Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация галогенорганическими соединениями фотоники индельного хромофора и фотоповреждений мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Модификация галогенорганическими соединениями фотоники индельного хромофора и фотоповреждений мембран"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

ГГБ ОД

УДК 577.344 2 Я ИЮН 7ЛПП

ПИНЧУК Сергей Владимирович

МОДИФИКАЦИЯ ГАЛОГЕНООРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ ФОТОНИКИ ИНДОЛЬНОГО ХРОМОФОРА И ФОТОПОВРЕЖДЕНИЙ МЕМБРАН

03.00.02 - БИОФИЗИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Минск - 2000

» >

Работа выполнена в Институте фотобиологии HAH Беларуси

Научный руководитель - кандидат биологических наук

старшин научный сотрудник, Воробей A.B.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мажуль В.М. доктор физико-математических наук Цвирко М.П.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится " 30 " мая_ 2000 года в 14-00 часов на

заседании Совета по защите диссертаций (Д 01.37.0!) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072, Минск, ул. Академическая, 27. Телефон ученого секретаря - 284-28-88

С диссертацией можно ознакомиться ь библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси

Автореферат разослан 2000 года

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук

Е /3, О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Изучение механизмов деструктивного действия УФ-излучения на клетки является актуальной задачей фотобиологии, в связи с существующей опасностью разрушения озонового слоя атмосферы и, как следствие, увеличения достигающего поверхности Земли потока УФ-излучения диапазона УФВ (280-320 нм), представляющего серьезную угрозу для живых организмов [Сапежинский и Лозовская, 1993]. Высокочувствительной мишенью повреждающего действия излучения этого диапазона длин волн являются биологические мембраны. Основные компоненты мембран - белки и липиды легко повреждаются УФВ-светом: наблюдается нарушение функциональной активности мембранных белков [Konev et al., 1978], увеличивается пассивная проницаемость липидного бислоя [Владимиров и др., 1991]. В конечном итоге это приводит к нарушению ионного гомеостаза и лизису клеток [Рощупкин и др., 1988]. Одним из основных хромофоров, поглощающих УФВ-излучение в биологических мембранах является индолыюе кольцо триптофана. Роль триптофана в деструктивном действии УФ-излучения определяется продуктами его первичных фотохимических реакций. Природа этих фотопродуктов зависит от наличия в среде веществ, способных взаимодействовать с возбужденными молекулами триптофана [Greed, 1984]. В этой связи большой интерес представляет изучение фотоники триптофана в присутствии различных техногенных загрязнителей окружающей среды, в частности, галогеноорганических соединений (ГОС). ГОС находят самое широкое применение в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и в бьпу, что приводит к их накоплению в окружающей среде, в организме человека и животных [Трошева и Сурнина, 1998, Филов, 1990]. Имеются данные о том, что ГОС способны дезактивировать синглетное возбужденное состояние индольного хромофора [Chen et al., 1996, Johansson, 1997]. Вместе с тем, фотохимические реакции триптофана в присутствии ГОС, механизмы этих реакций и их роль в УФ-индуцирусмом повреждении мембран пока не изучены. Существующая опасность увеличения потока УФВ-света, достигающего поверхности Земли, и рост загрязнения окружающей среды делают задачу изучения модификации галогеноорганическими соединениями фотоники индольного хромофора актуальной.

Связь с крупными научными программами

Отдельные этапы данной работы выполнялись в рамках Республиканской программы "Функционирование биосистем" на 1989-1993 гг. - "Изучение механизмов фотоиндуцируемых свободнорадикальных повреждений биологических мембран и клеток и разработка методов их протекции и усиления" (№ ГР 01890036812); Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований, грант МП94-49 (1995-1996 гг.) - "Модификация галогеноорганическими соединениями повреждений клеточных мембран индуцируемых УФ -светом экологического диапазона" (№ ГР 1996179).

Цель к задачи исследования

Цель настоящей работы - выяснить механизмы влияния гллогенооргани-ческих соединений ка фотофизическис процессы и фотохимические реакции в индольном хромофоре и на индуцируемые УФ-излучением повреждения мембран.

Поставленная цель включала решение следующих задач:

1.Изучение влияния ГОС на фотопроцессы в триптофане и триптофан-содержащих белках.

2.Изученис влияния ГОС на индуцируемое УФ-излучением повреждение эритроцитарных мембранах.

3.Изучение фотосенсибилизирующей активности продуктов фоторазрушения триптофана, образуемых при облучении аминокислоты, белков и мембран в присутствии ГОС.

Объект и предмет исследования

В качестве объектов исследования использовались растворы триптофана, триптофан-содержащйх белков, суспензии изолированных эритроцитарных мембран.

Гипотеза

Предположено, что галогеноорганические соединения усиливают деструктивное действие УФ-излучения на мембраны, вследствие модификации фотофизических и фотохимических процессов в индольном хромофоре.

Методология и методы проведенного исследования

В работе использовались спсктрофотометрический, флуоресцентный, полярографический, радиоизотопный и биохимические методы анализа.

Научная новизна и значимость полученных результатов

Изучено влияние ряда ГОС (хлороформа, четыреххлористого углерода, дихлордифторметана, трихлорацетата натрия, хлорофоса) на индуцируемые УФ-излучением повреждения триптофана, триптофан-содержащих белков и эритроцитарных мембран. Показано, что в присутствии ГОС увеличивается квантовый выход фоторазрушения триптофана в растворе и белковых трипто-фанилов, происходит образование новых фотохимических продуктов триптофана, увеличивается квантовый выход фотоинактивации ферментов. Впервые показана интенсификация галогсноорганическими соединениями перекисного фотоокисления липидов в мембранах. Установлено, что в основе влияния ГОС леж1гг фотоиндуцированное образование обладающих высокой окислительной активностью радикалов одноэлектронного восстановления ГОС, реализующееся с участием возбужденных состояний триптофана, а также фотосенсибили-зирующес действие фотохимических продуктов аминокислоты. Одной из причин интенсификации пq>eкиcнeгo окисления липидов в мембранах при облучении УФ-излучением в присутствии ГОС является ослабление аитиокси-дантной защиты мембран, связанное с увеличением квантового выхода фотодеструкции мембранного а-токоферола.

Практическая значимость полученных результатов

Результаты исследования существенно расширяют и углубляют имеющиеся сведения о фотодеструктивных реакциях в биологических системах г.ри действии УФ-излучения. Полученные данные могут быть использованы при оценке степени опасности увеличения фотоповреждений биологических систем в условиях возрастания фона УФ-излучения и загрязнения окружающей среды техногенными ГОС.

Основные положения диссртации, выносимые на защиту

1.B присутствии ГОС (хлороформа, четыреххлористого углерода, дихлордифторметана, • , нхлорацетата натрия, хлорофоса) увеличиваются квантовые выходы фотодеструкции триптофана в растворе и белковых триптофанилов, фотоинактивации ферментов, образуются новые фотохимические продукты триптофана, что свидетельствует о модификации фотофизических процессов и фотохимических реакций в индольном хромофоре.

2.В суспензии изолированных мембран эритроцитов в присутствии ГОС усиливается индуцируемое УФ-излучением перекисное окисления липидов. Эффект обусловлен фотоиндуцированным, с участием возбужденных состояний триптофанилов мембранных белков, образованием радикалов одноэлекгронно-го восстановления ГОС, а также увеличением квантового выхода фоторазрушения мембранного антиоксиданта а-токоферола.

3.Продукты фотохимической деструкции триптофана и белковых триптофанилов при облучении УФ-излучением с Х>300 нм генерируют синглетный кислород и могут выступать в качестве фотодинамическнх сенсибилизаторов повреждений белков и мембран.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, анализ полученных данных и интерпретация результатов проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследований апробированы на III конгрессе Европейского Общества Фотобиологов ( Будапешт, Венгрия, 1989г.), I съезде Белорусского общества фотобнологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 22-23 ноября 1994г.), II съезде Белорусского общества фотобнологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25-27 июня 1996г.), междунароном конгрессе по радиационной защите (Вена, Австрия, 14-19 апреля 1996г.), III съезде Белорусского общества фотобиологов н биофизиков (Минск, Беларусь, 21-23 октября 1998г.), VIII конгрессе Европейского общества фотобнологов (Гранада, Испания, 3-8 сентября 1999г.)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 стат,й в научных журналах н г/ор-ннках, 7 тезисов докладов. Общее количество опубликованных страниц- 25.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из общей характеристики работы, введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования (1 глава),

изложения полученных результатов (3 главы), заключения и списка литературы, включающего 242 наименований. Работа изложена на 138 страницах, содержит 41 рисунок и 2 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Эритроцитарные мембраны (тени) получали из свежей донорской крови по методу Доджа с соавт. [Dodge et al., 1963]. Реконструированные тени эритроцитов получали путем инкубации выделенных эритроцитарных мембран в течение 40 мин при 37°С в содержащем 10 мМ Na-фосфатного буфера (рН7,4) физиологическом растворе (ЗФР). Восстановление барьерных свойств теней контролировали по скорости диффузии 1-анилин-8-нафталин-сульфоната (АНС) через мембрану [Варабен и др., 1974). Экстракция липидов и приготовление липосом из эршроцитарных мембран проводили согласно [Folch and Lees, 1957] и [Марголис и др., 1986]. Хлороформ, четыреххпористъш углерод и дифтор-дихлорметан добавляли к образцам в виде водных настоенных растворов. К 2 мл хлороформа (XJI) или четыреххлористого углерода (ЧУ) добавляли 100 мл НгО и настаивали 48 часов при 20°С. Водный раствор дифтордихлорметана (ФР) приготовляли продувкой газа в течение часа через 100 мл НгО. Максимальная концентрация XJI, ЧУ и ФР в воде составляет 7-Ю-2, 7-Ю 3 и 2,310-3 М, соответственно [Филов, 1990]. Водные растворы трихлорацетата Na (7-10 2 М) и хлорофоса (7-102 М) приготовляли непосредственно перед экспериментами. УФ-облучение образцов проводили излучением ртутной лампы HGO-125. Использовались несколько спектральных диапазонов облучения: УФ275, выделяемом светофильтром UV KSIF 275 с пропусканием в интервале 265-285 нм, УФ320, выделяемом стеклянной пластинкой толщиной 3 мм, пропускающей свет с Х>320 нм в термостатируемой (20°С) кварцевой кювете (1=1 см) при постоянном перемешивании. Плотность мощности светового потока при использовании УФ 320 в области длин волн (320-400 нм) составляла - 20 Вт/м2; при использовании УФ 275 - 2 Вт/м2, а при одновременном облучении с УФ320 -0,4 Вт/м2. УФ-индуцированное разрушение триптофана и окисление глутатиона характеризовали по скорости деградации биомолекул (Vtp, Vnn), равной количеству разрушенного триптофана или окисленного глутатиона за одну минуту облучения. Измерения спектров действия осуществляли облучением растворов излучением ксеноновой лампы ДКСШ-150, выделяя различные спектральные интервалы монохроматором МСД-1. Продукты фоторазрушения триптофана получали облучением аминокислоты (3-10-3 М) в 0,1 М Na-фосфотном буфере (pH 7,4) излучением диапазона УФ275 в теченне 180 мин без или в присутствии 7-10 2 М хлороформа. Продукты фоторазрушения трипто-фанилов белков получали облучением БСА (2мг/мл) в 0,1 М Na-фосфотном

буфере (рН 7,4) излучением диапазона УФ275 в течение 15 мин без или в присутствии ГОС. Для исследования фотосенсибилизирующей активности фотопродуктов их добавляли к исследуемым образцам в отношении 1:9 (по объему) для фотопродуктов триптофана и 1:2 - БСА, и облучали излучением диапазона УФ320. Гамма облучение образцов осуществляли на гамма-установке ЛБМ-y-lM (l37Cs). Доза облучения составила 20 крад, при мощности дозы 50 рад/с. Перекисное окисление мембранных липидов (ПОЛ) измеряли по количеству продуктов окисления, реагирующих с тиобарбшуровой кислотой [Stocks and Dormandy, 1971]. Определение уровня а-токоферопа в мембранах эритроцитов проводили по методике Тейлор и др. [Taylor et al., 1976]. Определение ферментативной активности ацетилхо линз стер азы осуществляли методом Эллмана [Ellman et al., 1961]. Ферментативную активность глюкоз о оксид азы оценивали по скорости убыли кислорода в реакции ферментативного окисления глюкозы. Концентрацию кислорода контролировали амперометрическим методом [Шолъц и Островский, 1975]. Ферментативную активность апкогопъде-гидрогеназы определяли по восстановлению НАД в ходе реакции ферментативного расщепления этанола. К 2 мл раствора НАД (5-Ю-4 М) в 0,1 M Na-фосфатном буфере (рН 8,2) прибавляли 0,2 мл 1М водного раствора этанола и 0,1 мл раствора фермента (0,1 мг/мл) в 0,1 M Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Ферментативную активность оценивали по изменению оптической плотности раствора при 340 нм. Ферментативную активность трипсина определяли согласно [Erlanger et al., 1961]. Количество мембранных SH-групп определяли по образованию окрашенного комплекса с ДТНБ [Ellman et al., 1961]. Наличие в образцах ионов СГ определяли нефелометрическн по светорассеянию раствора при образовании слаборастворнмон соли AgCl. К 3 мл исследуемого образца дабавлялн 0,1 мл 1 H HNO3 и 0,1 мл 0,05 M AgNOî, инкубировали 10 мнн при комнатной температуре и измеряли интенсивность рассеянного света при 550 нм. Хроматографию растворов триптофана проводили на колонке 80x1,5 см, заполненной гелем Toyopearl-40. На гель наносили 0,5 мл образца и отбирали фракции по 2 мл при скорости потока 10 мл/ч. Термолюминесценцию растворов триптофана (Ю 4 М), облученных в течение 3 мин при температуре жидкого азота, измеряли при нагревании образцов в кюветном отделении спекгрофлуо-риметра при комнатной температуре (Л.р«-=430 нм). Радиоизотопные исследования проводили на сцинтилляционном счетчике "Mark-Ill" (Голландия), флуоресцентные - на спсктрофлуориметре "JOBIN IVON JY3 CS" (Франция), спектрофо-тометрические - на спектрофотометре "Hitachi 150-20" (Япония). Статистическую обработку результатов проводили согласно общепринятым методам вариационной статистики [Рокицкнй, 1973].

Основные результаты и их обсуждение

Модификация галогеноорганическими соединениями индуцируемых УФ-излучением повреждений триптофана и триптофан-содержащих белков

Известно, что облучение водных растворов триптофана УФ-излучением может приводить к разрушению аминокислоты с образованием стабильных фотопродуктов, основными из которых являются кинуренины и пирролоиндо-лы [2У§тап, 1984]. Эти процессы проявляются в изменениях спектров поглощения и флуоресценции триптофана. В спектре поглощения раствора триптофана (Ю-4 М), облученного УФ-излучением в диапазоне УФ275, наблюдается снижение поглощения аминокислоты при 280 им и появление поглощения фотопродуктов в более длинноволновой и коротковолновой областях спектра (рис.1). Параллельно снижается интенсивность флуоресценции триптофана (15% после 15 минут облучения) и при возбуждении облученного раствора аминокислоты в области длин волн выше 300 нм регистрируется флуоресценция в видимой области спектра, с максимумом около 430 нм.

260 000 360 400 460 X, нм

Добавление в раствор аминокислоты таких галогеноорганических соединений как хлороформ (ХЛ),' хлорофос (ХФ), трихлорацетат натрия (ТХА), четыреххлористый углерод (ЧУ) и дихлордифторметан (ФР) приводит к увеличению квантового выхода фотодеструкции триптофана. Это видно из значительно большего уменьшения оптйческой плотности при 280 нм (см. рис.1). Снижение тггенсивности флуоресценции триптофана, индуцированное УФ-облучением в течение 15 мин в присутствии 7 мМ ХЛ, ХФ, ТХА; 3,5 мМ ЧУ или 2 мМ ФР также увеличивается и составляет 48%, 40%, 45%, 58%, 45%, соответственно.

О

о

Рис.1. Спектры поглощения триптофана в 0,1 М Ыа-фосфатном буфере (рН 7,4) до (1) и после облучения УФ-излучением в диапазоне УФ275 без ГОС (2) и в присутствии ТХА (3), ХЛ (4). Время облучения (2) - 60 мин, (3,4) - 30 мин; концентрация триптофана - Ю-* М,

ХЛ и ТХА - 7-Ю-3 М.

Фотодеструкция триптофана в присутствии ГОС сопровождается появлением фотопродуктов, поглощающих УФ-излучение в более длинноволновой и коротковолновой областях спектра (см. рис.1). На примере хлороформа, для определения количества и спектральных характеристик продуктов хлороформ-зависимого фоторазрушения триптофана (ХПФТ), мы провели хроматографию растворов аминокислоты, облученных без и в присутствии XJI, на колонке с Toyoperl-40. На хроматограмме раствора триптофана, облученного в присутствии XJI, выявлено 3 пика в 31-й, 35-й и 44-й фракциях (соответственно, фотопродукты А, В, С). Продукты фоторазрушения триптофана, полученные при облучении в отсутствии XJI, обнаруживаются только в фракциях 6-22 и соответствуют по своим спектральным параметрам пирролоиндолам (фракции 6-8) и формилкинуренину (фракции 17-22). Из этих данных следует, что по подвижности в геле ХПФТ отличны от известных фотопродуктов триптофана. Существенные различия между ХПФТ и известными фотопродуктами триптофана наблюдаются и в спектральных характеристиках. Фотопродукты А, В и С флуоресцируют с максимумами при 485, 535 и 525 нм, соответственно. В спектре же флуоресценции пирролоиндолов существует максимум при 320 и плечо при 340 нм [Zigman, 1984], для N-формилкинуренина в воде характерна флуоресценция с максимумом при 430 нм [Warlant and Santus, 1974].

Приведенные данные по гель-хроматографическому разделению фотопродуктов и спектральные характеристики ХПФТ свидетельствуют, что XJI является не просто катализатором известных фотопревращений аминокислоты, а вызывает образование новых продуктов фотодеструкции триптофана. Это подтверждается различной зависимостью образования фотопродуктов триптофана без и в присутствии XJI от кислорода. Скорость накопления ХПФТ не изменяется при удалении кислорода из облучаемого раствора, фотопревращение же триптофана в пирролоиндол или N-формилкинуренин протекает с потреблением кислорода [Zigman, 1984], т.е. является следствием окисления аминокислоты.

С использованием мС-меченого хлороформа, мы установили, что при действии УФ-нзлучения XJI ковалентно связывается с молекулой триптофана. В отличие от необлученного образца, в облученном часть 14С-хлороформа не удаляется при выпаривании, причем отношение числа молекул связанного XJI к количеству молекул триптофана, в которых произошел разрыв индольного кольца, близко к единице. Включение молекулы ХЛ в структуру образующихся ХПФТ позволяет классифицировать их как фотохимические продукты триптофана.

Для выяснения является ли образование ХПФТ единственной реакцией хлороформ-зависимой фотодеструкции аминокислоты, мы исследовали згвиси-мости скорости хлороформ-зависимого фоторазрушения триптофана и образования ХПФТ от концентрации XJI. Как видно из рис.2, (кривая 1), фоторазрушения триптофана возрастает при увеличении концентрации ХЛ нелинейно. В расчете на единицу добавленного ХЛ оно снижается при увеличении концент-

рации ХЛ. Количество же образуемых ХПФТ (кривая 2) увеличивается линейно с ростом концентрации ХЛ. Таким образом, количество образующихся ХПФТ на единицу разрушенного триптофана возрастает при увеличении концентрации ХЛ (примерно в 1,8 раза при переходе от концентрации ХЛ 1,4 к 35 мМ). Из этих данных следует, что при облучении триптофана в присутствии ХЛ возможны фотохимические реакции, приводящие к деструкции аминокислоты без образования ХПФТ и вклад таких реакций увеличивается с уменьшением концентрации ХЛ. В пользу возможности хлороформ-зависимого фоторазрушения триптофана без образования ХПФТ свидетельствуют и данные по влиянию восстановленного гаугатиона на фоторазрушенис аминокислоты и образование ХПФТ. Так, скорость разрушения триптофана при облучении УФ275 в присутствии 7 мМ ХЛ уменьшается на 37% при добавлении в облучаемый раствор 2 мМ глутатиона, в то время как накопление ХПФТ не изменяется.

Рис.2.3ависимосги скорости хлороформ-зависимого фоторазрушения триптофана (1) и образования ХПФТ (2) при облучении раствора аминокислоты излучением УФ275, а также скорости хлороформ-зависимого фо-тоокислсния глутатиона (3) при облучении УФ275 раствора три-пептида в присутствии триптофана от концентрации хлороформа. Концентрация триптофана - 2-Ю-4 М, глутатиона -10-4 М. Длина волны возбуждения флуоресценции ХПФТ - 365 им, регистрации - 500 им.

Каковы возможные механизмы хлороформ-зависимых фотохимических реакций триптофана? Для ответа на этот вопрос необходимо выяснить, кто является хромофором данных реакций, через какие энергетические уровни возбужденного хромофора они реализуются, каковы механизмы дезактивации этих уровней, а также установить природу хлороформ-зависимых фотохимических реакций деструкции триптофана без образования и с образованием ХПФТ.

Измерение спектров действия деструкции триптофана и образования ХПФТ, индуцированных УФ-излучением в присутствии ХЛ показало, что они совпадают со спектром поглощения аминокислоты. Следовательно, первичным фотофизическим актом для обоих процессов является поглощение кванта света индольным хромофором. Ряд полученных результатов свидетельствует, что

\гтр;угл, мкМ/мин i, отн. ед.

[ХЛ], мМ

хлороформ-зависимые фотопроцессы в триптофане связаны с синглетным возбужденным состоянием аминокислоты. Так, добавление к раствору триптофана, содержащему 7 мМ XJI, 75 мМ KJ, приводит к тушению флуоресценции индолыюго хромофора на 50% и сопровождается уменьшением квантового выхода деструкции аминокислоты на 48% и образования ХПФТ - на 42%. В пользу участия первого синглетного уровня в "хлороформ-зависимых" фотопроцессах в триптофане свидетельствует и наличие тушения флуоресценции аминокислоты хлороформом (константа Штсрна-Фольмера тушения флуоресценции при комнатной температуре и нейтральных значениях рН равна 10,3). Константа скорости данного процесса увеличивается от 3,6-108 до 7,7-108 М-' с1 при увеличении температуры от 20 °С до 50 °С. Это указывает на динамическую природу тушения флуоресценции триптофана ХЛ [Лакович, 1986].

Согласно литературным данным, тушение флуоресценции индольного кольца галогеноорганическими соединениями может быть связано как с переносом па них электрона от возбужденного хромофора [Evans et al., 1978], так и с переносом от них протона на возбужденный хромофор [Chen et al., 1996]. Для хлорформа механизм дезактивации синглетного возбужденного состояния триптофана, по-видимому, связан с переносом электрона от возбужденного хромофора на молекулу ХЛ. Это подтверждается зарегистрированным нами снижением термошоминесценцин триптофана, облученного при температуре жидкого азота в присутствии ХЛ. Термолюминесценция является результатом рекомбинации образующихся при фотоионнзацин триптофана катион-радикала аминокислоты и сольватированного электрона [Владимиров, 1965]. Поскольку хлормстановые соединения являются относительно сильными акцепторами электрона [Lai et al., 1988], весьма вероятно, что при взаимодействии ХЛ с триптофаном в возбужденном состоянии происходит прямой перенос между ними электрона без выхода последнего в раствор, что и приводит к снижению термошоминесценцин.

Динамическая природа тушения флуоресценции триптофана хлороформом указывает на необходимость сближения молекул возбужденной аминокислоты и ХЛ. Линейная зависимость образования ХПФТ от концентрации в облучаемых образцах хлороформа (см. рис.2.) позволяет утверждать, что данная фотохимическая реакция реализуется на расстоянии между возбужденной молекулой триптофана и молекулой хлороформа значительно меньшем среднестатистического расстояния между молекулами аминокислоты и ХЛ в растворе, т. е. при их столкновении. Если в результате столкновения произойдет перенос электрона, то образовавшаяся ион-радикальная пара, вероятнее всего, рекомбиниру-т, ввиду близости расположения радикалов, с образованием ХПФТ. Подтверждением этого является то, что восстановленный глутатион не влияет на фотохимические реакции, ведущие к образованию ХПФТ, хотя способен перехватывлть свободные радикалы одноэлектронного восстановления ГОС [Slater, 84]. Фотохимические реакции хлороформ-зависимой деструкции триптофана протекающие без образования ХПФТ имеют иную природу. Об этом свидетель-

ствует влияние на хлороформ-зависимую деструкцию триптофана восстановленного глутатиона. Поскольку восстановленный глутатион обладает высокими константами скоростей взаимодействия со многими свободными радикалами [Пикаев и Кабакчи, 1982], можно предположить, что наблюдаемое уменьшение скорости фоторазрушения триптофана в присутствии глутатиона может быть обусловлено способностью пептида выступать в качестве перехватчика свободных радикальных продуктов, появляющихся при облучении раствора аминокислоты в присутствии XJI и приводящих к деструкции хромофора. В пользу такого предположения свидетельствует окисление самого антиоксиданта при облучении его раствора в присутствии триптофана и XJI (см. рис.2., кривая 3).

Фотоиндуцируемое образование упомянутых радикальных продуктов, скорее всего, является результатом одноэлектронного восстановления XJ1. Известно, что при одноэлекгронном восстановлении галогенуглеводородов появляются высокоактивные радикалы, способные повреждать аминокислотные остатки в белках, инициировать процессы перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах и деструкцию антиоксидантов в растворах [Lai, 88, Slater, 84]. Одноэлектронное восстановление хлороформа реализуется по схеме [Lai,88]: СНСЬ + е" -> СНС1з" -> СНС12' + СГ, т.е. сопровождается образованием хлорид-ионов. Мы обнаружили появление хлорид-ионов по реакции с нитратом серебра. Взаимодействие СГ с нонами серебра приводит к образованию слаборастворимой в воде соли AgCl и сопровождается помутнением раствора. Добавление соли AgNOj к водному раствору триптофана (I04 М), облученному УФ275 в течение 60 мин или у-излучением в дозе 20 крад в присутствии 1,5 мМ XJI, действительно приводит к помутнению раствора и увеличению его светорассеяния (интенсивность светорассеяния после у-нзлучения становится равной 1, а после УФ-облучения - 0,8 интенсивности светорассенвания водной 0,01% суспензии латекса с диаметром частиц - 1 мкм), что служит экспериментальным подтверждением фото- или у-индуцируемого образования радикалов одноэлектронного восстановления XJI.

Поскольку, одной из первичных фотохимических реакций триптофана является фотоионизация его индольного кольца с образованием сольватирован-ного электрона, можно предположить, что взаимодействие с сольватированным электроном и приводит к одноэлектронному восстановлению XJI. Однако, образование ионов СГ при УФ-облученнн раствора аминокислоты в присутствии 1,5 мМ XJI практически не уменьшается (~ на 10-15%) при добавлении в раствор перед облучением ионов N2+ (20 мМ NiSO.»), конкурирующих с ХЛ за сольватированный электрон (константы скорости взаимодействия с сольватированным электроном Ni2+ и ХЛ одного порядка и равны 2-1010 и 3-1010 М-1 с-1, соответственно [Пикаев и Кабакчи, 1982]). В то же время при у-облучении в присутствии 20 мМ NiS04 образование СГ уменьшается в 3 раза. Отсюда следует, что фотоионизация индольного кольца не шрает существенной роли в образовании свободных радикалов ХЛ. Вероятнее всего, образование свобод-

пых радикалов ХЛ связано с переносом электрона на ХЛ непосредственно с триптофана в сингаетном возбужденном состоянии.

В связи с индуцируемым УФ-излученнем повреждением биосистем, значительный интерес представляет модификация галогеноорганическими соединениями фотопроцессов в триптофанилах белков. Облучение растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА) УФ-излучением в диапазоне УФ275 в течение 5 минут в присутствии 7 мМ хлороформа приводит к фотоиндуцируе-мому снижению интенсивности ультрафиолетовой флуоресценции на 50%. Облучение в отсутствии ХЛ приводит к снижению интенсивности флуоресценции только на 9%. Контрольные опыты показали, что данные изменения обусловлены фоторазрушением индольного хромофора. Следовательно, хлороформ вызывает увеличение квантового выхода фоторазрушения белковых трнптофа-нилов. Как и для триптофана в растворе, облучение БСА в присутствии ХЛ приводит к образованию интенсивно флуоресцирующих в видимой области спектра фотопродуктов. Максимум флуоресценции фото продуктов, образуемых в белке, смещен в коротковолновую область на 25 нм по сравнению с максимумом флуоресценции ХПФТ, расположение же максимумов и форма спектров возбуждения флуоресценции фотопродуктов различаются не столь значительно (рис.3). Различия в положениях максимумов спектров флуоресценции фотопродуктов в растворе и белках, очевидно, являются следствием м:ьсе

I, отн. ед.

1.0

0,5

Рис.З. Спектры возбуждения флуоресценции (1,2) н флуоресценции (3,4) триптофана (1,3) и БСА (2,4) в 0,1 М №-фосфатном буфере (рН 7,4) после облучения УФ-излучением в диапазоне УФ275 в присутствии хлороформа. Длина волны возбуждения флуоресценции - 320 нм, регистрации - 460 нм. Время облучения - 10 мин. Концентрация триптофана - 10^ М, БСА - 1 мг/мл, хлороформа - 7-Ю-3 М.

300 350 400 460 500 550 Я, нм

полярного микроокружения хромофора в составе белковой макромолекулы. В пользу этого свидетельствует смещение максимума в спектре флуоресценции ХПФТ при переходе от водного раствора к менее полярному спиртовому на 20 нм в коротковолновую область Из этого следует, что облучение растворов белков УФ-излучением в присутствии ХЛ приводит к образованию фотопродуктов, имеющих структуру аналогичную ХПФТ, т. е. ХЛ модифицирует

фотофизическис и фотохимические процессы в триптофане не только в растворе, но и в составе белковой макромолекулы и механизм модифицирующего действия, скорее всего, одинаков в обоих случаях.

Таким образом, ГОС увеличивают квантовый выход фоторазрушения индольного хромофора в растворе и белках. На примере хлороформа установлено, что увеличение квантового выхода фоторазрушения индольного хромофора яляется результатом взаимодействия ГОС с триптофаном в синглетном возбужденном состоянии. Взаимодействие возбужденного триптофана и ГОС имеет динамическую природу, сопровождается переносом электрона от индольного хромофора на молекулу ГОС и приводит к образованию новых продуктов фотохимической деструкции аминокислоты и свободных радикалов одно-электронного восстановления ГОС.

Модификация галогеноорганическими соединениями индуцируемых УФ-излучением повреждений мембран эритроцитов

Галогеноорганические соединения (хлороформ, трихлорацетат Ыа, четы-реххлористый углерод) вызывают увеличение фоторазрушения триптофанилов мембранных белков (при концентрации ХЛ, ТХА равной 7 мМ, ЧУ - 3,5 мМ фотодеструкция увеличивается в ~ 3,1; 2,4; 3,7 раза, соответственно) и образование фотопродуктов, флуоресцирующих в видимой области спектра, при облучении суспензии теней эритроцитов УФ-нзлучением в диапазоне УФ275. Фотопродукты, полученные при облучении суспензии теней в присутствии хлороформа, флуоресцируют с максимумом при 463 нм (ХвоУ5=320 нм), а спектр возбуждения их флуоресценции имеет максимум при 370 нм и плечо около 310 нм. Приведенные параметры спектров флуоресценции фотопродуктов в тенях близки к таковым для ХПФТ в БСА (см. рис.3). Следовательно, ГОС влияют па фотохимические реакции триптофанилов не только в растворах белков, но и в белках в составе мембран.

Фотохимические реакции триптофанилов, индуцируемые УФ-излученисм в присутствии ГОС, могут влиять на функциональную активность мембранных белков. На рис.4 приведено изменение ферментативной активности мембрано-связанной ацетилхолинэстеразы теней эритроцитов при облучении УФ275. Как видно, при облучении в присутствии ГОС наблюдается более выраженное снижение ферментативной активности АХЭ. Влияние ГОС на фотоинактивацию АХЭ не зависит от кислорода и, вероятно, обусловлено увеличением фотодеструкции триптофанилов самого фермента. Гос без облучения не влияли на ферментативную активность АХЭ.

В реализации повреждающего действия УФ-нзлучения на мембраны важная роль принадлежит фотонндуцируемому перекисному окислению липидов. Как видно из рис.4, облучение суспензии теней эритроцитов излучением УФ275 в присутствии ГОС вызывает резкую активацию процесса ПОЛ. Без облучения или добавленные к облученным образцам ГОС не влияют на содержание

в мембранах ТБК-активных продуктов. Из этого следует, что усиление ПОЛ в присутствии ГОС обусловлено модификацией индуцируемых УФ-излучением фотофизических и/или фотохимических процессов в мембранах.

А, %

100

60

гЬ

Г*1

[ТБК-пр.], нМ/мг белка б

1*1

Л

ГТ_

гЬ

Рис.4.Ферментативная активность АХЭ (а) и количество ТБК-активных продуктов (б) в мембранах эритроцитов до (1) и после облучения суспензии мембран УФ-излучением в диапазоне УФ275 без ГОС (2) и в присутствии ХЛ (3), ТХА (4), ЧУ (5). Концентрация ХЛ, ТХА,- 7-10-э М, ЧУ - 3,5-103 М. Время облучения - 5 минут.

Для выяснения механизмов такого влияния ГОС, мы исследовали спектр действия усиления ПОЛ в присутствии хлороформа. Этот спектр локализуется в области длин волн 254-312 нм и имеет максимум при 285 нм. Поскольку его положение и максимум близки к соответствующим параметрам спектра поглощения триптофана, одним из хромофоров фотоиндуцируемого ПОЛ, вероятно, является индольное кольцо триптофанилов мембранных белков, что подтверждается отсутствием влияния ХЛ на ПОЛ в липосомах, приготовленных из суммарной фракции лнпидов мембран эритроцитов.

Кроме триптофанилов мембранных белков в усилении индуцируемого УФ-излучением ПОЛ в тенях эритроцитов участвуют и другие хромофоры. Это следует из того, что спектр действия хлороформ-зависимого ПОЛ шире и максимум его располагается в более длинноволновой области по сравнению со спектром действия хлороформ-зависимого фоторазрушения триптофана в растворе. Вычитание указанных спектров показало, что максимум поглощения второго хромофора находится в области 295 нм. Таким хромофором может бьггь а-токоферол, максимум поглощения которого в этаноле, согласно нашим данным, равен 293 нм. Действительно, мы зарегистрировали резкое (в 4 раза) усиление деструкции а-токоферола в мембранах и этаноле при облучении в

3

I

I

присутствии 7 мМ XJI. Следовательно, участие а-токоферола в хлороформ-зависимом ПОЛ, вероянее всего, обусловлено увеличением квантового выхода фоторазрушения антиоксиданта.

Таким образом, ГОС вызывают усиление индуцируемого УФ-излучением перекисного окисления лнпидов в эритроцитарных мембранах. Эффекг реализуется с участием триптофанилов мембранных белков. Одной из причин интенсивного развития фотоиндуцируемого ПОЛ, является ослабление антиокси-дантной зашиты мембран, связанное с увеличением в присутствии ГОС квантового выхода фотодеструкцин мембранного антиоксиданта а-токоферола.

Фотосенсибилизирующая актипность продуктов фоторазрушения триптофана

Продукты фотодеструкцин триптофана, в частности N-формилкинуренин, проявляют фотосенснбилизирующую активность при поглощении длинноволнового (300-400 нм) УФ-излучения [Zigman, 1984; Krishna ct al., 1991]. Проведенные исследования показали, что обнаруженные нами фотохимические продукты фотодеструкции триптофана также способны выступать в роли фотосенсибчлпзаторов повреждений биологических систем различного уропня организации: аминокислот, белков и мембран.

Мы исследовали фотосенсибилизированное ХПФТ разрушение самого триптофана, поскольку данная аминокислота легко подвергается деструкции при взаимодействии со многими свободными радикалами и синглстным кислородом [Walrant and Santus, 1974]. Облучение излучением диапазона УФ320 в течение 40 мин раствора триптофана (10 4 М), в который добавлены ХПФТ (их концентрация характеризуется поглощением при 340 нм равном 0,7), сопровождается деструкцией 20% молекул аминокислоты. Так как в присутствии хлороформ-независимых фотопродуктов триптофана при тех же условиях облучения разрушается менее 3% молекул аминокислоты, это свидетельствует о фотосенсн-билизирующем действии ХПФТ. Фотосенсибилизированное ХПФТ разрушение триптофана увеличивается в 3 раза в дейтерированпой воде и уменьшается в 2 раза в присутствии 5 мМ азида натрия. Поскольку NaNj является тушителем синглетного кислорода, а л тяжелой воде время жизни Юг увеличиплется на порядок по сравнению с IhO [Красновскнй, 1988], приведенные данные свидетельствуют об участии синглетного кислорода в фотосенсибилизируемом ХПФТ разрушении триптофана.

Сходные результаты получены по фотосенсибнлизирусмому влиянию ХПФТ на ферментативную активность ацетилхолинэсгеразы. Облучение излучением УФ320 раствора АХЭ (0,5 мг/мл) в присутствии ХПФТ » течение 40 мин приводит к ингибированию ее ферментативной активности на 18%. Лзнд натрия (5 мМ) уменьшает фотоингибирование фермента в два раза.

Как показано выше, фотохимические продукты образуются и в триптофа-нилах белков. Их фотосенснбилизирующую активность мы исследовали с

использованием растворов БСА и гистидина. Образование фотохимических продуктов триптофанилов индуцировали облучением раствора БСА излучением диапазона УФ275 в течение 15 мин в присутствии хлороформа, четыреххлористого углерода, трихлорацетата Na или хлорофоса. Об образовании фотохимических продуктов в белке свидетельствует увеличение оптической плотности облученных растворов при А=320 нм. Последующее облучение излучением диапазона УФ320 образцов, фотомодифнцированных в присутствии ГОС, приводит к значительной убыли кислорода из раствора. Поскольку, гнстидин имеет большую консташу скорости взаимодействия с Юг (Ю-8 М"1 с1) [Matheson and Lee. 1979], наблюдаемое потребление кислорода, скорее всего, является результатом окисления данной аминокислоты синглетным кислородом, генерируемым фотопродуктами триптофанилов. Подтверждением этого является уменьшение эффекта в 5-6 раз в присутствии 5 мМ NaN3.

Фотосенснбилнзируюшую активность продуктов фотохимического разрушения триптофанилов в мембранных белках исследовали при совместном действии излучения диапазонов УФ275 и УФ320 на суспензию мембран эритроцитов в присутствии хлороформа. Плотность мощности излучения в диапазоне УФ320 была в 50 раз больше, чем в диапазоне УФ275, что моделирует ситуацию резкого снижения интенсивности достигающей поверхности Земли солнечной УФ-раднацнн при Х<300 нм [Стржижовскин, 1996]. Как видно из рнс.5, облучение излучением в диапазоне УФ320 практически не вызывает окисления SH-групн и липидов мембран, но резко усиливает деструктивное действие излучения диапазона УФ275. Происходящее при совместном действии УФ-излучения двух диапазонов окисление мембранных белков и липидов значительно превышает суммарные повреждения, наблюдаемые при отдельном облучении мембран излучением в диапазонах УФ275 или УФ320.

[SH-rp],%

[ТБК-пр.], нМ/мг белка

Рис.5.Зависимости количества до-

о

о

ю

20

эо

о

слупных ЭТИВ БН-групп и ТБК-актнвных продуктов в мембранах эритроцитов от времени облучения суспензии мембран в присутствии хлороформа УФ-излучени-ем различных диапазонов: УФ275 - (1,4); УФ320 - (2,5); УФ275 + УФ320 - (3,6). Концентрация мембран - 1 мг белка/мл, хлороформа - 7-Ю-5 М. Плотность мощности излучения в диапазоне УФ275 - 0,4; УФ320 - 20 Вт/м*.

t, мин

В целом, полученные данные свидетельствуют, что образуемые в растворе и белках новые продукты фотохимической деструкции триптофана генерируют синглетный кислород при облучении УФ-излучением в диапазоне длин волн 300-400 нм и могут выступать в качестве фотодинамичсских сенсибилизаторов повреждений белков и мембран.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследовано влияние ряда галогеноорганических соединений (хлороформа, четыреххлористого углерода, дихлордифторметана, трихлора-цетата натрия, хлорофоса) на индуцируемые УФ-излученпсм фотофизичсские процессы и фотохимические реакции в триптофане, белковых триптофанилах и биологических мембранах. Показано, что:

1 .Галогеноорганическис соединения увеличивают квантовый выход фоторазрушения индолыюго хромофора в растворе и белках. На примере хлороформа установлено, что увеличение квантового выхода фоторазрушения индолыюго хромофора яляется результатом взаимодействия ГОС с триптофаном в синглетном возбужденном состоянии [1,3,4].

2.Взанмодснствие возбужденного триптофана и ГОС имеет динамическую природу, сопровождается переносом электрона от индолыюго хромофора на молекулу ГОС и приводит к образованию новых продуктов фотохимической деструкции аминокислоты и свободных радикалов одноэлектронно-го восстановления ГОС [1,3-6,10].

3.Галогеноорганическне соединения усиливают индуцируемое УФ-излучением перекисное окисление липидов в эритроцитарных мембранах. Эффект инициируется радикалами ГОС, образуемыми с участием возбужденных триптофанилов мембранных белков. Одной из причин интенсивного развития фотоиндуцируемого в присутствии ГОС окисления липидов является ослабление антиоксидантной защиты мембран, связанное с увеличением квантового выхода фотодеструкции мембранного антиоксиданта а-токоферола [4,7-9,11,12].

4. Продукты фотодеструкцин триптофана, образуемые в растворе и белках в присутствии ГОС, обладают поглощением в диапазоне длин волн 300400 нм. генерируют синглетный кислород при облучении УФ-излучсннем >.>320 нм и могут выступать в качестве фотодинамичсских сенсибилизаторов повреждений белков и мембран [1-6].

Список опубликованных работ по теме диссертации

1 .Хлороформ-зависимые фотопродукты триптофана / А.В. Воробей, ЕЛ. Черницкий, C.B. Конев и др. II Биофизика.- 1992. -Т.37, №5,- С.848-850.

2.Воробей А.В., Пинчук С.В., Шуканова НА. Фотосенсибилизирую-щая активность продуктов хлороформ-зависимого фоторазрушения триптофана //Доклады АНБ.- 1992.- Т.Зб, №6.- С.562-564.

3.Пинчук С.В., Воробей А.В. Спекральные характеристики и механизмы образования хлороформ-зависимых фотопродуктов триптофана. // Журнал прикладной спектроскопии. -1993. -Т.59, №3-4. С.312-317.

4.Воробсй А.В., Пинчук С.В. Образование и фотосенсибилизирующая активность продуктов фотохимического разрушения триптофанилсв белков в изолированных эритроцитарнььк мембранах // Биофизика. - 1995,- Т.40, №2.- С .342-346.

5.Vorobey A.V., Pinchuk S.V. Spectral studies of new tryptophan destruction products forming upon irradiation with UV-light in presence of chlorine-containing compounds II Spectroscopy of Biological Molecules: Сб.: J.C.Merlin etc. ed.- Dordrecht, Boston, London: Kluver Academic Publishers, 1995. - P.609-610.

6.Chloroform-dependent tryptophan photoproducts: nature and photosensitizing activity I A.V. Vorobey, N.A. Shukanova, S.V. Pinchuk, EA. Chernitsky // Abstracts of 3th Congress of European Society for Photobiology, 27 august - 2 September, 1989. / Hungarian Biophysical Society.- Budapest, 1989- P.307.

7.Воробей А.В., Пинчук С.В. Модификация хлорорганнческими соединениями индуцируемых УФ-светом фотоповреждений мембран // Тез. докл. I съезда Бел. общества фотобиол. и биофиз., Минск, 22-23 ноября 1994 г. / Ин-т фотобиол. НАНБ,- Минск,1994,- С.26.

8.Vorobey A.V., Pinchuk S.V., Shukanova NA. Modification of radiation-induced membrane and cell damages by halogen-containing compounds (HCC) II Abstracts of 9th Intern. Congress on Radiation Protection, Vienna, 14-19 April 1996.-Vienna, 1996.-P. 672.

9.Воробей A.B., Пинчук С.В. Усиление индуцируемого УФ-светом пе-рекисного окисления липидов изолированных мембран эритроцитов в присутствии галогеноуглеводородов II Тез. докл. II съезда Бел. общества фотобиол. и биофиз., Минск, 25-27 июня 1996 г. / БГУ.- Минск, 1996.- С.116.

Ю.Пинчук С.В. Индуцированное УФ-облучением окисление глутати-она в растворе, содержащем триптофан и хлороформ //Тез. докл. III съезда Бел. общества фотобиол. и биофиз., Минск, 21-23 октября 1998 г. / Ин-т фотобиол. НАНБ,- Минск, 1998.- С.66.

11 .Пинчук С.В., Воробей А.В. Разрушение а-токоферола в мембранах эритроцитов при облучении УФ-светом в присутствии галогеноорганиче-ских соединений //Тез. докл. III съезда Бел. общества фотобиол. и биофиз., Минск, 21-23 октября 1998 г. / Ин-т фотобиол. НАНБ.- Минск, 1998.- С.67.

12.Vorobey A.V., Pinchuk S.V. Modification of UV-light damages of membranes by halogen-derivative hydrocarbons (HH) II Abstracts of 8th

Congress European Society for Photobiology, Granada, 3-8 Sept. 1999.-Granada, 1999.- P. 155.

РЭЗЮМЭ Пшчук Сяргей Уладз1м1рав1ч

Мадыфжацыя галагенааргашчным1 рэчывам! фатонЫ нщольнага храмафора I фотапашкодтканняу мембран

Кточавыя словы: трыптафан, трыптафан-змяшчальныя бялю, мембраны эрытрацытау, галагенаарган1чныя рэчывы, УФ-выпраменьванне, фотасенспбшзацыя, фотапашкоджанне,

фотапрадукты, пераюснае аюсленне лтщау.

Вывучана зЬдзеянне шэрагу галагенааргашчных рэчывау (ГАР): хлараформа, хларафоса, трыхлорацэтата натрыя, дыфтордыхлор-мстана, чатыроххлорыстага вуглерода, на ¡ндуцыраванае УФ-выпраменьваннем пашкоджанне трыптафана, трыптафан-

змяшчальных бялкоу 1 эрытрацытарных мембран. Паказана, што у прысутнасщ ГАР павял1чваецца квантавы выхад фотаразбурэння трыптафана у растворы 1 бялковых трыптафаншау, адбываецца угварэнне фотах1м1чных прадуктау трыптафана, павял;чваецца квантавы выхад фоташактывацьп ферментау, ¡нтэнафщыруецца псраюснае фотаамсленне лтщау у мебранах. Выяулена, што уплыу ГАР заснаваны на фоташдуцыраваным утварэнш валодаючых высокай аюсляльнай актыунасцю радыкалау аднаэлектроннага аднаулення ГАР, якое адбываецца з удзелам узбуджаных станау трыптафана, 1 фотасенс1бшз!руючае дзеянне фотах1м!чных прадуктау амшаюслаты.

Атрыманыя вынш маюць важнае значэнне для устанаулення мехатзмау пашкоджанняу клетачных мембран 1 могуць быць выкарыстаны пры ацэнцы патанцыяльнай небяспею спалучальнага дзеяння сонечнай УФ-радыяцьи 1 галагенааргашчных рэчывау, як1я забруджваюць навакольнае асяроддзе, на б1ялапчныя аслэмы.

РЕЗЮМЕ

Пннчук Сергей Владимирович

Модификация галогеноорганическими соединениями фотонпки индолыюго хромофора и фотоповреждений мембран

Ключевые слова: триптофан, триптофан-содержащие белки, мембраны эритроцитов, галогеноорганические соединения, УФ-нзлучение, фотосенсибнлизация, фотоповрежденне, фотопродукты, перекисное окисление лнпндов

Изучено влияние ряда галогеноорганических соединений (ГОС): хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорди фтор метан, трихлорацетат натрия, хлорофос, на индуцируемые УФ-излучснием повреждения триптофана, триптофан-содержащих белков и эритроцитарных мембран. Показано, что в присутствии ГОС увеличиваются квантовые выходы фоторазрушения триптофана в растворе и белковых триптофанилов, происходит образование новых фотохимических продуктов триптофана, увеличивается квантовый выход фотоинактивации ферментов и усиливается перекисное фотоокисление липндов в мембранах. Установлено, что в основе влияния ГОС лежит: фотоиндуцирусмое образование обладающих высокой окислительной активностью радикалов одноэлектронного восстановления ГОС, реализуемое с участием триптофана в возбужденном еннглетном состоянии, и фотосенсибилизирующее действие фотохимических продуктов аминокислоты.

Полученные данные имеют важное значение для установления механизмов усиления галогеноорганическими соединениями индуцируемых УФВ-светом повреждений клеточных мембран и могут быть использованы при оценке потенциальной опасности сочетанного действия солнечной УФ-радиации и галогеноорганических соединений, загрязняющий окружающую среду, на биологические системы.

SUMMARY

Pinchuk Sergei Vladimirovich

Modification of indole chromofore photonic and photodestruction of membranes by halogenorganic compounds

Key words: tryptophan, tiyptophan-containing proteins, erythrocyte membranes, halogenorganic compounds, UV-radiation, photosensitization, photodestruction, photoproducts, lipid peroxidation

The influcncc of halogenorganic compounds (HOC): chloroform, carbon tetrachloride, diftordichloromethane, trichloroacetic acid sodium salt, chlorophos, on UV-radiation induced damages of tryptophan, tryptophan-containing proteins and erythrocyte membranes was investigated. It was shown, that in presence of HOC quantum yields of photodestruction of tryptophan in solution and protein tryptophanyls were increased, new photochemical products of tryptophan appeared, a quantum yield of enzyme photoinactivation was increased and a photoperoxidation of membrane lipids was intensificated. It was established that HOC influence was bound with photoinduced formation of HOC one-electron reduction radicals, which was realized with participation of tryptophan in singlet exited state, and photosensitized action of photochemical products of aminoacid.

These results ha 'e a great importance in the determination of the mechanisms of increase of UV-radiation induced destruction of cell membranes by HOC and could be used in the estimation of potential danger of joint action of sun UV-radiation and HOC contamination on the biological systems.