaea to procariotic production in the deep Atlantic Ocean//Appl. Environ. Microbiol, 2005, V. 71, p. 2303-2309.

59. Herrick J.B., Miller D.N., Madsen E.L., Ghiorse W.C. Extraction, purification, and amplification of microbial DNA from sediments and soils // PCR: Essential Techniques, Burke J.F., Ed., New York: John Wiley and Sons, 1996, p. 130-133.

60. Holben W.E. Isolation and purification of bacterial DNA from soil //Methods of Soil Analysis, part 2."Microbiological and Biochemical Properties, Weaver R.W., Angle S., Bottomley P., et al., Eds., Madison, 1994, p. 727-751.

61. Hommes N. G., Sayavedra-Soto L.A., Arp D.J. Mutagenesis of hydroxylamine oxidoreductase in Nitrosomonas europaea by transformation and recombination // J. Bacterid, 1996, V.178,№ 13, p. 3710-3714.

62. Hommes N.G., Sayavedra-Soto L.A., Arp D.J. Mutagenesis and expression of amo, which codes for ammonia monooxygenase in Nitrosomonas europaea I I J. Bacterid, 1998, V. 178, № 14, p. 3710-3714.

63. Inceoglu O., Hoogwout E.F., Hill P., van Elasas J.D. Effect of DNA extraction method on the apparent microbial diversity of soil // Appl. Environ. Microbiol, 2010, V. 6, № 19, p. 3378-3382.

64. Jia Z., Conrad R. Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil // Environ Microbiol., 2009, V. 11, № 7, p. 1658-71.

65. Jones R.D., Morita R.Y. Low temperature growth and whole cell kinetics of a marine ammonium oxidizer // Mar. Ecol.-Prog. Ser, 1985, V. 21, p. 230-243.

66. Keough B.P., Schmidt T.M., Hicks R.E. Archaeal nucleic acids in picoplankton from great lakes on three continents // Microb Ecol., 2003", V.46, № 2, p. 238-248.

67. Killham K. Heterotrophic nitrification. // Nitrification. Special publications of the society of general microbiology. V. 20 / Ed. Prosser J.It Oxford: IRL Press, 1986, V. 36, p. 117-126.

68. Kitano T., Onoue T., Yamauchi K. Archaeal lipids forming a low energy-surface on airwater interface // Chemistry and Physics of Lipids, 2003, V. 126, p. 225-232.

69. Koops Y.-P., Pommerening-Rnser A. Distribution« and ecophysiology of nitrifying bacteria emphasizing cultured species // FEMS Microbiol. Ecol, 2001, V. 37, p. 1-9.

70. Konneke M., Bernhard A.E., de la Torre J.R., Wolker C.B., Waterbury J.B., Stahl D.A. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon // Nature, 2005, V. 437, p. 543-546.

71. Kurakov A.V., Kupletskaia M.B., Skrynnikova E.V., Somova N.G. Search116for micromycetes producers extracellular catalaze and study of conditions of its synthesis // Prikl Biokhim Mikrobiol., 2001, V. 37, № 1, p. 67-72.

72. Kurganova I., Teepe R., Loftfield N. Influence of freeze-thaw events on carbon dioxide emission from soils at different moisture and land // Carbon Balance and Management, 2007, V. 2, № 2, p. 1-9.

73. Kuske C.R., Banton K.L., Adorada D.L., et al. Small-Scale DNA sample preparation method for field PCR detection of microbial cells and spores in Soil // Appl. Environ. Microbiol, 1998, V. 64, p. 2463-2472.

74. Lebedeva E.V., Alawi M., Fiencke C., Namsaraev B., Bock E., Spieck E. Moderately thermophilic nitrifying bacteria from a hot spring of the Baikal rift zone // FEMS Microbiol Ecol, 2005, V. 54, № 2, p. 297-306.

75. Leininger S., Urich.T., Schloter M., Schwark L., Qi J., NicoFG.W., Prosser J.I. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in> soils // Nature, 2006, V. 442, p. 806-809.

76. Lipthaya J.R., Enzingerb C., Johnsena K., et al. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis // Soil Biol. Biochem. 2004. V.36. P. 1607-1614

77. Mahendrappa, M.K., Smith, R.L., Christiansen, A. T. Nitrifying organisms affected by climate region in western United States // Soil Sci. Soc.Am. J, 1986, V. 30, p. 60-62.

78. Mannisto, M.K., Tiirola, M., Haggblom, M.M. Effect of freeze-thaw cycles on bacterial communities of arctic tundra soil // Microb Ecol, 2009, V. 58, № 3, p. 621-631.

79. Martikainen P.J., Nurmiaho-Lassila E.L. // Canad. J. Microbiol, 1985, V. 31, p. 190-197.

80. Matulewich V.A., Strom P.F., Finstein M.S. Length of incubation for enumerating nitrifying bacteria present in various environments // Appl. Environ. Microbiol, 1975, V. 29, p. 265-268.

81. McTavish H., LaQuier F., Arciero D., Logan M., Mundfrom G., Fuchs J.A., Hooper A.B. Multiple copies of genes coding for electron transport proteins in the bacterium Nitrosomonas europaea // J. Bacteriol, 1993b, V.175, № 8, p. 24452447.

82. Miller L.G., Coutlakis M.D., Oremland R.S., Ward B.B. Selective inhibition of ammonium oxidation.and nitrificationlinlced N20 formation by methyl fluoride and dimethyl ether //Environ. Microbiol, 1993, V.59, p.2457-2464.

83. Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.S. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples//Appl: Environ. Microbiol, 1999, V. 65, № 11, p. 4615-4724.

84. Mulder A., van de Graaf A.A., Robertson L.A., Kuenen J.G. Anaerobic ammonia-oxidizing discovered in a denitrifying fluidized-bed reactor // FEMS Microbiol. Ecol, 1995, V. 16, p. 177-184.

85. Muyzer G., Smalla K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology//Antonie Van Leeuwenhoek, 1998, V. 73, № 1, p. 127-141.

86. Nakagawa T., Ikehata R., Myoda T., Miyaji T., Tomizuka N. Overexpression and functional analysis of cold-active beta-galactosidase from Arthrobacter psychrolactophilus strain F2 // Protein Expr Purif, 2007, V. 54, p.118295.299.

87. Nicol G.W., Tscherko D., Embley T.M., Prosser J.I. Primary succession of soil Crenarchaeota across a receding glacier foreland // Environ Microbiol, 2005, V. 7, p. 337-347.

88. Nicol G.W., Schleper C. Ammonia-oxidising Crenarchaeota: important players in the nitrogen cycle? // Trends Microbiol, 2006, V.14, № 5, p. 207-212.

89. Nicol G.W., Leininger S., Schleper C., Prosser J.I. The influence of soil pH on the diversity, abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria // Environ Microbiol, 2008, V. 10, p. 2966-2978.

90. Nicolaisen M.H, Ramsing N.B. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) approaches to study the diversity of ammonia-oxidizing bacteria // Microbiol Methods, 2002, V. 50, p. 189-203.

91. Ochsenreiter T., Selezi D., Quaiser A., Bonch-Osmolovskaya L., Schleper C. Diversity and abundance of Crenarchaeota in terrestrial habitats studied by 16S RNA surveys and real time PCR // Environ. Microbiol, 2000, V. 5, p. 787-797.

92. Ochsenreiter T., Selezi D., Quaiser A., Bonch-Osmolovskaya L., Schleper C. Diversity and abundance of Crenarchaeota in terrestrial habitats studied by 16S RNA surveys and real time PCR // Environ Microbiol, 2003, V. 5; p. 787-797.

93. Offre P., Prosser J.I., Nicol G. Growth of ammonia-oxidizing archaea in soil microcosms is inhibited by acetylene // FEMS Microbiol. Ecol, 2009, V. 70, p. 99108.

94. Pearson A., Huang Z., Ingalls A.E., Romanek C.S., Wiegel J., Freeman K.H., Smittenberg R.H., Zhang C.L. Nonmarine crenarchaeol in Nevada hot springs //Appl. Environ. Microbiol, 2004, V. 70, p. 5229-5237.

95. Pitcher A., Schouten S., Damste J.S.S. In situ production of Crenarchaeol in two California hot springs // Appl. Environ. Microbiol, 2009, V. 75, p. 4443-4451.119

96. Pitcher A., Villanueva L., Hopmans E.C., Schouten S., Reichart G.J., Sinninghe Damste J.S. Niche segregation of ammonia-oxidizing archaea and anammox bacteria in the Arabian Sea oxygen minimum zone // Nature, 2011, May 19. Epub ahead of print.

97. Poth M., Focht D.D. 15N Kinetic analysis of N20 production by Nitrosomonas europaea: An examination, of nitrifier denitrification.// Appl.Environ.Microbiol, 1985, V. 49, p. 1134-1141

98. Pommerening-Roser A., Rath G., Koops H.P. Phylogenetic diversity within the genus Nitrosomonas II System. Appl. Microbiol, 1996, V. 19, p. 344-351.

99. Preston C.M., Wu K.Y., Molinski T.F., DeLong E.F. A psychrophilic crenarchaeon inhabits a marine sponge: Grenarchaeumsymbiosum gen. nov., sp. nov. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, p. 6241-6246.

100. Reigstad L.J., Richter A., Daims. H., Urich T., Schwark L., Schleper C. Nitrification in terrestrial hot springs of Iceland and Kamchatka // FEMS Microbiol. Ecol, 2008, V.64, p. 167-174.

101. Rojas-Herrera R., Narvaez-Zapata J., Zamudio-Maya M., Mena-Martiens M.E. A simple silica-based method for metagenomic DNA extraction from soil and sediments // Mol. Biotechnol, 2008, V.40, № 1, p. 112-119.

102. Rotthauwe J.H., Witzel K.P., Liesack W. The ammonia monooxigenase structural gene amoA as a functional marker: molecular fine scale analysis of natural ammonia-oxidizing population // Appl. Environ. Microbiol, 1997, V. 63, № 12, p. 4704-4712.

103. Sandaa R.A., Enger O., Torsvik V. Abundance and diversity of Archaea in heavy-metal-contaminated soils // Appl. Environ. Microbiol, 1999, V. 65, p. 32933297.

104. Sayavedra-Soto L. A., Hommes N.G., Arp D J. Characterization of the gene encoding hydroxylamine oxidoreductase in Nitrosomonas europaea // J. Bacteriol, 1994, V. 176, № 2, p. 504-510.

105. Sayavedra-Soto L. A., Hommes N.G., Alzerreca J.J., Arp D.J., Norton J.M., Klotz M.J. Transcription of the amoC, amoA, and amoB genes in Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp. NpAV. II FEMS Microbiol. Lett, 1998, V. 167, № 1, P. 81-88.

106. Scherm H., van Bruggen A.H.C. Global warming and nonlinear growth: how important are changes in average temperature // Phytopathology, 1994, V. 84, p. 1380-1384.

107. Sharma S., Szele Z., Schilling R., Munch J.C., Schloter M. Influence of freeze-thaw stress on the structure and function of microbial communities and denitrifying populations in soil // Appl. Environ. Microbiol, 2006, V. 72, № 3, p. 2148-2154.

108. Schleper C., Holben W., Klenk H.P. Recovery of crenarchaeotal ribosomal DNA sequences from freshwater-lake sediments // Appl. Environ. Microbiol, 1992, V. 63, p. 321-323.

109. Schmidt I., Book E. Anaerobic ammonia oxidation // Arch. Microbiol, 1997,1211. V. 167, p. 106-111

110. Simon H.M., Dodsworth J.A., Goodman R.M. Crenarchaeota colonize terrestrial plant roots // Environ. Microbiol. 2000, V. 2, p. 495-505.

111. Smits N.A.C., Hefting M.M., Karnst-van Agterveld M.P., Laanbroek H.J., Paalman A.J., Bobbink R. Nitrification along a grassland gradient: Inhibition found in matgrass swards // Soil Biol. Biochem, 2010, V. 42, p. 635-641.

112. Stark J.M., Firestone M.K. Mechanisms for soil moisture effects on activity of nitrifying bacteria // Applied and Environmental Microbiology, 1995, V. 61, № 12, p. 218-221.

113. Stopnisek N., Gubry-Rangin C., Hofferle S., Nicol G.W., Mandic-Mulec I., Prosser J.I. Thaumarchaeal ammonia oxidation in an acidic forest peat soil is not influenced by ammonium amendment // Appl. Environ. Microbiol, 2010, V. 76, p. 7626-7634.

114. Strous M., Fuerst J.A., Kramer E.H.M., Logemann S., Muyzer G., van de pas-Schoonen K.T., Webb R., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Missing lithotroph identified as new plactomycete // Nature, 1999, V. 400, p. 446-449.

115. Strous M., Fuerst J.A., Kramer E.H.M., Logemann S., Muyzer G., van de Pas-Schoonen K.T., Webb R., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Missing lithotroph identified as a new planctomycete // Nature, 1999, V. 400, p. 446-449.

116. Takai K., Moser D.P., DeFlaun M., Onstott T.C., Fredrickson J.K. Archaeal diversity in waters from deep South African gold mines // Appl Environ Microbiol, 2001, V. 67, p. 5750-5760.

117. Teske A., Aim E., Regan J.M., Toze S., Rittmann B.E., Stahl D.A. Evolutionary relationships among ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria // J Bacterid, 1994, V. 176, p. 6623-6630.

118. Tourna M., Freitag T.E., Nicol G.W., Prosser J.I. Growth, activity and temperature responses of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in soil microcosms // Environ Microbiol., 2008, V. 10, p. 1357-1364.

119. Urakawa H., Tajima Y., Numata Y., Tsuneda S. Low temperature decreases the phylogenetic diversity of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in aquarium biofiltration systems // Appl Environ Microbiol, 2008, V. 74, p. 894-900.

120. Verstraete W. Terrestrial nitrogen cycles. Processes, ecosystem strategies and management impact. Ecol. Bull. 33. F.E. Clark and T. Rosswall. Eds. Swedish natural science research council, Stockholm, 1981, p. 303-314.

121. Venter J.C., Remington K., Heidelberg J.F., Halpem A.L., Rusch D. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea // Science, 2004, V. 304, p. 66-74.

122. Vetriani C., Reysenbach A.L., Doré J. Recovery and phylogenetic analysis of archaeal rRNA sequences from continental shelf sediments // FEMS Microbiol Lett, 1998, V.161,p. 83-88.

123. Walker C.B., de la Torre J., Klotz M.G., Urakawa H., Pinel N., Arp D.J., Brochier-Armanet C., Chain P.S.G., Chan P.P., Gollabgir A., Hemp J., Hügler M.,123

124. Wang X.H., Wen X.H., Criddle C., Zhang J., Yang N.N., Zhao Y. Community structures of ammonia-oxidizing bacteria in active sludge of wastewater treatment plants // Huan Jing Ke Xue, 2009, V. 15, № 30, p. 30023006.

125. Woese C.R., Weisburg W.G., Paster B.J., Hahn C.M., Tanner R.S., Kreig N.P., Koops H.-P., Harms H., Stackebrandt E. The Phylogeny of purple bacteria: The beta subdivision // Syst. Appl. Microbiol, 1984, V. 5, p. 327-336.

126. Wood P.M. Nitrification as bacterial, energy source // Nitrification. Special publication of the society of general microbiology / Edi Prosser J.L oxford: IRL Press, 1986, V. 20, p. 39-62.

127. Wrange N. Role of nitrifier denitrification in the production of nitrous oxide // Soil Biol. Biochem, 2001, V. 33, p. 1723-1732.

128. Wucheter C., Schouten S., Boschker H.T., Sinninghe Damste J.S. Bicarbonate uptake by marine Crenarchaeota // FEMS Microbiol. Lett, 2003, V. 219, p. 203-207.

129. Yeates C., Gillings M.R., Davison A.D., Altavilla N., Veal D.A. Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification // Biol Proced Online, 1998, V.14, № 1, p. 40-47.

130. Yergeau E., Kowalchuk G.A. Responses of Antarctic soil microbial communities and associated functions to temperature and freeze-thaw cycle frequency// Appl. Environ. Microbiol, 2008, V.,10, №. 9, p. 2223-2235

131. Yoshida T., Alexander M. Hydroxylamine formation by Nitrosomonas europaea II Can. J. Microbiol, 1964, V. 10, p. 923-926.

132. You J., Das A., Dolan E.M., Hu J. Ammonia-oxidizing archaea involved in nitrogen removal // Elsevier Ltd, 2005, V. 43, № 7, p. 1801-1809.

133. Zhang C.L., Pearson A., Yi-Lian L., Mills G., Wiegel, J. Thermophilic temperature optimum for crenarchaeol synthesis and its implication for archaeal evolution // Appl. Environ. Microbiol, 2006, V. 72, p. 4419-4422

134. Zhang L.M., Wang M., Prosser J.I., Zheng Y.M., He J.Z. Altitude ammonia-oxidizing bacteria and archaea in soils of Mount Everest // FEMS Microbiol Ecol., 2009, V. 70, p. 52-61.

Информация о работе

Черобаева, Анна Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы