Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Холинэстеразные тесты в экологическом контроле биологически активных соединений

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Белякова, Светлана Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ЭКОЛОГО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (литературный обзор).

2.1. Применение холинстераз в тест-методах определения загрязнителей окру-эюающей среды - специфических ингибиторов.

2.1.1. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз.

2.1.2. Особенности использования холинэстераз в контроле объектов окружающей среды.

2.2. Каликсарены - потенциальные возможности и опыт применения в аналитической химии.

2.2.1. Комплексы "гость-хозяин". Каликсарены - строение и основы молекулярного распознавание.

2.2.2. Применение каликсаренов в определении специфических гостей

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и объекты исследования.

3.2. Приборы и методы эксперимента.

3.2.1. Методы измерения ферментативной активности.

3.2.2. Оценка кинетических параметров ингибирования.

3.3. Методы пробоподготовки.

4. ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫЕ ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ В КОНТРОЛЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.

4.1. Изучение операционных характеристик холинэстеразных тестов.

4.2. Влияние матрицы на аналитические характеристики определения пестицидов в объектах окружающей среды.

4.2.1. Влияние органического растворителя.

4.2.2. Зерно.

4.2.3. Виноградный сок.

4.2.4. Почвы.

4.3. Обобщенная оценка загрязненности почв и осадков сточных вод

4.3.1. Влияние солей металлов на ингибирующее действие экстрактов из почв и осадков сточных вод.

4.3.2. Биохимическое тестирование почв.

4.3.3. Осадки сточных вод.

5. СКРИНИНГ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ - НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ.

5.1. Производные изатина и оксиндола.

5.2. Семичленные циклические ацетали на основе витамина В6 и дельдрина.

5.3. 1,3-Дизамещенные каликсарены и их тиоаналоги.

5.3.1. Фотометрическое детектирование.

5.3.2. Изучение комплексообразования каликсаренов и органических кислот.

5.3.3. Кинетика и механизм ингибирования в системе каликсарен - ИФА -БуХЭ.

5.3.4. Потенциометрическое детектирование.

6. ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

АХЭ - ацетилхолинэстераза;

БуХЭ - бутирилхолинэстераза;

ИФА - индофенилацетат;

ДДВФ - дихлордиметилвинилфосфат;

ПДК - предельно допустимая концентрация загрязнителя;

ХЭ - холинэстераза

Cmin - предел обнаружения, М или мг/л;

Q - концентрация ингибитора, М или мг/л;

Е0 - сигнал потенциметрического сенсора в контрольном измерении, мВ;

Ej - сигнал потенциометрического сенсора в присутствии ингибитора фермента, мВ;

I - ингибитор;

1,% - степень ингибирования фермента; к - константа скорости реакции; кп - бимолекулярная константа скорости необратимого ингибирования, М^мин"1;

К, - константа ингибирования, М ;

К,,, - константа Михаэлиса; t - температура, °С; г - коэффициент регрессии;

S - субстрат ферментативной реакции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Холинэстеразные тесты в экологическом контроле биологически активных соединений"

Актуальность работы. Современные тенденции развития экологического мониторинга характеризуются приоритетным развитием обобщенных методов оценки состояния окружающей среды, ориентированных на характеристику неблагоприятных последствий загрязнения на биоту или отдельных ее представителей в целом [1]. Безусловно, современный уровень развития экоаналитического контроля позволяет надежно и с высокой чувствительностью определять практически все загрязняющие вещества. Однако это зачастую требует дорогостоящего лабораторного оборудования (хроматомасс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и т.д. [2]), сложной и длительной пробоподготовки и высокой квалификации обслуживающего персонала. Постоянное увеличение числа контролируемых параметров, ужесточение санитарно-гигиенических норм присутствия загрязнителей в объектах контроля ограничивают сферу эколого-аналитического контроля, все более сводя его к возможностям немногочисленных хорошо оснащенных стационарных лабораторий. В результате формируется разрыв между потребностью населения и контролирующих природоохранных органов в достоверной информации о качестве среды обитания и реальными сроками ее получения. Сходные проблемы существуют в скрининге биологической активности новых синтезируемых соединений, в том числе при поиске экологически безопасных средств защиты растений. Исчерпывающий анализ токсических свойств на биологических объектах различного уровня организации, с учетом всех разнообразных факторов, определяющих эффективность воздействия токсиканта, видовой, половой и индивидуальной изменчивости реакции организма, определение количественных показателей токсичности (LD50 и другие), требует, по разным оценкам, от 250 тыс. до нескольких миллионов долларов США и до 10 лет интенсивных исследований для каждого исследуемого соединения [3].

Не заменяя современных методов физико-химического анализа, тестовые методы позволяют получать предварительную информацию о присутствии приоритетных токсикантов (или преобладающем токсикологическом эффекте) непосредственно по месту пробоотбора, с минимальной пробоподготовкой или в отсутствие таковой [4]. Немаловажно, что подобные тесты не требуют специальных профессиональных навыков и могут в ряде случаев проводиться даже в бытовых условиях. В результате появляется возможность быстрого и недорого определения потенциальной опасности загрязнения, природу и источник которого можно определить позднее. Предварительный контроль с использованием тест-методов не только позволяет выиграть время и тем самым предотвратить поступление токсикантов по трофическим цепям, но и существенно сократить себестоимость экоаналитического контроля, исключив из последующего детального изучения заведомого нетоксичные пробы. Не случайно даже в богатых индустриально развитых странах разработке тест-методов анализа уделяется первостепенное значение, а производство разнообразных средств предварительного контроля (индикаторные бумаги и трубки, полевые химические лаборатории и т.д.) сосредоточено в руках крупнейших химических концернов (Merck, Aldrich, Boeringer Mangheim, Ohmicron и др.).

Среди тест-методов экоаналитического контроля средства биохимической диагностики занимают особое положение. В них используются биологические компоненты -ферменты, микробные культуры, генетический материал и т.д. [5,6]. Индикация присутствия биологически активного вещества основана на его вовлечении в биохимический процесс - ферментативную реакцию, образование комплекса антиген-антитело, нарушение специфичности связывания нуклеиновых кислот и т.д. Такие биохимические тесты с различной степенью достоверности моделируют реальные процессы токсикации живого организма. Полученные результаты характеризуют тот потенциальный вред, который теастируемые соединения могут нанести живому организму. В ряде случаев достигаемые пределы обнаружения биологически активных соединений настолько низки, что позволяют проводить прямое определение токсиканта на уровне ПДК в объекте контроля без его предварительного концентрирования.

Принцип оценки количества вещества по его биологическому эффекту типичен для подходов биологического мониторинга [1], однако в случае тест-методов становится возможна детальная количественная оценка токсического эффекта. Тем самым появляется возможность не только расширить сферу действия экологического мониторинга, но и решать некоторые специальные задачи экотоксикологии, фармакологии и т.д. (экологическое нормирование, поиск новых лекарственных препаратов, установление механизма метаболической трансформации и токсикации живого организма).

Вместе с тем, несмотря на огромный потенциал, средства биохимической диагностики экотоксикантов пока не находят широкого практического применения. Например, в области ферментативных методов анализа на долю тест-методов контроля загрязнения окружющей среды приходится лишь 2% рынка, что составляет около 20 млн. долларов в год. Одна из причин этого состоит в недостаточной изученности поведения биохимических тестов в условиях разнообразия компонентов, присутствующих в объектах окружающей среды. В отличие от средств медицинской диагностики, ориентированных на определение достаточно больших (на уровне nx 10"4 М) концентраций метаболитов в средах относительно постоянного состава, экологические тесты должны позволять детектирование микро- и наномолярных концентраций токсикантов в присутствии многократных избытков сотен различных соединений, многие из которых также способны влиять на стабильность и активность биологического компонента [7].

Холинэстеразы являются одними из наиболее исследованных ферментов, используемых в ферментативных методах контроля окружающей среды [8 и цитируемые в обзоре работы]. Это связано с уникально широким кругом ингибиторов холинэстераз, в числе которых пестициды, поверхностно-активные вещества, соли тяжелых металлов. Однако примеры практического использования холинэстераз весьма ограничены. Проблемы стабилизации фермента при хранении и применении, сложность интерпретации отклика и необходимость реактивации ингибированного фермента затрудняют внедрение холинэстеразных тестов в практику деятельности природоохранных служб. Попытки упростить процедуру измерения путем создания одноразовых сенсоров на основе технологий микропечати не продвинулись дальше пилотных образцов, поскольку воспроизводимость отклика биосенсоров в производимой серии и быстрая инактиавация холинэстераз в процессе хранения не позволяют получить надежного и воспроизводимого сигнала в присутствии токсикантов в объектах окружающей среды.

Внедрение средств биохимической диагностики в практику экологического мониторинга требует в первую очередь решить вопросы надежности детектирования и инте-претации биохимического сигнала, расширения круга определяемых соединений, в том числе с использованием модификаторов, обеспечивающих селективность детектирования конкретных токсикантов. Необходимо также выработать алгоритма оценки механизма ингибирования для вновь синтезируемых соединений. В этой связи настоящая работа, посвященная дальнейшему развитию средств биохимической диагностики загрязнения на основе стабилизированных препаратов холинэстеразы, является актуальной.

Целью настоящей работы явилось развитие теоретических и практических подходов к диагностике загрязнения окружающей среды и скринингу токсичности органических соединений с помощью стабилизированных препаратов холинэстеразы с фотометрическим и потенциометрическим детектированием сигнала.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить операционные характеристики тестов на основе холинэстеразы, включенной в состав водорастворимого стабилизатора - N-фталилхитозана, в определении ингибиторов фермента в модельных растворах и объектах окружающей среды;

- установить влияние макрокомпонентов объектов окружающей среды (почвы, зерно, виноградный сок, осадки сточных вод) на чувствительность и селективность определения фосфорорганических пестицидов с помощью разработанных тестов, предложить новые способы пробоподготовки, нивелирующие обнаруженное влияние матрицы сложных объектов;

- предложить подходы к скринингу токсического действия новых синтезированных эле-ментоорганических соединений, не являющихся специфическими ингибиторами холинэстеразы;

- разработать способы биохимической регистрации образования комплексов типа "гость-хозяин" с участием 1,3-дизамещенных каликсаренов и их тиоаналогов, обосновать механизм влияния каликсаренов -комплексообразователей на активность нативной холинэстеразы, а также предложить методики фотометрического и потенциометрического определения органических соединений, участвующих в формировании комплексов.

Научная новизна работы заключаются в том, что:

- определены рабочие условия прямого обнаружения и полуколичественной оценки содержания пестицидов антихолинэстеразного действия в растительных и почвенных экстрактах, виноградном соке и осадках сточных вод без предварительного концентрирования пробы;

- впервые установлено влияние процессов ионного обмена и миграции подвижных форм металлов на ингибирующее действие осадков сточных вод и почв и на этой основе предложено использовать показатели степени ингибирования в различных режимах пробоподготовки для предварительной обобщенной характеристики загрязненности объектов контроля;

- впервые установлен факт ингибирования холинэстераз 1,3-замещенными каликсарена-ми, предложен механизм ингибирования, включающий кооперативное взаимодействие комплекса типа "гость-хозяин" между субстратом и каликсареном и активного центра фермента без образования ковалентных связей или электростатического взаимодействия;

- впервые количественно охарактеризовано антихолинэстеразное действие фосфорилиро-ванных производных оксиндола и изатина, семичленных ацеталей производных витамина В 6 и дельдрина, предложены методологические подходы к оценке механизма ингибирования и количественной оценке ингибирующего эффекта.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые и удобные в использовании ферментные тесты на основе коммерческих препаратов холинэстераз, включенных в водорастворимые пленки на основе фталилхитазана, и фотометрических и потенциометрических способов детектирования, отличающиеся повышенной стабильностью при хранении и использовании;

- предложены методики высокочувствительного детектирования остаточных количеств фосфорорганических соединений в объектах окружающей среды на уровне установленных норм, а также оценки общей загрязненности почв и осадков сточных вод подвижными формами тяжелых металлов без трудоемких способов пробоподготовки;

- разработаны алгоритмы оценки экотоксикологических характеристик и скрининга биохимической активности новых синтезированных органических веществ, содержащих несколько потенциальных центров связывания с ферментом.

На защиту выносятся:

- результаты исследования влияния макрокомпонентов матрицы на результаты определения пестицидов с помощью ферментных тестов на основе стабилизированных препаратов холинэстеразы и вывод о возможности прямого детектирования их количеств на уровне ПДК без концентрирования экстрактов или их очистки;

- обоснование возможности применения ферментных тестов для обобщенной оценки загрязнения почв и осадков сточных вод подвижными формами тяжелых металлов;

- сравнительное исследование процессов комплексообразования индофенилацетата различными 1,3-замещенными каликсаренами физико-химическими и биохимическими методами и обоснование кооперативного механизма ингибирования в системе каликсарен - холинэстераза - субстрат без образования ковалентных связей с активным центром фермента;

- влияние присутствия органических кислот и их эфиров, способных связываться с каликсаренами, на их ингибирующую способность и способ определения молекул -"гостей" по их либеративному действию на ингибированную холинэстеразу.

- результаты скрининга антихолинэстеразной активности производных изатина и ок-синдола, семичленных ацеталей производных пиридоксина и дельдрина и подходы к определению центров связывания и механизма ингибирования холинэстераз полифункциональными неспецифическими ингибиторами.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2000, 2001 гг.), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.), Российско-германском симпозиуме "Биосенсоры для экологического мониторинга" (Иркутск, 2000 г.), Международном симпозиуме "Молекулярный дизайн и синтез супрамо-лекулярных структур" (Казань, 2000 г.), 11 Российско-японском симпозиуме по аналитической химии (Москва, 2000 г.), 1 Научной конференции молодых ученых, аспирантов и

13 студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2000), 7 Симпозиуме по кинетическим методам анализа (Бухарест, 2001), Всероссийском симпозиуме по тест-методам анализа (Москва, 2001).

Основные результаты изложены в 2 статьях и 7 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста, включает 31 рисунок и 20 таблиц. Состоит из Введения, 4 глав, Выводов и Списка использованных библиографических источников, включающего 173 ссылки на отечественные и зарубежные работы.