Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного состава

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного состава"

На правах рукописи

ПРОКОФЬЕВА Дарья Станиславовна

МОДИФИКАЦИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКНХ СОЕДИНЕНИЙ В ПРОБАХ СЛОЖНОГО СОСТАВА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2010 г.

004603494

Работа выполнена в лаборатории молекулярной токсикологии ФГУП НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека Федерального медико-биологического агентства

доктор биологических наук Гончаров Николай Васильевич

доктор биологических наук Бронников Геннадий Ефремович

Институт биофизики клетки РАН

доктор биологических наук Морозов Владимир Игоревич Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится 27 мая 2010 г. в 14 ч. 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан _ апреля 2010 г.

И.о. Ученого секретаря Диссертационного совета, р '

доктор биологических наук, профессор ^ (¿<,<.....Е.Г. Новоселова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день в Российской Федерации остаются достаточно большие запасы химического оружия, в том числе зомана и ЯУХ, относящихся к группе фосфорорганических отравляющих веществ (ФОБ). Согласно Конвенции по Химическому Разоружению [Анон, 2005а] в РФ проводятся мероприятия по их обезвреживанию на объектах уничтожения химического оружия (УХО). Обезвреживание ФОБ осуществляется с помощью различных дегазирующих растворов, при этом необходимо вести непрерывный мониторинг остаточных количеств ФОБ на поверхностях технологического оборудования, в производственных сточных водах и объектах окружающей среды.

В РФ в качестве скрининговых методов определения остаточных количеств ФОБ аттестованы и повсеместно применяются метод Эллмана и метод с бромтимоловым синим [Анон, 2004а, 20046, 2004в, 20056, 2005в, 2006а]. Однако компоненты дегазирующих растворов, продукты гидролиза ФОБ и другие примеси часто мешают определению ФОБ указанными методами, что приводит к получению ложноположительных и, что особенно опасно, ложноотрицательных результатов, которые можно выявить только с помощью более специфического и дорогого химического анализа. Однако он характеризуется гораздо более высоким пределом обнаружения по сравнению с биохимическим анализом, поэтому нет возможности проверять с его помощью все получаемые результаты. Для повышения специфичности более дешевого и простого в исполнении биохимического анализа необходимо установить точные границы применения уже существующих биохимических методов, т.е. исследовать их устойчивость к влиянию посторонних примесей, затем по возможности расширить их границы или подобрать альтернативные методы, обладающие большей специфичностью и не уступающие в чувствительности аттестованным биохимическим методам. Кроме низкой специфичности, к недостаткам аттестованных методов определения ФОБ можно отнести низкую производительность, большой объем проб и расход реагентов, необх< .

для проведения анализа. Кроме того, данные методы не позволяют оцепить опасность многокомпонентной пробы для человека.

Помимо оценки антихолинэстеразной активности проб с объектов УХО, необходимо проводить оценку их токсичности, а затем опасности для человека. Традиционно это выполняют в экспериментах на гидробионтах [Саноцкий и др., 1986; Анон, 1998, 20076; Кокуричева н др., 2005], реже на теплокровных животных [Анон, 1980а, 19806, 2003]. Принципиально новым подходом в этой области могло бы стать использование в качестве тест-объектов клеточных культур, особенно человеческих клеточных линий [Tiffany-Castiglioni et al., 1999, Tiffany-Castiglioni et al., 2006]. Человеческая линия нейробластомы SH-SY5Y представляется нам уникальным объектом, позволяющим проводить определение цитотоксичности проб с объектов УХО параллельно с определением количества ФОВ в этих пробах модифицированным вариантом метода Эллмана, поскольку в плазматической мембране этих клеток экспрессировано большое количество АХЭ [Ehrich et al., 1995]. Большинство ложных результатов, получаемых биохимическими методами, связано с непосредственным контактом компонентов исследуемой пробы с реагентами этих методов. Поскольку клетки нейробластомы являются адгезионными, добавление в анализ дополнительной процедуры отмывки клеток от исследуемых проб поможет значительно сократить количество ложных результатов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в поиске наиболее перспективных с точки зрения оценки остаточных количеств ФОВ биохимических методов определения активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), переводе этих методов на планшетный формат и установлении границ применения данных методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. Перевод методов Эллмана и Хестрина на планшетный формат, определение границ линейных диапазонов и пределов обнаружения методов для двух ФОВ: зомана и RVX.

-4-

2. Изучение причин возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов биохимического анализа.

3. Моделирование ложноположительных и ложноотрицательных результатов с использованием известных веществ и с учетом особенностей состава проб с объектов УХО.

4. Поиск способов устранения ложных результатов биохимического анализа.

5. Перевод метода Эллмана на планшетный формат с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии Л7/-ЛТ5У и его апробация на двух ФОВ: зомане и ЯУХ.

Научная новизна. Для определения содержания ФОВ в пробах сложного состава впервые применен метод Хестрина. Разработанный планшетный вариант данного метода значительно превосходит аналогичный вариант метода Эллмана по специфичности и селективности проводимого анализа, не уступая ему по чувствительности и диапазону линейности. Впервые предложено использование клеток человеческой нейробластомы БН-БУЗУ как для оценки содержания ФОВ в пробах сложного состава, так и для определения их цитотоксичности.

Практическое значение работы. Разработка и аттестация новых методик выполнения измерений (МВИ) на основании полученных данных позволит сократить количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, получаемых биохимическими методами при анализе проб сложного состава, в частности проб с объектов УХО. Перевод существующих биохимических методов на планшетный формат повысит их производительность, а также снизит стоимость анализа. Кроме того, существенно уменьшится объем исследуемой пробы, который иногда является лимитирующим фактором при проведении анализа. Использование клеток человеческой нейробластомы для анализа многокомпонентных проб

позволяет оценивать не только содержание в них ФОВ планшетным вариантом

метода Эллмана, но также их цитотоксичность. С помощью данной тест-системы возможно проведение исследований механизмов действия ФОБ, которые к настоящему моменту детально не изучены.

Публикации и апробация работы. Основные материалы опубликованы в 15 печатных работах, из них 9 статей в реферируемых журналах, 3 статьи в сборниках, 3 тезисов докладов. Результаты исследований доложены на 12-й Международной конференции по химическому разоружению (CWD 2009, Стратфорд-на-Эйвоне), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2009), 61-й Международной конференции и специализированной выставке аналитической химии, технологий, прикладной спектроскопии и смежных отраслей (PITTCON 2010, Орландо), 49-й Ежегодной токсикологической конференции и специализированной выставке (SOT 2010, Солт Лейк Сити), Съезде Аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 25 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания экспериментальной части и ее обсуждения, заключения, списка цитируемой литературы, который включает в себя 23 отечественных и 76 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Планшетный вариант метода Эллмана. Описываемый вариант метода Эллмана [Ellman et al., 1961] является модифицированной версией уже существующей адаптации данного метода к планшетному формату [Hammond, Forster, 1989]. Модификация была проведена с целью снижения на порядок предела определения метода для ФОБ. Поскольку в аттестованных методиках определения ФОБ их концентрации имеют размерность мг/мл, в работе концентрации ФОБ представлены в двух размерностях. Зоман (ГСО 82472003, содержание целевого продукта не менее 90%) и RVX (ГСО 8249-2004,

содержание целевого продукта не менее 90%) растворяли в ДМСО в концентрации 37,4 мМ для RVX и 55 мМ для зомана (10 мг/мл). Градуировочные растворы ФОБ готовили не более чем за 2 часа до начала эксперимента на фосфатном буфере (ФБ, Биолот) рН7,4. Концентрации зомана и RVX в градуировочных растворах составляли от 18,7 пМ до 3,74 нМ для RVX и от 27,5пМ до 5,5нМ для зомана (от 0,5* 10~8 мг/мл до 1*10"6 мг/мл). В день анализа готовили рабочий раствор АХЭ эритроцитов человека (0,325 Ед/мл, Sigma) в ФБ. Для построения градуировочной характеристики в лунки 96-луночного планшета (Falcon) вносили по 160 мкл градуировочных растворов ФОБ на лунку в порядке возрастания концентрации. Каждый градуировочный раствор анализировали в тройном повторе в пределах одного планшета. Контрольные и холостые пробы также готовили в тройном повторе, заменяя градуировочный раствор на эквивалентный объем ФБ. Раствор АХЭ (32 мкл) добавляли во все лунки за исключением лунок, содержащих холостые пробы, куда вместо раствора фермента вносили эквивалентный объем ФБ. Планшет инкубировали при 37°С с покачиванием (400 об/мин) 30 мин. Смесь рабочих растворов 5,5'-дитио-бис-2-1штробензошюй кислоты (ДТНБ, 2 мМ) и АТХ (70 мМ) (9:1) вносили в количестве 80 мкл во все лунки планшета, используя 8-канальный дозатор переменного объема. Планшет инкубировали при 37°С без покачивания 15 мин и считывали показаний абсорбции на планшетном спектрофотометре MULTISCAN ASCENT (Termo Electron Со) против холостой пробы при А.=405 им. Проводили четыре независимых эксперимента для обоих ФОБ. Расчет процента ипгибироваиия выполняли по формуле:

Планшетный вариант метода Хестрина. Стоковый и градуировочные растворы ФОБ готовили, как описано выше. Концентрации ФОБ в градуировочных растворах составили от 37,4 пМ до 3,74 нМ для ЯУХ и от

55пМ до 5,5нМ для зомана (от 1*10"8 мг/мл до 1*10"6 мг/мл). Для построения градуировочной характеристики в лунки планшета вносили по 125 мкл градуировочных растворов ФОВ на лунку в порядке возрастания концентрации, начиная с ФБ, который использовали в качестве дополнительной контрольной пробы (контроль для холостой пробы). Этот контроль и все градуировочные растворы анализировали в тройном повторе в пределах одного планшета. В качестве контрольной и холостой проб использовали ФБ. Во все лунки с калибровочными растворами, в том числе и в дополнительную контрольную пробу, добавляли по 25 мкл раствора АХЭ эритроцитов человека (6,5 Ед/мл, Sigma), используя 8-канальный дозатор переменного объема. В контрольные и холостые пробы вносили эквивалентное количество ФБ. Планшет инкубировали при 37°С с покачиванием (400 об/мин) в течение 30 минут. По окончании инкубации во все пробы кроме холостых вносили по 130 мкл 20 мМ АХХ на ФБ. В холостые пробы добавляли по 130 мкл ФБ. Планшет инкубировали при 37°С с покачиванием (400 об/мин) в течение 2 часов. Затем отбирали по 50 мкл содержимого каждой лунки, переносили его в лунки нового планшета с предварительно внесенной в них 100 мкл смеси (1:1) 2 М NH2OH*HCl и 3,5М NaOH и перемешивали на иикубаторе/шейкере iEMS НТ (Termo Electron Со) 10 мин. В каждую лунку вносили по 50 мкл 3,9 М HCl, встряхивали планшет в течение 2 мин, потом добавляли по 50 мкл 0,37 М FeCl3 на 0,1н HCl в каждую лунку, снова встряхивали и проводили считывание показаний абсорбции на планшетном спектрофотометре против холостой пробы при длине волны >.=540 им. Из величины абсорбции контрольной пробы вычитали абсорбцию всех остальных проб. Полученная величина характеризует собой количество гидролизованного АХХ, которое прямо пропорционально активности АХЭ. Далее рассчитывали процент ингибирования АХЭ для каждой концентрации ФОВ, используя дополнительную контрольную пробу (градуировочный раствор с нулевым содержанием ФОВ), и строили график зависимости этих двух величин. Проведено три независимых эксперимента для обоих ФОВ.

Исследование влияния примесей. Концентрационный диапазон возможных примесей в пробах с объектов УХО выбирали, учитывая данные химического анализа проб с объектов УХО [Анон, 20066, 2009] и эксперименты по гидролизу ФОВ in vitro различными дегазирующими растворами [Yang et al., 1996, Munro et al., 1999, Radilov et al., 2009]. При исследовании влияния пинаколилметилфосфоновой кислоты (ПМФК), изобутилметилфосфоновой кислоты («Б МФК), метилфосфоновой кислоты (МФК), бис-(2-диэтиламиноэтил) дисульфида, восстановленного глутатиона, 2-(N,N-диэтиламнно) этантиола, моноэтаноламина (МЭА), Н202, капронового и валерианового альдегидов на результаты, получаемые с помощью планшетных вариантов методов Эллмана и Хестрина, градуировочные растворы ФОВ заменяли эквивалентным объемом разведений исследуемых веществ в ФБ. Концентрации МФК, г/БМФК, ПМФК в рабочих растворах состовлялн от 1 мкМ до 400 мкМ. Бис-(2-диэтиламиноэтил) дисульфид присутствовал в растворах в концентрациях от 38 пМ до 38 нМ, МЭА - в концентрациях 1-5 мМ, а Н2О2 - в диапазоне концентраций от 40мкМ до 0,6М. Капроновый и валериановый альдегиды растворяли до конечных концентраций от 0,25 мМ до 4 мМ и от 0,25 мМ до 10 мМ соответственно. Для каждого разведения исследуемого вещества готовили специальную холостую пробу, которая состояла из анализируемой пробы, реагентов для визуализации реакции и ФБ в объеме, соответствующем объему используемого в анализе раствора фермента. Конечное значение абсорбции для каждой концентрации исследуемого вещества рассчитывали с учетом величины абсорбции индивидуальной холостой пробы для этой концентрации. Полученные результаты обсчитывали аналогично данным, полученным при построении градуировочных кривых для ФОВ. Для каждого исследуемого вещества было проведено не менее трех независимых экспериментов с тремя повторами для каждой концентрации в каждом эксперименте.

При проведении экспериментов по оценке совместного действия ФОВ, МЭА, восстановленного глутатиона и Н2О2 на активность АХЭ планшетным

вариантом метода Эллмана были приготовлены смеси ФОБ с исследуемыми веществами. Объем добавляемой в лунки планшета смеси соответствовал объему градуировочных растворов ФОБ.

Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве источника АХЭ клеточной линии человеческой нейробластомы. Клеточную линию нейробластомы SH-SY5Y (American Type Cell Culture) культивировали в С02-инкубаторе во влажной атмосфере при 37°С и 5% СО2 в среде DMEM/F12 с 15% ФБС (Биолот), 2 мМ L-глутамина и 50 мкг/мл гентамицина. Для проведения опытов по определению процента ингибирования АХЭ различными концентрациями ФОБ в лунки планшета вносили по 100 мкл клеточной суспензии с исходной концентрацией клеток 0,75 млн/мл. Спустя 24 часа после рассева клеток среду из лунок удаляли, клетки промывали раствором Хэнкса и добавляли по 100 мкл рабочих растворов ФОБ на лунку. Концентрации ФОБ в градуировочных растворах составили от 18,7 пМ до 5,61 нМ для RVX и от 27,5 пМ до 8,25 нМ для зомана (от 0,5*10"8 мг/мл до 1,5*10"7 мг/мл). Каждая концентрация была представлена четырьмя лунками. Контрольной пробой был раствор Хэнкса. Клетки инкубировали 1 ч при 37°С и 5% С02. По истечении этого времени клетки промывали 2 раза ФБ и в каждую лунку добавляли 50 мкл АТХ (4,5 мМ) и 150 мкл ДТНБ (0,14 мМ), приготовленных на растворе Хэнкса в день проведения эксперимента. Абсорбцию проб при А.=405 нм измеряли с помощью планшетного спектрофотометра через 2 ч после добавления реагентов с вычетом значений абсорбции холостой пробы, представляющей собой растворы ацетилтиохолина и ДТНБ, внесенные в лунки, не содержащие клеток. Холостая проба была представлена в четверном повторе. Расчет процента ингибирования выполняли аналогично расчету в методе Эллмана. Проведено два независимых эксперимента для RVX и три для зомана.

Оценка цитотоксичности с помощью определения содержания АТФ в клетках нейробластомы SH-SY5Y. Клеточную линию нейробластомы SH-SY5Y культивировали как описано выше и рассевали в количестве 70 тысяч

-10-

клеток па лунку. Через 24 ч после рассева клеток среду удаляли, клетки промывали 2 раза ФБ и вносили анализируемые пробы в лунки планшета по 100 мкл. Каждая проба была представлена в тройном повторе. В качестве контрольной пробы использовали раствор ФБ. Холостая проба была представлена тремя лунками, куда при посеве клеток внесли по 100 мкл на лунку среды без клеток. Планшет с клетками переносили в инкубатор на 3 ч, затем пробы из лунок удаляли, клетки лизировали и измеряли люминесценцию полученных лизатов в каждой лунке с помощью набора Bioluminescent somatic cell assay kit (Sigma) в соответствии с рекомендациями производителя на приборе Multi-Detection Microplate Reader (BioTek) против холостой пробы. Измеряемая люминесценция прямо пропорциональна количеству АТФ в клетках после инкубации их с пробами.

Комплексное исследование проб с объекта УХО. Пробы для анализа были получены с объекта УХО в п. Леонидовка Пензенской области [Анон, 2009]. Определение содержания ФОВ (RVX) в пробах проводили биохимическими методами. Оценку цитотоксичности проб осуществляли с помощью определения содержания АТФ в лунках планшета, после инкубации клеток нейробластомы SH-SY5Y с пробами. Для оценки цитотоксичности ФОВ на примере RVX готовили растворы RVX на растворе Хенкса в диапазоне концентраций от 3,74 пМ до 374 нМ (от 0,5*10"8 до 1*10"5 мг/мл). Инкубацию клеток с растворами ФОВ осуществляли в течение 3-х часов. В качестве контрольной пробы использовали раствор Хэнкса.

Обработка экспериментальных данных. Для обработки экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel. Статистический анализ данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. Для сравнения независимых выборок использовали t-критерий Стьюдента. В качестве интервальной оценки величины приводится выборочное среднее ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Планшетные варианты биохимических методов. На основании проведенных экспериментов по установлению характера ингибиторного действия ЛУХ и зомана на активность АХЭ, определяемую планшетными биохимическими методами, были построены зависимости процента иигибирования АХЭ от концентраций ФОБ в анализируемой пробе, выбраны линейные диапазоны методов для обоих веществ и построены градуировочные зависимости в двойных логарифмических координатах. В табл.1 указаны характеристики градуировочных зависимостей разработанных планшетных вариантов биохимических методов. Линейный диапазон метода Хестрина для обоих ФОВ существенно шире линейного диапазона метода Эллмана (в 1,5 раза). Пределы определения (нижние границы линейного диапазона) зомана обоими методами совпадают, однако, предел определения 11УХ методом Хестрина оказался в 2 раза выше по сравнению с методом Эллмана. Этот факт не налагает никаких ограничений на использование метода, поскольку даже увеличенный вдвое предел обнаружения значительно меньше ПДУ ЯУХ в водном растворе (табл. 2).

Таблица 1. Характеристики градуировочных зависимостей разработанных планшетных вариантов биохимических методов для обоих ФОВ

Метод ФОВ Линейный диапазон, *10"8 мг/мл Линейный диапазон, пМ Предел обнаружения (р=0,05), пМ Квадрат коэфф. кор., Я2

Метод Эллмана ЯУХ 1 - 10 37,4 - 374 18,7 0,9962

Метод Эллмана зоман 1 - 10 55-550 27,5 0,9919

Метод Хестрина ЯУХ 2-30 74,8-1120 37,4 0,9973

Метод Хестрина зоман 1 - 15 55 - 825 55 0,9971

Характеристики разработанных планшетных вариантов биохимических методов позволяют говорить о том, что планшетный вариант метода Хестрина не уступает планшетному варианту метода Эллмана при анализе остаточных количеств ФОВ в водных растворах. Линейные диапазоны разработанных планшетных вариантов двух биохимических методов значительно шире, а

пределы определения ниже, чем в аттестованных методиках, основанных на методе Эллмана (табл. 1 и 2). Расход реактивов в планшетном варианте метода Эллмана в 6,25 раз меньше по сравнению с аттестованными МВИ.

Таблица 2. Характеристики аттестованных методик для оценки остаточных количеств ФОВ на поверхностях технологического оборудования, основанных на методе Эллмана

МВИ ФОВ Диапазон определения, *10"6 мг/дм2 ПДУ, *10"6 мг/дм2 Диапазон определения, *10'8 мг/мл Концентрация ФОВ в пробе*, *10"8 мг/мл

№031-04-157-05 RVX 1-5 2 2,5-12,5 5

№031-04-217-06 зоман 0,5-2 1 7-2В 14

*Расчет проводили согласно пробоподготовке каждой методики.

Изучение влияния продуктов гидролиза ФОВ на результаты биохимического анализа. Изучение влияния на активность АХЭ, определяемую с помощью планшетного варианта метода Эллмана, некоторых основных продуктов гидролиза зомана и ЛУХ показало, что МФК, «БМФК, ПМФК и бис-(2-диэтиламиноэтил) дисульфид в исследованном диапазоне концентраций не оказывают воздействия на активность фермента (рис.1). Можно предположить, что возможные примеси с объектов УХО могут взаимодействовать не только с АХЭ, но также с реагентами метода Эллмана. Ни одно из перечисленных выше веществ в исследованном диапазоне концентраций не оказывало влияния на ход цветной реакции метода, что было определено с помощью постановки индивидуальных холостых проб для каждой концентрации исследованных веществ. Для метода Хестрина были проведены аналогичные опыты, которые дали сходные результаты.

Изучение влияния компонентов лакокрасочных покрытий на результаты биохимического анализа. Присутствие капронового и валерианового альдегидов в анализируемом растворе не отразилось на активности фермента. В табл.3 представлены данные для капронового альдегида. Было показано, что ни один из альдегидов не взаимодействует с реактивами метода Эллмана.

Рисунок 1. Изучение влияния продуктов гидролиза ФОВ на активность АХЭ планшетным вариантом метода Эллмана; л=3

Таблица 3. Результаты изучения влияния капронового альдегида на активность АХЭ планшетным вариантом метода Эллмана; п=3

концентрация, мМ 0 0,25 0,5 1 2 3 4

активность АХЭ, % 100±3 98±3 97±1 99±2 101±5 99±4 101±4

Изучение влияния перекиси водорода на результаты биохимического анализа. Перекись водорода является одним из основных компонентов дегазирующих растворов для обезвреживания различных ФОВ [Анон, 20066, Анон, 2009]. В этих растворах ее концентрация варьирует от 1 до 2% (0,43 М -0,85 М). В наших экспериментах впервые показано, что перекись водорода, как сильный окислитель, влияет на результаты, получаемые по методу Эллмана, начиная с концентрации 40 мкМ (рис. 3, сплошная кривая), что обусловлено ее взаимодействием с анионом 5-тио-2-нитробензойной кислоты, имеющим желтую окраску. При проведении исследования влияния перекиси водорода на метод Хестрина в планшетном варианте мы обнаружили, что ее присутствие также приводит к ложноположительным результатам (рис.3,

пунктирная кривая). Значение 1С50 для перекиси водорода по методу Хестрина составляет 80 мМ, что почти на 2,5 порядка больше той же величины определенной по методу Эллмана (325 мкМ). Таким образом, из двух сравниваемых биохимических методов метод Хестрина является более специфичным в присутствии Н202 в анализируемых пробах.

—«КЛУЛ ...... Уа.тртл •

: 1 •<■ ■ | ■

Рисунок 3. Ложноположительные результаты, Рисунок 4. Эффект совместного действия полученные в присутствии перекиси водорода зомана и перекиси водорода на результаты, в анализируемых пробах биохимическими получаемые планшетным вариантом метода методами; л=9 Эллмана; пунктирная линия показывает

эффект ингибирования активности АХЭ зоманом в концентрации 110 пМ (2*10-8 мг/мл); п=6.

На рис.4 представлены данные по моделированию ложноположительных результатов, полученных методом Эллмана в присутствии перекиси водорода и зомана в реакционной смеси. Для сравнения приведены кривые, отображающие действие зомана и перекиси водорода по отдельности. Кривую совместного эффекта обоих веществ можно получить простым их сложением. Эффект совместного действия может быть рассчитан на основании калибровочных зависимостей двух веществ без проведения опытов с использованием их смесей. Это очень важно, поскольку для многих организаций работа с ФОВ затруднительна, а для большинства - невозможна.

Изучение влияния меркаптанов на результаты биохимического анализа. Для моделирования присутствия восстановителей в исследуемых пробах мы выбрали восстановленный глутатион (ОЗН). Восстановительные свойства глутатиона обусловлены наличием у данного соединения тиоловой

группы, что объединяет его с одним из основных продуктов гидролиза ЯУХ -2-(М,1Ч-диэтиламино)этантиолом. Как видно на рис. 5, данные для которого были получены в отсутствии в среде инкубации АХЭ, вБН взаимодействует с ДТНБ с образованием желтого аниона. Присутствие в среде инкубации АХЭ согласно методу Эллмана приводит к увеличению абсорбции всех проб на фиксированную величину, равную значению абсорбции контрольной пробы (черные столбцы на рис.7). Удаление из среды инкубации субстрата никак не влияет на результат эксперимента, что лишний раз свидетельствует о взаимодействии только между ДТНБ и вБИ.

Рисунок 5. Исследование влияния Рисунок 6. Результаты исследования восстановленного глутатиона и восстановленного глутатиона на

диэтиламино) этантиола на результаты планшетный вариант метода Хестрина; п=6. планшетного варианта метода Эллмана в отсутствии АХЭ; п-3.

Едва заметное влияние 05Н на метод Хестрина начинается с концентрации 1 мМ (рис. 6), но достоверные отличия от контроля появляются только с концентрации 10 мМ. Изменения идут не в сторону кажущегося увеличения активности АХЭ как в методе Эллмана, а в сторону уменьшения, как в случае с Н2О2. Следует отметить, что концентрация перекиси 10 мМ также является тем пороговым значением, с которого наблюдается кажущееся ингибирование фермента по методу Хестрина. Очевидно, кажущееся ингибирование АХЭ, оцениваемое методом Хестрина, обусловлено денатурирующим действием этих двух соединений, что представляет собой ограничение для использования обоих биохимических методов. Постановка индивидуальных холостых проб при проведении анализа растворов вБН

планшетным вариантом метода Хестрина показала отсутствие взаимодействия 0811 с реагентами метода Хестрина, что также подтверждает предположение о частичной денатурации фермента.

На рис. 7 представлены данные по моделированию ложноотрицательных

[

| результатов по методу Эллмана при проведении анализа проб, содержащих

зоман и вБИ. В диапазоне концентраций вБН от 100 до 250мкМ возможно полное компенсирование эффекта ингибирования АХЭ зоманом в концентрации 220 пМ (4*10~8 мг/мл). Однако при учете процента ингибирования АХЭ дополнительных холостых проб можно полностью устранить влияние ввН на результаты метода Эллмана [ (белые столбцы). Исследование совместного действия С8Н и 11УХ показало [ сходные результаты. Как в случае с Н202 эффект совместного действия и ! ФОВ может быть рассчитан на основании их градуировочных зависимостей.

Эксперименты по оценке воздействия 2-(1Ч,]Ч-диэтиламино) этантиола на результаты, получаемые по методу Эллмана, показали, что он подобно С8Н взаимодействует с ДТНБ и не взаимодействует с АХЭ (рис. 5). На примере двух соединений впервые продемонстрирована возможность получения

[

ложноотрицательных результатов при анализе проб, содержащих помимо | аналита (ФОВ) веществ с тиоловыми группами. Ввиду полного совпадения | кривых на рис.5, все результаты, полученные для 08Н, можно экстраполировать на 2-(М,1Ч-диэтиламино)этантиол. Таким образом, влияние 2-(1Ч,М-диэтиламино)этантиола, который образуется на начальном этапе

[

| гидролиза 11УХ, на результаты метода Эллмана можно устранить постановкой индивидуальной холостой пробы для анализируемого раствора. Данная процедура легко выполнима и, несомненно, будет востребована на объектах

.1,1,1.1,1

) ¡<М11.™М|

Рисунок 7. Эффект действия зомана и ОБН вместе и по отдельности на результаты, получаемые планшетным вариантом метода Эллмана; п=6.

УХО. Тем не менее, метод Хестрина более селективен при анализе проб, содержащих меркаптаны, поскольку метод Эллмана, основанный на определении количества SH-групп в растворе, не в состоянии отличить тиохолин, продукт ферментативного гидролиза ацетилтиохолина, от других меркаптанов, присутствующих в исследуемом растворе.

Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве источника АХЭ клеточной линии человеческой нейробластомы. В ходе работы мы были вынуждены отказаться от адаптации метода Хестрина применительно к используемой клеточной линии нейробластомы, поскольку количество экспрессируемой клетками АХЭ недостаточно для данного метода, но достаточно для разработки планшетного варианта метода Эллмана. Предел чувствительности методики был определен для каждого исследуемого вещества и составил для RVX 18,7±7,5 пМ ((0,5±0,2)*108 мг/мл, р=0,05), а для зомана -55±1 пМ ((1±0,2)*10"8 мг/мл, р=0,05). Границы линейного диапазона методики составляют от 18,7 до 300 пМ (от 0,5*10"* до 8*10"* мг/мл) для RVX и от 110 до 550 пМ (от 2*10"8 до 1*10"7 мг/мл) для зомана. Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанная модификация метода Эллмана с использованием нейробластомы линии SH-SY5Y в качестве носителя АХЭ не уступает по своим характеристикам другим вариантам метода Эллмана. Природная иммобилизация фермента при определенной организации анализа позволит избежать прямого контакта анализируемой пробы с реактивами метода Эллмана и тем самым сократить количество ложных результатов. Кроме того, использование клеток нейробластомы дает возможность проводить скрининговые цитотоксические исследования большого количества образцов сложного состава, предположительно содержащих ФОВ, что трудно или даже невозможно сделать с помощью лабораторных животных.

Комплексный анализ проб с объекта УХО. Биохимический анализ пяти проб с объекта УХО, находящегося в п. Леонидовка Пензенской области, проводили разработанными планшетными вариантами двух биохимических методов, а также аттестованной для определения остаточных количеств RVX

-18-

МВИ №031-04-157-05 [Анон, 20056], основанной на методе Эллмана (табл. 4). Данные, полученные биохимическими методами, хорошо согласуются между собой. Отсутствие различий результатов планшетных вариантов методов Эллмана и Хестрина можно объяснить тем, что обезвреживание Ю/Х на объекте УХО в п.Леонидовка было давно завершено и количество активных соединений, таких как меркаптаны или Н2О2, снизилось до минимума.

Таблица 4. Результаты биохимического исследования представительных проб смывов с поверхностей технологического оборудования (концентрация ЯУХ в пробе, *10"8 мг/мл); п=3

М» пробы К 1 2 3 4 5

Планшетный вариант метода Эллмана - 3,4 - 1,9 4,3 1,4

Планшетный вариант метода Хестрина - 4,0 - - 4,6 -

МВИ №031-04-157-05 0 4,0 - 1,9 4,3 0,8

Определение цитотоксичности проб с объекта показало незначительное цитотоксическое действие у проб №4 и №5 (рис. 8). Для выяснения вопроса, связано ли изменение уровня АТФ в клетках с воздействием RVX на активность клеточных эстераз, мы провели отдельный эксперимент, в котором к клеткам нейробластомы добавляли растворы RVX в диапазоне концентраций от 3,74 пМ до 374 нМ (от 0,5* 10s до 1*10~5 мг/мл). Инкубация в течение 3-х часов показала, что присутствие RVX не влияет на уровень АТФ клеток нейробластомы (рис. 9), следовательно, цитотоксическое действие проб №4 и №5 обусловлено влиянием примесей.

Помимо оценки цитотоксичности проводили исследование морфологических изменений клеток нейробластомы, вызванных их инкубацией с анализируемыми пробами, с помощью фазово-контрастного микроскопа Axio Observer (Carl Zeiss). Трехчасовая инкубация клеток нейробластомы с пробами под номерами 1, 2, 3, 5 не привела к заметным морфологическим изменениям относительно контрольных клеток в фосфатном буфере. Инкубация клеток нейробластомы с пробой №4 в течение 3-х часов привела к их заметному округлению. Поскольку снижение уровня

АТФ было получено при инкубации клеток нейробластомы с двумя пробами (№4 и №5), можно предположить, что примеси этих проб отличаются между

собой по качественному и/или количественному составу.

£

■г ^Х'ОО

I (*и«Х| 3 с

Рисунок 8. Уровень АТФ в клетках Рисунок 9. Уровень ЛТФ в клетках

нейробластомы линии после 3-х нейробластомы линии 5//-6'К5К после 3-х

часовой инкубации с пробами (*р=0,05); часовой инкубации с различными

п=3 концентрациями ЛУХ; п=3

На примере проб с объекта УХО мы продемонстрировали, что цитотоксичность таких проб, как правило, связана не с ингибирующим действием ФОВ, а с воздействием примесей. Таким образом, данные по цитотоксичности проб сложного состава не являются избыточными, а, наоборот, делают результат комплексного анализа более полным.

ВЫВОДЫ

1. Для оценки содержания ФОВ в водных растворах разработаны планшетные варианты методов Эллмана и Хестрина, которые не уступают по своим характеристикам традиционным методам, отличаются большей производительностью, меньшим объемом тестируемой пробы и расходом реагентов.

2. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты биохимического анализа не связаны с наличием продуктов гидролиза ФОВ, МЭА, а также компонентов лакокрасочных покрытий в исследуемых пробах.

3. Присутствующая в анализируемом растворе перекись водорода влияет на результаты, получаемые по методу Эллмана, начиная с концентрации 40 мкМ. IC50 для перекиси водорода по методу Хестрина составляет 80 мМ, что почти на 2,5 порядка выше той же величины для метода Эллмана (325 мкМ).

4. Присутствие в исследуемых пробах меркаптанов в концентрациях, превышающих 10 мкМ, приводит к ложноотрицательным результатам по методу Эллмана. Ложноположительный эффект меркаптанов на метод Хестрина начинает проявляться с концентрации 10 мМ.

5. Для оценки содержания ФОВ в водных растворах разработан планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y, которая может быть использована для оценки цитотоксичности проб сложного состава.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

В реферируемых журналах

Martynova M.G., Bystrova O.A., Shabelnikov S.V., Margulis B.A., Prokofjeva D.S. Hsp70 in the atrial neuroendocrine units of the snail, Achatina fúlica // Cell Biology International. -2007.-V.31.-№4. - P.413-419.

Краснов И.А., Гончаров H.B., Бабаков B.H., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.И., Поляков Н.Б., Радилов A.C., Краснов Н.В. Изменения спектра производных фибринопептида в плазме крови при действии 0-изобутил-8-(2-диэтиламиноэтил) метилтиофосфоната // Научное приборостроние. - 2008. - Т. 18. - №4. - С.29-36.

Краснов И.А., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я. А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.Н., Поляков Н.Б., Радилов A.C., Краснов Н.В. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии. // Научное приборостроение. -2008.- т. 18.- №4,- с.46-53.

Прокофьева Д.С. Разработка и сравнительный анализ микропланшетных биохимических методов определения фосфорорганических отравляющих веществ на примере зомана // Токсикологический Вестник. - 2009. - №6. - С.39-46.

Бабаков В.Н., Гончаров Н.В., Радилов A.C., Глашкина Л.М., Подольская Е.П., Ермолаева Е.Е., Шилов В.В., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Егоров H.A. Новые подходы к раннему выявлению хронической интоксикации фосфорорганическими веществами у работников объектов уничтожения химического оружия. // Медицина труда и промышленная экология.- 2009-. № 4,- С 26-29.

Goncharov N., D. Prokofieva, N. Voitenko, L. Gustyleva, E. Savelieva, A. Radilov, V. Babakov, E. Ermolaeva, N. Khlebnikova, Y. Pechenevsky and V. Rembovsky Elaboration of microplate spectroscopic method for biomonitoring of warfare organophosphates soman and Russian VX. // The Toxicologist. - 2010. - V.99. - #1. - P.397 (A1866).

Гончаров H.B., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Бабаков В.Н., Глашкина JI.M. Молекулярные механизмы холинергической регуляции и дисрегуляции // Токсикологический вестник,- 2010. - № 2. - С.5-10.

Бабаков В.Н., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Краснов И.А., Поляков Н.Б., Войтенко Н.Г., Прокофьева Д.С., Краснов Н.В., А.С. Радилов. Новые маркеры интоксикации фосфорорганическими соединениями в пептидной фракции плазмы крови крыс // Токсикологический вестник,- 2010. - № 2. - С.31-38.

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Определение токсичности фосфорорганических соединений на клетках нейробластомы линии SH-SY5YII Биологические Мембраны. - 2010. - Т.27. - №3. - С.252-255.

Материалы научно-практических конференций

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Метод Эллмана в планшетном варианте с использованием нейробластомы линии SH-SY5Y как носителя ацетилхолинэстеразы // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. - 2-4 июня 2009, Пущино. - С.722-727.

Бабаков В.Н., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Подольская Е.П., Фатеенко В.Н., Ермолаева Е.Е., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Влияние отравляющих веществ на активность ключевых внутриклеточных сигнальных систем в клетках нейробластомы человека SK-N-MC II В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции.-2-4 июня 2009, Пущино.-С.321-326.

Войтенко Н.Г., Глашкина Л.М., Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Гончаров Н.В. N-ацетилирование: новые возможности старых методов. // Сборник статей «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесников, А.В. Бережнов). -Пущино, 2009. С.335-339.

Goncharov N.V., Prokofieva D.S., Glashkina L.M., Savelieva E.I., Koryagina N.L., Voitenko N.G., Dobrylko I.A., Ermolaeva E.E., Radilov A.S.. Biochemical and cytotoxicity studies for developing a methodology of combined express analysis and risk assessment at chemical weapon destruction facilities // 12th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference (CWD 2009). - 19-21th May 2009, Stratford-upon-Avon. -P.69.

Prokofieva D.S., Gustyleva L.K., Voitenko N.G., Babakov V.N., Goncharov N.V. Biochemical methods to estimating organophosphates in environmental objects // 61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). - 28 Februaiy-4 March 2010. - Orlando.

Gustyleva L.K., Prokofieva D.S., Savelieva E.I., Khlebnikova N.S., Goncharov N.V. Comparative capabilities of biochemical and chromatographic methods for trace analysis of toxic substance VX in complex matrices //61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). -28 February-4 March 2010. - Orlando.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 21.04.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5935Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс-, (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокофьева, Дарья Станиславовна

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ

АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОС (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. АХЭ: СТРУКТУРА, ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ФУНКЦИИ

1.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

1.2.1. Биологический метод

1.2.2. Манометрический метод

1.2.3. Титриметрический метод (потенциометрическое титрование)

1.2.4. Электрометрический метод

1.2.5. Спектрофотометрические (колориметрические) методы, основанные на использовании рН индикаторов

1.2.6. Спектрофотометрические (колориметрические) методы, основанные на использовании специфических субстратов

1.2.7. Химический метод

1.2.8. Радиометрический метод

1.2.9. Обзор методов определения активности ХЭ: резюме

1.3. СОЗДАНИЕ ПЛАНШЕТНЫХ ВАРИАНТОВ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АХЭ

1.4. СОЗДАНИЕ ПЛАНШЕТНЫХ ВАРИАНТОВ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АХЭ, СОДЕРЖАЩЕЙСЯ

В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ КЛЕТОК

1.5. ВОЗМОЖНОСТЬ ЗАМЕНЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОЧНЫМИ ЛИНИЯМИ

1.6. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ ФОС И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

1.7. МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФОС С АХЭ

1.8. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ

КОЛИЧЕСТВ ФОВ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Планшетный вариант метода Эллмана

2.2 Планшетный вариант метода Хестрина

2.3 Исследование влияния примесей

2.4 Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве источника АХЭ клеточной линии человеческой нейробластомы

2.5. Оценка цитотоксичности с помощью определения содержания

АТФ в клетках нейробластомы SH-SY5Y

2.6. Комплексное исследование проб с объекта УХО

2.7 Анализ продуктов гидролиза RVX методом ГХМС-ЭУ

2.7.1. Идентификация продуктов превращения RVX избыточным количеством воды в кислой среде

2.7.2. Идентификация продуктов превращения RVX эквимолярным количеством воды

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Химический анализ продуктов превращения ФОВ

3.2. Планшетные варианты биохимических методов

3.3. Изучение влияния продуктов гидролиза ФОВ на результаты биохимического анализа

3.4. Изучение влияния компонентов лакокрасочных покрытий на результаты биохимического анализа

3.5. Изучение влияния МЭА на результаты биохимического анализа

3.6. Изучение влияния перекиси водорода на результаты биохимического анализа

3.7. Изучение влияния меркаптанов на результаты биохимического анализа

3.8. Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве источника АХЭ клеточной линии человеческой нейробластомы

3.9. Комплексный анализ проб с объекта УХО

3.9.1. Биохимический анализ

3.9.2. Анализ проб на цитотоксичность

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного состава"

Актуальность проблемы

Известно, что на сегодняшний день в Российской Федерации остаются достаточно большие запасы химического оружия (ХО), в том числе зомана и RVX, относящихся к группе фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ). Согласно Конвенции по Химическому Разоружению 1993 года (вступившей в силу в апреле 1997 года) [Анон, 2005а] в РФ ведется непрерывная работа по их обезвреживанию на объектах уничтожения химического оружия (УХО). Обезвреживание ФОВ осуществляется с помощью различных дегазирующих растворов. В ходе этой работы необходимо вести непрерывный мониторинг остаточных количеств ФОВ на поверхностях технологического оборудования, в производственных сточных водах и объектах окружающей среды.

В Российской Федерации в качестве скриннинговых методов определения остаточных количеств ФОВ аттестованы и повсеместно применяются метод Эллмана и метод с бромтимоловым синим [Анон, 2004а, 20046, 2004в, 20056, 2005в, 2006а]. Однако очень часто компоненты дегазирующих растворов, продукты гидролиза ФОВ и другие примеси, мешают определению ФОВ указанными методами, что приводит к получению ложноположительных и, что особенно опасно, ложноотрицательных результатов, которые можно выявить только с помощью более специфического химического анализа. Однако химический анализ характеризуется гораздо более высоким пределом обнаружения по сравнению с биохимическим анализом, поэтому нет возможности проверять с его помощью все получаемые результаты. Кроме того, химический анализ не дешев. Для его проведения необходимо наличие дорогого высокопрецизионного оборудования и высококвалифицированного персонала. Для повышения специфичности более дешевого и простого в исполнении биохимического анализа необходимо установить точные границы применения уже существующих биохимических методов, то есть исследовать 6 их устойчивость к влиянию посторонних примесей. Затем по возможности расширить их границы или подобрать альтернативные методы, обладающие большей специфичностью и не уступающие в чувствительности аттестованным биохимическим методам.

К общим недостаткам аттестованных методов определения ФОВ можно отнести низкую специфичность, низкую производительность, большой расход реагентов, большой объем пробы необходимый для проведения анализа. Кроме того, данные методы не позволяют оценить опасность многокомпонентной пробы для человека. Метод с бромтимоловым синим [Wolfsie, Winter, 1954] был исключен нами из рассмотрения, поскольку кроме перечисленных выше недостатков для него характерны высокая трудозатратность и повышенная субъективность при оценке результатов анализа. В качестве альтернативы был выбран метод Хестрина [Hestrin, 1949], который по нашему суждению должен обладать наибольшей специфичностью при определении остаточных количеств ФОВ в пробах сложного состава. Для ускорения процесса биохимического анализа, снижения его стоимости и повышения производительности необходим перевод наиболее перспективных методов оценки антихолинэстеразной активности многокомпонентных проб на планшетный формат.

Помимо оценки антихолинэстеразной активности проб с объектов УХО, необходимо проводить оценку их токсичности, а затем опасности для человека. Традиционно это выполняют, проводя токсикологические эксперименты на гидробионтах [Саноцкий и др., 1986; Анон, 1998, 20076; Кокуричева и др., 2005], реже на теплокровных животных [Анон, 1980а, 19806, 2003], поскольку объем пробы всегда ограничен, а содержание ФОВ в пробе обычно не столь велико, чтобы привести к достоверному отличию показателей опытной и контрольной группы животных в острых опытах. Гидробионтов можно назвать специфичной тест-системой только применительно к оценке опасности для самих гидробионтов попадания отходов с предприятий УХО в водоемы. Экстраполяция полученных данных на человека крайне затруднительна. 7

Принципиально новым подходом в этой области могло бы стать использование в качестве тест-объектов клеточных культур, особенно человеческих клеточных линий [Tiffany-Castiglioni et al., 1999; Tiffany-Castiglioni et al., 2006]. Человеческая линия нейробластомы SH-SY5Y представляется нам уникальным объектом, позволяющим проводить определение цитотоксичности проб с объектов УХО параллельно с определением количества ФОБ в этих пробах модифицированным вариантом метода Эллмана, поскольку в плазматической мембране этих клеток довольно большое количество АХЭ [Ehrich et al., 1995]. Большинство ложных результатов, получаемых биохимическими методами, связано с непосредственным контактом компонентов исследуемой пробы с реагентами этих методов. Поскольку клетки нейробластомы являются адгезионными, добавление в анализ дополнительной процедуры отмывки клеток от исследуемых проб поможет значительно сократить количество ложных результатов.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в поиске наиболее перспективных с точки зрения оценки остаточных количеств ФОВ биохимических методов определения активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), переводе этих методов на планшетный формат и установлении границ применения данных методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Перевод методов Эллмана и Хестрина на планшетный формат, определение границ линейных диапазонов и пределов обнаружения методов для двух ФОВ: зомана и RVX.

2. Изучение причин возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов биохимического анализа.

3. Моделирование ложноположительных и ложноотрицательных результатов с использованием известных веществ и с учетом особенностей состава проб с объектов УХО.

4. Поиск способов устранения ложных результатов биохимического анализа.

5. Перевод метода Эллмана на планшетный формат с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y и его апробация на двух ФОВ: зомане и RVX.

Положения диссертации, выносимые па защиту

1. Планшетные варианты методов Эллмана и Хестрина, разработанные для оценки содержания ФОВ в водных растворах, не уступают в чувствительности традиционным методам, отличаются большей

• производительностью, меньшим расходом реагентов и объемом тестируемой пробы.

2. Основные продукты гидролиза ФОВ, МЭА, а также компоненты лакокрасочных покрытий не влияют на результаты биохимических методов в исследованном диапазоне концентраций.

3. Метод Хестрина более специфичен по сравнению с методом Эллмана при анализе проб, содержащих перекись водорода.

4. Метод Хестрина более селективен по сравнению с методом Эллмана при анализе проб, содержащих меркаптаны.

5. Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y не уступает по чувствительности другим вариантам метода Эллмана.

Научная новизна работы

Для определения содержания ФОВ в пробах сложного состава впервые применен метод Хестрина. Разработанный планшетный вариант данного метода значительно превосходит разработанный планшетный вариант метода Эллмана по специфичности и селективности проводимого анализа, не уступая ему по чувствительности и по диапазону линейности. Впервые предложено использование клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y как для оценки содержания ФОВ в пробах сложного состава так и для определения их цитотоксичности.

Теоретическое и практическое значение работы

Разработка и аттестация новых методик выполнения измерений (МВИ) на основании полученных данных позволит сократить количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, получаемых биохимическими методами при анализе проб сложного состава, в частности проб с объектов УХО. Перевод существующих биохимических методов на планшетный формат повысит их производительность, а также снизит стоимость анализа. Кроме того, существенно уменьшится объем исследуемой пробы, который иногда является лимитирующим фактором при проведении анализа.

Использование клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y дня анализа многокомпонентных, проб позволяет оценивать не только содержание в них ФОВ планшетным вариантом метода Эллмана, но также их цитотоксичность. С помощью данной тест-системы возможно проведение исследований механизмов действия ФОВ, которые к настоящему моменту детально не изучены.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на 12-й Международной конференции по химическому разоружению (CWD 2009, Стратфорд-на-Эйвоне), Международной конференции "рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2009), 61-й Международной конференции и специализированной выставке аналитической химии, технологий, прикладной спектроскопии и смежных отраслей (PITTCON 2010, Орландо), 49-й Ежегодной токсикологической конференции и специализированной выставке (SOT 2010, Солт Лейк Сити), Съезде Аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, 2010).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 25 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания экспериментальной части и ее обсуждения, заключения, списка цитируемой литературы, который включает в себя 23 отечественных и 76 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Прокофьева, Дарья Станиславовна

выводы

1. Для оценки содержания ФОВ в водных растворах разработаны планшетные варианты методов Эллмана и Хестрина, которые не уступают по своим характеристикам традиционным методам, отличаются большей производительностью, меньшим объемом тестируемой пробы и расходом реагентов.

2. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты биохимического анализа не связаны с наличием продуктов гидролиза ФОВ, МЭА, а также компонентов лакокрасочных покрытий в исследуемых пробах.

3. Присутствующая в анализируемом растворе перекись водорода влияет на результаты, получаемые по методу Эллмана, начиная с концентрации 40 мкМ. IC50 для перекиси водорода по методу Хестрина составляет 80 мМ, что почти на 2,5 порядка выше той же величины для метода Эллмана (325 мкМ).

4. Присутствие в исследуемых пробах меркаптанов в концентрациях, превышающих 10 мкМ, приводит к ложноотрицательным результатам по методу Эллмана. Ложноположительный эффект меркаптанов на метод Хестрина начинает проявляться с концентрации 10 мМ.

5. Для оценки содержания ФОВ в водных растворах разработан планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y, которая может быть использована для оценки цитотоксичности проб сложного состава.

СПИСОК РАБОТ И ПУБЛИКАЦИЙ

В реферируемых журналах

Martynova M.G., Bystrova О.А., Shabelnikov S.V., Margulis B.A., Prokofjeva D.S. Hsp70 in the atrial neuroendocrine units of the snail, Achatina fulica II Cell Biology International. - 2007. - V.31. - №4. - P.413-419.

Краснов И.А., Гончаров H.B., Бабаков B.H., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.И., Поляков Н.Б., Радилов А. С., Краснов Н.В. Изменения спектра производных фибринопептида в плазме крови при действии 0-изобутил-8-(2-диэтиламиноэтил) метилтиофосфоната // Научное приборостроние. — 2008. — Т. 18. - №4. - С.29-36.

Краснов И.А., Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.И., Поляков Н.Б., Радилов А.С., Краснов Н.В. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии // Научное приборостроние. - 2008. - Т. 18. - №4. - С.46-53.

Бабаков В.Н., Гончаров Н.В., Радилов А.С., Глашкина Л.М., Подольская Е.П., Ермолаева Е.Е., Шилов В.В., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Егоров Н.А. Новые подходы к раннему выявлению хронической интоксикации фосфорорганическими веществами у работников объектов уничтожения химического оружия. // Медицина труда и промышленная экология. - 2009. -№4. - С.26-29.

Прокофьева Д.С. Разработка и сравнительный анализ микропланшетных биохимических методов определения фосфорорганических отравляющих веществ на примере зомана // Токсикологический Вестник. — 2009. - №6. - С.39-46.

Goncharov N., D. Prokofieva, N. Voitenko, L. Gustyleva, E. Savelieva, A. Radilov, V. Babakov, E. Ermolaeva, N. Khlebnikova, Y. Pechenevsky and V. Rembovsky Elaboration of microplate spectroscopic method for biomonitoring of warfare organophosphates soman and Russian VX. // The Toxicologist. - 2010. - V.99. - #1. - P.397 (A1866).

Гончаров H.B., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Бабаков В.Н., Глашкина JI.M. Молекулярные механизмы холинергической регуляции и дисрегуляции // Токсикологический вестник.- 2010. - № 2. - С.5-10.

Бабаков В.Н., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Краснов И.А., Поляков Н.Б., Войтенко Н.Г., Прокофьева Д.С., Краснов Н.В., А.С. Радилов. Новые маркеры интоксикации фосфорорганическими соединениями в пептидной фракции плазмы крови крыс // Токсикологический вестник.- 2010. -№2.-С.31-38.

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Определение токсичности фосфорорганических соединений на клетках нейробластомы линии SH-SY5Y // Биологические Мембраны. - 2010. - Т.27. - №3. - С. 1-4.

Материалы научных конференций

Краснов И.А., Прокофьева Д.С., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М., Поляков Н.Б., Радилов А.С., Краснов Н.В. Поиск вероятных маркеров интоксикации фосфорорганическими соединениями в плазме крыс // Бюллетень северного государственного медицинского университета. - 2008. - №1. - С.71.

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Метод Эллмана в планшетном варианте с использованием нейробластомы линии SH-SY5Y как носителя ацетилхолинэстеразы // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. — 2-4 июня 2009, Пущино. - С.722-727.

Бабаков В.Н., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Подольская Е.П., Фатеенко В.Н., Ермолаева Е.Е., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Влияние отравляющих веществ на активность ключевых внутриклеточных сигнальных систем в клетках нейробластомы человека SK-N-MC // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. — 2-4 июня 2009, Пущино. - С.321-326.

Войтенко Н.Г., Глашкина JI.M., Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Гончаров Н.В. N-ацетилирование: новые возможности старых методов // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. — 2-4 июня 2009, Пущино. - С.335-338.

Goncharov N.V., Prokofieva D.S., Glashkina L.M., Savelieva E.I., Koryagina N.L., Voitenko N.G., Dobrylko I.A., Ermolaeva E.E., Radilov A.S. Biochemical and cytotoxicity studies for developing a methodology of combined express analysis and risk assessment at chemical weapon destruction facilities // 12th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference (CWD 2009). - 19-21th May 2009, Stratford-upon-Avon. - P.69.

Podolskaya E.P.,.Goncharov N.V, Babakov V.N., Glashkina L.M., Ermolaeva E.E., ProkoFeva D.S., Krasnov I.A., Polyakov N.B., Radilov A.S., Krasnov N.V. Effects of organophosphates on peptide fraction of human blood serum. // Proceedings of HUPO-2008 World Congress 16-20 August 2008, Amsterdam.

Prokofieva D.S., Gustyleva L.K., Voitenko N.G., Babakov V.N., Goncharov N.V. Biochemical methods to estimating organophosphates in environmental objects // 61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). - 28 February-4 March 2010. -Orlando.

Gustyleva L.K., Prokofieva D.S., Savelieva E.I., Khlebnikova N.S., Goncharov N.V. Comparative capabilities of biochemical and chromatographic methods for trace analysis of toxic substance VX in complex matrices //61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). - 28 February-4 March 2010. - Orlando.

Савельева Е.И., Гончаров H.B., Радилов A.C., Густылева JI.K., Прокофьева Д.С., Хлебникова Н.С. Определение токсичных ФОС в сложных матрицах хромато-масс-спектрометрическим и биохимическим методами // Съезд аналитиков России. — 25-30 апреля 2010. - Клязьма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показано, что разработанные планшетные варианты биохимических методов не уступают аттестованным в Российской Федерации методам анализа остаточных количеств ФОВ по чувствительности и значительно превосходят их по производительности и ширине линейного диапазона. Они позволяют на порядок уменьшить объем исследуемых проб и расход реактивов, что снижает стоимость анализа и делает возможным проведение анализа проб объемом 0,5 мл.

Исследования специфичности двух биохимических методов с применением соединений, присутствие которых наиболее вероятно в пробах с объектов УХО, показало, что основной вклад в ложные результаты, получаемые методом Эллмана, вносят меркаптаны и перекись водорода (табл. 3.26).

Способы устранения ложноположительных и ложноотрицательных результатов по методу Эллмана сформулированы нами следующим образом:

1. Постановка дополнительной холостой пробы для каждого анализируемого раствора, которая поможет установить факт взаимодействия реактивов метода Эллмана с компонентами анализируемого раствора, а в случае присутствия в пробе только меркаптанов (восстановителей) постановка такого типа проб позволяет устранить получение ложноотрицательных результатов.

2. Использование иммобилизованного фермента, например, адгезионной клеточной линии человеческой нейробластомы SH-SY5Y, что при определенной организации анализа позволяет избежать прямого контакта анализируемой пробы с реактивами метода Эллмана. Кроме того, такой вариант анализа позволяет ферменту находиться в нативном окружении в составе плазматических мембран клеток.

3. Комбинация двух биохимических методов или замена метода Эллмана на метод Хестрина при анализе проб сложного состава.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокофьева, Дарья Станиславовна, Санкт-Петербург

1. Анон. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и об его уничтожении, русская версия // Технический Секретариат Организации по Запрещению Химического Оружия. 2005а. - 181 с.

2. Анон. Аттестованные методики выполнения измерений содержания отравляющих веществ, токсичных химикатов, указанных в списках Конвенции о запрещении химического оружия // Отдельный раздел 1 -ХО федерального реестра МВИ. — 2007а. 241 с.

3. Анон. Методика выполнения измерений уровня загрязнения веществом типа VX поверхности технологического оборудования ферментативным методом // Свидетельство об аттестации МВИ №031-04-157-05. 20056. -23 с.

4. Анон. Методика выполнения измерений уровня загрязнения зарином поверхности технологического оборудования ферментативным методом // Свидетельство об аттестации МВИ №031-04-176-05. 2005в. - 19 с.

5. Анон. Методика выполнения измерений уровня загрязнения зоманом поверхности технологического оборудования ферментативным методом // Свидетельство об аттестации МВИ №031-04-217-06. 2006а. - 23 с.

6. Анон. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний // Федеральный реестр 1.39.2007.03222., Москва. — 20076.

7. Анон. Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных > нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение // Москва, изд-во ВНИРО. 1998.

8. Анон. Об утверждении концепции метрологического обеспечения уничтожения химического оружия и его бывших производств в Российской Федерации // Государственный комитет Российской Федерации по стандартизации и метрологии / Приказ №78. — 2001а. 10с.

9. Анон. Определение класса опасности токсичных отходов производства и потребления // Санитарные правила № 2.1.7.1386-03, М: Министерство здравоохранения Российской Федерации. 2003. - 28 с.

10. Анон. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи // Методические указания № 2102-79, Москва. — 1980а. 23 с.

11. Анон. Постановка исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны // Методические указания № 2163-80., Москва. 19806. - 19 с.

12. Каган Ю.С. Токсикология фосфорорганических пестицидов // Москва «Медицина». 1977. - 298 с.

13. Кокуричева М.П., Чинарева И.Д., Екимова С.Б. Использование методов биотестирования для экологического мониторинга на примере токсикологической оценки снега и льда с Калининской АС // Межвузовские научные труды, С-Петербург. 2005.

14. Лошадкин Н.А., Курляндский Б.А., Беженарь Г.В., Дарьина Л.В. // Военная токсикология. Глава 2. 2006. - С.67-100.

15. Саноцкий И.В., Монаенкова A.M., Курляндский Б.А. и др. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду // Москва. -1986. С.252-315.

16. Ammon R. Die fermentative Spaltung des Acetylcholine // Pfliigcrs. Arch. Ges. Physiol. 1934. - V.233. -P.486-491.

17. Anon. Sigma Technical Bulletin No.420. -1969.

18. Aurbek N., Thiermann H., Szinicz L., Eyer P., Worek F. Analysis of inhibition, reactivation and aging kinetics of highly toxic organophosphorus compounds with human and pig acetylcholinesterase // Toxicology 2006. -V.224. - #1-2. - P.91-99.

19. Biedler J.L., Roffler-Tarlov S., Schachner M., Freedman L.S. Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones // Cancer Res. 1978. - V.38. - P.3751-3757.

20. Brogdon W.G., Dickinson C.M. A microassay system for measuring esterase activity and protein concentration in small samples and in high-pressure liquid chromatography eluate fractions // Anal. Biochem. — 1983. V.131. - #2.-P.499-503.

21. Caraway W.T. Photometric determination of serum cholinesterase activity // Am. J. Clin. Pathol. 1956. - V.26. - #8. -P.945-955.

22. Carvalho F.A., Gra?a L.M., Martins-Silva J., Saldanha C. Biochemical characterization of human umbilical vein endothelial cell membrane bound acetylcholinesterase // FEBS J. 2005. - V.272. - #21. - P.5584-5594.

23. Clark A.J., Raventos J., Stedman E. and Ellen Stedman. Kinetics of choline esterase //Exp. Physiol. 1938. -P.77-86.

24. Correll L., Ehrich M. A microassay method for neurotoxic esterase determinations. //Fundam. Appl. Toxicol. 1991. - V. 16. - #1. -P. 110-116.

25. Costa L.G. Current issues in organophosphate toxicology // Clinica Chimica Acta. 2006. - V.3 66. - P. 1 -13.

26. Crane C.R., Sanders D.C., Abbott J.K. A comparison of serum cholinesterase methods: II // FAA Civil Aeromedical Institute. Report № AM-72-12. March 1972. - 6 pages

27. Crane C.R., Sanders D.C., Abbott J.K. A comparison of three serum cholinesterase methods // Dept. of Transportation, Office of Aviation Medicine, Report No. AM-70-13. 1970. - 7 pages

28. De la Huerga J., Yesinick C., Popper H. Colorimetric method for the determination of serum cholinesterase // Am J Clin Pathol. 1952. — V.22. -#11.-P.1126-1133.

29. Doctor B.P., Toker L., Roth E., Silman I. Microtiter assay for acetylcholinesterase // Anal. Biochem. 1987. - V.166. - #2. - P.399-403.

30. Ehrich M., Veronesi B. Esterase comparison in neuroblastoma cells of human and rodent origin // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1995. - V.22. - #5. -P.385-386.

31. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. -V.82. — P.70-77.

32. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres VJr., Feather-Stone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. V.7.-P.88-95.

33. Eyer P., Worek F., Kiderlen D., Sinko G., Stuglin A., Simeon-Rudolf V., Reiner E. Molar absorption coefficients for the reduced Ellman reagent: reassessment // Anal. Biochem. 2003. - V.312. - P.224-227.

34. Fremaux I., Mazeres S., Brisson-Lougarre A., Arnaud M., Ladurantie C., Fournier D. Improvement of Drosophila acetylcholinesterase stability byelimination of a free cystein // BMC Biochemistry. 2002. - V.3. - #21. -P.1471-1476.

35. Gajewski D. Acetylcholinesterase activity in several rat liver cell fractions after repeated poisoning with some organophosphates // Acta Physiol. Pol. -1980. — V.13. — P.575-580.

36. Garcia-Lopez J.A., Monteoliva M. Physiological changes in human erythrocyte cholinesterase as measured with the "pH-stat" // Clin. Chem. 1988. - V.34. -#10. — P.2133-2135.

37. Glick D. A micro method for the determination of choline esterase and the activity-pH relationship of this enzyme // The Journal of General Physiology. -1937. — V.21. -P.289-295.

38. Glick D. Methods of Biochemical Analysis // John Wiley & Sons, Inc. V.5. -P.552.

39. Hammond P.S., Forster J.S. A microassay-based procedure for measuring low levels of toxic organophosphorus compounds through acetylcholinesterase inhibition // Anal. Biochem. 1989. - V. 180. -P.3 80-383.

40. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application // J Biol Chem. 1949. -V.180. - #1. -P.249-261.

41. Hiraki K., Kitayama M., Shibata S., Takahashi H. A simple procedure for the estimation of serum cholinesterase applicable to routine clinical biochemistry // Bull. Yamaguchi Med. School. 1955. - V.3. - #1. - P. 19-25.

42. Holmstedt B.O. Distribution and determination of cholinesterases in mammals //Bull. Org. Mond. Sante, Bull. Wld. Hlth. Org. 1971. - V.44. -P.99-107.

43. Johnson C.D., Russell R.L. A rapid, simple radiometric assay for cholinesterase, suitable for multiple determinations // Analytical Biochemistry.- 1975.-V.64. -#1. — P.229-238.

44. Kalow W., Lindsay H.A. A comparison of optical and manometric methods for the assay of human serum cholinesterase // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1955. - V.33. -P.568-574.

45. Kawashima K., Fujii T. Basic and clinical aspects of non-neuronal acetylcholine: overview of non-neuronal cholinergic systems and their biological significance //J. Pharmacol. Sci. -2008. V.106. -P.167-173.

46. Kreimer D.I., Dolginova E.A., Raves M., Sussman J.L., Silman I., Weiner L. A metastable state of Torpedo californica acetylcholinesterase generated by modification with organomercurials // Biochemistry. 1994. - V.6. - #33(48).1. P.14407-14418.

47. Limperos G., Ranta К. E. A Rapid Screening Test for the Determination of the Approximate Cholinesterase Activity of Human Blood // Science. — 1953. -V.117. P.453 - 455.

48. Lockridge O., Adkins S., La Du B.N. Location of disulfide bonds within the sequence of human serum cholinesterase // J. Biol. Chem. 1987. — V.262. -P. 12945-12952.

49. Lockridge O., Eckerson H.W., La Du B.N. Interchain disulfide bonds and subunit organization in human serum cholinesterase // J. Biol. Chem. 1979. -V.254. - P.8324-8330.

50. Massoulie J., Bon S. The molecular forms of cholinesterase and acetylcholinesterase in vertebrates // Annu. Rev. Neurosci. 1982. - V.5. -P.57-106.

51. Michel H.O. An Electrometric method for the determination of red blood cell and plasma cholinesterase activity // J. Lab. Clin. Med. 1949. - V.34. -P.1564-1568.

52. Morel N., Bon S., Greenblatt H.M., Van Belle D., Wodak S J., Sussman J.L., Massoulie J., Silman I. Effect of mutations within the peripheral anionic site on the stability of acetylcholinesterase // Molecular Pharmacology. 1999. - V.55.- P.982-992.

53. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F., Hauschild V. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products // Environ Health Perspect. 1999. - V.107. - #12. - P. 933-974.

54. Nabb D.P., Whitfield F. Determination of cholinesterase by an automated pH stat method // Arch Environ Health. 1967. - V.15. - #2. - P.147-154.

55. Nakashima K., Sera Y., Nakano K. A rapid and simple ultramicromethod for the estimation of serum pseudocholinesterase with butyrylthiocholine as substrate //Bull. Yamaguchi Med. School. 1968. - V.15. - #4. - P.257-268.

56. Newman M.A., Que Нее S.S. Interconversion and comparison of the results of three methods for cholinesterase in serum // Clin. Chem. 1984. - V.30. -#2. -P.308-310.

57. Pedzikiewicz J., Piaskowska E., Pytasz M. Acetylcholinesterase (E.C.3.1.1.7.) in the skeletal muscle and brain of rats after exercise and long-term training // Acta Physiol. Pol. 1984. - V.35. - P.469-474.

58. Rappaport F., Fischl J., Pinto N. An improved method for the estimation of cholinesterase activity in serum // Clin. Chim. Acta 4. 1959. - P.227-230.

59. Roberts W.L., Doctor B.P., Foster J.D., Rosenberry T.L. Bovine brain acetylcholinesterase primary sequence involved in intersubunit disulfide linkages // J. Biol. Chem. 1991. - V.266. - P.7481-7487.

60. Roszell L.E., Kramer B.C., Leach G.J. A microassay method using a neuroblastoma cell line to examine neurotoxicity of organophosphate mixtures // Alternative toxicological methods / edited by Katz S.A., Salem H. 2003. -P.341-346.

61. Russell W.M. The development of the three Rs concept // Altern. Lab. Anim. -1995. V.23. - #3. - P.298-304.

62. Sasaki M. An ultramicromethod for the estimation of serum cholinesterase using metanitrophenol as an indicator // Rinshybyori. — 1964. V.12. - P.555-558.

63. Schumacher M., Maulet Y., Camp S., Taylor P. Multiple messenger RNA species give rise to the structural diversity in acetylcholinesterase // J. Biol. Chem.- 1988.- V.263. -P.l8979-18987.

64. Shibata S., Takahashi H. A simple procedure for the estimation of serum cholinesterase by means of comparator with phenol red as indicator // Bull. Yamaguchi Med. School. 1953. - V.l. - #3. -P. 188-196.

65. Sikorav J.L., Duval N., Anselmet A., Bon S., Krejci E., Legay C., Osterlund M., Reimund В., Massoulie J. // EMBO J. 1988. - V.7. - P.2983-2993.

66. Stedman E., Stedman E. The relative choline-esterase activities of serum and corpuscles from the blood of certain species // Biochem. J. 1935. - V.29. -P.2107-2111.

67. Stedman E., Stedman E., Easson L.H. Choline-esterase. An enzyme present in the blood-serum of the hourse // Biochem. J. 1932. - V.26. - P.2056-2066.

68. Steinberg N., Roth E., Silman I. Torpedo acetylcholinesterase is inactivated bythiol reagents //Biochem. Int. 1990. -V.21. - P.l043-1050.122

69. Szinicz L. History of chemical and biological warfare agents // Toxicology. -2005. V.214. -P.167-181.

70. Takahashi H. Studies on serum cholinesterase I. A method for the estimation of serum cholinesterase activity which is useful in the routine work of clinical laboratory // Bull. Yamaguchi Med. School. 1956. - V.3. - #3. - P. 155-164.

71. Takahashi H., Shibata S. A simple method for the serum cholinesterase determination applicable to routine examination // Igaku to Seibutsugaku. — 1951.- V.20. — P.96-98.

72. Thullbery M.D., Cox H.D., Schule Т., Thompson C.M., George K.M. Differential localization of acetylcholinesterase in neuronal and non-neuronal cells // J Cell Biochem. 2005. - V.96. - #3. - P.599-610.

73. Tiffany-Castiglioni E., Ehrich M., Dees L., Costa L.G., Kodavanti R.S., Lasley S.M., Oortgiesen M., Durham H.D. Bridging the gap between in vitro and in vivo models for neurotoxicology // Toxicological Sciences. 1999. - V.51. — P.178-183.

74. Tiffany-Castiglioni E., Hong S., Qian Y., Tang Y., Donnelly K.C. In vitro models for assessing neurotoxicity of mixtures // Neuro Toxicology. — 2006. — V.27. P.835-839.

75. Tomoda A., Sugimoto K., Suhara M., Takeshita M., Yoneyama Y. Haemichrome formation from haemoglobin subunits by hydrogen peroxide // Biochem. J. 1978. - V.171. -P.329-335.

76. Veronesi В., Ehrich M. Differential cytotoxic sensitivity in mouse and human cell lines exposed to organophosphate insecticides // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1993. - V.120. - #2. - P.240-246.

77. Weiner L., Kreimer D., Roth E., Silman I. Oxidative stress transforms acetylcholinesterase to a molten-globule-like state // Biochem. Biophys. Res. Com. 1994. - V.198. - P.915-922.

78. Wolfsie J.H., Winter G.D. Bromothymol blue screening test value for determination of blood cholinesterase activity // A. M. A. Arch. Ind. Hyg. Occup. Med. 1954. - V.9. - #5. — P.396-401.

79. Worek F., Koller M., Thiermann H., Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning // Toxicology. 2005. - V.214. - P. 182-189.

80. Worek, F., Reiter, G., Eyer, P., Szinicz, L. Reactivation kinetics of acetylcholinesterase from different species inhibited by highly toxic organophosphates // Arch. Toxicol. 2002. - V.76. - P.523-529.

81. Yang Y., Szafraniec L.L., Beaudry W.T., Rohrbaugh D.K., Procell L.R., Samuel J.B. Autocatalytic hydrolysis of V-type nerve agents // J. Org.Chem. — 1996. V.61. - P.8407-8413.