Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация репарации повреждений ДНК, индуцированных хлористым кадмием

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Модификация репарации повреждений ДНК, индуцированных хлористым кадмием"

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНВЕРСИТЕТ Г ИМ. АЛЬ-ОЛРАБИ

2 7 !::он г;:;

На пропах рукописи УДК 575.577.117:599

КУСАИНОВА КЫРШЗЫ ЛПТЫХБЗГОВНА

.Ч0ДИЯ5КАЦИЯ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЩНИП ДНК, ИНДУЦИРОВАННЫХ ХЛСРПСТ1Р5 кддштш

03.00.15 - Генетика

Авторефэрат диссертации ко сопскшгаз учено! степени кглдвдата бполоппосгап кзуз:

АЛЛА ТЫ, 1994

Работа выполнена в лаборатории генетических механизмов репарации Института общей генетики иы.Н.Н.Вавилова РАН и в лаборатории генетики вирусов Института микробиологии и вирусологии НДН РК.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, проф. Засухина Г.Д. доктор биологических наук, член-корр, НДН РК, лауреат Государственной прешш по науке и технике РК

проф. Ахматуллина Н.Б.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Акифьев А.П. доктор биологических наук проф. Толмачев B.C.

Ведущая организация:

АлиатинскиЯ государственный университет им.Абая

Заэдта состоится »18 " U.hOhf¿L 1994 г. в /У час. ОО шш. ца соседашш специализированного Ученого совета К 14/А.01.13 при биологической факультете Казахского государственного национального университета т. Аль-Фарабн по адресу г.Алматы, 480121, пр.Аль-Фараби, 71.

С диссертацией иошо ознакомиться в библиотеке бдолошческого факультета Университета.

Автореферат разослан «i? И 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук Шалашатова Т.М.

Актуальность проблемы. Разработка методов повшепля устойчивости клеток и организма к негативным факторам приобретает особу» остроту в связи с нарастающим загрязнением окруаапдей среди различными химическими соединениями. Среди них особую опасность представляют тяжелио металлы, в частности соли кадмия, особенно широко рг..простраиешше ;; регионах с развитой тягелой проишлешюстью. У людей, проаагоакоях в районах загрязнения соедшештяыл кадмия, обнаруживается повышенный уровень хрсмосо.ших аберраций (Tang et al., 1990). На металлургических заводах, где рабочие имеют многоголетниЯ контакт с солями кадмия, с писокой частотой развиваются рак легких п печени (Hoffman, 1903: Чопиквпеилл, 1992). Известно, что поврзздения ЛИК, индуцированные соединениями кадмия, в омгао от радиации и ряда алггилиругаух соединения, плохо репарируг-этсл п клетках человека (Засунша п сотр., 1981: Ochi . 1933). Эгл обстоятельства указывают па необходимость разрзботи! способов аоглЕгенпя резистентности бпологотесгах объектов к окзогептяг» гоэдэйстсмы загрязнителей огсруггакцсй среди.

Одним из подходов, обеспечниагпга стаСильисать клетки, является модификация реппративной cüctcüw, восетенпвлапптая спонташгаэ и индуцированное поврехдетш ДИК.

К нзстоязеку врсмзпи известна «погочаолошщэ хзяясскя синтезпрсвапныз стимулятора репаратзшзнх систем, однако нкогге пз ran обладают собственной гопзтог.с-ипостю. В сглзи с с-';г?л шсцопт исследований в последнее время сместился в сторону использования бпогогсшх антемугагеаеп п определения va' взрспсктет.

Цель и задачи исследования. Целью пастс,™зй работа баля разработка научных основ chesgíem мутвтегглого дзалсяня соодпяешй кадмия в системах in vitro a in vivo ара псmocsi биогешшх сатпмутагепов (nrrepSepoaa, аскорбпповоЗ шелотп, ретинола).

Поставленная цель определяла пссбходгмссть ропопля слодуппдх задач:

- исследование действия хлористого кадмия па ДНК клеток человека в опытах in vitro.

- изучение влияния интерферона, аскорбиновой кислоты и ретинола па формирование разрывов -ДНК и six ресинтез при воздействии хлористого кадмия.

- анализ действия хлорзстого кадмия на различные втапы

репарации ДНК в культивируемых In vitro лимфоцитах рабочих кадмиевого цеха,

- разработка основ защиты генома рабочих, контактирующих с соединениями кадмия d производственных условиях, с помощью биогенных антимутагенов.

Научная новизна. Установлено, что предварительная обработка клеток интерфероном защищает ДНК , нормальных и репаративно-дефектных (хронически инфицированных вирусом кори) клеток человека от образования разрывов ДНК, индуцировашшх хлористым кадмием. Показано, что предварительная инкубация клеток комбинацией аскорбиновой кислоты и ретинола приводит к полному восстановлении кадмий-индуцированных повреждения ДНК. Впервые проведен биоыониторинг в популяции рабочих, контактирующих с соединениями каддая, и выявлено ингивироваше репарации ДНК по показателям образования разрывов ДНК и их ресинтеза, по реактивации и иутабильности вируса осповакцшш и репаративному синтезу ДНК. .Разработан и апробирован подход к стимуляции репарации ДНК в клетках рабочих кадмиевого цеха при использовании аскорбиновой кислоты, ретинола и их комбинации.

Практическое значение. Обнаружено полное восстановление повреждений ДНК, индуцированных CdCl2, при предобработке клеток комбинацией ретинола о аскорбиновой кислотой. Это позволило рекомендовать комбинированный прием витаминов А и С для защиты организма человека, подвергающегося мутагенным воздействиям соединений кадмия в производственных условиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

- доказательства стабилизации структуры ДНК и стимуляции процесса ресинтеза разрывов ДНК в клетках человека Нер-2 под влиянием интерферона;

- оптимальные условия проявления защитного аффекта витаминов;

- ингабирование процессов репарации ДНК у рабочих, контактирующих с соедиениями кадмия на производстве;

- bLuuojuiooTL стимуляции процессов репарации у рабочих кадмиевого цеха витаминными препаратами.

Апробация работы прошла на заседании мекпабораторюго семинара отдела мутагенеза и репарации Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, на расширенном меккафедральном семинаре биологического факультета Казахского государственного национального университета им. Аль-Фараби и в лаборатории

гене wat гяруссз Института мхсробиологш и вирусологии НАЛ УК. Осно.гг'о гтпучкко розультр-гк б или дологешг на заседанию! секция гспвгг.чвскяг аспс.тгсз пробле!"! «Человек н биосфера" (г.Ерсеоп, 1937); на Воесюянсм координационном соаецании ГГенетичесгсае последствии загрязнения с'срукапц'тП среда мутагенпгмя факторг-л!" (Моекаа-Сг.часкззд, tO'jO); ira меэдувэ родием сга<позяу?«> "Штш'.у.ч'!-.' к С!ю?'с:гитср:л!г" (г.Загорск, 1991).

По матерс-ад^м диссертации спубд,,гтопрно 7

няунпгх р от,

осгем даооертпшг.; м ое структура. Диссертация состоит из зо(\веккя, сбзэдо литературы, 3 глав, заг-шпения, шгаодоз я

у::л2^г-?ля лпгерзгури. Работе »зло*з:гз «а__стротсдид

нз!СПспчс:?ого 7схс«<з. еодерг:? _ тзбдяц и _ тг?суга:ов. Cn-:co:t

¡штируечс-l лг.торзтурн вк-yiwт _ пазвп;1*Л.

содьт^гкиз РЛВОП<

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРУ

1.1. Гепет:!'1ес:с!с о^фектн тягзлга гзталлов и недгитагц кх

дейетгглл

К пвдаоски? прск.'ьдг кпг'.сплено деемтотпо мзогй сесдсепЛ с •: ;:а'п;огэг-':'':с*5 гкт»:п:;сс~:< солсЛ тг"¡олчд «»о?гдкоа (Еягаяас-л- J^cr.ari, 1990$ A-hfcy, 1990 и др.}. йаедодсвагпя

по гекстс.«:с:гп:ос7.ч ».«зтяллея яот«с.г.тг. что в сдкгедмаста

сг хсрок?-?рз соэгзе.'пл oti nc5.«~£sr чдсссту СХО л «-.гтеролдер (Ghosh, 1953$ Forai. 1939 и др.,). 5?с:гл тякгпи: шталдоэ vvryx Е'-'знвахь едаючшге и ргзр-гп Л'!', сбрггогтаэгь сгсткз

ДНК-ДНК, ДИХ-бсдек» котерпэ трудно' рззар-тпттся pinspsrsEnra сисгенс"! кяэтпа Oiaa-nott, 1937$ Coatí, 1?CS ri др.). К груше пезшептгого ряскя отгисясся ргбочяз гзталлург.дкегдтл. зздедез, i:отог-'о пг,*гвт дгагельшй kc:jtc::t с совдзгэягг.:? уяхояа цэгаггза.

1.2. Е'оггТзкзцял процесса мутагенеза з рзпзрзцпя ептпуутагеппил

[йюгочисл-зпппз пкепор-.^'.ептн п сЗлзстл епткмутагепезо продемонстрировал! калило ciponoro icpyn пгдеств, подавлягсот спото1пш9 îî кпдущтровглпгвз путают. Акцент ксслэдовашгЗ H последнее время сивехгиоя п сторону Еспользовашгя скогеппш антнмутэгенов, к иоторпм относится 1п;тзр£орсп п вптемшш.

Выраженная антимутагеннзя активность Сила обнаружена у штерферояов, которые стимулируют различные пути репарации и сникают уровни ХА и СХО, индуцированные физическими и химическими мутагенами (Засухина и сотр.,1979-1990).

Классическими биогенными антимутагенами являются многие витамины. В отличие от ИФ для витаминов характерна специфичность действия по отношению к конкретному мутагену или классу мутагенов (De Plora, Ramel, 1988). Существуют отдельные сообщения о ббльией эффективности применения комбинации витаминов (Georgian et al.,1986). Действие ИФ и витаминов по отношению к кадмий-индуцированным повреждениям ДНК не изучалось.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура лимфоцитов периферической крови. Гепаришзированыую кровь отстаивали при комнатной температуре 40-60 шн., затем стерильно отбирали сыворотку, содержащую ]слетки и культивировали по стандартной методике (Uundeford, 1965).

Мутагены и воздействие мутагенами. В работе использованы CdCl е концентрации 10_6М, 5к10"6М при вкспозиции 20 часов и 4-штрохияол1ш-1-оксид (4-НХО) в концентрации 10 И при вкспозвдиа 60 мин.

Аптимутагеки и обработка клеток анткыутагенами. В качестве алтшутагенов использованы интерферон, аскорбиновая кислота и ретинол. Обработку клеток лейкоцитарным а -интерфероном ("Signa",США) в концентрации 50 МЕ/мл, аскорбиновой кислотой (10~6М) и ретинолом (25М£/мл) и их комбинацией проводив! за 20 часов до воздействия мутагена. Рабочие кадмиевого цеха принимали еседаевно по 500 мг аскорбиновой кислоты и по 33000 ME ретинола в течение месяца. В качестве малых доз ионизирующей радиации . принималась доза 10 рад у-облучения (установка ГУПОС с источником излучения 1370а мощностью 3,62 Гц/мин).

Определение возникновения однонитевых разрывов в Д1ГК проводили методом хрсмотогафиа клеточных лизатов на колонках о гвдроксиапатитоа (Ridterg В.,1975). В логарифмической фазе роста клетки метили Нэ-ти!Л1дш1сы (уд.ак.18,6 КиХммоль) с

дезоксиаденозшюм (50 ыкг\ш) в течение 24 ч. Хромотографиа проводили посредством ступенчатого градиента натрий-фосфатного буфера рН 6,0 при температуре 60°С. О количестве разрывов, .судили по степени уменьшения даунитевоЦ ДНК.по сравнении с контролем.

- ? -

Реактивация и индущгрованшшй мутагенез вируса осповакцшш. Выживаемость вируса осповакцины для кавдого образца вычисляли по разнице титров вируса в контрольных и обработанных мутагенами клетках. Мутабильность вируса учитывали по размеру бляшек: мелкими считали бляшки менее 2 iat.

Определение репаративного синтеза ДНК. Уровень

репаратишого синтеза ДНК измеряли по вюочени» Нэ-ткмидина ( "ArcerGham", Англия, удельная активность 49 Ки/мл) в общий пул клеток (10й кл/мл) при подавлении репликативаого синтеза ДНК оксимочевгаюЯ (10 мМ) в течении 30 мин. За индекс стимуляции репаративного синтеза ДНК принимали отношение показателей счета радиоактивности (имп/мин) проб после воздействия мутагеном к • .радиоактивности в контрольных образцах.

Определения скорости седиментации клеточного нуклеоида (ОСС) проводили в градиенте плотности нейтральной сахарозы.

Математическая обработка полученных результатов проводилась на компьютере IBM РС/АТ-386 по программе, разработанной в лаборатории генетики вирусов.

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БИОГЕННЫХ АНТИМУТАЛЕНОВ НА ДНК-ПОВРНДДАЩУЮ АКТИВНОСТЬ ХЛОРИСТОГО ВДЩЯ.

3.1. Действие интерферона на повревдекия ДНК, индуцированные хлористым кадмием.

В экспериментах использовали перевиваемую культуру клеток карциномы гортани человека (Нер-2) при предварительной инкубацин клеток о аа-иптерфероном (50 МЕ/мл).

В таблице 1 представлены результаты по индукция разрывов ДНК п их росинтезу в клетках Нер-2, обработанных CdCla в концентрации 5«10"6Ы. В контрольных клетках количество двунйтевой ДНК принималось за 10035 и дальнейшие расчета проводились в каадсм опыте относительно своего контроля. Из данных табл.1 следует, что в необработанных ИЗ) клетках происходит существенное снижение количества двунйтевой ДНК, которое липь незначительно повыпается в условиях постинкубации клеток в среда роста в течение от 4 до 24 часов. Это подтверадает неполную репарабельность разрывов ДНК, вызываемых солями кадмия. Интерферон стабилизировал структуру ДНК - количество разрывов после обработки мутагеном было минимальным (доля двунйтевой ДНК составляла 9456 от контроля).

Таблица 1.

Действие С1С1 па ДНК клеток человека (Нер-2)

Врзмл пост- Количество двуштевой ДНК,

¡¿пкубации, Я от контроля

час обработанные 1К? не обработанные »№

0 '3414 72±5

4 - 93 ±7 7916

24 еа±б 78-5

Изучение еодга1еатащ'.о:-шых свойеть "неточного цуклси«ла выы^ц-э рсзлгая в ССС (относительно!! скорое?» седиментации) г^г^ду Ггродобработсшилк и иеобработ&ьишл кяетка\п после ссзгэйОх-ЕЛ« СиС1„ (р::с.1). 4-часовая иосгишсубеция ниссробот¿.¡тих кял'ок в сродо роста цдаодала к зиачательисау ошгсзшш ОСС ку!!лзо:да. Шролтоо, ото происходит за счет всзшишоиошю Яауцяъсяя. разр^аоа ЫИ, сорозугадася в результате ьцуаш:зшш падцато-йшах 2лэр1;стим каделеи непразден;/: дес. ПродоСрг.ооп:а

Раа.1. Сзй^за^сро^гадэ овоЗсяза киегочшх суклсоздоз а глеики чолозока Нор-2: 1- без кг, 2- с 3-«олтроль.По оси ебццсс - цргмя постинкуб&цц;: |у;сто:с (ч), по оса ординат - ОСС нуклеоида (Й от контроля).

Через 24 часа постинкубвцш количество разрывов ДНК 1 в клетгах сокращалось. о чем свидетельствует возрастание ОСС нуклесида, однако полной репарации разрывов ДНК не наблюдалось. Предварительная обработка клеток ИФ приводила к большему, по не полному воссоединению разрывов ДНК.

Таким образом, мы обнаружили, что интерферон обладает выра^ениши защитными свойствами по отношению тс мутзгепем, зызгазагаи:*! перепарабельные поврегдепия ДНК (представителем которых' в догшом случае является хлористый кадмий). Предполагается, что ИФ индуцирует в клетке какую-то новую систему зениты, явяпэдукся безошибочной и работающую до и посла репликации..

3.2. Действие интерферона в хронически шфпвфовэншх клетках человека

Для выяснения влияния 1'Л на ингибнрозяпшк системы реппрзцш были использованы хрстгческн инфяцирсзснте вирусом"кори клетки человека Нер-2. Еггрус при гроппческо.'! гнфепсл! находится в интегрированной с клеткой хозяина форме, поэтому ота п!1утр:псл-эточзшо вирусы обладает абсолютной нечугсггптзльяозтьи :: протнвсп'Фусисму де2ствы> КЗ (Колснтша И.В. и др., 1933).

погод проведением опытов оярздэляли ucjctigctbo слоятшзшх разрызоа ДНК в пе^фищтрозагошг и ют^аерсасплш: клэтеах язтодсч хроматограф« клеточных лизптсв на ГЛЛ-е. Прз эточ ос'зэругалось, что в кехпфплфовзпних ¡слетках количество дпупитевсЗ 72 ЕС составляло 04?, тогда как в ппфшяфопяшпе: - только 15%. ?скоэ сгаегепяе доли дзунятевей ДШС в zpcmriccici жгтодврэз&пях плетках tíoano объяснить, либо вероятлоЗ Д!?сте6г?глсглисй ео за счет постоянно р-зпродуцярущегося птруез, .тзбо .ггягггсттрсвзпнеи ферюнтоа репарация. Обработка ПЭ npsaíjnecia пэ пс:.:егалз ко.'ппества спонтанных разрывов ДШС (G1% а ппт&стпп я 7 С."5 - и инфицированных клетках).

Iipri вселедовшшп действия CdCl из г^з&Чрсзаспю ^чэткз било показано (тя.бл.2), что п таких глзтаг д!!К Солее устойчива к действии CdCl2, чем в пормалышх клетка?. tí:o.tWecíno дпукйтевоЗ ДНК в пеЕпТгщйрсвапшл Клетках cocíüiUstóo 12,1 от контроля).

ВОЗМОЗЯО ЭТО происходит йз-зп koití¡topíai!ÍIOEffli£ íí3!.'eH0I¡nñ в

хроматине, обусловленный ппл^чйеМ йпдуцйроййшШ вируешпе болков в клетках.

- 10 - Т0бЛНЦ& 2

Действие CdCln на клетга; Нар-2, ¿тропически кнфицаровагаше вирусом кори

^ре.'/л пост-ina:y6airjm, чао Количество двуштевой ДНК, % от контроля

нредобработашые ИФ не обработанное №

0 100»2 05 ±2

69i7 59-6

24 9b ±Ь 75±5

Обработка IU: п-.¿гасла к ссибалиэаца»; структура ДПОС, ко после 4-х часовой ¡Еа-^бащ."! в срэдо роста происходило накэаодшс P£,3Kœob Д1ЕС ка;: б цредоСрг.ой'гбК'-^и: Щ' глеъ-ях, чек к s злоткзд бе:; К;', Поело 24 часоч иоси^кублиг.] I'ZCÏ;:-: ИСОЛГДЬЛН.«, г когозеновлошгэ сяугдурн ЕШС. Б causas о К* зо ./го «зрс:лп б культуре лсг.оласл струи1; yps Д:Ги госстгпюыи^сь иракт гчас.к:; цалюетью.

Таксы оброзо;.!, mj::;-îo щмде&лагатх», что в ьтфгшфиьызиЕ ïai&îîiîix с кодаглошс»; а;ате).'о-: ыхцизношю;- валэдтое

д-,»2ст££-.о ccv.'wcïenncTca но порез х-агл, ¿этзС'дргггшдое и ciioïcî-a

3.3. EnaiZiiu дс:» рздгкшга кв ездяйсу р^ри-сок iulv

их ргожгик в c6p2<fcwiSEi'.; Wei..

s v^îi'i;';-: ; :v;;:.:v : n îie^cfiU щ^лгслсд,,

лсдупигс» zïiïzzvz, с глот". Од*;с..э, со

х;с«сльс.ог,с!л::оь чел леке-

1214 и il') uîï уровиэ 20 nasoesa (табл.З).

Как бздко кз и'абл. э, еэсло оолучо-г^я иалиа дозой ^-лучоь обрабола пз^лзовьешх ^броблзстов Cd01„ па пршкдал& и

~ 11 - Таблица 3

Индукция разрывов ДНК и 1а ресинтез при воздействии С<1С1 в условиях предварительного облучения меток малыми дозами радиецга

: ^эрггляти опчта Дзунитевая ДНК.Й от контроля

С^Сж 2 СйС1_| 20ч. иеотишеубзщ-гл п среде роста *0 рпл + 4ч. псотлт'этгяплм ■> СаО! а 10 род ^ 4".. ?0 ч. поз7;згкубг!»:к в сседо роста 75±5 73±2 V 97±3 -;з±з

г^зпзгагозотгд р.'.згл'зов дШ'.. Количество даугахо?сз ДНК составляло ■}']:*. от колтролл. Эти /глпгпе г.палопш'и о р.-,:'оо :;0луче:пг:!гл по клетках Нзр-2, продобгзботзлглх ?!» (колотсство л."у^'.тг'пс.'1 Сило 94*. от контроля).

Не '"¡о птгедполо'ат», что о клот!«» существует е/тазая скотома с::т1тн, згегтаипуетса как и случае сзр''6отгш гслэтзк !■!>,

так и ггрт ядапттпшем ответе.

3.4. Действие ткгитоп из певре^денкя ДНК, стдуцпруеглге хлорзостга *;'см

Влягл тле пятоюпоп па рензрпц^э сощззэдешй ДНК, йздуцирозапша <МС1„, определяла п ку.шгдзт>уе'ла: 1п уЛгго лвДОцзтах пелезоко, проотзрктояьяю сбргботгпзгг аскорбиновой гаслотсЗ (10"®М), рэ-пшолом (25 ?3/ил) к тт. ксУбпггцшЗ. В качество ре^оревс-нутагепа Соя зспольаегса 4-И'О (УВ-игмэзпк).

Результат»» о того иеслздопвпяя пролсгвалгш вя ряс.2. Из рис. 2 видно, что яреяпзрзтвльагя сбгзСспм лта^сштов, культивируемых 11*1 VIаскорбпясзсЗ клслстсЯ соссйрот тгокоторув устогнипость ЛИК :: ^зрглфСЕошпэ газргсез л опг.'ул^рзгвг процесс восстановления псзроэдсппЛ ДНТС, гфппрэвэявях хлорготвд кадмием. Обработка 'цгт^мипем С щи лштольеовпптгп в качество .чутагеи.ч 4-1Г.С0 но дзпя.'; тамого 3 огалчпе от

аскорбиновой ?:исдотц реткиол не оказывал существенного влияния на чувствительность ДНК как к Сс1С1г, так и к 4-11X0. Однако обработка клеток влтаг&шон А приводила к активации процессов ресинтеза ДИК при действии Сс1С12. При отом такая обработка ретинолом не оказшзсла влияния на процесс воссоединения разрывов ДНК, визиваемш 4-11X0. Предварительная инкубация клеток с аскорбиновой кислотой в сочетают с ретинолом сопровоздалась не только ярко виракэнншл задитнш оф$о ктом, но и практически полны,! восстановлением исходной структуры ДНК как б огштах с хлористым каджеы, та;; п 4-НХО.

100806040200

гН

гй

>

Л

и /

/ /

/

ä

у

У

II

III

Rio.2. Сормароасицо разрдаов ДНК к шс росинтез в яшфсцктах,' ¡сульотЕУрованниг in viti-o до и после обработки вктаганаки I - до обработки bht£.v^u£tj:i; II - после capaöoiioi витамином С; III - посла обработки ептелидом Л; IV - пселе обработки конбаяацаеС шгшшоз А и С. Количество двупптовсй ДНК (й от контроля) ПрП вэздсйс2в5ш Cd01„ (1) ц 4-НХО (2). ЦЗ - i

J ES3 - 2

Тыаш образом, ворзпараболшио для корузльнг-а плеток повраздоыпя ДНК. шццгцированиш OdCl , переходят в рзпарабелышэ, еага клетки предобработок комбинацией аскорбиновой кислоты и ретаасла. Uoiao предположить, что в основе втого в^фзкта дсиаг сшюргиднш взаимодействия витаминов, когда каздый из ш-та.*дшов скшуллрует определенный отах репарации. При втем очевидна BarjiocTb использования антимутагенов с различными мэхшиоыана действия да стимуляции репаратпвнше процессов.

Для сравнения защитник эффектов всех изученных антимутагенов бил введен коеффнцент защ!ти клетки (К3 3, который вычисляли по формуле

(К-О)-(К'- О')

К =--. 100Л5

К-0

э

где К - количество дзунитевой ДНК в контроле, О - количество двузштевой ДНК в опыте с мутагеном, К' и 0' - соответствующие величины в опытах с применением запиты (т.е. с витаминами, ИФ и чалзш дозглс! радиатш).

В таблице 4 представлены коеффиценты зашиты ¡слеток от действия ГГР1-' использовании всех исследовашшх

антимутзгенов.

Таблица 4

Сравпегше защитного эффекта ИФ с действие!,! витаминов (аскорбиновая кислота, ретинол) и малых доз радиации

Тип клеток КосДОздепт зааити (К )

лзлфоцитн фкбробластн Нер-2

Условия форт-ировашхя клеточнсД з£:циты вит. С вит. Л Л+С 7-радиация КЭ

ДеГ;ств:те С<101о 21,2 8,5 32 83 70,5

Как видно ':з табл.4, з случае предобработка клеток оскорбигосой кислотой его яолачкна невелика (21,2%), кетиполеи ецо менызэ (8,53), при использовании сочетания

В1:тс.;,"аюз А + С косц^щг.епт К возрастал до 32 Я. вэлтпш 1С достигал прч предобработка клеток КФ

псяолъзеяйчпи калкх доз радиащз!

происходит кпдукщш новогоища рпботагдей до я после рэшккашга.

(CS3), когда, базоозбочаой

Начбольпя! (793) п вероятно, репарации,

4. изучение состояния реплративных систш в клеим ЛВДЕЙ, длительно К011ТАКТКРУШК с соединениями клд?ш И пути прост шшстики генетических поврешшш днк

4.1. Еиог-гопаторхшг в популяции рабочих, контактирующих с хлорлстим кадмием по критерию определения репарзтихшой активности

Для определения чувствительности ДНК бшш обследованы 1.', рабочих кадмиевого цеха со стаже« разоты от 0.5 месяца до 23 лет.

Таблица 5

Дойстиис Cd Cl и 4-1К0 на днк люлфоцитов рабочих, контактирухаках с соедшшгеиши кадмия в процессе производства

Донор Двунмтевая ДНК, % от контроля

CdCia CdCl +20ч 4-НХО 4-1Е0+20Ч Ctrí;

постинкубацин постинкубещт paöovu

контроль 7U3 8б±2 60i4 95±ß

1 60±4 73 ±8 68¿3 70Í6 1b

2 66±7 64 ±5 53*3 64i6 22

3 6413 59±3 74¿2 9U5 11

4 58±5 65í4 6Q¿7 95±3 4

38¿7 . 50±3 70i4- Ö2±6 4

6 57±2 65¿2 67í5 75¿7 23

7 70±4 7öib . 65±> 4ÍÍ¿4 15

8 б9±5 72*5 71¿3 82±4 13

9 62*3 7в±4 7á±7 96±6 1.5

10 37±4 32±3 S5±4 68±5 0,5

11 64±7 7'jíé ' 67±6 58±8 13

12 73±4 70¿5 75±6 89±3 11

13 74±6 78±4 02±3 100±3 28

14 7 ИЗ . ... 75i'í 79±6 76±4 10

^лфоцздш рябочаз, культявпрусмге in vitro, обробат»шояа 0d01„ (10"6 М). Эта концентрзшя тзит-.ша «£?чк?'ольнев иатиестсл разрхвов ДйС в клетках здоровил доноров, и процесс рэсиг.тозэ протекал без изменения. Еолее оысокке концентрации отсЯ соли рчзллали персларзболыше поврякдегая "ЯК.

Из табл. 5 видно, что п лпг^оцчтах здоропих допорол, котслыо «лугьш з качостге контроля, используемая нсгцентр'нгая CdOl. тл.ллглала незначительнее колэтестпо paipimou 3 лта^цитазг 3

;гз 14 рзбоччх, обработягашз CdC'i„, ааблэдалось зогкшшсвзшгв ббльпего, чем в иорде, число рзпрнсоз в Б случаях

•-¡улетлитол'люогл ДН1' мутзгоау лестопэрло не отличилась ci гдоропыг .«стерев. П;?1! лсололу:: юА "sictycoifni "леток в чрэ.чо рос?'1 '! "С рсСО"Т!Х ЯЗ '4 ЛС1?Ь 'ПГГЛбЗГОЧвГОЮ ЯрСЦЗССОа

jn.iK. а у 4 бл"л лллл>лл£: дплн?л£лая .;ог1\-:дл!.л;Л €л >до2гз-;!?лы:о, у сбелодопоттлах г^бс^и

::сб;.-здплось глубелоз :лп';лгр~лгтг:е ¡рттгц-гч ЛИК.

РоздсПотпно на ' ••¡•""ч то* лл ргл'олл: 4-iiXO пелтзгла, что у 5 гзйлллл леллл^етго лл'Л-лоп ."^Гл 'Tyjv"'. ле ол лч;..;л;:!л лл лелтлел'лл'л .т.норог,, ту"- /ЛГЧ л . о "о.";': ус?с*пттт-л " ля^сл": л '/."ого ••«"¡»••.г'-ао: г; случая;:. нг;Лл.:л?ллл< лслллсллс л^лл-лг.л'л; .".¡К. Способность л:; лоуптоп р-»бг:чял :: с о с 'Т т г г: т vr- f s т ь лечтл'пенлл " о•:j- о 4-Ю10, б::. лсл:оли:сл ь слугу:», л О

и л 3 цлу'-тял п'блллплпсь лпллолулол лоллпделл'л п,:л

л.Л' -.-( лотцзлтр ллл ,-iiv} л ллел-л: лло'ллмл лслолом лглс.:гг.г".;ггзгг/гез ллолелл'лтэ лрглллпекл г.ог-юо'г1'л.

ллл;л crnsc.:, слплул'лл'л'.'л о^уллплг'лю йлпллто :ог'г:лос?лп гллл'тсл л ;:лгл2лрог:ллтч лсс^лсзз лглл'лл "л< л

-"ТЛ'Л; сбс::?;:слг.лт";г р-бо'л'л ло л ллолл'?"л геплголтлт^

ЛР'ЛЛЛЬ "'СЛЛОЛ ЛСЛГОЛ.ЛТЛЛ "ГЛЛУ ОТ"Л"Л! л :fc

лс:;:".'•-.'■:-"■ ;.:л пг.л л-"<";лллл !"ул?Г",ллл р^'-р'-лзл "'л л tix лсспдкдсП: v.~з лсЛлзллггпсъ.

4.2. Елгяттпо лслопблчслоЛ л:юлс?!!г р^лллелл и лсм:;;лгл;п1 ттл ллпелаглл>ту:о лглкллосль а ^т^ с'ли^х га^оллл

Рел;:р2!лаз яоврэ.^ип!:!: .ЩПС» ¡.шдущфоиэпти CdOJ ,, спрздэллл'! л Ky.!LT:iDi;pyei.'ti:. in \?itro рабочих, которче з течвшв

носяца ^медаезно нг-плп.«ал:; оокорбшгову» гаслоту по 0,3 г, ретинол - '53 ООО М.Е л: их ксыСкиащда. В качестве psftspeuc-мутагепа прт.;знялн -1 -НХО.

Влияние аскорбиновой кислоты, ретинола и их комбинированного воздействия на репаративный синтез ДНК (PC) определяли в индексах стимуляции при использовании caci и 4-НХО в лимфоцитах рабочих кадмиевого цеха и здоровых доноров. Обнаружено ингибирование PC ДНК при воздействии хлорида кадмия в лимфоцитах 10 обследованных рабочих.

Стимуляция PC ДНК после приема аскорбиновой кислоты обнаружена у рабочих при воздействии CdCla (индекс стимуляции 2,76 против 1,13), и прием витамина С не вызывал стимуляции PC ДНК при использовании 4-НХО щ: у здоровых доноров, ни у рабочих.

Ретинол вызывал незначительную стимуляцию PC ДНК, индуцированного 4-НХО, » бил невффективен в случае обработки клеток хлористым кадмием. Комбинированное действие аскорбшювой кислоты и ретинола незначительно повышало уровень PC ДНК в лимфоцитах рабочих при воздействии использованных мутагенов.. В лимфоцитах контрольной группы усиление PC ДНК наблюдалась только в случае CdCl„ (индекс стимуляции был 3,37 против 2,38 без витаминов). При етом следует отметить индивидуальный ответ кавдого донора на прием витаминов.

Таким образом, прием витаминов рабочими сопровоадался усилением PC ДНК, икгибировашюго вследствие длительного контакта с солями кадмия.

lía рис.3 представлены средние значения по влияшш витаминов к их комбинации на образование разрывов ДНК и их ресиитез. Из рас.З видно, что прием аскорбшювой кислоты не оказывал существенного влияния на чувствительность ДНК к CdCl0 и • на процесс восстановления nonpesyseiatö ДКК, как в клетках рабочих, так и здоровых доноров. Сходный е^фэкт обнаруяей в контрольных метках, обработанных 4-НХО, но прием аокорбгаю.юй кислоты значительно уменьшил количество разрывов ДНК.

Применение ретинола показало небольшое улучшение процесса восстановления разрывов, вызываемых CdCl2, тогда как воссоединение разрывов, вызываемых 4-НХО, практически оставалось на том s:e уровне.

Прием рабочими комбинации обоих витаминов выявил выраженную стимуляцию процессов восстановления ДНК как в опытах с CdCl2, так и 4-НХО (и в том и в другом случае наблюдалось воссоединение разрывов ДНК практически до уровня контроля). Кроме того, в лимфоцитах доноров контрольной группы наблюдалось ' повышение

устойчивости ДНК при действии обоих мутагенов. Из втого следует, что плохо репарируемые поврекдения ДНК в лимфоцитах рабочих, индуцированные солями кадмия, переходят в репарируемые. Необходимо отметить, что во всех случаях приема рабочими витаминов наблюдалось существенное снижение спонтанных разрывов ДНК, что отражалось в увеличении количества двунитевой ДНК в контрольных необработанных мутагенами клетках (в среднем на 19 % в случае комбинации витаминов, на 13Яь - в случае ретинола и на 10$ - в случае аскорбиновой кислоты).

Показатели мутагенеза вируса отражают способность . клетки хозяина к репарации сублетальных и предмутациотшх повреадений ДНК, которые реализуются в мутвции в случае, если они не репарируются.

Рис.4. Реактивация и индуцированный мутагенез вируса оспо-вакцины в лимфоцитах рабочих, контактирующих с CdCl2 до и после приема витаминов; К - здоровые доноры. Вирус, обработанный: I - CdCl2. II - 4-НХО, III - спонтанный мутагенез вируса; 1 - без витамина, 2-е аскорбиновой кислотой, 3-е ретинолом.

На рис.4 представлены средние значения по реактивации и мутабильности вируса осповакцины в лимфоцитах рабочих, контактирующих в производственных условиях с солями кадмия, и влияния на эти показатели витаминов А и С.

Средний показатель по реактивации вируса осповакцшш, полученный при обследовании 14 рабочих, показал амкенную способность клеток к восстановлению сублетальных повреждений ДНК (выживаемость вируса в клетках рабочих была достоверно шике, чем в клетках здоровых доноров). Соответственно, в лимфоцитах рабочих были повышены показатели мутагенеза вируса осповакцины, индуцированного как CdCl2, так и 4-НХО по сравнению с таковыми, полученными в клетках здоровых доноров. Из низшей части рисунка видно, что прием виташнов нормализовал процессы восстановления: вызсгоаемость вируса не отличалась от показателей в клетках контрольной группы. Индуцированный мутагенез тшсхз характеризовался выракениой тенденцией к сшшенхпо в лимфоцитах рабочих после приема аскорбиновой кис-поты и практически по отличался от контроля после приема ретинола.

'Гают.1 образом, использоватае в качестве антиыутагенов аскорбиновой кислоты, ретинола и их комбинации у рабочих кадмиевого цеха позволило выявить четкую стимуляцию процессов репарации ДНК. Это. особешю вайю для группы рабочих с большим стоке!,) работы, для которих характерным било ингабирование ДНК по всем изученным параметрам. Исходя из представленных результатов моию предложить использование комбинации витаминов А и С б качестве метода снижения мутагенного потенциала тяжелых металлов.

выводи

1. Было исследовано действие хлористого кадмия на репарации ДНК клеток человека, культивируешь in vitro л модификация этих процессов интерфероном, витаминами и их комбинацией.

2. Установлено, что предобработка интерфероном заседает клетки человека от образования разрывов ДНК, индуцированных хлористым кадмием.

3. Выявлены оптпмалышо концентрации аскорбиновой кислоты (10"6Ш и ретинола (25 МЕ/мл), проявляющие наиболее четкую зациту от последующего воздействия CdCl3 в лимфоцитах человека. Показано, что витамин С придает ДКК устойчивость я -стимулирует процесс воссоединения разрывов ДНК. Ретинол но влияет на ■

чувствительность ДНК к действию CdCla, но приводит к активации процессов рссшггеза повреэдешй ДНИ.

4. Предварительная обработка клеток комбинацией аскорбиновой кислоты и ретинола сопровождалась полни.) восеодинениеы разрывов ДНК индуцировашшх хлористым кад».и:мем.

5. Обнаружено, что малые дози /-радиации, шц;уцируь";не ь клетках человека адаптивный ответ, способны защищать ДНК от действия хлористого кадмия.

6. Проведен биоыошзтор:шг в популяции рабочих кадг^геисго цеха к коррекция повреадешй ДНК лихфэцитов с помочь» вптаыишшх препаратов. В обследованных лимфоцитах U рыбоч'.гс кадмиевого цеха со стажем работы от 0,5 до 23 лет обнаружено ингибирова!гле репарации ДНК. Зарегистрирована индивидуальная чувствительность Д}ПС рабочих к хлористому кадмии.

7. Прием рабочими кадмиевого цеха одновременно витаминов А и С привод?? к стабилизации структуры ДНК и стимуляции репарации поврездзниа ДНК, кидуцированных хлористым кадмием в лимфоцитах их крови. Эти условия могут быть рекомендованы для снижения генетических о^фоктов соедшюний кадмия у людей.

Список работ, опубликованных по тема диссертации

1. Индукция хлористым кадднем слабо репарпруе;.:их новрэздесЦ: ДШС. Тезнсн докладов но заседали сеюдан гвнота:час:с:и аспектов проблем "Человек к биосфера". Ереван, 1937. С.52 ( s соавторстве с Колоншюй И.!.:.г Засухнпой Г.Д., Васильевой U.U.).

2. 12ехсшхшы нарушений рапараша ДНК в клетках человека. Интерферон зеаетао* ДШС хроксчески кафздзроьашйн. клеток от позреэдешш еыацваоша хлорлешм кадапен. // Генетика. 1939. Т. 25, N 25. C.1Ö72-187Q ( в соавторстве Васильевой И.М.. Колонию:? И.В., Богомоловой H.H., Звсухшой Г.Д.).

3. Аскорбиновая ich слота модифицирует репарации поврзвденця ДНК, индуцщюзашшх 4-НХО и хлористш кадмием в лимфоцитах рабочих, контоктпруших с солями кадмия. Тезиси доводов Всесоюзного совещания "Генетические последствия загрязнения окрукащей среда мутагепшл-и факторами", Ыоскас-Самаркаад. 1990 г. Стр.61 (в соавторстве с Васильевой ИЛ.!., Чопикашвили Л.В., Засухнной Г.Д.).

4 Мониторинг в популяции рабочих, контактирующих с солями кадмия, на основе исследования теста на репарации ДНК. // Матер.заседания Секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера", Караганда. 1990. С.34 (в соавторстве с Васильевой И.М. и Засухиной Г.Д.).

5. Стимуляция репарации ДНК у рабочих, контактирующих с хлористым кадмием, витаминами, используемыми в качество антимутагенов. Доклады Академии Наук, т.318, N2, 1991, С.441-445 (в соавторстве с Васильевой И.М., Чековой В.В., Львовой Г.Н., Чопнкашвили Л.В., Засухиной Г.Д.).

6. Подходы к снижению мутагенного потенциала загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами на основе данных мониторинга в популяции человека. Тезисы докладов Международного симпозиума "Еиомонитсринг и биоиндикация". Загорск, 1991, С.209 (в соавторстве с Васильевой H.H. и Засухзшой Г.Д.).

7. Защита от действия хлористого кадмия клеток человека, предобработанных витаминами, интерфероном и предварительным у-облучением в малых дозах. Доклады Академии Наук. Том 322, N 2, 1992 г. С.398-401 (в соавторстве с Васильевой И.М., Чековой В.В., Ахматуллиной Н.Б., Засухиной Г.Д.).

КУСАШНОВА КЫРШЗЬ АИТЫКЬЛ ЦЫЗЫ

Кадмий хлормеи вакымлалган ДНК репарацинсын С'е.чещлгу"

Ьул енОектЁ оиогешик антицутагендерлш камдий хЛормен лакыцпалган клеткалардагы кыэиечi зирпелген. Ьерпеу ыти-Kecinne инторфверан, вишшндер сек!л.г1 Оиогещпк ашиуура-генлер жане из кушт1 ^ - свулес! курылымьш нигайтвди капе клеткадагы репарации куОылысым жеделдетедi деген 7ужы-рыыга келген. Муншен патнр кадмий eHiipiciwie icieflTin кумыскерлердпн клеткилирынтги ДЩ-га тнген закиадар да эер-i-телген. Олардкн клеткаларьшла репарация отказу кушпин теже-ленгещиг! ашкталган. Оеыган орай жогарыдагы оч тияириОелершен алгин деректерге гуйене опхрып, кумыскерлер-Л1 шпаминдермен i-ayuKiupy колдары усьшилган.

"Modification of Repair of DNA Damage Induced by CdCla"

The thesis is devoted to biogeniouB antisiutagenes influenoe on CdCl DNA-darcaging potenoial in human cells. During the research the oell pretreatment with interferon, vitaraino and low doses of 7-irradiation results in stabilisation of DNA struoture, as well as in stimulation of a DNA damages repair were obtained. Por the first time, the biomonitoring in a population of workers kept in oontaot with Cd salts was held out, and inhibition of DNA repair is shown. On the basis of data Obtained from "in vitro" tests, the approaoh to a stimulation of a DNA repair in oells of workers is proposed.

KUSAINOVA KYRMYZY AITYKEHOVNA

о