Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды"

На правах рукописи

ГАБСАБИРОВА РЕГИНА РАСИМОВНА

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ ПЕРОКСИДАЗНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ГРАФИТОВЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03.00.16 -Экология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ -2003

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель: доктор химических наук,

доцент Евтюгин Геннадий Артурович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Фридланд Сергей Владимирович кандидат биологических наук, ст.научн.сотр. Петров Андрей Михайлович

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт безопасности жизнедеятельности Республики Башкортостан (г.Уфа)

Защита диссертации состоится 23 декабря 2003 г. в 1430 на заседании диссертационного Совета Д 212.081.19 при Казанском государственном университете им. В. И. Ульянова-Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, ауд. 204 экологического факультета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета.

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, КГУ, Научная часть « . .

Автореферат разослан

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор химических наук

Г.А. Евтюгин

17157

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современное развитие экологического мониторинга отличается повышенным вниманием, уделяемым развитию средств экспресс-оценки состояния окружающей среды на основании токсикологических критериев. Целью применения таких нестандартных средств диагностики является совокупная оценка неблагоприятных последствий всей совокупности токсикантов, присутствующих в объекте контроля, на б йоту. Такая оценка должна предшествовать полному анализу физико-химических и токсикологических свойств образца, требующему дорогостоящего лабораторного оборудования (хроматомасс-спектроскопия, ВЭЖХ и др.) и высокой квалификации обслуживающего персонала. Экспресс-системы оповещения о токсичности призваны заполнить существующий разрыв между потребностью населения и контролирующих природоохранных органов в достоверной информации о качестве среды обитания и реальными сроками ее получения.

Ферменты как никакие другие биологические компоненты подходят для создания и использования экспрессных биологических тестов в экоаналитиче-ском контроле окружающей среды. Они обеспечивают получение быстрого и чувствительного сигнала и способны в течение нескольких минут определить присутствие той или иной группы токсических веществ в объекте контроля. Немаловажно, что влияние токсикантов на ферменты поддается количественной обработке и может быть осуществлено с использованием стандартных процедур, достаточно распространенных в биотехнологии, клиническом анализе и микробиологической промышленности. Это расширяет сферу применения экологического мониторинга и позволяет одновременно решать задачи экотоксикологии и экологического нормирования поступающих загрязняющих веществ.

Вместе с тем, практическое использование биохимической диагностики требует предварительного решения задач стандартизации отклика на основные экотоксиканты. Эта проблема особенно актуальна, если объект отличается разнообразием макро- и микрокомпонентов, что типично для промышленных сточных вод и отходов производства и потребления. Требуется надежная теоретическая и экспериментальная база для производства и эксплуатации ферментных тестов, в том числе с использованием серийно выпускаемого измерительного оборудования.

Пероксидаза - один из наиболее изученных ферментов, широко используемых в биоаналитических методах исследования. Помимо широкой субстрат- 3 - ....... .

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПетербургчу

оа ^Ь

ной специфичности, пероксидаза является индикатором уровня метаболических процессов и стрессовых состояний живых организмов. Это делает пероксидазу одним из перспективных объектов для включения в состав ферментных сенсорных устройств, предназначенных для оценки загрязнения окружающей среды. В этой связи настоящая работа, эколого-аналитическому применению пероксидаз-ного сенсора, является актуальной.

Целью настоящей работы явилось создание и всесторонняя характеристика пероксидазного сенсора на основе планарного графитового электрода, предназначенного для контроля содержания основных токсикантов и обобщенной оценки загрязнения сточных вод.

Дня достижения поставленной цели были поставлены и решены следующие задачи:

- определены оптимальные условия иммобилизации пероксидазы и измерения сигнала сенсора в присутствии различных токсикантов и сточных вод;

- оценена чувствительность сигнала пероксидазного сенсора к модельным токсикантам в однокомпонентных растворах;

- установлены факторы, влияющие на проявление токсических свойств субстратов и эффекторов пероксидазы, а также вклад неферментативных путей образования конечных продуктов;

- проведен скрининг пероксидазной активности ранее не изучавшихся соединений с различными функциональными группами (циклические производные пи-ридоксина) для установления влияния их строения пероксидазную активность;

- проведено тестирование сточных вод предприятий г.Казани и установлена зависимость между сигналом пероксидазного сенсора при различных разведениях вод, гидрохимическими и токсикологическими характеристиками стоков с привлечением современных методов статистического анализа.

Научная новизна работы заключаются в том, что:

- впервые предложено использовать пероксидазный сенсор для количественной характеристики замещенных фенолов и анилинов - потенциальных компонентов сточных вод;

- впервые установлено влияние процессов каталитического окисления гидрохинона в присутствии ионов металлов на изменение сигнала пероксидазного сенсора в широком диапазоне рН и концентраций реагентов;

- определены рабочие условия измерения сигнала, позволяющие разделить влияние отдельных групп токсикантов и неферментативные (каталитические) стадии образования продуктов на сигнал биосенсора;

- впервые охарактеризованы свойства циклических замещенных пиридоксинов как эффекторов пероксидазы;

- показана возможность использования показателя пероксидазной активности для классификации сточных вод по степени их очистки и источнику поступления, установлена корреляция сигнала биосенсора с результатами биотестирования на Paramecium caudatum (острая токсичность).

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые и удобные способы иммобилизации пероксидазы и регистрации пероксидазной активности по току восстановления бензохинона, образующегося в реакции с участием гидрохинона на поверхности амперометриче-ского сенсора;

- предложены методики определения замещенных фенолов и анилинов - субстратов пероксидазы, а также оценки загрязненности промышленных сточных вод без трудоемких способов пробоподготовки;

- на примере циклических производных пиридоксина предложены подходы к оценке влияния структуры соединений на их пероксидазную активность, предложены упрощенные процедуры предварительного скрининга биохимической активности новых синтезированных органических соединений, содержащих несколько потенциальных центров связывания с ферментом.

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе в Казанском государственного университете при чтении

общего курса "Экологических мониторинг".

На защиту выносятся:

- исследование влияния условий иммобилизации и измерения сигнала на чувствительность определения органических субстратов и неорганических ингибиторов пероксидаз и вывод о характере влияния упомянутых факторов на сигнал пероксидазного сенсора;

- обоснование возможности применения пероксидазного сенсора в предварительной оценке уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод;

- сравнительное изучение процессов каталитического и ферментативного окисления гидрохинона пероксидом водорода в присутствии ионов металлов и вы-

вод о вкладе неферментативных реакций в сигнал пероксидазного сенсора в присутствии солей никеля, кадмия, свинца и ртути (И);

- классификация сточных вод по показателям пероксидазной активности и вывод о возможности определения источника и степени загрязненности сточных вод по совокупности гидрохимических, экотоксикологических и биосенсорных данных;

- скрининг пероксидазной активности циклических производных пиридоксина и подходы к определению центров связывания и механизма действия полифункциональных неспецифических ингибиторов фермента.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2001, 2002 гг.), Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (2001 г.), Поволжской конференции по аналитической химии (2001 г.), Всероссийской конференции с международным участием "Актуальные проблемы аналитической химии" (2002 г.), Международной конференции по аналитической химии Euroanalysis-12 (Дортмунд, Германия, 2002 г.), III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003 г.).

Основные результаты изложены в 1 статье и 6 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, включает 40 рисунков и 26 таблиц. Состоит из введения, шести глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 163 ссылки на отечественные и зарубежные работы.

Диссертация выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета в рамках госбюджетной темы ГР № 01.98.0006937, код ГСНТИ 87.43.21, при поддержке грантов РФФИ (00-03-32605 "Разработка электрохимических биосенсоров на основе планарных модифицированных электродов для диагностики загрязнения окружающей среды"), CRDF (НОЦ Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" REC-007), Академии наук Татарстана (09-9.4-124/2003(Ф) "Информационно-аналитическая система оценки токсичности промышленных сточных вод на основе биосенсоров").

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Использовали пероксидазу из корней хрена производства Уйай, Россия, с удельной активностью 3 1Е / мг. Субстратами ферментативной реакции служили гидрохинон и перекись водорода. Иммобилизацию проводили кросс-сшивкой глутаровым альдегидом из расчета 1 Е на электрод в присутствии 0.5% нафиона и 0.01% желатина.

Для изготовления пероксидазных сенсоров использовали пленарные электроды на основе пленок поливинилхлорида со слоем графитовой композиции, наносимых методом трафаретной печати (НПВП "ИВА", Екатеринбург) или путем напыления (университет г. Перпиньян, Франция).

1.5 см

В качестве модельных токсикантов - субстратов и эффекторов пероксида-зы - исследовали соли меди (II), ртути (II), свинца, никеля и кадмия, замещенные ароматические амины и фенолы, гидроксиламин, гидразин сульфат, триэтанола-мин, алифатические спирты. Были изучены производные пиридоксина (табл.1), синтезированные под рук. с.н.с. Штырлина JO.IV в Научно-исследовательском химическом институте им.А.М.Бутлерова.

Сигнал пероксидазных сенсоров регистрировали с помощью полярографического анализатора РА-2 (Брно, Чехия) и вольтамперометрического анализатора ИВА-5 (НПВП "ИВА", Екатеринбург) в режиме линенйной развертки потенциала или при постоянном потенциале. Все потенциалы измеряли относительно хлорсеребряного электрода сравнения (Ад/А§С1). Противоэлектродом служила никелевая фольга. Измерения проводили в 0.002 М ацетатном или фосфатном буферном растворе.

Таблица 1

Структура и шифры производных пиридоксина, изученных в работе

Шифр_Структура_Шифр

Структура

н о—^снз ( Я Н3С N02 О^Ц-"СНз ( Р

1 СН3СОО^ ГТ 7 о2м- 1г°уУ

щС ч ) N

( Н О—^СН3 Р Н3С О-^СНз \ я

2 8 нсх. гУ

X Н3С N J Н3С^

Н3С Н3С О^СН,

з СН3СОО^ Л7 9 нох Л7

щс" V щс'

Н3С 0_Ц-СН3 ( О н 0—^"сн3 Л7

4 С6Н3СО(Х А-7 10 но^

Н3С' V НзС''

Н3С 0-Ц-"снз Г я 0_^СН(СН3)2 Г я

5 С6Н580зх IV 11 нсх. гУ

Н3С^ и н3С -к ) N

СН2ОН Сб^ЭОз^ „СН2ОН

Н3СК

Сигналом пероксидазного сенсора служил ток восстановления бензо-хинона, образующегося в реакции пероксидазного окисления гидрохинона (1). Пероксидаза

Измерение активирующего и ингибирующего действия эффекторов проводили, добавляя их к рабочему буферному раствору на 10 мин., после чего в тот же раствор вносили гидрохинон и пероксид водорода (по 1.0 мМ) и измеряли сигнал. Аналогичным образом проводили тестирование сточных вод. Перед измерением воды фильтровали, корректировали рН до величины 6.5 и разбавляли в пропорции от 1:1 до 1:100.

Операционные характеристики пероксидазного сенсора. Для оценки активности иммобилизованной пероксидазы нами предложено использовать реакцию окисления гидрохинона. Преимуществами данного субстрата являются обратимость ферментативного и электрохимического превращения, а также отсутствие продуктов поликонденсации и неспецифической сорбции субстрата и продукта на графитовых электродах. В отсутствие пероксидазы окисление гидрохинона пероксидом водорода протекает достаточно медленно и оказывает влияние на сигнал биосенсора только при больших избытках окислителя относительно гидрохинона или в присутствии ионов металлов, катализирующих неферментативное окисление субстрата.

На рис.1 в качестве примера представлена поверхность отклика, полученная путем моделирования по индивидуальным концентрационным профилям с помощью ППП Surfer. В слабокислой среде чувствительность сигнала к гидрохинону намного выше, чем к пероксиду водорода. В области высоких концентраций последнего проявляется спад сигнала, связанный с побочными окислительными реакциями с участием данного субстрата. Напротив, в нейтральной среде наклон начального линейного участка выше при варьировании концентрации пероксида водорода. Расчетные значения константы Михаэлиса по значениям тока, отвечающего насыщающим концентрациям субстратов, дали значение

(О

-150 мВ OTH.Ag/AgCl

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

0.4±0.1 мМ, хорошо согласующееся с литературными данными, а также результатами кинетических исследований с нативным ферментом. Это свидетельствует об отсутствии значительного диффузионного торможения переноса субстрата к активному центру, а также о том, что процедура иммобилизации не затрагивает ближайшего окружения активного центра фермента.

мкА

и!

Ш

9.0

Гидрохинон, 7-° мМ 5.0

' э.о

7 0 Пероксид водорода, 5 0 мМ

з.о 30

1.оч ^ 1.0

Рисунок I. Поверхность отклика пероксидазного сенсора. Фосфатный буферный раствор, рН 4.5

Нагрузку фермента определяли исходя из величины сигнала (рис.2) и его стабильности.

Рисунок 2. Зависимость сигнала от концентрации фермента (а) и рН (б)

Максимум активности пероксидазы при ее иммобилизации смещается в сторону ббльших значений рН. Это может быть проявлением собственных буферных свойств белковой пленки |в электроде или связано с участием ионов водорода в реакции катодного восстановления бензохинона.

Для шести последовательных измерений на одном электроде погрешность определения сигнала пероксидазного сенсора составила 4%, в серии из шести электродов, приготовленных одномоментно, - 7-8%. Отклик стабилен при хранении и использовании сенсора в течение по крайней мере месяца. В этот период • времени происходит закономерное увеличение времени отклика и погрешности

' его измерения, сопровождаемое помутнением и растрескиванием поверхностной

! белковой пленки.

Ъ

Характеристики определения других потенциальных субстратов перокси-дазы в сравнении с гидрохиноном приведены в табл.2.

Таблица 2

Характеристики определения субстратов пероксидазы с помощью амперометрического биосенсора

Субстрат пероксидазы Предел обнаружения, мМ Диапазон определяемых концентраций, мМ Чувствительность, А М'1 см'2

Гидрохинон 0.01 0.02-0.08 0.18

л-Метоксианилин 0.02 0.03-1.00 0.031

и-Хлоранилин 0.005 0.006-0.060 0.035

.м-Толуидин 0.02 0.03-0.45 0.10

3,4-Дихлорфенол 0.09 0.12-0.22 0.125

2-Амино-4-нитрофенол 0.003 0.005-0.230 0.27

По чувствительности и диапазону определяемых концентраций с гидрохиноном может соперничать только 2-амино-4-нигрофенол. Но он склонен к полимеризации в условиях измерения сигнала, что приводит к неконтролируемым изменениям сигнала в серии измерений с одним и тем же электродом.

Влияние эффекторов пероксидаз - модельных токсикантов. Вещества, меняющие активность фермента или его состояние в белковой пленке, закономерно изменяют сигнал пероксидазного сенсора. Результаты скрининга перок-сидазной активности ряда типичных представителей сточных вод химических производств приведены на рис.3.

Токсикант

Рисунок 3. Относительное изменение сигнала (1,%) пероксидазного сенсора в присутствии 1 мг/л токсикантов. 1 - триэтаноламин, 2 - гидразин сульфат, 3 -изобутиловый спирт, 4 - оксалат натрия, 5 - анилин, 6 - нитрат кадмия, 7 - хлорид

меди (И), 8 - гидроксиламин гидрохлорид, 9 - муравьиная кислота, 10 - нитрат свинца. Гидрохинон и пероксид водорода 1.0 мМ. Фосфатный буферный раствор,

рН 6.0.

Действие всей указанных соединений носит обратимых характер, только изобутанол после отмывки биосенсора сохраняет свое ингибирующее действие, что, возможно, обусловлено необратимыми изменениями третичной структуры белка вследствие нарушения гидрофильно-гидрофобного баланса. Сходный эффект оказывают и другие органические растворители, смешивающиеся с водой.

Действие ионов металлов ограничено влиянием фосфатного буферного раствора, снижающего их подвижность в белковом слое. В ацетатном буферном растворе в нейтральной и слабокислой среде действие металлов на сигнал пе-роксидазного сенсора становится неоднозначным. Впервые обнаружено, что варьирование концентрации токсикантов вместо закономерного изменения ин-гибирующего действия приводит к появлению острых максимумов активности. Их положение и величина зависят от природы металла и условий эксперимента. В качестве примера на рис. 4 представлено относительное изменение сигнала при варьировании концентрации ионов ртути (II) и рН.

Рисунок 4. Влияние ионов ртути (II) на относительное изменение сигнала (1,%) пероксидазного сенсора. Гидрохинон и пероксид водорода 1.0 мМ, ацетатный буферный раствор, рН 5.5. Инкубирование 10 мин.

Для всех изученных металлов СВДП), Сё, Си(Н), РЬ, N0 при общем сохранении тенденции к увеличению ингибирующего действия по мере возрастания их концентрации в области средних концентраций и рН наблюдается "яма" - область активации фермента. Кроме того, встречаются локальные максимумы и минимумы активности на краях поверхности сигнала, что может быть обусловлено гидролитической неустойчивостью ионов металлов и недостаточной эффективностью процедуры сглаживания.

Для объяснения активирующего действия металлов на сигнал пероксидазного сенсора было выдвинуто предположение об участии ионов металлов в неферментативном окислении гидрохинона. Действительно, как показали эксперименты, в присутствии ионов металлов окисление гидрохинона пероксидом водорода значительно ускоряется, что приводит к образованию дополнительных количеств бензохинона и увеличению сигнала биосенсора. В качестве примера на рис.5 представлены зависимости тока восстановления бензохинона от продолжительности реакции в смеси гидрохинона, нитрата кадмия и пероксида водорода, зарегистрированные на стеклографитовом электроде в отсутствие перок-сидазы. Как видно, заметное накопление бензохинона происходит уже к 15 минуте. Максимальные значения сигнала соответствуют окислению около 20% исходного количества субстрата. Очевидно, что при тестировании проб произвольного состава (сточных вод и др.) совокупный эффект всех металлов, присут-

I I

ствующих в образце, может значительно превышать указанное значение. Поскольку катодное восстановление регенерирует субстрат, неферментативное образование бензохинона может увеличивать сигнал биосенсора многократно.

3.5-i s З.о-

2.5-

2.0-

1.5-

1.0-

0.5-

0 1000 2000 3000 4000 5000

t, с

Рисунок 5. Зависимость тока восстановления бензохинона от состава реакционной смеси в присутствии ионов кадмия. А - Ccd 0.09 мМ, CH¡0 5.0 мМ, Д - CCj 0.09 мМ, CHi0¡ 0.5 мМ, ■ - Си 0.022 мМ, Сн,0, 1.0 мМ, □ - Ccd 0.09 мМ, CH¡0¡ 2~0 мМ, • - CCd 0.044 мМ, СНЛ 1.0 мМ, О - Cc<i 4.3 мкМ, Снд 1.0 мМ. Концентрация гидрохинона 1.0 мМ. ацетатный буферный раствор. рН 5.0.

В изученных условиях каталитическая активность металлов увеличивается в ряду: медь < кадмий < свинец. Каталитическое действие солей ртути охарактеризовать не удалось в силу низкой воспроизводимости ее влияния. Возможно, это связано с гидролитической неустойчивостью ионов ртути (II) в изученном диапазоне рН.

Тестирование промышленных сточных вод. Было проведено тестирование 58 проб сточных вод, отобранных в рамках программы контроля промышленных стоков ЦСИАК Минэкологии и природных ресурсов Татарстана. Статистика основных гидрохимических показателей показала нормальное распределение всех характеристик (табл.3). При оценке пероксидазной активности воды разбавляли в интервале от 1:1 до 1:500. Всего более 60% всех проб показало активацию или ингибирование сигнала биосенсора. В тестах на острую токсичность на парамециях было выявлено 4 токсичных образца, на дафниях -16.

Разбавление стоков нерегулярно влияет на сигнал пероксидазного сенсора. Как и в случае с ионами металлов, на зависимостях сигнала от разбавления имеются максимумы и минимумы, характерные для отдельных источников поступления стоков. Можно предположить, что такое поведение определяется соотношением содержания органического вешества и металлов.

Таблица 3

Статистическая оценка некоторых гидрохимических показателей выборки

проб промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод г.Казани

Параметр рН Взвешенные ' ХПК '> БПК3 *' Нефтепродукты *' АПАВ*'

Число проб 46 55 55 55 27 31

Среднее 7.54 4.62 4.83 3.59 -1.11 -1.33

Расхождение 0.18 1.24 1.44 2.98 2.64 2.01

Стандартная погрешность 0.42 1.11 1.20 1.73 1.62 1.42

Минимальное значение 6.7 2.94 2.91 0.41 -3.91 -4.02

Максимальное значение 8.4 6.61 6.70 5.87 1.19 0.64

Разбег 1.7 3.66 3.79 5.47 5.11 4.66

Стандартная асимметрия 0.090 0.48 -0.13 -1.39 -0.59 -0.85

Стандартный эксцесс -0.89 -1.36 -1.88 -1.54 -0.95 -1.17

*) Логарифмическая шкала, ^(С, мг/л)

При высоком содержании органического вещества разбавление сточных вод уменьшает ингибирующее действие металлов. Если же содержание органического вещества невелико, то превалирует каталитическое действие металлов и связанное с ним неферментативное образование бензохинона. На изменение сигнала будут влиять также комплексообразование и гидролиз солей металлов. Все это делает пероксидазный сенсор неспецифичным индикатором характера загрязнения сточных вод, а разбавление позволяет получить дополнительную информацию о характере загрязнения.

Статистика биосенсорных данных (относительное изменение сигнала пероксидазного сенсора при различных разбавлениях вод) выявила выпадения, искажающие их нормальное распределение. Учитывая небольшой объем выборки, было предложено модифицировать данные с помошью виндзоровских преобра-

зований. Суть их состоит в замене выпадающих значений следующими по рангу, полученными после сортировки всей исходной выборки. Это привело к значительному улучшению исходной статистики и последующей классификации сточных вод с использованием таких данных.

Для оценки прогнозных возможностей пероксидазного сенсора с помощью дискриминантного анализа была проведена классификация исходной выборки данных по трем моделям, учитывающим характер формирования стоков, их первичную очистку и сезон. Результаты классификации представлены в табл.4-6.

Таблица 4

Классификация сточных вод по источнику: хозяйственно бытовые сточные воды

(класс 1) и промышленные сточные воды (класс 2)

Реальный класс образца Размер группы Предсказанный класс

1 2

1 38 21 (55%) 17(45%)

2 14 2 (14%) 12 (85%)

Таблица 5

Классификация сточных вод по обработке: сточные воды, поступающие на очистные сооружения (класс 1) и очищенные перед сбросом в коллектор

Реальный класс образца Размер группы Предсказанный класс

1 2

1 27 21 (78%) 17 (45%)

2 26 10 (38%) 16 (62%)

Таблица 6

Классификация сточных вод по сезону: осень (класс 1), зима (класс 2), __весна (класс 3)_

—Реальный класс— образца Размер группы Предсказанный класс

1 2 3

1 18 10 (56%) 3 (17%) 5 (27%)

2 18 9 (50%) 7 (39%) 2(11%)

3 20 5 (25%) 6 (30%) 9 (45%)

Как видно, биосенсорные данные по пяти разбавлениям сточных вод (от 1:1 до 1:500) позволяют добиться успешного прогноза в 80% случаев по первой модели (источник сточных вод) и около 70% - по второй (очистка). Для сравне-

ния, аналогичные прогнозы по совокупности гидрохимических показателей показали успешность не более 55%, что близко к априорной вероятности класса.

Сезонные изменения состава сточных вод, очевидно, незначительны для достоверного их установления, поэтому все варианты расчетов не дали достоверного прогноза класса. Аналогичным образом, установлена корреляция сигнала пероксидазного сенсора и показателя острой токсичности для парамеций (более 80%) и дафний (около 70%). Однако малое количество токсичных проб не позволило дать полную количественную оценку связи.

Оценка пероксидазной активности циклических производных пири-доксина. Возможность быстрой оценки биологического эффекта новых синтезированных соединений была показана на примере семичленных циклических аце-талей и кеталей пиридоксина (витамина Вб). Пероксидазная активность указанных соединений 1-11 предположительно связана с наличием гидроксильной группы пиридоксинового кольца, потенциально способного к окислительным превращениям аналогично замещенным фенолам. Действительно, соединения 2 и 8 показывают выраженный активирующий эффект на иммобилизованную пе-роксидазу, увеличивая сигнал биосенсора в 1.5-2.5 раза. Они характеризуются максимальной чувствительностью и минимальным значением действующих концентраций в представленном ряду. Вместе с тем, соединения 9-11 практически не действуют на фермент (табл.7).

Таблица 7

Влияние циклических производных пиридоксина на активность пероксидазы

Шифр соединения Чувствительность (Д%/Д ^С) Концентрация максимального эффекта Диапазон изученных концентраций, нМ

1 40 4-6 мкМ 10 - 800

2 60 10 нМ 0.5 -100

3 34 2 мкМ 1 - 2000

4 -20 40 нМ 1-40

8 55 100 нМ 1-600

Обращает внимание, что при переходе от ацетали 2 к кетали 8 эффективность активации снижается практически в 10 раз, хотя семичленный цикл находится достаточно далеко от потенциального центра связывания. По-видимому, различия в пероксидазной активности указанных соединений определяются также доступностью гидроксильной группы для редокс-центра фермента. Конфор-

мационные изменения в цикле (при переходе от ацетали к кетали и от метального к изопропильному заместителю) и наличие разветвленного 2-диметиламиноэтильного заместителя в пиридоксиновом фрагменте затрудняют достижение необходимой ориентации эффектора относительно активного центра фермента, что снижает его влияние на фермент. Что касается соединений 1,3 и 4, их активирующее действие связано, по-видимому, с первичных гидролизом сложноэфирной группы и высвобождением свободной гидроксогруппы (превращением в соединения 2 и 8). В пользу этого свидетельствует отсутствие пе-роксидазной активности у простого эфира 7, не способного к гидролизу.

Поскольку скорость гидролиза зависит от природы уходящей группы и рН раствора, активирующее действие указанных соединений выражено намного слабее. В случае соединения 4 в изученном диапазоне концентраций превалирует незначительное ингибирующее действие, возможно, в силу прямого ингиби-рующего действия бензоат-иона на геминовый центр пероксидазы. Что касается аминопроизводных 9 и 10, их биологическая активность может иметь иной характер, в частности, благодаря способности аминогрупп к конкурентному связыванию с гидролитическими ферментами. Холинэргическое действие данных соединений было подтверждено в экспериментах с нативной холинэстеразой.

Таким образом, разработанный биосенсор позволил провести оценку влияния конформационных эффектов на специфичность связывания и уровень пероксидазной активности циклических производных пиридоксина.

ВЫВОДЫ

1. Разработан пероксидазный сенсор на основе пероксидазы из хрена, иммобилизованной на поверхности графитового пленарного электрода путем кросс. сшивки глутаровым альдегидом в присутствии стабилизирующих добавок желатина. Для мониторинга пероксидазной активности использован гидрохинон, дающий стабильный сигнал, отнесенный к восстановлению окисленной формы (бензохинона), образующейся в ферментативной реакции в присутствии перок-сида водорода.

2. Пероксидазный сенсор позволяет обнаруживать широкий 1фуг потенциальных загрязнителей (производные фенола и анилина, тяжелые металлы, ряд азоторга-нических соединений и органических растворителей) как субстратов и ингибиторов фермента в милли- и микромолярном диапазоне их содержания, что по-

зволяет использовать биосенсор для предварительной оценки уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод. I 3. Исследование реакций гидрохинона в условиях измерения сигнала выявило

, вклад неферментативных реакций в образование бензохинона в присутствии со-

лей никеля, кадмия, свинца и ртути (И), что расширило диапазон изменения сигнала пероксидазного сенсора при тестировании сточных вод, содержащих значительные количества окисляющихся органических веществ и солей металлов.

4. Совместное использование гидрохимических и биосенсорных данных позво-г лило провести классификацию сточных вод по их источнику и степени очистки с

успешностью прогноза до 80%. Установлена корреляция показателя пероксидаз-ной активности исследованных муниципальных и хозяйственно-бытовых стоков с их острой токсичностью для Daphnia magna и Paramecium caudatum.

5. На основе изучения пероксидазной активности семичленных циклических ацеталей и кеталей - производных пиридоксина - установлено влияние стериче-ских и конформационных факторов в их биологическую активность и возможность определения указанных соединений по их активирующему действию на

' фермент в наномолярном диапазоне концентраций.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Будников Г.К. Обобщенная оценка загрязнения сточных вод на основе перок-сидазных и холинэстеразных одноразовых сенсоров / Г.К.Будников, Е.В.Супрун, Р.Р.Габсабирова, Г.А.Евтюгин, Ж.-Л.Марти, В.Г.Винтер // Всерос. симпозиум "Тест-методы химического анализа". Москва 28-30 ноября 2001 г. С64

2. Габсабирова P.P. Экспресс-оценка органического загрязнения с помощью пероксидазного сенсора / Р.Р.Габсабирова, Е.В.Супрун, Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников II Поволжская конференция по аналитической химии. Казань, 2022 ноября 2001 г. С.58.

3. Супрун Е.В. Оценка загрязнения сточных вод с помощью комбинированных ферментных сенсоров на основе печатных углеродных электродов / Е.В.Супрун, Р.Р.Габсабирова, Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников // Всероссийская конф. "Актуальные проблемы аналитической химии". Москва, 11-15 марта 2002 г. М.- 2002.-Т.2.- С.168-169.

'' 4. Евтюгин Г.А. Биохимическое тестирование промышленных сточных вод /

Г.А.Евтюгин, Д.А.Семанов, Р.Р.Габсабирова // Вестник ТО РЭА,- 2002,- №3-4.-С.112-116.

1 5. Suprun E.V. Bi-enzyme amperometric sensors for the monitoring of environmental

pollution / E.V.Suprun, R.R.Gabsabirova, G.A.Evtugyn, H.C.Budnikov // Euroanaly-sis-12. Dortmund, Sept. 8-13. 2002,- Book of Abstracts. P. 308.

6. Suprun E.V. Two-enzyme sensors based on screen-printed carbon electrodes covered with electropolymerised tyramine / E.V.Suprun, H.C.Budnikov,

»1915*

R.R.Gabvsabirova, G.A.Evtugyn // 17 International Symposium on Bioelectrochemis-try and Bioenergetics. Florence, Italy, June 19-24, 2003. P.199. Q ? A

7. Габсабирова Р.Р.Ферментные сенсоры на основе модифицированных — — (\

графитовых материалов / Р.Р.Габсабирова, Е.В.Супрун, С.В.Белякова, Е.Е.Стойкова // 3 Научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии 21 века". Казань, 5 мая 2003 г. С.45.

Отпечатано в ООО «Печатный двор». Казань, у л Журналистов, 1/16. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11 01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 14.11.03. Уел п.л. 1,0. Заказ № К-1120. Формат 60x901/16 Тираж 100 экз Бумага офсетная Печать - ризография

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Габсабирова, Регина Расимовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ - СУБСТРАТОВ И ЭФФЕКТОРОВ (Литературный обзор).

2.1. Общая характеристика пероксидазы.

2.2. Создание и особенности функционирования пероксидазных сенсоров.

2.2.1. Иммобилизация пероксидазы.

2.2.2. Установление электрохимического контакта между электродом и пероксидазой. Определение пероксида водорода.

2.3. Применение пероксидазного сенсора для определения органических и неорганических токсикантов.

2.3.1. Определение легко окисляющихся органических соединений.

2.3.2. Определение ингибиторов пероксидазы.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и расходные материалы.

3.2. Приборы и оборудование.

3.2.1. Изготовление пероксидазного сенсора и измерение его сигнала.

3.2.2. Фотометрическое измерение холинэстеразной активности.

3.2.3. Отбор и анализ проб промышленных сточных вод.

4. ОПЕРАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.

4.1. Выбор условий измерения пероксидазной активности.

4.2. Оценка сигнала в отношении модельных токсикантов - субстратов и ингибиторов пероксидазы.

5. ОЦЕНКА ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СТОЧНЫХ ВОД.

5.1. Общая оценка тестирования сточных вод с помощью биосенсоров.

5.2. Характеристика основных гидрохимических и биохимических показателей сточных вод.

5.3. Построение прогнозных моделей.

5.4. Связь показателей биосенсоров с характеристиками токсичности сточных вод

6. ПЕРОКСИДАЗНАЯ И ХОЛИНЭСТЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ

ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИДОКСИНА.

6.1. Влияние производных пиридоксина на пероксидазное окисление гидрохинона.

6.2. Антихолипэстеразная активность аминопроизводных циклических ацеталей и кеталей пиридоксина.

7. ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды"

Актуальность работы. Современное развитие экологического мониторинга отличается повышенным вниманием, уделяемым развитию средств экспресс-оценки состояния окружающей среды на основании токсикологических критериев. Целью применения таких нестандартных средств диагностики является совокупная оценка неблагоприятных последствий всей совокупности токсикантов, присутствующих в объекте контроля, на биоту [1]. Такая оценка должна предшествовать полному анализу физико-химических и токсикологических свойств образца, требующему дорогостоящего лабораторного оборудования (хроматомасс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и др. [2]) и высокой квалификации обслуживающего персонала. Экспресс-системы оповещения о токсичности призваны заполнить существующий разрыв между потребностью населения и контролирующих природоохранных органов в достоверной информации о качестве среды обитания и реальными сроками ее получения.

Ферменты как никакие другие биологические компоненты подходят для создания и использования экспрессных биологических тестов в экоаналитическом контроле окружающей среды. Они обеспечивают получение быстрого и чувствительного сигнала и способны в течение нескольких минут определить присутствие той или иной группы токсических веществ в объекте контроля. Немаловажно, что влияние токсикантов на ферменты поддается количественной обработке и может быть осуществлено с использованием стандартных процедур, достаточно распространенных в биотехнологии, клиническом анализе и микробиологической промышленности.

Принцип оценки присутствия опасного вещества по его биологическому эффекту характерен для биологического мониторинга [1], однако в случае ферментных тестов становится возможна количественная оценка токсического эффекта. Это расширяет сферу применения экологического мониторинга и позволяет одновременно решать задачи экотоксикологии и экологического нормирования поступающих загрязняющих веществ.

Вместе с тем, практическое использование биохимической диагностики экотоксикантов требует предварительного решения задач стандартизации отклика на основные поллютанты. Эта проблема особенно актуальна, если объект отличается разнообразием макро- и микрокомпонентов, что типично для промышленных сточных вод и отходов производства и потребления. Требуется надежная теоретическая и экспериментальная база для производства и эксплуатации ферментных тестов, в том числе с использованием серийно выпускаемого измерительного оборудования.

Пероксидаза - один из наиболее изученных ферментов, широко используемых в биоаналитических методах исследования. Это связано с уникально широким кругом субстратов, к числу которых относятся фенолы, анилины, аскорбиновая кислота, ароматические амины и другие соединения - индикаторы состояния метаболических процессов и стрессовых состояний живых организмов [3]. Кроме того, пероксидазы отличаются высокой стабильностью и многообразием способов регистрации активности. Не случайно данный фермент используется в качестве метки в иммуноферментном анализе и в контроле активности оксидаз, в первую очередь, в составе глюкозных сенсоров.

Все это делает пероксидазу одним из перспективных объектов для включения в состав ферментных сенсорных устройств, предназначенных для оценки загрязнения окружающей среды. Пероксидазные сенсоры могут найти применение в контроле загрязнения сточных вод, содержащих малоустойчивые органические соединения и тяжелые металлы. Это хозяйственно-бытовые стоки, сточные воды фармацевтической и пищевой промышленности, ливневой сток крупных населенных пунктов и т.д.

В этой связи настоящая работа, посвященная эколого-аналитическому применению пероксидазного сенсора, является актуальной.

Целью настоящей работы явилось создание и всесторонняя характеристика пероксидазного сенсора на основе планарного графитового электрода, предназначенного для контроля содержания основных токсикантов и обобщенной оценки загрязнения сточных вод.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- определить оптимальные условия иммобилизации пероксидазы и измерения сигнала сенсора в присутствии различных токсикантов и сточных вод;

- оценить чувствительность сигнала пероксидазного сенсора к модельным токсикантам в однокомпонентных растворах;

- установить факторы, влияющие на проявление токсических свойств субстратов и эффекторов пероксидазы, а также вклад неферментативных путей образования конечных продуктов, регистрируемых электрохимически; ■""

- провести скрининг пероксидазной активности новых ранее не изучавшихся соединений с различными функциональными группами (циклические производные пиридоксина) "> для установления влияния их строения на пероксидазную активность;

- провести тестирование сточных вод предприятий г.Казани и установить зависимости ■ между сигналом пероксидазного сенсора при различных разведениях вод, гидрохимическими и токсикологическими характеристиками стоков с привлечением современных методов статистического анализа.

Научная новизна работы заключаются в том, что:

- впервые предложено использовать пероксидазный сенсор для количественной характеристики замещенных фенолов и анилинов - потенциальных компонентов сточных вод;

- определены рабочие условия измерения сигнала, позволяющие разделить влияние отдельных групп токсикантов и неферментативные (каталитические) стадии образования продуктов на сигнал биосенсора;

- впервые установлено влияние процессов каталитического окисления гидрохинона в присутствии ионов металлов на изменение сигнала пероксидазного сенсора в широком диапазоне рН и концентраций реагентов;

- впервые охарактеризованы свойства циклических замещенных пиридоксинов как эффекторов пероксидазы;

- впервые показана возможность использования показателя пероксидазной активности для классификации сточных вод по степени их очистки и источнику поступления, установлена корреляция сигнала биосенсора с результатами биотестирования на Paramecium caudatum (острая токсичность).

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые и удобные способы иммобилизации пероксидазы и регистрации пероксидазной активности по току восстановления бензохинона, образующегося- в реакции с участием гидрохинона на поверхности амперометрического сенсора;

- предложены методики определения замещенных фенолов и анилинов - субстратов пероксидазы, а также оценки загрязненности промышленных сточных вод без трудоемких способов пробоподготовки;

- на примере циклических производных пиридоксина предложены подходы к оценке влияния структуры соединений на их пероксидазную активность, а также предложены упрощенные процедуры предварительного скрининга биохимической активности новых синтезированных органических соединений, содержащих несколько потенциальных центров связывания с ферментом.

На защиту выносятся:

- исследование влияния условий иммобилизации и измерения сигнала на чувствительность определения органических субстратов и неорганических ингибиторов пероксидаз и вывод о характере влияния упомянутых факторов на сигнал пероксидазного сенсора;

- обоснование возможности применения пероксидазного сенсора в предварительной оценке уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод;

- сравнительное изучение процессов каталитического и ферментативного окисления гидрохинона пероксидом водорода в присутствии ионов металлов и вывод о вкладе неферментативных реакций в сигнал пероксидазного сенсора в присутствии солей никеля, кадмия, свинца и ртути (II);

- классификация сточных вод по показателям пероксидазной активности и вывод о возможности определения источника и степени загрязненности сточных вод по совокупности гидрохимических, экотоксикологических и биосенсорных данных;

- скрининг пероксидазной активности циклических производных пиридоксина и подходы к определению центров связывания и механизма взаимодействия полифункциональных неспецифических ингибиторов фермента.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на-Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2001, 2002 гг.), Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (2001 г.), Поволжской конференции по аналитической химии (2001 г.), Всероссийской конференции с международным участием "Актуальные проблемы аналитической химии" (2002 г.), Международной конференции по аналитической химии Euroanalysis-12 (Дортмунд, Германия, 2002 г.), III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003 г.).

Основные результаты изложены в 1 статье и 6 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, включает 31 рисунок и 26 таблиц. Состоит из введения,

Заключение Диссертация по теме "Экология", Габсабирова, Регина Расимовна

1. Разработан пероксидазный сенсор на 0С1юве пероксидазы из хрена, иммобилизованной на поверхности графитового планарного электрода путем кросс-сшивки глутаровым альдегидом в присутствии стабилизирующих добавок желатина. Для мониторинга пероксидазной активности использован гидрохинон, дающий стабильный сигнал, отнесенный к восстановлению окисленной формы (бензохинона), образующейся в ферментативной реакции в присутствии пероксида водорода.2. Пероксидазный сенсор позволяет обнаруживать широкий круг потенциальных загрязнителей (производные фенола и анилина, тяжелые металлы, ряд азоторганических соединений и органических растворителей) как субстратов и ингибиторов фермента в МИЛЛИ- и микромолярном диапазоне их содержания, что позволяет использовать биосенсор для предварительной оценки уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод.3. Исследование реакций гидрохинона в условиях измерения сигнала выявило вклад неферментативных реакций в образование бензохинона в присутствии солей никеля, кадмия, свинца и ртути (II), что расширило диапазон изменения сигнала пероксидазного сенсора при тестировании сточных вод, содержащих значительные количества окисляющихся органических веществ и солей металлов.4. Совместное использование гидрохимических и биосенсорных данных позволило провести классификацию сточных вод по их источнику и степени очистки с успешностью прогноза до 80%. Установлена корреляция показателя пероксидазной активности исследованных муниципальных и хозяйственно-бытовых стоков с их острой токсичностью для Daphnia magna и Paramecium caudatum.5. На основе изучения пероксидазной активности семичленных циклических ацеталей и кеталей - производных пиридоксина - установлено влияние стерических и конформационных факторов в их биологическую активность и возможность определения указанных соединений по их активирующему действию на фермент в наномолярном диапазоне концентраций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Габсабирова, Регина Расимовна, Казань

1. Экологический мониторинг. 4.1. Методы биомониторинга. / Под ред. Гелашвили Д.Б. Н.Новгород: Изд-во Нижегород. ун-та, 1995. - 190 с.

2. Майстренко В.Н. Эколого-аналитический мониторинг суперэкотоксикантов / В.Н. Майстренко, Р.З. Хамитов, Г. К. Будников. М.: Химия, 1996.-319 с.

3. Nondestructive Biomarkers in Vertebrates (eds. Walker C.H., Thompson H.M.).- Siena, May 25-27,1992.- 65 P.

4. Андреева B.A. Фермент пероксидаза. М.: Наука. 1988.-161 с.

5. Газарян И.Г. Пероксидазы растений. Итоги науки и техники. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. 1992. Т. 36. 4-28.

6. Thevenot D.R. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D.R.Thevenot, K.Toth, R.A.Durst, G.S.Wilson // Pure Appl. Chem.-1999.- V.71.- P.2333-2348.

7. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Тернера Э., Карубэ И., Уилсона Дж, М.: Мир, 1992.-615 с.

8. Dennison M.J. Biosensors for environmental monitoring / M.J.Dennison, A.P.F.Turner // Biotech. Advances-1995.- Vol.13.- P.1-12.

9. Venugopal V. Biosensors in fish production and quality control // Biosens. Bioelectron.- 2002.-V.17.-P.147-157.

10. Electrochemical sensors in bioanalysis / R.-I. Stefan, J. F. van Staden, H.Y.Aboui-Enein, Marcel Dekker. New York: Basel, 2001.- 311 p.

11. Wang B. Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium / B.Wang, B.Li, Z.Wang, G.Xu, Q.Wang, S.Dong// Anal. Chem.-1999.- V.71.- P.1935-1940.

12. Conesa A. Fungal peroxidases: molecular aspects and applications /A.Conesa, P.J,Punt, C.A.M.J.J. van den Hondel // J.Biotechnol.- 2002.- V.93.- P. 143-158.

13. Bagirova N.A. Enzymatic determination of phenols using peanut peroxidase / N.A.Bagirova, T.N.Shekhovtsova, R.B. van Huystee // Talanta.- 2001.- У.55.- P.1151-1164.

14. Sadeghi S.J., Mediated electrochemistry of peroxidases - effect of variations in protein and mediator structures / SJ.Sadeghi, G.Gilardi, A.E.G.Cass // Biosens.Bioelectron.-1997.- V.12.-P.1191-1198.

15. Ferapontova E.E. Direct electron transferin the system gold electrode - recombinant horseradish peroxidases / E.E.Ferapontova, V.G.Grigorenko, A.M.Egorov, T.Borchers, T.Ruzgas, 1..Gorton//J. Electroanal. Chem.- 2001.- V.509.- P.19-26.

16. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М.Егоров, А.П.Осипов, Б.Б.Дзантиев, Е.М.Гаврилова. М.: Высшая школа, 1991.- 288 с.

17. Veselova I. Visual determination of mercury(II) using horseradish peroxidase polymerized on polyurethane foam./1.Veselova, T.Shekhovtsova // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.392.- P.151-158.

18. Veselova LA. Enzymatic determination of organomercury compounds using horseradish peroxidase immobilized in polyurethane foam / LA.Veselova, T.N.Shekhovtsova //Mendeleev Commun.- 2000.- № 6.- P.98-102.

19. Arefyev A.A. Flow-injection enzyme immunoassay of haptens with enhanced chemiluminescence detection / A.A.Arefyev, S.A.Eremin, S.B.Vlasenko, A.P, Osipov, A.M.Egorov // Anal.Chim.Acta.-1990.- V.237.- P.285-289.

20. Easton P.M. Quantitative model of the enhancement of peroxidase-induced luminal luminescence / P.M.Easton, A.C.Simmonds, A.Rakishev, A.M.Egorov, L.P.Candeias // J.Am.Chem.Soc-1996.- V.118.- P.6619-6624.

21. Rubtsova M.Yu. Chemiluminescent biosensors based on porous supports with immobilized peroxidase /M.Yu.Rubtsova, G.V.Kovba, A.M.Egorov// Biosens.Bioelectron.-1998.- V.13.-P.75-85.

22. Frew J.E. A method for estimation of hydrogen peroxide based on mediated electron transfer reactions of peroxidases at electrodes / J.E.Frew, M.A.Harmer, H.A.O.Hill S.I.Libor// J.Electroanal.Chem.-1986.- V.201, № 1.- P.1-10.

23. Schubert F. Mediated amperometric enzyme electrode incorporating peroxidase for the determination of hydrogen peroxide in organic solvents./ F.Schubert, S.Saini, A.P.F.Turner / Anal.Chim.Acta.-1991.- V.245, № 2.- P.133-138.

24. Park T.-M. Sol-gel based amperometric biosensor incoфorating an osmium redox polymer as mediator / T,-M.Park, E.l.Iwuoha, M.R.Smyth, R.Freaney, A.J.McShane // Anal.Commun.-1996.- V.33.- P.271-273.

25. Yan F. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix / F. Yan, B. Liu, J. Deng, J. Kong // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.386, № 1-2.- P.31-39,

26. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы./ Под ред. И.В.Березина, В.К.Антонова, К.Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1976.- Т.2.- 358 с.

27. Zhao J. Direct electron transfer at horseradish peroxidase-colloidal gold modified electrode / Zhao J., Henkens R.W., Stonehuerner J., O'Daly J.P., Crumbliss A.L. // J. Electroanal. Chem.-1992.- V.327.- P. 109-119.

28. Gavalas V.G. Improved operational stability of biosensors based on enzyme-polyelectrolyte complex adsorbed into a porous carbon electrode / V.G.Gavalas, N.A Chaniotakis, T.D.Gibson // Biosens. Bioelectron.-1998.- V.13.- P.1205-1211.

29. Sun C. Fabrication of multilayer films containing horseradish peroxidase based on electrostatic interaction and their application as a hydrogen peroxide sensor / C.Sun, W.Li, Y.Sun, X.Zhang, J.Shen//Electrochim.Acta.- 1999.- V.44.- P.3401-3407.

30. Jonsson G. An electrochemical sensor for hydrogen peroxide based on peroxidase adsorbed on a spectrographic graphite electrode / G.J6nsson, L.Gorton // Electroanalysis. 1989.-V.1.-P.465-468.

31. Presnova G. Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidase on gold / G.Presnova, AEgorov, T.Ruzgas, A.Lindgren, L.Gorton, T.Borchers // Faraday Discuss.-2000.-V.116.-P.281-289.

32. Pandey P.C. Peroxide biosensors and mediated electrochemical regeneration of redox enzymes / P.C.Pandey, S.Upadhyay, B.Upadhyay // Anal.Biochem.- 1997.- V.252.- P.136-142.

33. Miao Y. Amperometric hydrogen peroxide biosensor with silica sol-gel/chitosan film as immobilization matrix./Y.Miao, S.N.Tan // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.437.- P.87-93.

34. Rosatto S.S. Biosensor for phenol based on the direct electron transfer blocking of peroxidase immobilising on silica-titanium / S.S.Rosatto, L.T.Kubota, G. de Oliveira Neto // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.390.- P.65-72.

35. Ruzgas T. The development of a peroxidase biosensor for monitoring phenol and related aromatic compounds / T.Ruzgas, J.Emneus, L.Gorton, G.Marko-Varga // Anal.Chim.Acta.-1995.-V.311.-P.245-253.

36. Li J. Viologen-thiol self-assembled monolayers for immobilized horseradish peroxidase at gold electrode surface / J.Li, J.Yan, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong// Electrochim.Acta,-1997.-V.42.- P.961-967.

37. Berzina T.S. Study of horseradish peroxidase activity in alternate-layer Langmuir-Blodgett films / T.S.Berzina, L.Piras, V.l.Troitsky // Thin Solid Films.-1998.- V.327-329.- P.621-626.

38. Willner I. Integration of layered redox proteins and conductive supports for bioelectronics applications / I.Willner, E.Katz // Angew.Chem. Int.Ed.- 2000.- V.39.- P.l 180-1218.

39. Park Т.-М, Development of sol-gel enzyme inhibition based amperometric biosensor for cyanide / T.-M.Park, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Electroanalysis.-1997.- V,9, №14.- P. 1120-1123.

40. Pandey P.C. An ormosil-based peroxidase biosensor - a comparative study on direct electron transport from horseradish peroxidase / P.C.Pandey, S.Upadhyay, I.Tiwari, V.S.Tripathi // Sensors Actuators B,- 2001.- V.72.- P.224-232.

41. Wang B. Sol-gel-derived amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on methylene green incorporated in Nafion film / B.Wang, S.Dong // Talanta.- 2000,- V.51.- P.565-572.

42. Dong S. A novel enzyme electrode for the water-free organic phase / S.Dong, Y.Guo // J.Electroanal.Chem.-1994.- V.375.- P.405-407.

43. Adeyoju O. Determination of kinetic parameters for the inhibitory effects of organic sulphides on an amperometric peroxide biosensor in non-aqueous media / O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Talanta,-1994.- V.41, № 9.- P.1603-1608.

44. Adeyoju O. Reactivities of amperometric organic phase peroxidase-modified electrodes in the presence and absence of thiourea and ethylenethiourea as inhibitors /O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth//Anal.Chim.Acta.- 1995.- V.305.- P.57-64.

45. Qian J. Immobilization of horseradish peroxidase with a regenerated silk fibroin membrane and its application to a tetrathiafulvalene-mediating H2O2 sensor / J.Qian, Y.Liu, H.Liu, T.Yu, J.Deng// Biosens.Bioelectron.-1997.- V.12.- P.1213-1218.

46. Rosatto S.S. Effect of DNA on the peroxidase based biosensor for phenol determination in waste waters / S.S.Rosatto, G. di Oliveira Netto, L.T.Kubota // Electroanalysis.- 2001.- V.13, №6.- P.445-450.

47. Xu X. Ti02 sol-gel derived amperometric biosensor for H2O2 on the electropolymerized phenazine methosulfate modified electrode / X.Xu, J.Zhao, D.Jiang, J.Kong,-B.Liu, J.Deng // Anal.Bioanal.Chem.- 2002.- V.374.- P.1261-1266.

48. Liu B. An amperometric biosensor based on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene blue on a a-type zeolite modified electrode / B.Liu, Z.Liu, D.Chen,J.Kong, J.Deng // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.367.- P,539-544.

49. Liu B. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilisation of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix / B.Liu, F.Yan, J.Kong, J.Deng // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.386,- P.31-39.

50. Rajendran V. Amperometric peroxide sensor based on horseradish peroxidase and toluidine blue 0-acrylamide polymer in carbon paste / V.Rajendran, E.Csoregi, Y.Okamoto, L.Gorton // Anal.Chim.Acta.- V.373.- P.241-251.

51. Ferri T. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. P.L A voltammetric and spectroscopic study / T.Ferri, A.Poscia, R.Santucci // Bioelectrochem. Bioenerg.-1998.- V.44.- P.177-181.

52. Zhanen Z. lectrochemical immobilization of horseradish peroxidase on an electro-activated glassy carbon electrode / Zhanen, L. Chenghong, S. Wenliang, L. Haiying, D. Jiaqi // J.Electroanal.Chem.-1996.- V.419, № 1.- P.85-91.

53. Gerard M. Application of conducting polymers to biosensors / M.Gerard, A.Chaubey, B.D.Malhotra // Biosens.Bioelectron.- 2002.- V.17.- P.345-359.

54. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review // Biosens.Bioelectron.-1999.- V.14.- P.443-456.

55. Palmisano F. Amperometric biosensors based on electrosynthesized polymeric films / F.Palmisano, P.G.Zambonin, D.Centonze // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.366.- P.586-601.

56. Pham M.C. Voltammetric and XPS analysis of metal-complexed polytyramine films: geometry-dependent electron transfer therein / M.-C.Pham, P,-C.Lacaze, J.-E.Dupois // J.Electrochem.Soc.-1984.- V.131, № 4,- P.777-784.

57. Situmorang M. Immobilisation of enzyme throughout a polytyramine matrix: a versatile procedure for fabricating biosensors / M.Situmorang, J.J.Gooding, D.B.Hibbert // Anal. Chim. ' Acta.-1999.- V.394.- P.211-223.

58. Long D.D. Amperometric hydrogen peroxide sensor electrodes coated with electropolymerized tyrosine derivative and phenolic films / D.D.Long, K.A.Marx, T.Zhou // J.Electroanal.Chem.- 2001.- V.501.- P.107-113.

59. Cosnier S. Electropolymerization of amphiphilic monomers for designing amperometric biosensors // Electroanalysis.-1997.- V.9.- P.894-902.

60. Tatsuma T. Feroxidase-incoфorated polypyrrole membrane electrodes / T.Tatsuma, M.Gondaira, T.Watanabe // Anal.Chem.-1992.- V.64.- P.1183-1187.

61. Tian F. Hydrogen peroxide biosensor with enzyme entrapped within electrodeposited polypyrrole based on mediated sol-gel derived composite carbon electrode / F.Tian, B.Xu, L.Zhu, G.Zhu // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.443.- P.9-16.

62. Razola S.S. Hydrogen peroxide sensitive amperometric biosensor based on horseradish peroxidase entrapped in a polypyrrole electrode / S.S.Razola, B.L.Ruiz, N.M.Diez, H.B.Mark, J.-M. Kauffmann // Biosens.Bioelectron.- 2002.- V.17.- P.921-928.

63. Belanger D. Electrochemistry of the polypyrrole glucose oxidase electrode / D.Belanger, J.Nadreau, G.Fortier//J.Electroanal.Chem.-1989.- V.274.- V.143-155.

64. Palmisano F. Correlation between permeselectivity and chemical structure of overoxidized polypyrrole membranes used in electroproduced enzyme biosensors / F.Palmisano, C.Malitesta, D.Centonze, P.G.Zambonin // Anal.Chem.- 1995.- V.67.- P.2207-2211.

65. Mulchandani A. Ferrocene conjugated m-phenylenediamine conducting polymer- incorporated peroxidase biosensors / A.Mulchandani, S.Pan // Anal.Biochem.-1999.- V.267.-P.141-147.

66. Deng Q. Mediatorless hydrogen peroxide electrode based on horseradish peroxidase entrapped in poly(o-phenylenediamine) / Q.Deng, S.Dong // J.Electroanal.Chem.-1994.- V.377.-P.191-195.

67. Nakabayashi Y. Amperometric biosensors for sensing of hydrogen peroxide based on electron transfer between horseradish peroxidase and ferrocene as mediators./ Y.Nakabayashi, H.Yoshikawa // Anal.Sci.- 2000.- V.16.- P.609-613.

68. Xiao Z. A reagentless hydrogen peroxide sensor based on incoфoration of horseradish peroxidase in poly(thionine) film on a monolayer modified electrode / Z.Xiao, H.-X. Ju, H.Y.Chen//Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.391.- P.299-306.

69. Yang R. A H2O2 biosensor based on immobilization of horseradish peroxidase in electropolymerized methylene green film on GCE /R.Yang, C.Ruan, J.Deng // J.Appl. Electrochem.-1998.- V.28.- P.1269-1275.

70. Bartlett P.N. An enzyme switch employing direct electrochemical communication between horseradish peroxidase and a poly(aniline) film / P.N.Bartlett, P.R.Birkin, J.H.Wang // Anal.Chem.-1998.- V.70.- P.3685-3694.

71. Iyengar S. Frequency domain selection of the peroxidase signal for amperometric biosensors / S.Iyengar, E.A.H.Hall, N.G.Skinner, J.J.Gooding // Electroanalysis.-1998.- V.IO.- P. 1089-1095.

72. Tatsuma T. Peroxidase incoфorated sulfonated polyaniline- polycation complexes for electrochemical sensing of H2O2 / T.Tatsuma, T.Pgawa, R.Sato, N.Oyama // J.Electroanal. Chem.- 2001.- V.501.- P.180-185.

73. Yang Y. Bioelectrochemical responses of the polyanline horseradish peroxidase electrodes / Y.Yang, S.Mu // J.Electroanal.Chem.-1997.- V.432.- P.71-78.

74. Bowers L.D. Immobilized enzymes in analytical biochemistry / L.D.Bowers, P.W.Carr // Advances in Biochem.Eng.-1980.- V.15.- P.89-129.

75. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В.Березин, Н.Л.Клячко, А.В.Левашов, К, Мартинек, В.В.Можаев, Ю.Л.Хмельницкий. М.: Высшая школа, 1987.- 159 с.

76. Jin Z. А novel method for polyaniline synthesis with the immobilized horseradish peroxidase enzyme / Z.Jin, Y.Su, Y.Duan // Synth.Metals- 2001.- V.122.- P. 237-242.

77. Han S. A methylene blue-mediated enzyme electrode for the determination of trace mercury(II), mercury(I), methylmercury, and mercury-glutathione complex / S.Han, M.Zhu, Z.Yuan, X.Li // Biosens.Bioelectron.- 2001.- V.16.- P.9-16.

78. Razola S.S. Reagentless enzyme electrode based on phenothiazine mediation of horseradish peroxidase for subnanomolar hydrogen peroxide determination / S.S.Razola, E.Aktas, J.-C.Vire, J.-M.Kauffmann // Analyst.- 2000.- V.125.- P.79-85.

79. Danilowicz С An Os(byp)2ClPyCH2NH poly(allylamine)hydrogel mediator for enzyme wiring at electrodes / C. Danilowicz, E. Gorton, F. Battaglini, E. J. Calvo // Electrochim.Acta.-1998.-V.43.-P.3525-3531.

80. Caspar S. Biosensors based on novel plant peroxidases: a comparative study / S.Gaspar, I.C.Popescu, I.G.Gazaryan, A.G.Bautista, I.Yu.Sakharov, B.Mattiasson, E.Csoregi // Electrochim. Acta.- 2000.- V.46.- P.255-264.

81. Buck S. Use of a peroxidase reactor in flow injection analysis for the determination of chloramine and the inhibition kinetics / S.Buck, K.Stein, G.Schwedt // Anal. Chim. Acta.-1999.-V.390.-P.141-146.

82. Smit М.Н. Cyanide detection using a substrate-regenerating peroxidase based biosensor / M.H.Smit, A.E.G.Cass // Anal.Chem.-1990.- V.62.- P.2429-2436.

83. Darder M. Dithiobissuccinimidyl propionate as an anchor for assembling peroxidases at electrodes surfaces and its application in a H2O2 biosensor // M.Darder, K.Takada, F.Pariente, E.Lorenzo, H.D.Abruna // Anal.Chem.-1999.- V.71, № 24.- P.5530-5537.

84. Li B. Synthesis of a self-gelatinizable grafting copolymer of poly(vinyl alcohol) for construction of an amperometric peroxidase electrode / B.Li., L.Niu, W.Kou, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong//Anal.Biochem.-1998.- V.256, № 1.- P.130-132.

85. Gamburzev S. Bifunctional hydrogen peroxide electrode as an amperometric transducer for biosensors / S.Gamburzev, P.Atanasov, A.L.Ghindilis, E.Wilkins, A.Kaisheva, Llliev // Sensors Actuators B. -1997.- V.43, № 1-3.- P.70-77.

86. Ruzgas T. Peroxidase-modified electrodes: fundamentals and application / T. Ruzgas, Csoregi E., J.Emneus, LGorton, G.Marko-Varga // Anal.Chim.Acta.-1996,- V.330.- P.123-138.

87. Matos R.C. Flow-injection system with enzyme reactor for differential amperometric determination of hydrogen peroxide in rainwater / R.C.Matos, J.J.Pedrotti, L.Angnes // Anal. Chim.Acta.- 2001.- V.441.- P.73-79.

88. Ghindilis A.L. Potentiometric biosensors for cholinesterases inhibitor analysis based on mediatorless bioelectrocatalysis / A.L.Ghindilis, T.G.Morzunova, A.V.Barmin, I.N. Kurochkin // Biosens.Bioelectron.-1996.- V.ll , № 9.- P.873-880.

89. Гиндилис А.Л. Потенциометрические электроды для определения холина, бутирилхолина и ингибиторов холинэстераз / А.Л.Гиндилис, И.Н.Курочкин // Прикл.биохим.микробиол.-1998.- Т.34, №3.- 326-331.

90. Csoregi Е. Mediatorless electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide at graphite electrodes chemically modified with peroxidases / E.Csoregi, CJonsson-Pettersson, L.Gorton // J. Biotechnol.-1993.- V.30.- P.315-337.

91. Ferapontova E. Adsoфtion of differently charged forms of horseradish peroxidase on metal electrodes of different nature: effect of surface charges / E. Ferapontova, E. Dominguez // Bioelectrochemistry.- 2002.- V.55.- РЛ27-130.

92. Ferri T. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. P. II: Amperometric detection of hydrogen peroxide / T.Ferri, A.Poscia, R.Santucci // Bioelectrochem.Bioenerg.-1998.- V.45.- P.221-226.

93. Huang R. Direct electrochemistry and electrocatalysis with horseradish peroxidase in Eastman AQ films / R.Huang, N.Hu // Bioelectrochemistry.- 2001.- V.54.- P.75-81.

94. Ferapontova E. Effect of pH on direct electron transfer between graphite and horseradish peroxidase / E.Ferapontova, E.Puganova // J.Electroanal.Chem,- 2002.- V.518.- P.20-26.

95. Li J. The electrochemical study of oxidation-reduction properties of horseradish peroxidase /J.Li, S.Dong//J.Electroanal.Chem. -1997.- V.431 - P. 19-22.

96. Варфоломеев Д. Конверсия энергии биокаталитическими системами. М.: Изд-во " МГУ, 1981.-С.256.

97. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биокатализ в электрохимии органических соединений / Ю.Ю.Кулис, В.Й.Разумас. Вильнюс: Мокслас, 1981.- 168 с.

98. Ryabov А. Steady-state kinetics, micellar effects, and the mechanism of peroxidase- catalyzed oxidation of n-alkylferrocenes by hydrogen peroxide / A.D.Ryabov, V.N.Goral // JBIC-1997.- V.2.- РЛ82-190.

99. Sanchez P.D. Peroxidase-ferrocene modified carbon paste electrode as an amperometric sensor for the hydrogen peroxide assay / P.D.Sanchez, J.M.Ordieres, A.C.Garcia, P.T.Blanco/ZElectroanalysis.-1991.- V.3, № 9.- P.281-287.

100. Zhang J.Z. Functionalized inorganic-organic composite material derivated by sol-gel for construction of mediated amperometric hydrogen peroxide biosensor / J.Z.Zhang, B.Li, Z.X.Wang, CJ.Cheng, S.J.Dong // Anal. Chim. Acta.-1999.- V.388.- P.71-78.

101. Jiao К, Application of p-phenylenediamine as an electrochemical substrate in peroxidase- mediated voltammetric enzyme immunoassay / K.Jiao, W.Sun, S.-S.Zhang, G.Sun // Analytica Chim.Acta.- 2000.- V.413.- P.71-78.

102. Desmond D. A lactoperoxidase-based flow injection amperometric biosensor for iodide detection / D.Desmond, D.Compagnone, B.Lane, J.Alderman, J.D.Glennon, G.G. Guilbault // Sensors and Actuators В.-1998.- V.47.- P.30-36.

103. WoUenberger U. Enzyme electrodes using bioelectrocatalytic reduction of hydrogen peroxide / U.Wollenberger, V.Bogdanovskaya, S.Bobrin, F.Scheller, M.Tarasevich // Anal. 1.ett.- 1990.- V.23.- P.1795-1808.

104. Palecek E. Past, present and future of nucleic acids electrochemistry // Talanta.- 2002.- V.56.- P.809-819.

105. Cheng X. Spectroelectrochemical investigation of direct electron transfer between resting . horseradish peroxidase and its oxidation states promoted by DNA / X.Chen, C.Ruan, J.Kong, J.Deng // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.367.- P.172-177.

106. Marko-Varga G. Development of enzyme-based amperometric sensors for the determination of phenolic compounds / G.Marko-Varga, J.Emneus, L.Gorton, T.Ruzgas // Trends in Anal.Chem.-1995.- V.14.- P.319-328.

107. Serra B. Graphite-teflon-peroxidase composite electrochemical biosensors. A tool for the wide detection of phenolic compounds / B.Serra, B.Benito, L.Agiii, A.J.Revielo, L.M.Pingarr6n // Electroanalsis.- 2001.- V,13, №3-4.- P.693-700.

108. Yu J. Phenol conversion and dimeric intermediates in horseradish peroxidase-catalyzed phenol removal from water/J.Yu, K.E.Taylor, H.Zou, N.Biswas, J.K.Bewtra // Environ.Sci. Technol.- 1994.- V.28.- P.2154-2160.

109. Юibanov A.M. Enzymatic removal of toxic phenols and anilines from wastewater / A.M.Юibanov, B.N.Alberti, E.D.Morris, L.M.Felshin //J.Appl.Biochem.-1980,- V.2.- P.414-421.

110. ЮШапоу A.M. Horseradish peroxidase for the removal of carcinogenic aromatic amines from water/A.M.Klibanov, E.D.Morris//Enzyme Microb.Technol.-1981.- V.3.- P.l 19-122.

111. Ganjidoust H. Role of peroxidase and chitosan in removing chlorophenols from aqueous solution / H.Ganjidoust, K.Tatsumi, S.Wada, M.ICawase // Water Sci.Technol.- 1996.- V.34.-P.151-155.

112. Arseguel D. Removal of phenol from coupling of talc and peroxidase. Application for depollution of waste water containing phenolic compounds / D.Arseguel, M.Baboulene // J. Chem.Technol.Biotechnol.- 1994.- V.61.- P.331-335.

113. Kanungo M. Studies on electropolymerization of aniline in the presence of dodecyl sulfate and its application in sensing urea / M.Kanungo, A.Kumar, A.Q.Contractor // J.Electroanal. Chem.- 2002.- V.528.- P.46-56.

114. Widera J. Electrochemical oxidation of aniline in a silica sol-gel matrix / J.Widera, J.A.Cox // Electrochem.Commun.- 2002.- V.4.- P.118-122.

115. Lomillo M.A.A. HRP-based biosensor for monitoring rifampicin / M.A.A.Lomillo, J.M. Kauffmann, M.J.A.Martinez // Biosens.Bioelectron.- 2003.- V.18.- P.1165-1171.

116. Шеховцова Т.Н. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной на бумаге / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, Н.В.Белкова, И.Ф.Долманова // Журн.анал.химии.-1995.- Т.50, № 5.- 538-542.

117. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения фенолов с использованием пероксидаз различного происхождения / Т.Н.Шеховцова, А.Л.Лялюлин, Е.И.Кондратьева, И.Г.Газарян, И.Ф.Долманова//Журн. анал. химии.-1994.- Т.49, №12.- 1317-1323.

118. Gazaryan I.G. Determination of phenols using various peroxidases / I.G.Gazaryan, D.B. 1.oginov, A.L.Lialulin, T.N.Shekhovtsova // Anal.Letters.-1994.- V.27, №15.- P.2917-2930.

119. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения ртути в природной воде / Т.Н. Шеховцова, В.Чернецкая, И.Ф.Долманова // Журн.анал.химии.- 1995.- Т.50, №3.- 309-311.

120. Шеховцова Т.Н. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием иммобилизованной пероксидазы / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, Е.Б.Никольская, И.Ф.Долманова//Журн. анал.химии.-1994.- Т.49, № 8.-С,862-867.

121. Shekhovtsova T.N. Determination of mercury at the picogram per milliliter level using immobilized peroxidase / T.N.Shekhovtsova, S.V.Chernetskaya // Analyt.Let.- 1994.- V.27, № 15.- P.2883-2898.

122. Shekhovtsova T.N. Determination of organomercury compounds and mercury(II) after their separation by thin-layer chromatography on "Silufol" / T.N.Shekhovtsova, S.V.Migunova, N.A.Bagirova // Mendeleev Commun.-1997.- V.3.- P.l 19-120.

123. Shekhovtsova T.N. Determination of organomercury compounds using immobilized peroxidase / T.N.Shekhovtsova, S.V.Migunova, N.A.Bagirova // Anal.Chim.Acta.- 1997.-V.344.-P.145-151.

124. Zhao J.G. Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase / J.G.Zhao, R.W.Henkens, A.L.Crumbliss // Biotechnol.Progr.-1996.- V.12, № 5.- P.703-708.

125. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения микроколичеств железа (III) и ряда ингибиторов пероксидазы / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, И.Ф.Долманова // Журн.аналит.химии.-1993.- Т.48, № 1.- 129-136,

126. Adeyoju О. Kinetic study of the inhibitory effects of methyl isothiocyanate on a peroxidase- modified platinum electrode in non-aqueous media / CAdeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Anal. 1.etters.-1994.- V.27, № 11.- P.2071-2081.

127. Buck S. Use of a peroxidase reactor in flow injection analysis for the determination of chloramine and the inhibition kinetics / S.Buck, K.Stein, G.Schwedt // Anal.Chim.Acta.-1999.-V.390.- P.141-146.

128. Korytnyk W. А seven-membered cyclic ketal of piridoxol // J.Org.Chem.- 1962.- V.27.- P.3724-3726.

129. Шайхутдинова Г.Р.Связь структуры некоторых шести- и семичленных циклических ацеталей с реакционной способностью / Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Казань, 2000.-133 с.

130. ГОСТ Р 51592-2000. Вода. Общие требования к отбору проб. М.: Госстандарт России, 2000.-33 стр.

131. Перечень предельно допустимых концентраций и ориентировочно безопасных уровней воздействия вредных веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. М.: Мединор, 1995.-221 с.

132. Перечень методик, внесенных в государственный реестр методик количественного химического анализа. М.: Государственное управление аналитического контроля Минприроды РФ, 1996. - 6 с.

133. Stiene М. Electrochemical characterization of screen-printed carbonaceous electrodes for the determination of peroxidase activity in novel screen-printed flow-through modules / M. Stiene, U.Bilitewski//Anal. Bioanal. Chem.- 2002.- V.372.- P.240-247.

134. Евтюгин Г.А. Биосенсоры для определения ингибиторов ферментов в окружающей среде / Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников, Е.Б.Никольская // Успехи химии.- 1999.- Т.68.- №12.-С.1142-1167.

135. Guo L, Electrosynthesis of soluble polyaniline in acetic acid / L.Guo, G.Shi, Y.Liang// Polymer Bulletin.- 1998.- V.41.- P.681-686.

136. Xu J.-J. Amperometric determination of ascorbic acid at a novel 'self-doped' polyaniline modified microelectrode / J.-J.Xu, D.-M.Zhou, H.-Y.Chen // Fresenius J.Anal.Chem.- 1998.-V.362.- P.234-238.

137. Koul S. Conducting polyaniline composite: a reusable sensor material for aqueous ammonia / S.Koul, R.Chandra, S.K.Dhawan // Sensors Actuators В.- 2001.- V.75.- P-151-159.

138. MacDiarmid A.G. Polyanilines: a novel class of conducting polymers / A.G.MacDiarmid, A.Epstein// Faraday Discuss.Chem.Soc-1989.- P.317-332.

139. Evtugyn G.A. Preliminary testing of w a^ste and sewage waters based on cholinesterase biosensor / G.A.Evtugyn, E.P.Rizaeva, N.Ju.Stepanova, A.M.Petrov // Environ. Radiology Applied Ecology.- 1997.- V.3, №1.- P.7-12.

140. Евтюгин Г.А. Экспертная оценка загрязненности промышленных сточных вод с помощью холинэстеразных биосенсоров / Г.А.Евтюгин, А.А.Савельев, Е.П.Ризаева, Е.Е.Стойкова, В.З.Латыпова, Г.К.Будников // Экологическая химия.- 2000.- Т.9, № 2.-С.106-114.

141. Reemtsma Т. Prospects of toxicity-directed wastewater analysis.// Anal.Chim.Acta- 2000. V.426.- P.279-287.

142. Методы биотестирования качества водной среды./ Под ред.Филенко О.Ф. М.: Изд-во МГУ, 1989.-124 с.

143. Karube I. Biosensors for environmental control / I.Karube, Y.Nomura, Y.Arikawa // Trends Anal.Chem.-1995.- V.14, № 7.- P.295-298.

144. TothiU I.E. Developments in bioassay methods for toxicity testing in water treatment / I.E.Tothill, A.P.F.Turner// Trends Anal.Chem.-1996.- V.15, №5.- P.178-188.

145. Steinberg S.M. A review of environmental application of bioluminescence measurements / S.M.Steinberg, E.J.Poziomek, W.H.Engelmann, K.R.Rogers // Chemosphere 1995.- V.30. № 11.-P.2155-2197.

146. Белякова C.B. Холинэстеразные тесты в экологическом контроле биологически активных соединений / Диссертация на соискание ученой степени кандидата наук. Казань, 2002.-151 с.

147. Экологическая химия. Основы и концепции./ Под ред. Корте Ф. М.: Мир, 1996.- 396 с.