Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение биологических свойств и почвенного метагенома прокариотного сообщества при длительном применении минеральных удобрений в черноземах Каменной Степи

ВАК РФ 03.02.13, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Изменение биологических свойств и почвенного метагенома прокариотного сообщества при длительном применении минеральных удобрений в черноземах Каменной Степи"

На правах рукописи

ТХАКАХОВА Азида Климентовна

ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОЧВЕННОГО МЕТАГЕНОМА ПРОКАРИОТНОГО СООБЩЕСТВА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ МИНЕРАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ В ЧЕРНОЗЕМАХ КАМЕННОЙ СТЕПИ

Специальность 03.02.13 - Почвоведение

11 НОЯ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва 2015

005564416

005564416

Работа выполнена в ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева», в Отделе биологии и биохимии почв

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, член

корр. РАН, главный научный сотрудник ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева» Алексей Анатольевич Завалин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор кафедры

биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова Наталия Александровна Манучарова

кандидат сельскохозяйственных наук, заместитель директора по научной работе ФГБНУ «НИИСХ ЦЧП им. В.В. Докучаева»

Алексапдр Митрофанович Новичихин

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное

учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Защита диссертации состоится « 29 » декабря 2015 в 11 часов 00 минут на заседании Диссертационного Совета Д 006.053.01 при ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева» по адресу: 119017, Москва, Пыжевский переулок дом 7 строение 2.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Почвенного института им. В.В. Докучаева

Автореферат разослан «28 » октября 2015г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по вышеуказанному адресу. Факс: 8 (495) 951-50-37; E-mail: lubimova@agro.geonetttt

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор сельскохозяйственных наук И.Н. Любимова

Актуальность исследований. Современный практический и теоретический уровень агрохимических исследований, направленный на получении высоких урожаев и оптимального качества растениеводческой продукции, сохраняя при этом экологические функции и «здоровье» почвы, требует нового, более глубокого научного подхода к изучению микробных сообществ агроценозов.

Для почв сельскохозяйственного использования, постоянно испытывающих антропогенные нагрузки, важно знать, как они влияют на интенсивность и направленность микробиологических процессов, причастных к почвенному плодородию (Микробное..., 2001).

Однако, несмотря на достаточно большое количество публикаций по изучению действия минеральных и органических удобрений на микробиологические процессы в почвах, до настоящего времени остается мало разработанным вопрос о регулирующей и оптимизирующей роли агрохимических средств в гомеостатическом, сбалансированном состоянии микробного сообщества почв агроценоза, жизнедеятельность которого обеспечивает поддержание плодородия агроэкосистем (Верховцева и др., 2006).

Поскольку черноземы представляют собой основной ресурс высокоплодородных почв России, обладающих высоким уровнем биологического разнообразия и адаптивного потенциала, исследования влияния интенсивности антропогенной нагрузки, связанной с внесением различных доз минеральных удобрений на изменение состава прокариотного сообщества почв, являются актуальными и могут внести вклад в изучение проблем эволюции и преобразования агрочерноземов.

Ландшафтный стационар «Каменная Степь» служит базовой моделью комплексных и разносторонних исследований вот уже более 100 лет, поэтому представляет интерес использование современных методов для более детального описания определенных свойств и процессов, протекающих в черноземах.

Применение методов молекулярной биологии, в частности, изучение количественных показателей компонентов микробного сообщества, а также исследование таксономического состава и оценка биоразнообразия почв, занятых в интенсивном сельскохозяйственном производстве, переводят исследования микробиологических свойств почвы на новый уровень, что

является чрезвычайно актуальным и важным на современном этапе. Кроме того, преимуществом молекулярных-генетических методов является учет микроорганизмов, культивирование которых невозможно на элективных средах чашечными методами. Известно, что большую часть в составе почвенных микроорганизмов составляют именно некультивируемые виды (Metagenomics, 2010; Delmont, 2011) и возможность их изучения появилась только с применением в почвенной микробиологии молекулярных методов (Rondon etal., 1999).

В результате секвенирования и расшифровки последовательностей структур ДНК всего разнообразия прокариотного сообщества почв, образуется огромные массивы метаданных. Обработка такого материала входит в область биоинформатики, является необходимым условием в молекулярно-биологических исследованиях и соответствует мировому тренду развития почвенной микробиологии.

Цель исследований. Оценить влияние минеральных удобрений на трансформацию метагенома прокариотного сообщества и интенсивность почвенно-биологических процессов в агроэкосистеме черноземных почв.

Задачи исследований.

1. Исследовать взаимосвязь почвенных микроорганизмов эколого-трофических групп и различных форм углерода и азота в некоторых системах землепользования Каменной Степи.

2. Определить численность прокариотных и эукариотных микроорганизмов по количеству выделенной ДНК методом ПЦР Реал-Тайм в различных вариантах полевого опыта.

3. Описать почвенный метагеном прокариотного сообщества черноземов Каменной Степи методом высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S рРНК; установить коровый (консервативный) и аксессорный (лабильный) компоненты почв, выявить микроорганизмы-индикаторы изменения черноземов под воздействием высоких доз минеральных удобрений.

4. Выявить сезонную динамику таксономической структуры микробного сообщества черноземных почв.

5. Провести анализ нуклеотидных последовательностей ампликонных библиотек и оценить биоразнообразие при длительном применении минеральных удобрений.

Научная новизна. Впервые методами молекулярной биологии получены данные по составу метагенома прокариотного сообщества черноземных почв с различной антропогенной нагрузкой, а также проведено исследование сезонной изменчивости таксономической структуры микробиомов при помощи секвенирования гена 16S рРНК. Выявлены семейства-маркеры, характеризующие пахотные почвы, внесение удобрений, а также особенности почв залежи. Впервые показано присутствие корового (консервативного) и аксессорного (лабильного, связанного с почвенными процессами или условиями среды обитания микроорганизмов) компонентов черноземных почв. Методом qPCR-Real Time дана количественная оценка отдельных филогенетических групп почвенных микроорганизмов (бактерий, архей, микромицетов) в черноземных почвах различных систем землепользования. Методами классической микробиологии выявлена связь некоторых форм углерода и азота с физиологическими группами микроорганизмов в агрочерноземах Каменной Степи и почвенно-биологическими процессами, проводимых ими.

Практическая значимость. Работа удостоена премии Правительства РФ 2015 года в области науки и техники для молодых ученых.

Показатели численности эколого-трофических групп микроорганизмов могут характеризовать почву, занятую в сельскохозяйственном производстве, с точки зрения ее «здоровья», экологической устойчивости. Выявленные с использованием высокопроизводительного секвенирования генов 16S рРНК семейства-маркеры могут быть использованы для идентификации процессов восстановления почвы и ее биоразнообразия после вывода из сельскохозяйственного производства, идентификации агрочерноземов, а также внесения минеральных удобрений.

Апробация. Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2007, 2014), «V съезд Всероссийского общества почвоведов им. В.В. Докучаева» (Ростов-на-Дону, 2008), «Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием к 85-летию Почвенного института им. В.В. Докучаева» (Москва, 2012), «Современное состояние чернозёмов» (Ростов-на-Дону, 2013); "Современные методы исследований почв и почвенного покрова» (Москва, 2015); на международных конференциях: «Европейский союз наук о Земле, Генеральная Ассамблея» (Австрия, 2013, 2014, 2015), 9-й Международный

конгресс почвоведов «The Soul of Soiland Civilization» (Турция, 2014), 13th symposium on bacterial genetics and ecology (Италия, 2015), «Генетическая интеграция про- и эукариот: фундаментальные исследования и современные агротехнологии» (Санкт-Петербург, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 1 б работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК для опубликования основных научных результатов диссертации.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 143 страницах, содержат 12 таблиц, 25 рисунков. Работа состоит из введения, литературного обзора, главы «Природные условия и объекты исследования», главы «Объекты и методы исследований», пяти экспериментальных глав, заключения и выводов. Список литературы включает 249 источников, в том числе 121 зарубежных.

Автор выражает благодарность Кутовой О.В., Фриду A.C., Хитрову Н.Б., Холодову В.А., Чернову Т.И. за организацию полевых исследований, помощь в анализе результатов и конструктивную критику.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (современное состояние проблемы) Рассмотрены черноземные почвы, их свойства, биологическая активность, устойчивость экосистемы черноземов при интенсивном сельскохозяйственном использовании, особое внимание уделено исследованием с использованием молекулярно-биологических методов (Fierer et al., 2012; Suleiman et al., 2013; Pan et al., 2014). Представлены данные об изучении микроорганизмов, как активного компонента почвы. Детально проанализирован метагеномный подход, основанный на прямом выделении нуклеиновых кислот из образцов окружающей среды для изучения и сравнения профилей сложных микробных сообществ (Biddle et al., 2008; DeLong et al., 2006; Alvarez et al., 2013, Steele, 2009; Simon, Daniel, 2010; Hanreich et al., 2013; Wang, 2013).

Глава 2. ПРИРОДНЫЕ УСЛОВИЯ И ПОЧВЕННЫЙ ПОКРОВ КАМЕННОЙ СТЕПИ.

Каменная Степь размещается на плоской равнине водораздела рек Чигла, притока Битюга и Елани, впадающей в Хопер. Это юго-восточная часть Воронежской области, Битюгско-Хоперское междуречье, на удалении 12 км к югу от районного центра Таловая. Климат Каменной Степи можно охарактеризовать как типично степной, умеренно континентальный с холодной зимой и теплым (нередко жарким и засушливым) летом.

Современные тенденции изменения климатических условий Каменной Степи проявляются в следующем (Чевердин, 2013): а) Существенное увеличение средней годовой суммы атмосферных осадков на 150 мм за счет увеличения, прежде всего в холодный период (с ноября по март) приблизительно на 100 мм, а так же в теплый (с апреля по октябрь) на 50 мм; б) Повышение среднемноголетних среднегодовых температур воздуха на 1,8°С за счет небольшого потепления в теплый период (около 1,0°С) и более серьезного потепления холодного периода (2,7°С).

По данным современных почвенных обследований, среди почв Каменной Степи выделяются лугово-черноземные, черноземно-луговые и черноземно-влажнолуговые почвы, а также черноземы типичные (Чевердин, 2013).

Глава 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Объекты исследований. Исследования проводили на длительных агрохимических опытах и опытах отдела кормопроизводства, расположенных на территории агроэкологического стационара «Каменная Степь» ФГБНУ НИИСХ им. В.В. Докучаева. В качестве абсолютного контроля исследовались почвы залежи, выведенные из сельскохозяйственного пользования более 100 лет назад. Исследуемые почвы стационара представлены: а) чернозем обыкновенный слабосмытый глинистый на двучленных глинистых отложениях (К-1977); агрочернозем сегрегационный глубоко квазиглееватый маломощный глинистый на двучленных глинистых отложениях (РК); Haplic Chernozem (Clayic, Aric) (WRB, 2014); б) чернозем типичный среднемощный легкоглинистый на лессовидных глинах (К-1977); чернозем миграционно-мицелярный постагрогенный глубоко квазиглееватый среднемощный глинистый на лессовидных глинах (РК); Haplic Chernozem (Pachic, Clayic) (WRB, 2014).

Агрохимический опыт заложен на территории стационара осенью 1991 года. Образцы отбирали в 2006 (сахарная свекла, предшественник озимая пшеница) и 2007 (ячмень) годах. Площадь учетных делянок - 20 м2. Для описания почвенного метагенома и выявления сезонной динамики таксономической структуры прокариотного сообщества черноземных почв под влиянием длительного применения минеральных удобрений были отобраны образцы (2012, 2013 и 2014 гг.) с полевого опыта, заложенного на территории отдела кормопроизводства в 1981 г. Образцы отбирали весной 2012 года перед посевом кукурузы на силос (предшественник ячмень на

зерно); весной 2013 перед посевом кормовой свеклы; весной, летом и осенью 2014 года, культура козлятник + кострец. Площадь делянок 60 м2. Вносимое минеральное удобрение - нитроаммофоска (ЫН4Н2Р04 + ЫН4Ж>з + КС1).

Таким образом были исследованы варианты: Залежь (косимая степь), Контроль (без удобрений), средние дозы и высокие дозы минеральных удобрений: средние дозы удобрений соответствуют Мц^Рю^Кю^ в 2006, 2007 году; ИбоРбоК^о в 2012 и ЫзоРзоКзо в 2013 году. Высокие дозы удобрений соответствуют ^6.5Р62.5К58.5 в 2006, 2007 годах; ¡Ч^оРцоКао в 2012 и Ы60РбоК«0 в 2013 году.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Отбор почвенных образцов.

Отбор почвенных образцов для микробиологических исследований выполнен по стандартным методикам (Звягинцев, 1991), в 3-х-кратной повторности из горизонтов Ри2 (5-20 см) в агрочерноземе и А1]гг (5-15 см) в почвах залежи. При необходимости образцы хранили при температуре +5°С. Для исследований методами молекулярной биологии - при -70°С.

3.2.2. Определение форм углерода и азота.

Анализ почвенных образцов на содержание общего азота (КГобщ.) проводили по ГОСТ-26107-84 «Методы определения общего азота», нитратов (NN03-) - по ГОСТ-26488-85 «Определение нитратов по методу ЦИНАО», аммиачного азота (N^4+) - по ГОСТ-26489-85 «Определение обменного аммония по методу ЦИНАО», органического углерода (Сорг.) по Тюрину (Орлов, Гришина, 1981), углерода водной вытяжки (Свод.) по методу Тюрина (Минеев, 1983). Анализы были проведены в аналитических лабораториях ФГБНУ ВНИИСХМ и ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева».

3.2.3. Определение численности микроорганизмов.

Использовали методы классической микробиологии - посев на плотные элективные среды и метод предельных разведений на жидкие среды из водной суспензии при разведении 1:10 (Практикум..., 1976): мясо-пептонный агар (МПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), подкисленная среда Чапека, среда Эшби (Теппер и др., 2005), среда Виноградского, среда ГНД (группа нитратного дыхания) (Ильина, Фомина, 1983), голодный агар (ГА). Учет численности микроорганизмов проводили через 3-14 дней культивирования в зависимости от питательной среды. Данные по численности микроорганизмов выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) и пересчитывали на 1 г воздушно-сухой почвы. На плотных средах проводили подсчет выросших

б

колоний. На жидких средах подсчитывали наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема суспензии (Практикум..., 1976). Активность аэробных азотфиксаторов оценивали по количеству обросших почвенных частиц, выражали в процентах (Теппер и др., 2005).

3.2.4. Приготовление препарата почвенной ДНК.

ДНК выделяли из 0,2 г образца почвы после механического разрушения с использованием циркониевых шариков в экстрагирующем буфере, содержащем 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер - 200 мМ, изоцианат гуанидина - 240 мМ, pH = 7), 350 мкл раствора Б (Трис-НС1 - 500 мМ, SDS - 1% по массе к объему, pH = 7) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1:1). Разрушение образца проводили в течение 40 с на гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin Technologies, Франция) при максимальной мощности (скорость 6500 об/мин). Полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 16000 об/мин. Водную фазу отбирали и повторно экстрагировали хлороформом. ДНК осаждали, добавляя равный объем изопропилового спирта. После центрифугирования осадок промывали 70% раствором этанола и далее растворяли в воде при температуре 65°С в течении 5-10 мин. Очистку препарата ДНК проводили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с последующим выделением ДНК из геля методом сорбции на оксиде кремния (Андронов и др., 2011).

3.2.5. Проведение количественной ПЦР.

Количественную оценку ДНК бактерий, архей и грибов проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в реальном времени. Для определения концентрации очищенного препарата почвенной ДНК реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Biorad) с измерением интенсивности флуоресценции реакционной смеси на каждом цикле в соответствии с рекомендациями производителя. Реакционную смесь готовили из препарата SuperMix Eva Green Biorad (концентрированный буфер с дезоксирибонуклеотидами, полимеразой Sso7d-ñision, MgC12, красителем EvaGreen и стабилизаторами).

В качестве контроля для бактерий использовали растворы клонированных фрагментов рибосомального оперона Esherichia coli, для архей - штамма FG-07 Halobacterium salinarum, для грибов - штамма дрожжей Saccharomyces cerevisae Meyen 1 B-D 1606. Были использованы следующие праймеры: Eub338/Eub518 - для бактерий (Lane, 1991), arс915f/arc 1059г — для архей (Yu et

al.,2005), ITSlf/5.8s - для грибов (Fierer et al., 2006). Определяли концентрацию ДНК консервативных участков бактерий и архей (16s ДНК) и грибов (18s ДНК) и пересчитывали в количество копий данных участков на грамм почвы (Железова и др., 2015):

3.2.6. Секвенирование нуклеотидных последовательностей.

Очищенный препарат ДНК использовали в качестве матрицы для реакции

ПЦР с использованием пары универсальных праймеров к вариабельному участку V4 гена 16S рРНК - F515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и R806 (GGACTACVSGGGTATCTAAT) (Bates et al., 2011). В праймеры вводили олигонуклеотидные идентификаторы и служебные последовательности. Подготовку проб и секвенирование выполняли на приборе GSJunior ("Roche", Швейцария) согласно рекомендациям производителя.

3.2.7. Обработка результатов секвенирования.

Обработку данных проводили при помощи программы QIIME (Caporaso et al., 2010): осуществлялась проверка качества и создание библиотеки сиквенсов, подбор OTE (операционных таксономических единиц) на основе 97% порога сходства, удаление синглтонов (OTE, содержащих только один сиквенс), расчет показателей альфа-разнообразия, анализ схожести сообществ (бета-разнообразия) по методу UniFrac (Lozupone & Knight, 2005). Разнообразие прокариотных сообществ оценивали по нескольким показателям: по количеству выделенных OTE (Sobs, аналог видового богатства), по индексу Шеннона (Н=Х Р, in p¡, где р, — доля /-го вида в сообществе) и индексу Chaol, оценивающему предположительное реальное

а2

количество OTE в сообществе (Chaol = Sobs + —, где Sobs — число обнаруженных OTE, а — число OTE, содержащих 1 сиквенс, b — число OTE, содержащих 2 сиквенса). При расчете индексов разнообразия проводилась нормализация данных по минимальному количество сиквенсов в образце (Чернов и др., 2015).

Различие структуры бактериальных сообществ разных образцов (бета-разнообразие) анализировали при помощи UniFrac (Lozupone & Knight, 2005), оценивающего филогенетическое «расстояние» между парами сообществ на основе схожести их филогенетического состава, мы использовали версию weighted UniFrac, оперирующая не только представленностью таксонов в сообществе, но и их относительным обилием.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Взаимосвязь почвенных микроорганизмов эколого-трофических групп и различных форм углерода и азота.

Микроорганизмы играют важнейшую роль в трансформации соединений биогенных элементов, поэтому представляет интерес изучение характера взаимосвязи некоторых биохимических показателей с развитием эколого-трофических групп микрофлоры.

Общее содержание гумуса (Сорг.) за 15 лет проведения опытов практически не изменилось (рис. 1), в то время как количество углерода водной вытяжки (динамичное органическое вещество почвенного раствора) увеличилось в почвах сельскохозяйственного использования на 4-11 мг/кг за счет повышенной биохимической активности агрочерноземов и повышенной интенсивности выделений корневой системы сельскохозяйственных растений.

Содержание общего и, особенно, нитратного азота (рис. 2) в вариантах сельскохозяйственного использования выше, чем в почве залежи, что, вероятно, связано с аэрацией почвы, высвобождением азота из лабильной части гумуса за счет биологической активности, процессов нитрификации. Количество аммонийного азота было равным во всех вариантах, за исключением вар. 3, что связано с применением высоких доз минеральных удобрений.

Свод., мг/кг

1М-ЫН4+,мг/кг; N общ., %

34,7

34,7

0,485 0,473,464

N-N03",мг

40 35

- 30

• 25

• 20 15

- 10 5 0

0,427

Сорг., %

12 3 4

N-N4/,мг/кг ■ N общ., %

N-N03",мг/кг

Рис. 1. Содержание общего углерода (Сорг, %) и углерода водной вытяжки (Свод, мг/кг) в агрочерноземах (агрохимический опыт):

Рис. 2. Содержание общего азота (Ыобщ, %), N-N03" (мг/кг) и №Ш4+ (мг/кг) в агрочерноземах (агрохимический опыт):

1 - N0 Р0 Ко; 2 N 10,5 Р 10,5 К-10,5; з - N56,5 Рб2,5 К58,5; 4 - Залежь.

Для оценки почвенно-биологических процессов в агрочерноземах с различной степенью нагрузки была изучена структура сообщества различных эколого-трофических групп микроорганизмов (рис. 3-7).

^ КОЕ/г

^ КОЕ/г

2006

2007 ■ 2

2012 3

2013

■ 4

Рис. 3. Численность аммонификаторов по годам исследований, по вариантам опыта:

Рис. 4. Численность амилолитиков по годам исследований, по вариантам опыта:

1 - контроль (без удобрений); 2 -средние дозы удобрений; 3 - высокие дозы удобрений; 4 - залежь.

Численность аммонификаторов (рис. 3) не зависит от систем землепользования, а на опытных полях не зависит от применения минеральных удобрений, т.е. между вариантами достоверной разницы ие зафиксировано. Количественные показатели амилолитиков (рис. 4) не различались по вариантам опыта, но сильно расходились по годам в первый период исследований 2006-2007 года, что объясняется климатическими показателями - сумма осадков меньше и температура ниже в 2006 г. яо сравнению с 2007 г. Аналогичная закономерность проявилась и у актиномицетов.

Таким образом, исследования показали консервативность микроорганизмов углеродного цикла и их резистентность к антропогенному воздействию.

Процессы, связанные с превращениями азота являются важными как для развития микрофлоры почвы, так и для растений. Были рассмотрены процессы накопления и потери азота из почвы.

Ig, KOE/g

I Ig KOE/r

2006 2012 2013 ■ 1 ■2 3 "4

P I Ml

■II

2006 2007 2012 2013

■ 1 ■2 3 "4

10 ■

I , il

РПН1

f im

\\ I !

I I I

2006 2007 2012 2013 ■ 1 "2 3 "4

Рис. 5. Численность аэробных азотфиксирующих микроорганизмов по годам исследований, по вариантам опыта:

Рис. 6. Численность анаэробных азотфиксаторов (Clostridium) по годам исследований, по вариантам опыта:

1 - контроль (без удобрений); 2 -средние дозы удобрений; 3 - высокие дозы удобрений; 4 - залежь.

Рис. 7. Численность денитрификаторов по годам исследований, по вариантам опыта:

Процессы азотного цикла проходят более интенсивно в агрогенных почвах, почвы залежи являются более консервативными. Высокая активность аэробных азотфиксаторов (рис. 5) в контроле может быть связана с отсутствием поступления дополнительного азота в виде минеральных удобрений, что инициирует активность аэробных диазотрофов. Активность Clostridium (рис. 6) максимальна в варианте с высокими дозами NPK практически во все года исследований. Высокая численности анаэробных азотфиксаторов в контрольном варианте (4,2 и 3,25 lg КОЕ), может быть связана с культурами-предшественниками (сахарная свекла, кукуруза на силос), т.к. свежие растительные остатки являются источником энергии, питательных веществ, витаминов, факторов роста, микроэлементов для клостридий (Емцев, 1974) и могут приводить к интенсивному их развитию (Лазарев, 1949; Пошон, Де Баржак, 1960). Активность денитрификаторов оценивали на среде ГНД, используя интегральный показатель - эмиссию газа, помутнение среды и изменение цвета (£ lg КОЕ/г, рис. 7). Этот показатель возрастает в 2006-2007 гг. в почвах с внесением удобрений пропорционально

их количеству, что может быть связано с избыточным содержанием минеральных форм азота и выносом N2| за счет активности денитрификаторов. В 2012-2013 гг. низкая активность денитрификаторов в варианте 3 - N56i5 P62.s К58.5 связана, вероятно, с токсичным действием высоких доз минеральных удобрений для некоторых представителей данной группы микроорганизмов.

4.2. Количественная оценка различных групп микроорганизмов по данным метода ПЦР Real Time.

Принципиальной особенностью метода является мониторинг и количественный анализ отдельных филогенетических групп почвенных микроорганизмов в продукте накопления полимеразной цепной реакции, а также автоматический учет и интерпретация результатов, полученных с помощью программного обеспечения.

Ig копий/г. почвы

NPK-60 NPK-120 ' ВАС "ARCH FUN

Рис. 8. Количество ДНК бактерий, архей и микромицетов по вариантам опыта.

Максимальная биологическая активность и численность микроорганизмов различных групп выявлена в варианте с внесением средних доз удобрений ЫбоРбоК^о (рис. 8). Вероятно, на количественные показатели

различных групп микроорганизмов повлиял факт внесения минеральных удобрений, в связи с чем увеличилась урожайность возделываемых культур —

кукурузы на силос (2012 год) и кормовой свеклы (2013 год) на 41,5% и 60,6% соответственно по сравнению с контролем. Закономерно увеличивалась корневая масса и корневые экссудаты, которые оказывают прямое воздействие на микроорганизмы. Кроме того, средние дозы удобрений менее токсичны для живой части почвы по сравнению с высокими.

Варианты залежи и пахотной почвы без удобрений по биологической активности наиболее близки по своим значениям. Достаточно низкие показатели численности можно связать с консервативностью природной

почвы и ограничением роста и развития сельскохозяйственных растений в варианте без внесения минеральных удобрений.

Таким образом, на основании количественных данных по содержанию ДНК в агрочерноземах Каменной Степи можно констатировать высокую общую биологическую активность этих почв. Количество микроорганизмов всех исследованных групп - бактерий, архей, микромицетов в почвах залежи самое низкое, что связано с уравновешенным течением почвенно-биологических процессов, которые характеризуются минимальным экзогенным воздействием, наличием в гумусово-аккумулятивном горизонте зернистой почвенной структуры, способной лучше удерживать и сохранять почвенную влагу в течение вегетационного периода. Поэтому для сохранения наибольшей биологической активности и биоразнообразия, а также поддержания «здоровья» почвы рекомендуется уменьшать дозы планируемых удобрений, а также учитывать отзывчивость культур на минеральные удобрения.

4.3. Почвенный метагеном прокариотного сообщества черноземов Каменной Степи.

Методами молекулярной биологии были определены последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК микроорганизмов для дальнейшего анализа микробного сообщества исследуемых почв.

Были проанализированы почвенные образцы 2013 и 2014 годов, количество сиквенсов (количество прочтений) в них варьирует от 1782 до 3332 в 2013 г. и от 971 до 6008 в 2014г. Анализ последовательностей был проведен по трем филогенетическим уровням: доменам, филумам и семействам.

Таксономическая структура анализируемых сообществ на уровне доменов представлена на рис. 9.

NPK-0 NPK-60 NPK-120 Залежь

13,5 0,10 20,6 0,20 17,7 0,20 8<4? 0,27

0% % 3% % 0% % * %

"NA ■ Archaea Bacteria

Рис. 9. Таксономическая структура прокариотных биомов черноземных почв на уровне доменов.

Доля архей увеличивается в пахотных почвах, особенно с внесением удобрений более, чем в два раза в варианте N6oP6oKio- Отмечается положительная связь представленности архей с количеством доступного азота в почве (Bates, 2011). Доля бактерий высокая как в пахотных почвах, так и в почвах залежи и варьирует от 79,17% до 91,26%. Во всех вариантах присутствует небольшое количество неатрибутируемых доменов.

Анализ бактериального сообщества на уровне филумов показал наличие мажорного (главного) компонента микробиома. Доля основных филумов в

Выявлено несколько доминирующих филумов, доля которых была достоверно выше по сравнению с остальными: Actinobacteria (32,57-47,97%), Proteobacteria (15,73 -23,70%), Crenarchaeota (8,47- 17,70%) и Firmicutes (1,63 -9,27%).

При сравнении таксономической структуры микробного сообщества залежи и агрочерноземов на уровне семейств было выделено несколько групп микроорганизмов-индикаторов, которые мы относим к аксессорному компоненту. Аксессорный компонент почвенного микробиома, вероятно, связан с условиями среды обитания микроорганизмов и, возможно, именно среди таксонов аксессорного компонента будут найдены микроорганизмы-индикаторы почв, процессов или условий.

В первую группу вошли семейства, доля которых уменьшается в пахотных почвах по сравнению с почвой косимой степи (залежь): Conexibacteraceae,

14

составе микробного сообщества показана на рис. 10.

Verrucomicrobia Proteobacteria ■ Planctomycetes

Gemmatimonadetes ■ Firmicutes ■Chloroflexi

i Bacteroidetes ■Actinobacteria ■Acidobacteria

■ Crenarchaeota

Рис. 10. Таксономическая структура мажорных компонентов прокариотного биома черноземных почв на уровне филумов.

РаШИЬас(егасеае, НурИот1СгоЫасеае, Буп&оркоЬа^егасеае, ЕВ 1017 и неатрибутируемые семейства филумов АЫ<1оЬас1ег1а, ЛсйпоЪа&ег'ш, Рго1еоЬас1епа. По долевому участию этих семейств в функционировании сообщества почвенных микроорганизмов можно говорить об агрогенном воздействии на почву (в случае уменьшения их доли) или восстановления почвы после выведения ее из сельскохозяйственного оборота (в случае увеличения их доли).

Вторая группа представлена семействами, доля которых в залежных почвах меньше чем в пахотных: Оеос/егтаЮрИИасеае, М'югососсасеае, Я1юс1о.<;р1гШасеае, БрЫп^отопа(1асеаа, ЕШп5301 и неатрибутируемые семейства филумов Ас1с{оЬас1епа, ОеттаИтопас1е1е$. Все семейства принадлежат только к четырем филумам: Лс1с1оЬас/ег1а, АсйпоЬас1епа, Сеттаитопас1е1ез и Рго(еоЬас1ег1а, при этом все семейства Сетта! 1топас!е 1е.ч вошли в состав исключительно второй группы.

Третья группа, в которую вошли семейства, доля которых уменьшается только в вариантах с удобрениями, может считаться индикатором внесения минеральных удобрений: АК1\У874, ЗоИгиЬгоЬаМегасеае, ЕМегоЪаМепасеае, Ряеис/отопаЛасеав, ОтеПасеае и ЫА семейство порядка Мухососса/а?.

В четвертую группу вошли семейства, доля сиквенсов которых увеличивается только в вариантах с удобрениями: СкШпорка2асеае, ВасШасеае, и неатрибутируемое семейство филума Р1гт1СШе.ч. Кроме того, в состав этой группы вошли архей из филума Сгепагс11аео1а, принадлежащие к семейству ЫигояозрИаегасеае.

Пятая группа, самая многочисленная, в которую вошли семейства, доля сиквенсов которых остается практически неизменной, или невозможно установить зависимость от антропогенного влияния и его интенсивности. Большинство представителей этой группы можно отнести к коровому компоненту изученных почв, например СЫЪотоЬаЫегасеае и 11иЬгоЬас(егасеае. Большая часть представителей корового компонента является консервативной и практически не подвержена изменению. Его присутствие указывает на высокую степень экологической пластичности почвенного сообщества. Характеристика групп и распределение микробного сообщества агрочерноземов по группам микроорганизмов-индикаторов представлена на схеме (рис. 11).

Группа 1:

Уменьшение доли в пахотных почвах Группа 2: Увеличение доли в пахотных почвах

► Микроорганизмы-индикаторы сельскохозяйственного использования почв

N

Группа 3:

Уменьшение доли в вариантах с удобрениям Группа 4:

Увеличение доли в вариантах с удобрениям

Микроорганизмы-индикаторы внесения минеральных удобрений

Группа 5:

Нейтральная, сельскохозяйственное использование не влияет на изменение численности микроорганизмов

Рис. 11. Распределение микробного сообщества агрочерноземов по группам микроорганизмов-индикаторов.

4.4. Сезонная динамика почвенного микробиома агрочерноземов.

Отбор образцов проводился таким образом, чтобы представилась возможность оценить естественную неоднородность почвенного микробиома в пределах анализируемых площадок, а также проследить сезонную изменчивость структуры прокариотного сообщества в течение вегетативного периода.

Количество сиквенсов варьировало от 971 до 6008 на образец. Таксономическая структура анализируемых сообществ на уровне филумов по сезонам (весна, лето, осень) представлена на рис. 12. Подавляющую часть филогенетического состава всех микробиомов составляли представители 10 филумов бактерий и археи группы ТаитагсИаео1а (СгепагсИаео(а), суммарная доля представителей остальных филумов составляла около 1%.

Доминирующими филумами во всех микробиомах являлись Рго(еоЬас!епа и АсйпоЬааепа. Три филума достоверно различались по относительному обилию в образцах залежи и поля - доли ЛУ/и/га/еу и СеттаИтопас1е1е$ были выше в образцах пахотных почв, доля УеггисоткгоЫа - в образцах залежных

почв. Подобное соотношение наблюдалось в течение всех трех сезонов (весна, лето, осень).

NPK-бОкг/га

л

g NPK-30кг/го к ..........................

| NPK-0

и -

Залежь NPK-бОкг/га | NPK-30 кг/га i NPK-0

Залежь NPK-бОкг/га Я NPK-30 кг/га 5 NPK-0

Залежь

0% 10% 20%

■ Taumarctiaeota (Crcnarchaeota)

■ Bacteroidetes

■ Gemmatimonadet« I ProteobMeria

30% 40% 50% MAcidobacteria

■ Cliloroflexi

■ Nitrospirae ■Vemicomic/oba

60% 70% 80% 90% 100%

■ Aclinobacteria

■ Firmicutes

■ Planctomycetes ■другие

Рис. 12. Таксономическая структура прокариотных биомов черноземных почв на уровне филумов по вариантам опыта в течение вегетационного периода (весна -май, лето - июль, осень - сентябрь).

При сравнении таксономической структуры образцов разных сезонов было выявлено несколько филумов (Taumarchaeota, Acidobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Verrucomicrobia), доля которых в весенних образцах была меньше, чем в летних и осенних, как для поля, так и для залежи. В свою очередь, существенно большую долю в весенних образцах имели представители филума Proteobacteria. Таким образом, можно говорить о более разнообразном (за счет увеличения долей минорных филумов) прокариотном сообществе в образцах летнего и осеннего периодов. Резких различий между микробиомами образцов пахотных почв с внесением и без внесений минеральных удобрений выявлено не было. Данный факт может быть объяснен несколькими причинам. Культура, возделываемая в изучаемы период - козлятник + кострец (Galega orientalis Lam. + Bromopsis inermis Leys.) - травяная смесь с участием бобовых и злаковых многолетних корневищных трав, не требует высоких доз удобрений. Таким образом, дозы

минеральных удобрений в 2014 году были снижены в два раза и составили ЫзоРзоКзо (средние дозы) и Ы(,оРбоКбо (высокие дозы). Кроме того, благоприятное воздействие корневых экссудатов этих культур также снивелировали влияние минеральных удобрений на состав микробного сообщества.

4.5. Анализ биологического разнообразия таксономической структуры микробного сообщества.

Разнообразие почвенной микробиоты является важным фактором биологической устойчивости почв, интенсивности и направленности многих биохимических процессов в почве и инструментом биодиагностики (Чернов и др., 2015). Индексы используются в качестве моделей разнообразия и связывают число видов и число особей в сообществе.

Значения индексов биоразнообразия представлены в таблице.

Таблица

Значения индексов биологического разнообразия прокариотных сообществ по вариантам полевого опыта в течение вегетационного периода: весна (май 2014), лето (июль 2014), осень (сентябрь 2014)._

Варианты опыта Количество OTE Индекс Шеннона Индекс Chao

NPK-0 321 7.0 725

га я NPK-30 316 6.8 763

о И NPK-60 302 6.6 684

Залежь 317 7.0 721

NPK-0 330 7.2 825

Лето NPK-30 377 7.6 968

NPK-60 368 7.5 964

Залежь 325 7.2 800

NPK-0 368 7.6 935

-о я NPK-30 347 7.4 824

о О NPK-60 347 7.3 832

Залежь 344 7.5 787

Анализ филогенетического разнообразия сообществ, проведенный по количеству OTE, индексу Шеннона и индексу Chao, не выявил существенного различия между образцами различных вариантов опыта в пахотных почвах и почвах залежи. Однако показаны сезонные флуктуации биоразнообразия - во всех вариантах опыта небольшое увеличение значений индексов в образцах летнего и осеннего периодов по сравнению с весенним.

Оценка бета разнообразия (схожесть сообществ). Результаты анализа weighted UniFrac представлены в виде трехмерной диаграммы по методу главных компонент (рис. 13), маркерами отмечены микробиомы конкретных образцов, расстояние между маркерами соответствует различию филогенетической структуры микробиомов.

О

" о и

Время отбора образцов

май июль сентябрь

Залежные почвы © о о

Пахотные почвы © о Q

Рис. 13. Анализ схожести микробиомов по методу weighted UniFrac, трехмерная диаграмма по методу главных компонент (три главные компоненты, объясняющие 51, 14 и 8 % вариабельности соответственно).

Проанализированные микробиомы заметно различаются по сезонам, причем осенние образцы ближе к весенним, чем летние. Это свидетельствует о том, что сезонные различия микробиомов - не просто постепенные временные изменения, а влияние экологических факторов, приводящее к перемене филогенетической структуры прокариотных сообществ. Такими факторами, предположительно, являются влажность и температура, которые могут влиять на микробные сообщества опосредованно - через изменение рН, ОВП (окислительно-восстановительного потенциала), доступности питательных веществ и других факторов активности почвенных микроорганизмов.

Также отмечается четкое разделение микробиомов залежи и поля (крупные и мелкие маркеры на рис. 13), показывающее, что тип землепользования существенно влияет на структуру микробного сообщества. Возможно, ключевыми факторами в этом влиянии являются тип растительности и аэрация корнеобитаемого слоя почвы.

Микробиомы разных сезонов разделяются преимущественно по оси первой главной компоненты (объясняющей 51% вариабельности), а микробиомы пахотных и залежных почв - по второй (объясняющей 14% вариабельности), то есть, различия структуры прокариотных микробиомов в разное время года оказались более значительными, чем различия между системами землепользования.

Примечательно, что анализом ишРгас практически не выявляются различий между образцами пахотных почв с внесением разных доз и без внесения минеральных удобрений - эта разница оказывается трудноотличимой от естественной неоднородности между повторностями. Вероятно, это связано с высокой буферностью и высоким адаптивным потенциалом черноземов. В данном опыте, даже учитывая его 30-летнюю историю, внесение удобрений является гораздо менее значимым фактором структуры микробиома, чем тип землепользования или сезонные климатические изменения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микробное сообщество почвы, являясь неотъемлемой и обязательной частью любого биоценоза, в том числе агроценоза, играет ключевую роль в функционировании почвы и может служить универсальным и очень чувствительным индикатором ее состояния, устойчивости экосистем, в том числе при различных антропогенных нагрузках и оптимизации систем земледелия. Использование методов молекулярной биологии и анализ метагенома прокариотного сообщества черноземных почв позволил выявить реальные количественные показатели биогенности почв по выделенной ДНК микроорганизмов различных групп (бактерии, археи, микромицеты), а также тенденции трансформации биогенома при интенсивном использовании агрочерноземов. Результаты, полученные в работе, предполагают дальнейшее развитие исследований, связанных с изучением количественных показателей не только основных групп микробного сообщества почвы, но и их функциональной значимости, то есть изучение функциональных генов.

Методами пиросеквенирования и дальнейшим анализом биоразнообразия микробных сообществ показано наличие корового (общего для различных почв, консервативного) и аксессорного (лабильного, связанного с условиями окружающей среды и процессами в почвах) компонентов микробиомов. На основе аксессорного компонента выделены микроорганизмы-индикаторы сельскохозяйственного использования почв и восстановления почвы после выведения ее из сельскохозяйственного оборота, а также микроорганизмы-индикаторы внесения минеральных удобрений. Таким образом, при анализе таксономической структуры микробного сообщества агрочерноземов можно получить сведения об экологическом статусе исследуемого объекта, его биоразнообразии и, в конечном итоге, о «здоровье» данной почвы, что

представляет практический интерес в сохранении черноземов Каменной Степи.

ВЫВОДЫ

1. Содержание гумусовых вещества в черноземных почвах Каменной Степи влияет на все группы микроорганизмов, кроме актиномицетов. Количественные показатели углерода водной вытяжки оказывают влияние на аэробные азотфиксаторы и амилолитики, использующие минеральные формы азота. Содержание аммонийного азота N-NH4+ тесно коррелирует с микроорганизмами, участвующими в азотном цикле - аммонификаторами (R = + 0,96), азотфиксаторами (R = + 0,97), денитрификаторами (R = + 0,78). При этом присутствие аммонийных форм азота в почве приводит к частичному ингибированию и/или ретардации развития актиномицетов.

2. Высокая биологическая активность микроорганизмов азотного цикла в почвах сельскохозяйственного использования (до 96% Azotobacter, 5,11 lg КОЕ/г почвы Clostridium и 11,11 Е lg КОЕ/г почвы денитрификаторы) связана с аэрацией корнеобитаемого слоя пашни, увеличением корневых экзометаболитов культурных растений, а также с дополнительным внесением питательных веществ (применение минеральных удобрений).

3. Методом ПЦР Реал-Тайм установлена высокая общая биологическая активность черноземных почв Каменной Степи: количество ДНК бактерий варьирует в пределах 8.79 х 109 - 6.71 х 10'° копий/г почвы; архей - 2.25 - 6.44 х 109 копий/г почвы; микромицетов - 2.51х Ю7 - 5.72 х Ю8 копий/г почвы. Почвы косимой степи консервативны, количественные показатели ДНК в них самые низкие. Наибольшая численность всех групп микроорганизмов отмечена в варианте со средними дозами удобрений - Ы6оРбоКбо-

4. Почвенный метагеном прокариотного сообщества изменяется при сельскохозяйственном использовании черноземных почв на уровне доменов (увеличивается доля архей с 8,47% в залежи до 20,63% в варианте Ы60РбоКбо) и филумов (доля Actinobacteria и Proteobacteria была максимальной в почвах залежи, а доля Firmicutes - в агрогенных почвах).

5. При анализе таксономической структуры микробиома на уровне семейств выделен коровый (консервативный) и аксессорный (лабильный) компоненты черноземных почв. В коровый компонент входят более десятка семейств различных филогенетических групп с разнообразными экологическими функциями. Наличие корового компонента связано с

адаптивными возможностями и «генетическим потенциалом» почвы, а также свидетельствует о «биологической буферности» черноземов.

6. Аксессорный компонент почвенного микробиома связан с условиями среды обитания микроорганизмов, ответная реакция этих микроорганизмов на длительное специфическое воздействие (вспашка, внесение удобрений) приводит к замедлению/ускорению или подавлению/активизации развития микроорганизмов. На основе аксессорного компонента выделены микроорганизмы-индикаторы сельскохозяйственного использования почв: уменьшение доли встречаемости в пахотных почвах по сравнению с почвами залежи (Сопех1Ьас1егасеае, Ра/иПЬас/егасеае, НуркотюгоЫасеае, Буп1горИоЬаЫегасеае, ЕВ1017 и неатрибутируемые семейства филумов Ас1с1оЬас1ег1а, АсйпоЬаЫепа, Рго(еоЬас1епа); увеличение доли встречаемости в пахотных почвах по сравнению с почвами залежи (Сеас1егта1орЫ1асеае, М1сгососсасеае, КИос/ояртЦасеае, ЗрИ^отопас/асеав, ЕШп5301 и неатрибутируемые семейства филумов АайоЬааепа, Огттайтопайе1ея). А также микроорганизмы-индикаторы внесения минеральных удобрений: уменьшение в вариантах с внесением удобрений по сравнению с почвами контрольного варианта и почвами залежи (АК1\У874, БоИгиЬгоЬас1егасеае, Еп(егоЬас1епасеае, Ряеис1отопас1асеае, СЫеНасеае и ЫА семейство порядка МухососсаШ)\ увеличение в вариантах с внесением удобрений по сравнению с почвами контрольного варианта и почвами залежи (Chitinophagaceae, ВасШасеае, и неатрибутируемое семейство филума Р1гт1сЫез).

7. Таксономическая структура микробного сообщества менялась в течение вегетационного периода по сезонам. Наиболее разнообразным за счет увеличения долей минорных компонентов филумов ТаитагсИаео1а, Ас1с]оЬас1епа, ВаМегоШ^ех, Р1гт'1си1ез и УеггисописгоЫа отмечен состав сообщества в летний и осенний период.

8. Анализ биоразнообразия показал четкое разделение микробиомов залежи и поля, а также значительное влияние типа землепользования на структуру микробного сообщества, в то время как внесение минеральных удобрений не является фактором трансформации микробного сообщества и разница в таксономической структуре находится на уровне почвенной неоднородности черноземов.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Тхакахова, А.К. Микробиологические процессы в черноземной почве Каменной степи при применении удобрений / А.К. Тхакахова // Агрохимический вестник. - 2007. - №5. - С.12-13.

2. Кутовая, О.В. Влияние различных доз минеральных удобрений на концентрацию ДНК и общую биологическую активность чернозема / О.В. Кутовая, Е.С. Василенко, А.К. Тхакахова, А.У. Павлюченко // Агрохимический вестник. - 2013. - № 5. - С. 8-11.

3. Чернов, Т.И. Применение различных индексов разнообразия для оценки почвенного прокариотного сообщества по данным метагеномного анализа / Т.И. Чернов, А.К. Тхакахова, О.В. Кутовая // Почвоведение. - 2015. - № 4. С. 462-468.

4. Чернов, Т.И. Сезонная динамика почвенного микробиома многолетнего агрохимического опыта на черноземах Каменной Степи / Т.И. Чернов, А.К. Тхакахова, Е.А. Иванова, О.В. Кутовая // Почвоведение. - 2015. - № 12. С. 1483-1488.

5. Тхакахова, А.К. Сравнение биологической активности черноземов Каменной степи целины и в агроценозах при длительном применении минеральных удобрений / А.К. Тхакахова, Е.С. Василенко, О.В. Кутовая // Материалы Международной научной конференции: Экология и биология почв. Ростов-на-Дону, 2007. - С. 232-235.

6. Кутовая, О.В. Биогенность черноземных почв Каменной Степи разных экологических ландшафтов / О.В. Кутовая, Е.С. Василенко, А.К. Тхакахова // Материалы V съезда Всероссийского общества почвоведов им. В.В. Докучаева. Ростов-на-Дону. ЗАО «Ростиздат». 2008. - С. 115.

7. Тхакахова, А.К. Взаимосвязь биохимических и микробиологических показателей чернозема обыкновенного Каменной Степи в условиях длительного агрохимического опыта / А.К. Тхакахова, Е.С. Василенко, О.В. Кутовая // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием к 85-летию Почвенного института им. В.В. Докучаева. - М.: Почв, ин-т им. В.В. Докучаева Россельхозакадемии, 2012. -С. 456-461.

8. Tkhakakhova, А.К. Effect of mineral fertilizers on microbiological and biochemical characteristics of agrochernozem / A.K. Tkhakakhova, E.S. Vasilenko, O.V. Kutovaya // Geophysical Research Abstracts of EGU General Assembly 2013.-2013.

9. Тхакахова, А.К., Численность микроорганизмов миграционно-мицелярного чернозема Каменной Степи и концентрация выделенной тотальной ДНК в длительном агрохимическом опыте / А.К. Тхакахова, Е.А. Иванова, Е.С. Василенко, А.У. Павлюченко, О.В. Кутовая // Материалы Международной научной конференции: Современное состояние чернозёмов, Ростов-на-Дону. 2013. -С 319-322.

Ю.Василенко, Е.С. Изменение численности микроорганизмов в зависимости от величины агрегатов миграционно-мицелярного чернозема / Е.С. Василенко, О.В. Кутовая, А.К. Тхакахова, А.С. Мартынов // Бюллетень Почвенного института им В.В. Докучаева. - 2014. - Вып. 73. - С.85-97.

11.Tkhakakhova, А.К. Biological Activity of Agrochernozem under Different Anthropogenic Loads according to Real-Time PCR Data / A.K. Tkhakakhova, O.V. Kutovaya, E.A. Ivanova, A.U. Pavlyuchenko // 9th International Soil Science Congress on «The Soul of Soiland Civilization». Side, Antalya (Turkey, 14-16 October),-2014.

12.Kutovaya, O.V. Application of Metagenomic Data for Soil Characterization / O.V. Kutovaya, A.K. Tkhakakhova, E.A. Ivanova, E.E. Andronov // 9th International Soil Science Congress on «The Soul of Soiland Civilization». Side, Antalya (Turkey, 14-16 October), - 2014.

13.Tkhakakhova, A. Changes in the biological diversity and concentration of total DNA under the influence of mineral fertilizers in agrochernozemic soils, A. Tkhakakhova, O. Kutovaya, E. Ivanova, A. Pavlyuchenko / Geophysical Research Abstracts of EGU General Assembly 2014, EGU2014-10667, -Vol. 16, -2014.

14. Ivanova, E. Bacterial diversity of soil aggregates of different sizes in various land use conditions / E. Ivanova, A. Tkhakakhova, O. Kutovaya // Geophysical Research Abstracts of EGU General Assembly 2014, EGU2014-4309, - Vol. 16, -2014.

15. Tkhakakhova, A. Land management and seasonal changes impact on chernozems prokaryotic soil microbial community / A. Tkhakakhova, T. Chernov, A. Zhelezova, M. Ssmenov, O. Kutovaya // 13th symposium on bacterial genetics and ecology, bagecol3, (Milan, Italy June 14 - 18), - 2015.

16.Ivanova, E. Pyrosequencing of microbial community of typical chernozem in contrast land use conditions / E. Ivanova, O. Kutovaya, A. Tkhakakhova // Geophysical Research Abstracts of EGU General Assembly 2015. EGU2015-1075,-V.17.

Подписано в печать:

26.10.2015

Заказ № 10988 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru