Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов

Гоголь, Эллина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов"

На правах рукописи

РГБ ОД

" 4 О I,г 1

ГОГОЛЬ Эллина Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ

ПЕСТИЦИДОВ

03.00.16- Экология

А В I О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ

2000

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Евтюгин Г.А.

доктор агрохимии, профессор Марти Ж.-Л.

доктор химических наук, профессор Фридланд C.B.

доктор химических наук, профессор Евгеньев М.И.

Ведущая организация:

Институт проблем прикладной экологии и природопользования, г.Уфа

Защита состоится "1У"^гсххЩз2000 г. в^З часов на заседании Диссертационного совета К 053.2^.24 при Казанском государственном университете по адресу: 420008. г. Казань, ул. Кремлевская. 18, Казанский государственный университет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГУ.

Автореферат разослан "1£_" ьслсу>.\ 2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета К 053.29.24.

доктор химических наук Евтюгин Г.А.

¿Г/с ¿Q,û

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Растущий поток загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду, предъявляет все более жесткие требования к эколого-аналитическому контролю их остаточных количеств. Это связано как с постоянным расширением числа токсикантов, так и с углублением представлений о токсическом действии загрязняющих веществ. Как следствие, ужесточаются гигиенические нормативы присутствия экотоксикантов в воде, почве и продуктах питания. Все это приводит к постоянно растущему разрыву между пробоотбором и фактическим получением информации о состоянии окружающей среды. Повышается риск поступления токсических веществ в питьевые воды и продукты питания, осложняется оперативное управление экологической ситуацией в целом.

Решение указанных проблем состоит в развитии методов биохимической диагностики, ориентированных на оценку токсического эффекта наиболее опасных загрязнителей. Перспективным направлением развития таких методов является создание надежных и простых в эксплуатации ферментных сенсоров. Они сочетают преимущества ферментов (высокая чувствительность к экотоксинам) и аппаратных средств контроля (количественная оценка загрязнения и возможность автоматизации).

Холинэстеразы наиболее часто используются в ферментативных методах контроля окружающей среды. Это связано с уникально широким кругом ингибиторов фермента, в числе которых пестициды, поверхностно-активные вещества, соли тяжелых метатлов. Однако практическое использование холинэстераз в экологическом мониторинге требует решения проблем стабилизации фермента при хранении, интерпретации отклика и упрощения процедуры измерения. Попытки решить проблемы путем создания одноразовых сенсоров на основе технологий микропечати не продвинулись дальше пилотных образцов, поскольку воспроизводимость отклика биосенсоров в производимой серии и быстрая инактивация холинэстераз в процессе хранения не позволяют получить надежного и воспроизводимого сигнала и присутствии токсикантов в объектах окружающей среды.

Внедрение средств биохимической диагностики в практику экологического мониторинга требует в первую очередь решить вопросы надежности аппаратурного оснащения, сопряжения биологического компонента и средства измерения. В эгой связи настоящая работа, посвященная развитию теоретических и практических основ конструирования холинэсгеразных биосенсоров и их применения для определения пестицидов в объектах окружающей среды, является актуальной.

Цель настоящей работы - создание и сравнительная характеристика новых биосенсоров на основе углеродистых и современных модифицирующих материалов для определения остаточных количеств фосфорорганических и карба-минатных пестицидов в обьектах окружающей среды.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- исследовать различные уишродистые материалы и способы изютовле-ния сенсоров на их основе с целью снижения рабочего потенциала и повышения воспроизводимости сигнала;

- изучить формирование амперомстрического отклика биосенсора, стабильность иммобилизованной хо.тинэстеразы и аналитические характеристики определения фосфорорганических и карбаминагных пестицидов;

- установить механизм влияния модифицирующего слоя нафиона па операционные и аналитические характеристики биосенсоров, определить рабочие условия нанесения модифицирующего покрытия;

- провести сравнительные испытания амиерометрических сенсоров для определения фосфорорганических пестицидов в стационарном и проточно-инжекционном режиме;

- изучить влияние органических растворителей и обратимых эффекторов на отклик биосенсоров и его чувствительность к фосфорорганическим пестицидам

- оценить эффективность применения биосенсоров в экспресс-оценке остаточных количеств пестицидов в растительной продукции, в том числе в рамках

межлабораторного эксперимента с участием Центра фигофармации Перпиньян-ского университета (Перпиньян, Франция).

Научная новизна работы заключается в том, что:

- впервые установлена возможность селективного определения сигнала (тока окисления тиохолина) биосенсоров на основе углеродистых материалов и снижения рабочего потенциала окисления в присутствии модифицирующего слоя нафиоиа без использования медиаторов электронного переноса;

- впервые показано, что нанесение модифицирующего слоя ионообменного полимера между основным материалом электрода и иммобилизованным ферментом не только стабилизирует отклик биосенсора, но и повышает чувствительность и селективность определения фосфорорганических пестицидов;

- установлено активирующее влияние ацетонитрила на нативную и иммобилизованную холинэстеразу и на этой основе достигнуто снижение пределов обнаружения фосфорорганических пестицидов в водно-органических экстрактах из зерна;

- определены пути повышения чувствительности и селективности определения пестицидов за счет регулирования удельной активности и толщины ферментсо-держащего слоя ятя биосенсоров на основе печатных углеродных электродов и за счет нестационарного режима массопереноса реагентов в ферментсодержа-щем слое и сорбционного предконцентрироваиия на материале мембраны в про-точно-инжекционном режиме.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые в производстве и удобные в использовании ампе-рометрические биосенсоры на основе планарных углеродных электродов, изготовляемых методом микропечати, позволяющие детектировать присутствие фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в воде и растительных экс-1рактах на уровне нормативов ПДК;

- предложены упрощенные методики ферментативного определения остаточных количеств пестицидов из растительных экстрактов без удаления органического растворителя;

- разработаны и апробированы конструкции проточных ячеек для проточ-но-инжекционного определения пестицидов.

Положения, выносимые на защиту:

- исследование и сравнение операционных и аналитических характеристик биосенсоров на основе печатных и объемных электродов из углеродистых материалов, выявление экспериментальных факторов (состав ферментсодержащсго слоя, материал электрода, режим массопереноса в мембрану), определяющих чувствительность и селективность определения ингибиторов;

- механизм влияния полимерного слоя нафиона, стабилизирующего отклик биосенсора и повышающего чувствительность и селективность определения остаточных количеств пестицидов;

- влияние органического растворителя на активность нативной и иммобилизованной холинэстеразы и вошожность прямою определения остаточных количеств пестицидов в экстрактах без удаления растворителя

- сравнительная оценка результатов контроля реальных обьектов окружающей среды с помощью разработанных бносенсоров и стандартных методов хроматографического анализа, метрологическая характеристика бносенсоров в межлабораторном эксперименте

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на итоговой научной конференции Казанскою государственного университета (1999 г.), 2 Всероссийском симпозиуме по проточному анализу (Москва, 1999), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), 3 международном симпозиуме INCO Copernicus "Применение биосенсоров для определения загрязнителей в полевых условиях" (Коимбра, 1998), 7 Международном симпозиуме по электроаналитической химии ESEAC-98 (Коимбра, 1998), 4 Франко-испанском семинаре по биосенсорам (Монпелье, Франция, 1999), 5 Франко-испанском семинаре (Вик, Испания, 2000).

Основные результаты изложены в 2 статьях и 5 тезисах докладов.

ских источников, включающего 229 ссылок на отечественные и зарубежные работы, и Приложения.

Диссертация выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета и в Лаборатории фитофармации Перпиньянского университета (Франция) в рамках договора о научном сотрудничестве между Казанским и Перпиньянским университетами и Российско-французской программы "Биотехнологии - агропроизводству" Миннауки РФ при поддержке РФФИ (грант № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров"), программы "Университеты России. Фундаментальные исследования" (грант № 015.01.07.01.12" Оценка загрязнения окружающей среды с помощью тест-методов биохимической диагностики").

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе в Казанском государственного университете при чтении общего курса "Экологических мониторинг".

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В исследованиях использовали промышленно выпускаемые препараты бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади (ХЭ), КФ 3.1.1.8, производства АО "Биомед", г. Пермь, с удельной активностью 4,2±0,5 Е/мг и "Sigma", США, с удельной активностью 600 Е/мг. Субстратом ферментативной реакции служил S-бутирилтиохолин иодид (БТХИ). Измерения проводили в 0,002 М. фосфатном буферном растворе, содержащих для постоянства ионной силы 0,1 М сульфата натрия.

Иммобилизацию ХЭ проводили путем кросс-сшивки парами и раствором глутарового альдегида на поверхности модифицированного нафионом печатного электрода и нитратцеллюлозной ("Sartorius") или нейлоновой ("Amersham") мембран.

Откликом служило максимальное изменение тока окисления тиохолина, регистрируемого после добавления субстрата (1).

(CH3)3N+CH2CH2SC0C3H7 + Il20 (CH3)3N+CH2CH2SH + СзНтСООН (1)

Вольтамперомстрические измерения проводили с помощью вольтамперо-трафа ИВД-3. (ННВП "Ива", Екатеринбург) и потенциостата Metrohm (641 VA Detector, Швейцария).

В качестве модельных ингибиторов были изучены диазинон |0-{2-изонропил-4-метилпиримидил-6)-0,0-диэтилтиофосфат| ; кумафос |0,0-диэтил-0-(3-хлор-4-метил-7-кумаринил)тиофосфат); трихлорфон !0.0-диметил-(2,2.2-трихлоро)-1 -гидроксютилфосфонат} : хлорнирифое-метил J 0.0-диметил-0-[2-(диэгиламино)-6-метил-4-пирнмидинил]-тиофосфат|, метиокарб: (4-метилтио-3,5-диметилфенил) N-метилкарбамат и фторид натрия.

Электроды на основе углеродистых материалов изготовляли из эпоксидно-углеродной композиции и путем микропечати на серебряной подложке из суспензии кристаллического графита в гилроксиэтилцелллюлозе с помощью принтера 1)Г-К 248 (DF.K, Англия). Измерения в проточно-инжекционном режиме проводили с помощью блока БР-1 проточною анализатора (АО "Химавтома-тика", Москва), оснащенного ячейкой типа "отражательная стенка" собственной конструкции

Характеристика отклика ампсромстричсских сенсоров. Углеродистые материалы весьма перспективны для создания биосепеоров. поскольку облегчают иммобилизацию фермента. Первоначально были изучены угольно-пастовые электроды на основе различных композиций с органическими и неорганическими пластификаторами и медиаторами электронного переноса (Nile Blue и Mel-dola Blue). Последний позволил снизить потенциал окисления тиохолина с 0,80 В до 0,60 В отн. Ag/AgCI, однако значительный фоновый ток и плохое разрешение пиков на вольгамперограммах приводили к низкой точности измерения сигнала. Вследствие низкой сорбционной емкости материала удельная активность ХЭ была достаточно низкой и быстро снижалась во времени вследствие вымывания фермента. Использование эпоксидно-углеродной композиции существенно улучшило воспроизводимость сигнала, снизив потенциал окисления до +0.50 В. Кроме того, fia данных электродах удалось добиться разделения токов окисления тиохолина и иодид-иона, использующегося в качестве прогивоиона субстрата ХЭ. Прямая иммобилизация ХЭ в пасте и на поверхности приводят к низ-

кому невоспроизводимому отклику, поэтому использовались накладные' мембраны на основе нейлоновых и нитратцеллюлозных носителей. Измерения проводили в проточно-инжекционном режиме. Форма сигнала и его основные характеристики приведены на рнс.1 и в табл.1, градуировочные кривые определения субстрата - на рис.2.

Рисунок I. Отклик биосенсора на основе эпоксидно-углеродного электрода и ХЭ, иммобилизованной на накладной нейлоновой мембране

Таблица I

Характеристики отклика амперометрических биосенсоров в проточно-инжекционном режиме (субстрат БТХИ 6х 10"5 М).

Материал мембраны ХЭ в растворе Нейлон I Нитрат целлюлозы НуЬош! I 5аг1:огш5

Удельная активность, Е/с\Г 4,2 (Е/мл) 1,8 | 1,4

Ток пика, мкА 31 5,5 12,5

Полуширина пика, с 24 61 33

Время пика, с 12 40 20

Общее время измерения, с 120 180 150

ХЭ сохраняет активность в течение не менее чем 3 месяцев после иммобилизации на нейлоне и нитрате целлюлозы, в растворе отклик сохраняется в течение не менее чем 3 недель, резкое снижение отклика, иногда наблюдаемое, связано, по-видимому, с образованием микротрещин и подтеканием буферного раствора к поверхности электрода.

¡. мкА

14 7

0,00 "0,05 0,10 0,15 0.20

С|5 . мМ

Рисунок 2. Определение БТХИ с помощью амперометрического биосенсора на основе эпоксидно-углеродного электрода и ХЭ, иммобилизованной на нитрат-целлюлозной (1) и нейлоновой (2) мембране.

Наилучшие результаты были получены с печатными электродами, в которых криаалличеекий графит размещали в виде суспензии в 1 идроксиэтилцел-люлозе на пластиковом носителе. Благодаря использованию техники удалось добиться высокой воспроизводимости характеристик поверхности сенсора и воспроизводимости основных операционных характеристик биосенсоров в серии. Предварительное тестирование электродов показало, что время их жизни ограничено деградацией электропроводящего слоя. Для увеличения адгезии уг-леродсодержащего слоя и снижения рабочего потенциала впервые было предложено наносить промежуточный слой ионообменного полимера нафиона. В результате такой модификации потенциал окисления тиохолина снижается с 0,8 В (немодифицированные электроды) до 0,25-0,41 В, по-видимому, за счет влияния катионообменных свойств полимера.

В подтверждение этого на модифицированных электродах практически не происходит окисления иодид-ионов. 'Гиохолин полностью ионизирован в щелочной среде буферного раствора (рН 7,8), однако его образование в ферментной пленке сопровождается высвобождением эквивалентного количества масляной кислоты в соответствии с ур.(1). Поэтому большая часть тиохолина во внутрен-

ней части ферментной пленки, расположенной на нафионовом покрытии, представляет собой неионизированную катионную форму (2).

(СНзЬГ^СНгСНгЭН — (СН3)}^СН2СН2Б+Н+ (2)

ферментная пленка: рН < 7 буферный раствор: рН 7.8

В результате рабочий потенциал окисления тиохолина на планарных электродах с нафионовым покрытием оказался лишь незначительно больше, чем для аналогичных сенсоров с включением медиаторов электронного переноса. В то же время, разработанный способ иммобилизации позволил сохранить естественное микроокружение фермента и упростить процедуру изготовления биосенсора.

Влияние нафиона на отклик биосенсора представлено на рис. 3,4.

¡, мкА 0,50 -| 0,25 -

0,00

0 2 4 6 8

Объем раствора нафиона, мкл

Рисунок 3. Зависимость сигнала биосенсора на основе печатного электрода от аликвоты 0,05 % нафиона, наносимого на электрод. Субстрат БТХИ 1x10-4 M, Е +400 мВ. Фосфатный буферный раствор 2x10"3 M + 1x10"1 M Na2S04, pli 7,8, 37°С.

ХЭ иммобилизовали на поверхности печатного электрода в парах глута-рового альдегида при пониженном давлении. Процедура иммобилизации позволяет получать сверхтонкие пленки фермента, практически не оказывающие диффузионного торможения переноса реагентов в мембрану.

1,25

к мкА

Концентрация нафиона

0,75

0,00

0,25

0.50

1,00

2.5 3.0 3.5 4,0 4.5 5,0

-^(Сб, М)

Рисунок 4. Зависимость отклика биосенсора на основе печатного электрода от концентрации нафиона. Аликвога 2 мкл на 1 электрод. Условия измерения сигнала см. рис.2.

Иммобилизация не меняет кинетических параметров ферментативной реакции. Константа Михаэлиса, рассчитанная по зависимости отклика от концентрации субстрата в двойных обратных координатах Г1 - СУ1, составила 2х 1 М для раствора ХЭ и 1,7x10"* М для иммобилизованного фермента.

Определены оптимальные характеристики нанесения нафиона (2 мкл 0,005 % суспензии на электрод) и иммобилизации ХЭ (время обработки парами глутарового альдегида 3-4 мин., 1-5 К фермента на электрод).

Полученный сигнал линейно зависит от концентрации БТХИ в диапазоне концентраций 1 * Ю'^о^Ю"* М. Природа буферного раствора оказывает незначительное влияние на определение субстрата. По мере разбавления раствора сиг-нап возрастает до максимального значения при концентрации 2xl0':!-5xl0":, М. рН-Оптимум отклика биосенсора практически совпадает с полученным для на-тивного фермента в тех же условиях измерения (рис. 5).

0.035

¡. мкА

0.030

0.025

0.020

Рисунок 5. Зависимость сигнала печатного биосенсора от рН рабочего буферного раствора. БТХИ 1 х I О"4 М, борат-ный. грис- и фосфатный буферные растворы.

рН

Таким образом, предварительное изучение различных типов биосенсоров позволило предложить использование эпоксидно-графитовых и печатных модифицированных нафионом биосенсоров для испытаний с модельными растворами токсикантов и экстрактами реальных объектов окружающей среды. Некоторые характеристики исследованных типов электродов и биосенсоров на их основе представлены втабл 2

Таблица 2

Характеристики электродов на основе углеродистых материалов и возможность их использования в составе холннэстсразных биосенсоров

Электроды Уголыю- Эпоксидно- Печатные

Характеристики пастовые углеродные нланарные

Рабочий потенциал окисления + 800 + 500-600 +250-410

тиохолина (отн.А{5/А§С1), мВ

Погрешность измерения сиг- 8-12 5-7 3-4

нала (6 последовательных из-

мерений, (С$ 1хЮ"3 М), отн.%

Соотношение фонового тока и 1-50 1-2 0,1-0,2

сигнала (С5 1х10"3М)

Возможность иммобилизации

фермента:

- в материале электрода + - -

- на поверхности без носителя - + +

- на инертном носителе + + -

Влияние оргапического растворителя. При ферментативном определении остаточных количеств пестицидов в растительном материале основная проблема состоит в выборе органического экстрагснта. В ходе настоящей работы был проведен скрининг органических растворителей по оказываемому ими ан-тихолинэстеразному действию. Как показало исследование, присутствие 20-25 % этанола и ацетона вызывает некоторое снижение активности ХЭ, причем иммобилизация на нейлоне и ниграге целлюлозы стабилизирует отклик как на субстрат, так и на ингибирующее влияние пестицидов (табл. 3).

Таблица 3

Антихолинэстеразное действие ор! анических растворителей

Растворители, смешивающиеся с водой Растворители, не смешивающиеся с водой

Растворитель Антихолинэстеразное действие Растворитель Антихолинэстеразное действие

Этанол 10% 20% + Хлороформ +

Ацетон 10% 20% + Тстрахлоруглерод +

Ацетонитрил 10% (а) Гексан -

Примечание, а) Активирующее действие

Для ацетонитрила впервые установлено не ингибирующее, а активирующее влияние на ХЭ как в нативном, так и в иммобилизованном состоянии. Это позволяет предложить данный растворитель для экстракции остаточных количеств пестицидов с последующим их ферментативным определением. Также было установлено, что экстракция ацетонитрилом чистых образцов зерна пшеницы, риса, ржи, ячменя не приводит к выделению природных ингибиторов ХЭ: после разбавления экстракт не оказывал ингибирующего влияния на активность на-тивного и иммобилизованного фермента. Количественные характеристики влияния ацетонитрила па отклик биосенсора на основе печатного электрода представлены на рис.6.

Определение пестицидов из модельных водных растворов. Для расчета степени необратимого ингибирования использовали относительное снижение

отклика биосенсора: I = (Ч/-^ х/00%. гле и - отклики биосенсора до и после ингибирования. соответственно.

25,0 г

I, мкА

20,0 -15,0 -10,0 -5,0 -

0 5 10 15 20 25

С(СН,СЫ),%

Рисунок б. Зависимость тока окисления тиохолина в присутствии 1 Е/мл X') ог концентрации ацетонитрила. об.%. Субстрат БТХИ 1х10'3М. Фосфатный буферный раствор. рН 7.8.

15 табл.4 приведены результаты определения пестицидов с помощью печатных злектродов, модифицированных нафионом. обобщены в табл.6

Свежеприготовленный раствор трихлорфона выдерживался перед определением в 1еченис не менее, чем 4 часов. Поданным хроматографическогоанализа, в растворе образуются как минимум 4 разных продукта гидролитической трансформации грихлорфона. Максимум накопления одного их них, дихлорме-тилвинилфосфата (ДДВФ) соответствует максимальному ингибирующему эффекту раствора (3).

-HCl

(СН,0)Р-СНСС13 -- (СН30)Р-0СП=ССЬ

» I II (3)

о он о 1 '

Трихлорфон ДДВФ

Тионовые фосфорорганнческие пестициды предварительно электрохимически окисляли до кислородных аналогов для повышения чувствительности определения. Для повышения их растворимости эксперименты проводили в 10 % растворе ацетонитрила.

Таблица 4

Градуировочные зависимости определения пестицидов с помощью печатного тонкопленочного электрода 1(%) = а + Ьх^(С|, М)

Пестицид Трихлорфон Кумафос Хлорпирифос

В 219 ±26 (200 ±30) 2,9+0,1 35±7

А 1410±170(1200±300) -2,3±0,9 177133

Коэффициент 0,9785 0,9974 0,9952

корреляции (г)

Предел обнару- 3,5x10"7 (9x10"7) 3,5х10"8(5х10"7) 2x10"5

жения, М

Диапазон опреде- 4хЮ"7- 8х10"7 4х10'8-2х]0"7 4,7x10"'-2x10"1

ляемых концен-

траций, М

Примечание. В скобках приведены значения, полученные для немодифициро-ванного электрода (в отсутствие слоя нафиона)

Эффективность активации пестицида зависит от продолжительности электролиза (рис 7). Максимум эффективности достигается после 5 мин. электролиза для кумафоса и 7 мин. - для хлоргжрифоса. В отсутствие ацетоннтрила продолжительность электрохимического окисления превышала 10 мин для всех изученных пестицидов.

1.%

25,0 г 20,0 15,0 10,0 5,0

—I—

20 25 1, мин

Рисунок 7. Зависимость ингибирующего действия 2.7x10"* М кумафоса от продолжительности его электрохимического окисления

Модификация нафионом приводит к снижению предела обнаружения трихлорфона в 3 раза. Для кумафоса этот эффект еще выше, по-видимому вследствие его сорбционного концентрирования на модифицирующем слое полимера, поскольку кумафос менее полярен, чем трихлорфон. Токсичность хлорпирифоса для теплокровных животных меньше, чем кумафоса (Ь05() для крыс 170 и 16

мг/кг соответственно). В том же направлении меняются пределы их обнаружения.

Чувствительность определения фосфорорганичсских пестицидов зависит также от толщины образующейся на поверхности сенсора белковой пленки Сравнение тонкопленочных биосенсоров с высокоактивным ферментом (600 Е/мг) и толстопленочных с малоактивным (4.2 Е/мг) препаратом ХЭ при одинаковой удельной активности фермента на рабочей поверхности сенсора имеют различный режим функционирования. Толстопленочные биосенсоры показывают предел обнаружения кумафоса более чем на порядок выше, а степень инги-бировапия - в 2-5 раз ниже, чем тонкопленочные. К тому же наблюдается восстановление ферментативной активности при отмывке.

Как показали исследования с тонкопленочными биосенсорами с различной удельной активностью ХЭ, с ростом активности фермента чувствительность отклика в отношении пестицидов снижается Гак. при нагрузке высокоактивной ХЭ 5 3 Е / электрод метиокарб определяется в диапазоне концентраций 4.4х 10° -2,2x10"4 М. югда как при активности 0.1 Е / электрода - 1х10"''-2>Т0"<' М Для окисленной формы кумафоса соответствующие диапазоны концетраций составили 2х 10"7-5.5хЮ-6 М и 4хЮ"х-2х10"7 М соответствию. Очевидно, чю при большей активности иммобилизованного фермента требуется относительно больше ингибитора для достижения того же ингибируюшего эффекта. Таким образом, в зависимости от конкретной эколого-аналитической задачи можно подбирать соотношение величины сигнала и чувствительности к пестицидам как компромисс между требованиями точности определения отклика и чувствительности определения токсиканта.

В экспериментах с эпоксидно-! рафитовыми электродами чувствительность определения пестицидов в проточно-инжекционном режиме оказалась даже выше, чем для нативного фермента. Можно предположить, что это связано с сорбционным концентрированием гидрофобного пестицида на полимерном носителе (табл.5). Этому способствовала специально сконструированная проточная ячейка с высоким отношением площади ферментсодержашей мембраны к объему контактирующего с ней раствора (2355 см'1).

Таблица 5

Гралуировочные зависимости определения диазинона с помощью биосенсора на основе эпоксидно-углеродных электродов с накладными мембранами 1(%) = а + Ьх1о£(Сь М)

Носитель Нейлон Нитрат целлюлозы Нативная ХЭ

В 58+2 63+3 42+2

А 470+10 528±26 342+18

Коэффициент 0,9981 0,9914 0,9956

корреляции (г)

Предел обнару- 4x10'у 1,5x10"'' 5x10"'

жения, М

Диапазон опреде- 6х10"9-3х10"7 4х10'9-1х10"7 7х10"9-5х10'7

ляемых концен-

траций, М :

11римечание. Скорость потока 0.4 мл/мин. Фосфатный буферный раствор 2х10~3 М + 0,1 М №2804. Инкубирование 10 минут. Субстрат БТХИ 6х 10° М.

Механизм формирования отклика печатных биосенсоров в стационарном и эпоксидно-углеродных электродов с накладными мембранами - в проточно-инжекционном режиме подтверждается закономерностями изменения ннгиби-руюшего действия фторидов. Переход от немодифицированного электрода к модифицированному нафионом сопровождается увеличением пределов обнаружения фторида с 1 х Ю"5 до 1,7х 10"4 М, вероятно, вследствие электростатического торможения переноса аниона в мембрану. Аналогичный эффект имеет использование гидрофобных носителей. В ряду "водный раствор фермента - нейлон -нитрат целлюлозы" предел обнаружения фторидов закономерно увеличивается (2х10'5 - 8х10'5 5x10"* М), а наклон калибровочной прямой ¡Д - СР , М, -уменьшается (623±9 - 549±42 - 425+15).

Определение пестицидов в растительном материале. Для изучения возможности детектирования остаточных количеств пестицидов в растительном материале в качестве модельных токсикантов были выбраны кумафос и метио-карб. Сопоставление результатов, полученных на модельных водных растворах пестицидов и их экстрактах из предварительно зараженных образцов зерна позволяет предположить, что степень экстракции ацетонитрилом достигает 90 %. Аналитические характеристики определения кумафоса представлены в табл.6.

Таблица 6

Аналитические характеристики определения кумафоса в растительном материале с помощью холинэстеразных амперометрических биосенсоров.

Зерно 1% = а + ЬС,. С|, мг/л

а В г2

Рис 3,75+1.80 1.40+0,15 0,9888

Ячмень 4,85+3,50 1,40+0,30 0,9799

Модельный раствор 2,30+1,10 0,75+0,050 0,9925

Для метиокарба реально определяемые количества составляют около 15% от внесенного количества, что связано, по-видимому, с высокой скоростью разложения этого карбаминатного пестицида при экстракции. Использование аие-тонитрила позволило значительно снизить влияние матрицы, наблюдавшееся, в частности, при использовании накладных холинэстеразных мембран или при экстракции пестицидов ацетоном.

Помимо искусственно зараженных образцов зернопродуктов, нами были исследованы пробы перца и груши, полученные от местных поставщиков в супермаркеты региона Лангедок-Русийон (Франция). Параллельно определению ингибиторов ХЭ в пробах с использованием тонкопленочных биосенсоров проводился их анализ методом ВЭЖХ. В экстрактах груши были обнаружены хлор-пирифос-этил, малатиои и пиримифос-метил, в экстрактах перца эти же фосфо-рорганические пестициды и дитиокарбаминагы. Экстракты из загрязненных образцов демонстрировали необратимое ингибирующее действие при разбавлении в 7000 раз (перец) и 5000 раз (груша). Чистые образцы снижения отклика биосенсора не вызывали. Степень ингибирования закономерно снижалась при изменении степени разбавления экстрактов, что свидетельствует об отсутствии обратимой составляющей ингибирования. Электрохимическое окисление экстракта позволяет выявить вклад тионовых пестицидов в общее загрязнение образцов веществами антихолинэстеразного действия.

Оценка метрологических показателей биосенсоров в межлабораторном эксперименте. Для проверки воспроизводимости результатов, полученных при использовании печатных биосенсоров, был проведен межлабораторный эксперимент на базе кафедры прикладной экологии (Казанский университет) и Центра фитофармации (Университет г. Перпиньян, Франция).

Совпадение морфологии субстратных зависимостей отклика и выхода на предельное значение силы тока (насыщение мембраны субстратом) независимо от места проведения измерений и аппаратурного обеспечения эксперимента (рис.8) свидетельствует, что методика изготовления и хранения биосенсоров надежно обеспечивает воспроизводимость их основных операционных характеристики.

Св.мМ

Рисунок 4. Оценка субстратной специфичности в межлабораторном эксперименте: 1 - результаты измерений в Казанском университете; 2 - результаты измерений в Центре фитофармации г. Перпиньян.

Оценку воспроизводимости (4) ингибирования модельным раствором ку-мафоса проводили методом сравнения углов наклона градуировочиых зависимостей кумафоса по Стьюденту.

, 51 (V = Ы,+Ыг4) (4)

где Ь| - наклон прямой, полученной по результатам российского эксперимента. Ь - наклон прямой, полученной по результатам французского эксперимента и V - число степеней свободы. Результаты расчетов представлены в табл.7.

Таблица 10

Воспроизводимость измерения ингибируюшего действия кумафоса по результатам межлабораторного эксперимента. 1(%) = а + Ьх1о£(С|, М)

Калибровочная кривая по результатам российского эксперимента Калибровочная кривая по результатам французского эксперимента

а -2.26 ± 0,87 5,67±1,59

Ь 2,90 ± 0,067 2,18±0,11

Коэффициент корреляции (Щ 0,9987 0,9965

5ь(6ь) 0.423 0.985

Воспроизводимость 0,814 <2,16

Значение воспроизводимости свидетельствует, что результаты ингибиро-вания с вероятностью 95% совпадают.

Аналогичным образом, ингнбируюшее действие разбавленною ацетонит-рилмюю же факт из риса, зараженною кумафосом, по результатам независимых измерений, проведенных в Казани и Пергжньяне с печатными биосенсорами, описываются единой градуировочной зависимостью:

1,% = 8, 78хС, - 3,71; Я" - 0.9985 (5)

я- г',,. Ч5%» -■= 0.71

Таким образом, межлабораторный эксперимент свидетельствует о надежности измеренных показателей ингибирования и выводов о загрязнении образцов растительной продукции, сделанных на их основе. Холинэстеразные биосенсоры могут, таким образом, служить средством первичного контроля растительной продукции, предназначенного для быстрого определения наиболее загрязненных образцов с тем, чтобы в последующем химическом анализе выявить природу содержащегося в них пестицида.

выводы

1. Разработаны новые амперометричеекие холинэетеразные сенсоры на основе углеродистых композиций и модифицирующих материалов, обладающих улучшенными операционными и аналитическими характеристиками определения остаточных количеств фосфорорганических (хлорпирифос, трихлор-фон, кумафос) и карбаминатных (метиокарб) пестицидов.

2. Электростатическое торможение переноса ионных компонентов реакции, создаваемое модифицирующим слоем нафиопа, увеличивает время их жизни до 6 месяцев, снижает мешающее влияние ионов - эффекторов фермента и увеличивает долгосрочную стабильность отклика. Чувствительность определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в 1,5-2 раза выше, а предел обнаружения - в 2-5 раз ниже, чем для биосенсоров на основе немо-дифицированных электродов.

3. Иммобилизация холинэстеразы в парах глутарового альдегида позволяет получить сверхтонкие ферментсодсржащис пленки, не создающие диффузионного торможения переноса компонентов реакции к поверхности сенсора. В результате расширяется диапазон определяемых концентраций и увеличивается чувствительность определения ингибиторов по сравнению с толстослойными мембранами, получаемыми путем кросс-сшивки раствором глутарового альдегида. Увеличение удельной активности фермента снижает чувствительность определения необратимых ингибиторов.

4. В нрогочно-инжекционных условиях чувствительность определения пестицидов с помощью иммобилизованной холинэстеразы повышается за счет сорбционного предконцентрирования ингибиторов. Действие обратимых эффекторов снижается в результате нестационарных условий их переноса в ферментсодержащую мембрану.

5. Установлены рабочие условия определения остаточных количеств пестицидов в растительном материале. Показано, что ацетон и этанол в концентрации до 25 % снижают, а ацетонитрил в концентрации до 20 % увеличивает активность нативной и иммобилизованной холинэстеразы. Оценка ингибирующего действия ацетонитрильных экстрактов из зерна пшеницы, ячменя, риса по-

зволяет определять фосфорорганичеекие пестициды на уровне установленных максимально допустимых уровней.

Основное содержание диссертации отражено в публикациях:

1. Evtugyn G.A., Gogol E.V., Ivanov A.N., Latipova V.Z. Flow-injection analysis of Cholinesterase inhibitors: optimization of detection system./ Intern.Congress on Analytical Chemistry. Moscow June 15-21,1997. Abstracts. 1997. V.l. F-12

2. Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Gogol E.V., Marty J.-L., Budnikov H.C. Carbonpaste amperometric biosensor for the flow-through determination of Cholinesterase inhibitors ESEAC'98. 7lh European Conference of Electro-analysis. Book ofAbstr. Coimbra 1998. P. 188

3 Evtugyn G A. Ivanov A N Gogol F..V, Budnikov H.C The comparative determination of Cholinesterase inhibitors in flow-through and batch conditions./ 3rd INCO-Copernicus Workshop "Biosensors for direct monitoring of environmental pollutants in the field" Coimbra, May 1998.

4. Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Gogol E.V., Marty J.L., Budnikov U.C. Amperometric flow-through biosensor for the determination of Cholinesterase inhibitors.// Anal.Chim.Acta. 1999. V.385. №1-3. P. 13-21

5. Gogol E.V., Marty J.-L., Evtugyn G.A., Budnikov H.C. The influence of the sensor and immobilization procedure on the sensitivity of the determination of Cholinesterase inhibitors.// Abstr.of IV rencontre transfrontalière capteurs et biocapteurs. Montpclier. France. 1999.

6. Евтюгин Г.А., Иванов А Н.. Гоголь Э.В., Будников Г.К. Определение ингибиторов холинэстераз с помощью проточных электрохимических биосенсоров Сб.тезисов докл. 2 Всерос. Симпозиума "Проточный химический анализ" 1-3 декабря 1999. М.: ИОНХ РАН,- С.75-76

7. Gogol E.V.. Evtugyn G.A., Marty J.-L.. Budnikov U.C.. Winter V.G. Amperometric biosensors based on Nafion coated screen-printed electrodes for the determination of Cholinesterase inhibitors.// Talanta. 2000. V.53. №2. P.379-389.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гоголь, Эллина Владимировна

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Токсикологическая характеристика химических средств защиты растений и их количественное определение.

1.1. Пестициды: общая характеристика.

1.1.1. Терминология и классификация.

1.1.2. Инсектициды.

1.1.3. Механизм ингибирования холинэстеразы фосфорорганическими и карбаминатными пестицидами.

1.2. Методы определения карбаминатных и фосфорорганических пестицидов.

1.2.1. Физико-химические методы.

1.2.2. Биохимические методы.

1.3. Принципы конструирования холинэстеразных биосенсоров.

1.3.1. Иммобилизация холинэстераз.

1.3.2. Организация амперометрического сигнала.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Приборы и методы эксперимента.

Глава 3. Общая характеристика амперометрических биосенсоров на основе углеродистых материалов.

3.1. Характеристики формирования аналитического сигнала на электродах из различных углеродистых материалов.

3.2. Условия функционирования биосенсоров на основе углеродных электродов.

3.2.1. Биосенсоры на основе эпоксидно-углеродных композиций.

3.2.2. Биосенсоры на основе печатных электродов с нафионовым покрытием.

Глава 4. Оптимизация условий определения токсикантов антихолинэстеразного действия.

4.1. Влияние органического растворителя.

4.2. Модельные растворы пестицидов.

4.2.1. Тонкопленочные печатные электроды.

4.2.2. Влияние условий иммобилизации фермента.

4.2.3. Биосенсоры на основе объемных электродов из эпоксидно-графитовой композиции.

4.3. Ингибирующее действие фторидов.

4.3.1. Тонкослойные печатные биосенсоры.

4.3.2. Объемные эпоксидно-графитовые электроды.

4.4. Анализ реальных объектов окружающей среды.

4.4.1. Определение остаточных количеств пестицидов в образцах растительного материала.

4.4.2. Анализ остаточного содержания пестицидов в экстрактах из груши и перца.

4.4.3. Сравнительная характеристика печатных биосенсоров (межлабораторный эксперимент).

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов"

Растущий поток загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду, предъявляет все более жесткие требования к эколого-аналитическому контролю их остаточных количеств. Это связано как с постоянным расширением числа токсикантов, в том числе образующихся вторично в окружающей среде в результате превращения первичных загрязнителей, так и с углублением наших представлений о токсическом действии загрязняющих веществ и отдаленных последствиях загрязнения. Как следствие, ужесточаются гигиенические нормативы присутствия экотоксикантов в воде, почве и продуктах питания. Не менее важен и другой аспект этой проблемы - усложнение химического анализа приводит к постоянно растущему разрыву между временем пробоотбора и временем фактического получения информации о состоянии окружающей среды. Это повышает риск поступления токсических веществ в питьевые воды и продукты питания, ограничивает оперативное управление экологической ситуацией в целом.

Решение указанных проблем состоит в развитии методов биохимической диагностики, ориентированных на оценку токсического эффекта наиболее опасных загрязнителей. Перспективным направлением развития таких методов является сочетание ферментов, отличающихся высокой чувствительностью к экотоксинам - специфическим ингибиторам, и средств автоматизированного контроля - химических сенсоров. Благодаря количественной оценке токсического эффекта появляется возможность не только повысить информативность биохимического мониторинга, но и решать некоторые задачи экотоксикологии (экологическое нормирование, моделирование токсикации организма на молекулярном уровне, установление механизма метаболической трансформации и т.д.).

Холинэстеразы являются одними из наиболее исследованных ферментов, используемых в ферментативных методах контроля окружающей среды. Это связано с уникально широким кругом ингибиторов холинэстераз, в числе которых пестициды, поверхностно-активные вещества, соли тяжелых металлов. Однако примеры практического использования холинэстераз весьма ограничены. Это связано с проблемами стабилизации фермента при хранении и применении, сложности интерпретации отклика и необходимостью реактивации ингибированного фермента после каждого определения. Попытки упростить процедуру измерения путем создания одноразовых сенсоров на основе технологий микропечати не продвинулись дальше пилотных образцов, поскольку воспроизводимость отклика биосенсоров в производимой серии и быстрая инактиавация холинэстераз в процессе хранения не позволяют получить надежного и воспроизводимого сигнала в присутствии токсикантов в объектах окружающей среды.

Внедрение средств биохимической диагностики в практику экологического мониторинга требует в первую очередь решить вопросы надежности аппаратурного оснащения, сопряжения биологического компонента и средства измерения. В этой связи настоящая работа, посвященная развитию теоретических и практических основ конструирования холинэстеразных биосенсоров и их применения для определения пестицидов в объектах окружающей среды, является актуальной.

Вышесказанное определяет цель настоящей работы, которая состоит в создании и сравнительной характеристике новых биосенсоров на основе углеродистых материалов и современных модифицирующих материалов для определения остаточных количеств фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в объектах окружающей среды.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- исследовать различные углеродистые материалы и способы получения сенсоров на их основе с целью снижения рабочего потенциала и повышения воспроизводимости сигнала;

- изучить формирование амперометрического отклика биосенсора, стабильность иммобилизованной холинэстеразы и аналитические характеристики определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов;

- установить механизм влияния модифицирующего слоя нафиона на операционные и аналитические характеристики биосенсоров, определить рабочие условия нанесения модифицирующего покрытия;

- провести сравнительные испытания амперометрических сенсоров в стационарном и проточно-инжекционном режиме для определения фосфорорганических пестицидов;

- оценить эффективность применения биосенсоров в экспресс-оценке остаточных количеств пестицидов в растительной продукции, в том числе в рамках межлабораторного эксперимента с участием Центра фитофармации Перпиньянского университета (Перпиньян, Франция).

Научная новизна работы заключаются в том, что:

- впервые установлена возможность селективного определения сигнала биосенсора (тока окисления тиохолина) на основе углеродистых материалов и снижения рабочего потенциала окисления в присутствии модифицирующего слоя нафиона без использования медиаторов электронного переноса;

- определены пути повышения чувствительности и селективности определения пестицидов за счет регулирования удельной активности и толщины ферментсодержащего слоя для биосенсоров на основе печатных углеродных электродов и за счет нестационарного режима массопереноса реагентов в ферментсодержащем слое и сорбционного предконцентрирования на материале мембраны в проточно-инжекционном режиме. Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые в производстве и удобные в использовании амперометрические биосенсоры на основе планарных углеродных электродов, изготовляемых методом микропечати, позволяющие детектировать присутствие фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в воде и растительных экстрактах на уровне нормативов ПДК;

- разработаны и апробированы конструкции проточных ячеек для проточно-инжекционного определения пестицидов.

Положения, выносимые на защиту:

- сравнительная характеристика операционных и аналитических характеристик биосенсоров на основе печатных и объемных электродов из углеродистых материалов, выявление экспериментальных факторов (состав ферментсодержащего слоя, материал электрода, режим массопереноса в мембрану), определяющих чувствительность и селективность определения ингибиторов;

- механизм влияния стабилизирующего слоя нафиона, стабилизирующего отклик биосенсора и повышающий чувствительность и селективность определения остаточных количеств пестицидов;

- влияние органического растворителя на активность нативной и иммобилизованной холинэстеразы и возможность прямого определения остаточных количеств пестицидов в экстрактах без удаления растворителя

- сравнительная оценка результатов контроля реальных объектов окружающей среды с помощью разработанных биосенсоров и стандартных методов хроматографического анализа, метрологическая характеристика биосенсоров в межлабораторном эксперименте.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на итоговой научной конференции Казанского государственного университета (1999 г.), 2 Всероссийском симпозиуме по проточному анализу (Москва, 1999), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), 3 международном симпозиуме INCO Copernicus "Применение биосенсоров для определения загрязнителей в полевых условиях" (Коимбра,

1998), 7 Международном симпозиуме по электроаналитической химии ESEAC-98 (Коимбра, 1998), 4 Франко-испанском семинаре по биосенсорам (Монпелье, Франция,

1999), 5 Франко-испанском семинаре (Вик, Испания, 2000).

Основные результаты изложены в 2 статьях и 5 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текста, включает 49 рисунков и 16 таблиц. Состоит из Введения, 4 глав, Выводов, Списка использованных библиографических источников, включающего 229 ссылок на отечественные и зарубежные работы, и Приложения.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Гоголь, Эллина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Использование углеродистых композиций для изготовления сенсоров и модификация их поверхности нафионом позволяют улучшить операционные и аналитические характеристики амперометрических холинэстеразных биосенсоров для определения остаточных количеств фосфорорганических (хлорпирифос, трихлорфон, кумафос) и карбаминатных (метиокарб) пестицидов по сравнению с аналогичными биосенсорами на основе металлических электродов.

2. Нанесение нафиона на поверхность печатных планарных электродов стабилизирует отклик биосенсоров, увеличивает время их жизни до 6 месяцев и снижает мешающее влияние ионов - эффекторов фермента за счет электростатического торможения их переноса к поверхности сенсора. Чувствительность определения фосфорорганически и карбаминатных пестицидов в 1.5-2 раза выше, а предел обнаружения - в в 2-5 раз ниже, чем для биосенсоров на основе немодифицированных электродов.

3. Иммобилизация холинэстеразы в парах глутарового альдегида позволяет получить сверхтонкие ферментсодержащие пленки, не создающие диффузионного торможения переноса компонентов реакции к поверхности сенсора. В результате расширяется диапазон определяемых концентраций и увеличивается чувствительность определения ингибиторов по сравнению с толстослойными мембранами, получаемыми путем кросс-сшивки раствором глутарового альдегида. Увеличение удельной активности фермента снижает чувствительность определения необратимых ингибиторов.

4. В проточно-инжекционных условиях чувствительность определения пестицидов с помощью иммобилизованной холинэстеразы повышается за счет сорбционного предконцентрирования ингибиторов. Действие обратимых эффекторов снижается в результате нестационарных условий их переноса в ферментсодержащую мембрану.

5. Ацетон и этанол в концентрации до 25 % снижают, а ацетонитрил в концентрации до 20 % увеличивает активность нативной и иммобилизованной холинэстеразы. Оценка

144 ингибирующего действия ацетонитрильиых экстрактов из зерна пшеницы, ячменя, риса позволяет определять фосфорорганические пестициды на уровне установленных норм.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гоголь, Эллина Владимировна, Казань

1. Биосенсоры: основы и приложения./ Под ред. Тернера Э, Карубэ И, Уилсона Дж.- М.: Мир, 1992,-615 с.

2. Богдановская В.А, Гаврилова Е.Ф., Тарасевич М.Р. Влияние состояния углеродных сорбентов на активность иммобилизованных фенолоксидаз.// Электрохимия,- 1986.- Т.22.-№ 6.- С.742-746.

3. Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б. Влияние природы субстрата, этанола и фосфатного буфера на торможение бутирилхолинэстеразного гидролиза обратимыми ингибиторами.// Укр.биохим.журн.-1991,- Т.63.- № 5.- С.51-57.

4. Будников Г.К., Каргина О.Ю, Абдуллин И.Ф. Переносчики электронов в электрохимических методах анализа.// Журн.анал.химии.- 1989.- Т.44.- № 10.- С.1733-1752.

5. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С, Волков A.B. Влияние ионов металлов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы.// Журн.анал.химии.-1989.- Т.44.- № 12,- С.2253-2257.

6. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Ризаева Е.П., Иванов А.Н., Латыпова В.З. Сравнительная оценка электрохимических биосенсоров для определения ингибиторов загрязнителей окружающей среды.// Журн.аналит.химии.- 1999.- Т.54.- №9.- С.973-982.

7. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. М.: Фаир-Пресс, 1999.-720 с.

8. Евтюгин Г.А, Будников Г.К., Галяметдинов Ю.Г., Сунцов Е.В. Амперометрическое определение эфиров тиохолина в присутствии бутирилхолинэстеразы.// Журн.аналит. химии,- 1996.- Т.51.- №4.- С.424-427.

9. Евтюгин Г.А, Стойкова Е.Е, Искандеров Р.Р, Никольская Е.Б, Будников Г.К. Электрохимическая пробоподготовка в ферментативном определении ингибиторов холинэсте-раз.// Журн.аналит. хим.- 1997.- Т.52.- №1.- С.6-10.

10. Евтюгин Г.А., Стойкова Е.Е., Никольская Е.Б., Будников Г.К. Влияние ионов металлов на колориметрическое определение необратимых ингибиторов холинэстеразы.// Журн. анал.химии.- 1997.- Т.52,- № 2,- С.188-192.

11. Евтюгин Г.А., Муслинкина JI.A., Будников Г.К., Казакова Э.Х. Потенциометрический холинэстеразный биосенсор с мембраной, модифицированной калике-4.резорци-нолареном.// Журн.аналит.химии.- 1999.- Т.54.- №9.- С.973-982.

12. Клисенко М.А., Письменная М.В. Хроматоферментный метод определения остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в продуктах питания и объектах окружающей среды.// Журн.анал.химии.- 1988,- Т.43,- № 2.- С.354-359.

13. Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б. Влияние солевого состава среды и этанола на холинэстеразный гидролиз некоторых субстратов.// Укр.биохим.журн,- 1988.- Т.60.- № 4,- С.35-40.

14. Кулис Ю.Ю. Аналитических системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас, 1981,- 200 с.

15. Кулис Ю.Ю., Виджюнайте P.A. Определение ароматических аминов с использованием ферментных электродов.// ЖАХ.- 1983,- Т.38,- Вып.З.- С.484-487.

16. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. М.: Химия, 1996.- 319 с.

17. В.Маршалл Основные опасности химических производств. М.Мир, 1989,- 671 с.

18. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы.// Журн.анал.химии.- 1990.- Т.45.- № 7.- С.1386-1389.

19. Мельников H.H. Пестициды. Химия, технология и применение. М.: Химия, 1987.-712 с.

20. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Госхимкомиссия при МСХ СССР, 1977, ч.8.-192 с.

21. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Госхимкомиссия при МСХ СССР, 1979, ч.9,- 289 с.

22. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Госхимкомиссия при МСХ СССР, 1980, ч.Ю.-117 с.

23. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Госхимкомиссия при МСХ СССР, 1981, ч.11.- 306 с.

24. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Госхимкомиссия при МСХ СССР, 1982, ч.12,- 301 с.

25. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Госхимкомиссия при МСХ СССР, 1983, ч.13.- 262 с.

26. Методы определения микроколичеств пестицидов./ Под ред. Клисенко М.А.- М.: Колос, 1977,- 367 с.

27. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде./ Под ред. Клисенко М.А.- М.: Колос, 1983.- 304 с.

28. Методы определения микроколичеств пестицидов./ Под ред. Клисенко М.А.- М.: Колос, 1984.-256 с.

29. Никольская Е.Б. Применение ферментов для изучения состава некоторых гидроксо-комплексов.// Журн.анал.химии.- 1983.- Т.38.-№ 1.- С.5-11.

30. Никольская Е.Б., Бузланова М.М., Ягодина О.В, Перышкова O.E., Годовиков И.Н. Константы ингибирования как критерий чистоты биологически активных соединений ингибиторов ферментативных реакций.//Докл.АН СССР.- 1989.- Т.309.- № 1.- С.144-147.

31. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А. Применение холинэстераз в аналитической химии.// Журн.анал.химии.- 1992.- Т.47.- № 8.- С.1358-1377.

32. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А., Шеховцова Т.Н. Проблемы и перспективы применения ферментов в анализе объектов окружающей среды.// Журн.анал.химии,- 1994.- Т.49.- № 5,- С.452-461.

33. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А., Искандеров P.P., Латыпова В.З. Потенциометрические сенсоры для определения ингибиторов холинэстераз.// Журн.аналит.химии.- 1996.- Т.51.-№5.- С.561-565.

34. Никольская Е.Б., Юринская В.Е., Дидина С.Е., Шерстобитов А.О. Влияние ионов таллия и цинка на активность иммобилизованной холинэстеразы // Вестник С.-Пб. ун-та. 1997. - Сер.4. - № 1. - С.79-85.

35. Никольская Е.Б., Моралев С.Н. Кинетические методы идентификации ингибитров ферментативных реакций.//Докл АН РФ.-1997.- Т.354,- № 6,- С.780-782.

36. О'Брайен Р. Токсичные эфиры кислот фосфора. М.: Мир, 1964.- С.93-138.

37. Овчинников Ю.А. Основы биоорганической химии. М.: Просвещение, 1987. 815 с.

38. Оксенгендлер Г.И. Яды и противоядия. Л.: Химия, 1982.- 182 с.

39. Перес-Бендито П., Сильва М. Кинетические методы в аналитической химии. М.: Мир, 1991.-395 с.

40. Разумас В.Й., Ясайтис Ю.Ю., Кулис Ю.Ю. Амперометрические ферментные электроды на основе углеродистых материалов./ ВИНИТИ.- Вильнюс, 1984.

41. Резник B.C., Аникиенко К.А., Курочкин В.К., Акамсин В.Д., Галяметдинова И.В., Бычи-хин Е.А. Новый класс ингибиторов холинэстераз: тетраалкилаамониевые производные 6-метилурацила и аллоксазина.// Докл.АН РФ.-1998.- Т.362.- № 1.- С.68-70.

42. Розенгарт В.И., Шерстобитов O.E. Избирательная токсичность фосфорорганических ин-сектоакарицидов. Л.: Наука, 1974.- 174 с.

43. Справочник по пестицидам: Гигиена применения и токсикология./ Сост. Седокур Л.К., под ред. Павлова A.B.- 3-е изд., испр. и доп.- Киев: Урожай, 1986.- 432 с.

44. Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1984. Т.1.- 232 с.

45. Тонкопий В.Д., Куценко С.А., Загребин А.О., Шерстнева Л.А. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки новых методов биоиндикации антихолинэстеразных соединений в водной среде.// Журн.эколог.химии.- 1993.- № 2.- С.133-137.

46. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир, 1983.- 218 с.

47. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 1980.- 432 с.

48. Яковлев В.А., Волкова Р.И. Кинетика взаимодействия холинэстеразы с необратимыми ингибиторами.// Докл АН СССР.- 1959,- Т.128.- № 4.- С.843-846.

49. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965. 248 с.

50. Adams R.N. Electrochemistry at solid Electrodes./ Marcel Dekker, INC.- New York.- 1969.-P.19.

51. Aldridge W.N. Some properties of specific cholinesterase with particular reference to the mechanism of inhibition by diethyl-p-nitrophenyl thiophosphate (E605) and analogues.// BiochemJ.- 1950.- V.46.- P.451-460.

52. Alles G., Hawes R.C. Cholinesterases in the blood of man.// J.Biol.Chem.- 1940.- V.133.- № 3.- P.375-390.

53. Ayyagari M.S., Kamtekar S., Pande R., Marx K.A., Kumar J., Tripathy S.K., Kaplan D.L. Biosensors for pesticide detection based on alkaline phosphatase-catalyzed chemilumines-cence.// Mat.Sci.Eng. C-Bio.- 1995,- V.2.- N 4.- P.191-196.

54. Bachmann T.T., Schmid R.D. A disposable multielectrode biosensor for rapide simultaneous detection of the insecticides paraoxon and carbofuran at high resolution.// Anal.Chim.Acta.-1999,- V.401.- P.95-103.

55. Basanta R., Nunez A., Lopez E., Fernandez M., Diaz-Fierros F. Measurement of cholinesterase activity inhibition for the detection of organophosphorus and carbamate pesticides in water.// InternJ.Environmental Studies.- 1995.-V.48.- P.211-219.

56. Bauman E.K., Goodson L.H., Guilbault G.G., Kramer D.N. Preparation of immobilized cholinesterase for use in analytical chemistry.// Anal.Chem.- 1965.- V.37.- №11,- 1378-1381.

57. Bender M.L., Stoops J.K. Titration of the active sites of acetylcholinesterase.// J.Amer. Chem.Soc. 1965. - V.87. - № 7. - P.1622-1623.

58. Berck B., Iwata Y., Gunther F. Worker environment research: rapid field method for estimation organophosphorus insecticides residues on citrus foliage and in grove soil.// J.Agricult.Food.Chem.-1981.- V.29.- №2,- P.209-216.

59. Bernabei M, Cremisini C, Mascini M, Palleschi G. Determination of organophosphorus and carbamic pesticides with a choline and acetylcholine electrochemical biosensor.// Anal. Letters. -1991,- V.24.- № 8.- P.1317-1332.

60. Bernabei M, Chiavarini C, Mascini M, Palleschi G. Anticholinesterase activity measurement by a choline biosensor application in water analysis.//Biosens. Bioelectron.- 1993.- №.8.- P. 265-271.

61. Bhatia S.K, Cooney M.J, Shriver-Lake L.C, Fare T.L, Ligler F.S. Immobilization of acetylcholinesterase on solid surfaces: chemistry and activity studies.// Sensors Actuators B.- 1991.-№3.-P.311-317.

62. Bhattacharya S, Alsen C, Kruse H, Valentin P. Detection of organophosphate insecticide by an immobilized-enzyme systeme.// Environ. Sci.Technol.-1981,- V.15.- №11.- P.1352-1355.

63. Blaicher G, Pfannhauser W, H.Woidich// Chromatographia.- 1980,- V.13.- P.438.

64. Bougherra M.L. Les poisons du tiers-monde./ La Découverte.- 1985.

65. Bouillie bordelaise.// Comptes rendus du colloque commemoratif du centenaire de la bouillie bordelaise.- 1985.-BCPC Pub, 2A Kidderminster Road, Croydon CRO 2UE (UK).- V. 1,2.

66. Bushway R.J, Fan Z. Complementation of GC-AED and ELISA for the determination of diazi-non and chlorpyrifos in fruits and vegetables.// J.Food.Protection.- 1998.- V.61.- №6.- P.708-711.

67. Budnikov H.C, Evtugyn G.A. Electrochemical biosensors for inhibitor determination: selectivity and sensitivity control.// Electroanalysis.- 1996.- V.8.- № 8-9.- P.817-820.

68. Bull. QMS.//1986.- V.64.- P. 177.

69. Budnikov H.C., Medjantsewa E.P., Babkina S.S. An enzyme amperometric sensor for toxicant determination.// J.Electroanal.Chem.- 1991.- V.310.- №1-2,- P.49-55.

70. Budnikov H.C., Evtugyn G.A. Electrochemical biosensors for inhibitor determination: selectivity and sensitivity control.// Electroanalysis.- 1996.- V.8.- № 8-9,- P.817-820.

71. Cagnini A., Palchetti I., Mascini M., Turner A.P.F. Ruthenized screen-printed choline oxidase-based biosensors for measurement of anticholinesterase activity.// Microchim.Acta.- 1995.-V.121.- P.155-166.

72. Cagnini A., Palchetti I., Lionti I., Mascini M., Turner A.P.F. Disposable ruthenized screen-printed biosensors for pesticides monitoring.// Sensors Actuators B.- 1995.- V.24-25.- P.85-89.

73. Campanella L., Achilli M., Sammartino M.P., Tomassetti M. Butyrylcholine enzyme sensor for determining organophosphorus inhibitors.// Biochem.Bioenergetics.-1991.- V.26.- P.237-249.

74. Campanelle L., De Luca S., Sammartino M.P., Tomassetti M. A new organic phase enzyme electrode for the analysis of organophosphorus pesticides and carbamates.// Anal.Chim.Acta.-1999.- V.385.- P.59-71.

75. Cholinesterase-Hemmtest. Screening Test zur Bestimmung von Cholinesterase hemmenden Organophosphat- und Carbamat-Pestiziden in Wasser. / Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim. Cat.№ 1293460.

76. Clark L.C.Jr., Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cradiovascular surgery.//Ann.N. Y.Acad. Sei.- 1962.- V.102.- P.29-45.

77. Corbett J.R. The biochemical mode of action of pesticides./ Acad.Press.- 1974.- P. 107.

78. Coulet P.R. What is biosensor?// Biosensor: Principle and Applications.- Blum L.J., Coulet P.R. Editors.-1991.- Marcel Dekker.- Inc. New York.- P. 1 -6.

79. Davis T.J., Malaney G.W. Acetylcholinesterase inhibition a new parameter of water pollution.// Water Sewage Works.- 1967.- V.l 14.- № 7.- P.272-274.

80. Dehlawi M.S., Eldefrawi A.T, Eldefrawi M.E., Anis N.A., Valdes J.J. Choline derivatives and sodium fluoride protect acetylcholinesterase against irreversible inhibition and aging by DFP and paraoxon.// J.Biochem.Toxicol.- 1994,- V.9.- № 5,- P.261-268.

81. Deltaméthrine.// Monographie Roussel-UCLAF.-1982.- 102, route de Noisy 93230 Romain-ville.

82. Deng Q., Dong S.J. The effect of substrate and solvent properties on the response of an organic phase tyrosinase electrode.// J.Electroanal.Chem.- 1997.- V.435.- № 1 -2.- P. 11 -15.

83. Diehl-Faxon J., Ghindilis A.L., Atanasov P., Wilkins E. Direct electron transfer based tri-enzyme electrode for monitoring of organophosphorus pesticides.// Sensors Actuators B.-1996.- V.36.- № 1-3,- P.448-457.

84. Dumschat C, Muller H., Stein K., Schwedt G. Pesticide sensitive ISFET based on enzyme inhibition.// Anal.Chim. Acta.-1991.- V.252.- № 1-2.- P.7-10.

85. Durand P., David A., Thomas D. An enzyme electrode for acetylcholine.// Biochim. Biophys.Acta.- 1978,- V.527.- P.277-281.

86. Durand P., Thomas D. Use of immobilized enzyme coupled with an electrochemical sensor for the detection of organophosphate and carbamate pesticides.// JEPTO.- 1984.- №5.- P.51-57.

87. Du Tingfa, Zhou Shiguang, Tang Mousheng A new micro-detection tube for cholinesterase inhibition in water.// Environ.Pollut.- 1989.-V.57.- № 3.- P.217-222.

88. Dzyadevich S.V., Schul'ga A.A., Soldatkin A.P., Nyamsi Hendji A.-M., Jaffrezic-Renault N., Martelet C. Conductometric biosensors based on cholinesterases for sensitive detection of pesticides.// Electroanalysis.- 1994.- V.6.- P.752-758.

89. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.// Biochem. Pharmacol. 1961.- V.7.- № 1.- P.88-95.

90. El Yamani H., Tran-Minh C., Abdul M., Dupont M. Automatic unit for measurement of toxicity of river water.// J.Fr.Hydrol.- 1987.- V.18.- № 1.- P.67-75.

91. El Yamani H., Tran-Minh C., Abdul M.A., Chavanne D. Automated system for pesticide detection.// Sensors Actuators.- 1988,- V.15.- P.193-198.

92. Everett W.R., Rechnitz G.A. Mediated bioelectrocatalytic determination of organophosphorous pesticides with a tyrosinase-based oxygen biosensor.// Anal.Chem.- 1998.- V.70.- № 4.-P.807-810.

93. Evtugyn G.A., Budnikov H.C., Nikolskaya E.B. Influence of surface-active compounds on the response and sensitivity of cholinesterase biosensors for inhibitor determination.// Analyst.-1996.- V.121.- №12.- P.1991-1915.

94. Evtugyn G.A., Rizaeva E.P., Stepanova N. Ju., Petrov A.M. Preliminary testing of waste and sewage waters based on Cholinesterase biosensor.// Environ.Radiology.Applied.Ecology.-1997.- V.3.- №1.- P.7-12.

95. Evtugyn G.A., Rizaeva E.P., Stoikova E.E., Budnikov H.C. The application of Cholinesterase Potentiometrie biosensor for preliminary screening of the toxicity of waste waters.// Elec-troanalysis.-1997.- V.9.- №14,- P.l 124-1128.

96. Evtugyn G.A., Budnikov H.C., Nikolskaya E.B. Sensitivity and selectivity of electrochemical enzyme sensors for inhibitor determination.// Talanta.- 1998.- V.46.- №5.- P.465-484.

97. Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Gogol E.V., Marty J.L., Budnikov H.C. Amperometric flow-through biosensor for the determination of Cholinesterase inhibitors.// Anal.Chim.Acta.- 1999.-V.385.- №1-3.- P.13-21.

98. Fernandez-Band B., Linares P., Luque de Castro M.D., Valcarcel M. Flow-through sensor for the direct determination of pesticide mixtures without chromatographic separation.// Anal.Chem.-1991,-V.63.-P. 1672-1675.

99. Fest C., Schmidt K.-J. The chemistry of organophosphorus pesticides.// Springer-Verlag. -1973.- Berlin Heidelberg New York.

100. Fournier J. Chimie des pesticides./ Agence de Cooperation Culturelle et Technique.- 13, quai André Citroën 75015 Paris.- Cultures et Techniques.- 23, rue recteur Schmitt 44072 Nantes CEDEX 3.- 1988.

101. Ghindilis A.L., Morzunova T.G., Barmin A.V., Kurochkin I.N. Potentiometrie biosensors for cholinesterases inhibitor analysis based on mediatorless bioelectrocatalysis.// Bio-sens.Bioelectron.- 1996,- V.ll.- № 9.- P.873-880.

102. Giang A.P., Hall S.A. Enzymatic determination of organic phosphorus insecticides.// Anal.Chem.-1951.- V.23.-№ 12,- P.1830-1834.

103. Gillespie A.M., Walters S.M. Rapid clean-up of fat extracts for organophosphorus pesticide residue determination using Ci8 solid-phase extraction cartridges.// Anal.Chim.Acta.- 1991.-V.245.- P.259-265.

104. Gilson M.K., Straatsma T.P., MacCammon J.A., Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. Open "back door" in a molecular dynamics simulation of acetylcholinesterase.// Science.- 1994,- V.263.- P.1276-1278.

105. Goodson J.H., Jacobs W.B., Davis A.W. An immobilized cholinesterase product for use in the rapid detection of enzyme inhibitors in air and water.// Anal.Biochem.- 1973.- V.5L- № 2.-P.362-367.

106. Goodson L.H., Jacobs W.B. Monitoring of air and water for enzyme inhibitors.// Methods Enzymol.- 1976.- V.44.- P.647-658.

107. Grass R., Scheller F., Shao M.J., Lui C.C. Electrochemical determination of cholinesterase activity using a thik-film metallized platinum electrode.// Anal.Lett.- 1989.- Vol.22.- N 5.-P.1159-1169.

108. Guilbault G.G., Kramer D.N., Cannon P.L. Electrochemical determination of organophosphorous compounds.//Anal.Chem.- 1962.- V.34.- P. 1437-1442.

109. Guilbault G.G., Sadar M.H., Zimmer M. Analytical applications of the phosphatase system. Determination of bismuth, beryllium and pesticides.// Anal.Chim.Acta.- 1969.- V.44.- P.361-367.

110. Guilbault G.G., Sadar M.H., Kuan S.S. Casey D. Enzymatic methods of analysis. Trace analysis of various pesticides with insect cholinesterases.// Anal.Chim.Acta.- 1970.- V.52.- № 1,-P. 1770-1774.

111. Giinther A., Bilitewski U. Characterisation of inhibitors of acetylcholinesterase by an automated amperometric flow-injection system.// Anal.Chim.Acta.- 1995.- V.300.- P.l 17-125.

112. Hall E.A.H.// Biosensors.- Bryant J.A, Kennedy J.F. Editors.- 1990,- ISBN.- Buckingem.

113. Harel M., Schalk I, Ehret-Sabatier L, Bouet F, Goeldner M, Hirth C, Axelsen P.H, Sil-man I, Sussman J.L. Quaternary ligand binding to aromatic residues in the active gorge of acetylcholinesterase.// Proc.Natl.Acad.Sci USA.- 1993.- V.90.- P.9031-9035.

114. Harel M, Sussman J.L, Krejci E, Bon S, Chanal P, Massoulie J, Silman I, Conversion of acetylchlolinesterase to butyrylcholinesterase: modelling and mutagenesis.// Proc.Natl. Acad. Sei. USA.- 1992,- V.89.- P.10827-10831.

115. Hartley I.C, Hart J.P. Amperometric measurement of organophosphate pesticides using a screen-printed disposable sensor nad biosensor based on cobalt phtalocyanine.//Anal.Proc.-1994,-V.31.- P.333-337.

116. Hassel F. A. The chemistry of pesticides./ Verlag Chemie.- 1982.- P.97.

117. Holan G, Smith D.R.J.// Experientia.-1986.- №42,- P.558.

118. Hollinghaus J .G.II Pestic.Biochem.Physiol.- 1987.- №27.- P.61.

119. Imato T, Ishibashi N. Potentiometrie butyrylcholine sensor for organiophosphate pesticides.//Biosens.Bioelectron.- 1995.- V.10.- P.435-441.

120. Index phytosanitaire ACTA. 35e edition.// Association de Coordination Technique Agricole.- 1999.-149, rue de Bercy 75595 Paris CEDEX 12.

121. L'Industrie mondiale de phytosanitaire.// DAFSA.- 1983.- 7, rue Bergère 75009 Paris.

122. InQuest OP/Carbamate Screen, Ohmicron, Newtown, PA, USA.

123. Ivanov A.N., Evtugyn G.A, Gyurcsânyi R.E, Tôth K, Budnikov H.C. Cholinesterase based electrochemical sensors for pesticide determination.// Anal.Chim.Acta.- 2000.-V.404.-P.55.

124. Jdanova A.S., Poyard S., Soldatkin A.P., Jaffrezic-Renault N., Martelet C. Conductometric urea sensor. Use additional membranes for the improvement of its analytical characteristics.// Anal.Chim.Acta.- 1996.- V.321.- P.35-40.

125. Jensen F.S., Viby-Mogensen J. Anaesthesia and abnormal plasma cholineseterase./ "Cho-linesterases, structure, function, mechanism, genetics and cell biology" .Proc. 3rd Intern. Meeting on Cholinesterases (Ed. Massouliu J.).-1991.- P.336-338.

126. Khayyami M., Perez Pita M.T., Garcia N.P., Johansson G., Danielsson B., Larsson P.-O. Development of an amperometric biosensor based on acetylcholine esterase covalently bound to a new support material.// Talanta.- 1998.- V.45.- P.557-563.

127. Kierstan M.P.J., Coughlan M.P. Immobilization of cells and enzymes by gel entrapment.// Immobilized cells and enzymes: a practical approach.- Woodward J. Editor.- 1985,- IRL Press.-P.39-74.

128. Kobatake E., Niimi T., Haruyama Y., Aizawa M. Biosensing of benzene derivatives in environment by luminescent Esherichia coli.// Biosens.Bioelectron.- 1995.- V.10.- № 6-7.- P.601-606.

129. Koput J. Spectre de micro-ondes.// J.Mol.Spectroscopy.- 1986.- V.l 15.- P.131.

130. Kuhr R.J., Dorough H.W. Carbamate insecticides: chemistry, biochemistry and toxicology./ CRC Press.- 1976.

131. Kulys J.J, D'Costa J. Printed amperometric sensor based on TCNQ and cholinesterase.// Biosens.Bioelectron.-1991.-V.6.- P.109-115.

132. Kutner W, Wang J, L'her M, Buck R.P. Analytical aspects of chemically modified electrodes: classification, critical evaluation and recommendations (IUPAC Recommendations 1998).//Pure.Appl.Chem.- 1998.- V.70.- № 6.- P.1301-1318.

133. La Rosa C., Pariente F., Hernandez L, Lorenzo E. Determination of organophosphorus and carbamic pesticides with an acetylcholinesterase amperometric biosensor using 4-aminophenyl acetate as susbtrate.//Anal.Chim. Acta.- 1994.- V.295.- P.273-282.

134. Leon-Gonzalez M.E, Townshend A. Flow-injection determination of paraoxon by inhibition of immobilized acetylcholinesterase.// Anal.Chim.Acta.- 1990,- V.236.- P.267-272.

135. Leon-Gonzalez M.E, Townshend A. Determination of organophosphorus and carbamate pesticide standards by liquid chromatography with detection by inhibition of immobilized acetylcholinesterase.// J.Chromatogh.-1991.- V.539.- P.47-54.

136. Leuzinger W, Baker A.L.// Proceeding of Nat.Acad.Sci.- 1967.-Washington.- V.57.- P.446.

137. Linares P, Castro L, Valcarel M. Integrated reaction and photometric detection with enzymes immobilized in the flow cell of a flow injection system.// Anal.Chim.Acta.- 1990.-V.230.- P.199-302.

138. Liu, D.H, Yin A.F, Chen K, Ge K, Nie L.H., Yao S.Z. Determination of trace-level of mercury(II) based on the inhibition of urease using saw/impedance enzyme transducer.// Anal.Letters.- 1995.- V.28.- № 8,- P.1323-1337.

139. Lorelle V. Phytoma Défense des cultures./ 380,- 1985.- P.5.

140. Manuel of pesticide residue analysis.// DFG.- Pesticide commission.- Thier H-P., Zeumer H. Editors.- 1987.- VCH, Weinheim.- V.l.

141. Marco M.P., Barcelo D. Environmental applications of analytical biosensors.// Measur.Sci Technol.- 1996.- V.7.- № 11.- P. 1547-1562.

142. Martorell D., Cespedes F., Martinez-Fabregas E., Alegret S. Amperometric determination of pesticides using a biosensor based on a polishable graphite-epoxy biocomposite.// Anal.Chim. Acta.- 1994.- V.290.- № 3.- P.343-348.

143. Marty J.-L., Mionetto N., Rouillon R. Entrapped enzymes in photocrosslinlable gel for enzyme electrodes.//Anal.Lett.- 1992.- №8.- P.1389-1398.

144. Marty J.-L., Sode K., Karube I. Biosensors for the detection of organophosphate and carbamate insecticides.// Electroanal.- 1992.- V.4.- P.249-252.

145. Mascini M., Ianello M., Palleschi G. Enzyme electrodes with improved mecanical and analytical characteristics obtained by binding enzymes to nylon nets.// Anal.Chim.Acta.- 1983.-V.146.- P.135-148.

146. Matsumura F. Toxicology of insecticides./ Plenum Press.- 1975.- P.141.

147. McCosker P.J. Babesiosis/ ed. Ristic M., Kreier J.P.- Academic Press, NY.-1981.- P.l-24.

148. Mendez J.H., Martinez R.C., Martin J.S.// Anal.Chem.- 1986.- V.58.- P.1969.

149. Méthodes multirésidus de determination par chromathographie en phase gazeuse de résidus de pesticides (aliments non gras)./ Norme européenne EN 12393-2: 1998.- Ed. Ass.Franç.Norm. (AFNOR).- Tout Europe.- 1999.

150. Mionetto N., Rouillon R., Marty J.-L. Inhibition of acetylcholinesterase by organophosphorus and carbamate compounds. Studies on free and immobilized enzymes.// Zeitschrift.Wasser.Abwasser.Forschung.- 1992.- V.25.- P.171-174.

151. Mionetto N., Marty J.-L., Karube I. Acetylcholinesterase in organic solvents for the detection of pesticides. Biosensor application. // Biosens.Bioelectron.- 1994.- V.9.- P.463-470.

152. Mizutani F., Tsuda K. Amperometric determination of cholinesterase with use of an immobilized enzyme electrode.// Anal.Chim.Acta.- 1982,- V.139.- P.359-362.

153. Morelis R.M., Coulet P.R. Highly sensitive biosensor for choline and acetylcholine determination with fast immobilization of bi-enzyme system on a disposable membrane.// Anal.Chim.Acta.-1991,- V.231.- P.27.

154. Mortensen M.L. Pediatric Clinics of North America.- 1986.- V.33.- P.421.

155. Mostafa F.I.Y., Karns J.S., Mulbry W.W. An enzyme based assay for differential determination of coumaphos and potasan in cattle dips.// J.Environ.Sci.Health.-1999.- V. B34.- №2,-P. 193-205.

156. Mulchandani A., Pan S., Chen W. Fiber-optic enzyme biosensor for direct determination of organophosphate nerve agents.// Biotechnol.Prog.- 1999.- Vol.15.- N 1.- P. 1304.

157. Ngen-Ngwainbi J., Foley P.H., Kuan S.S., Guilbault G.G. Parathion antibodies on piezoelectric crystals.// J.Americ.Chem.Soc.- 1986.- V.108.- P.5444-5447.

158. Nikolskaya E.B., Evtugyn G.A., Budnikov H.C. Development and application of potenti-ometric and amperometric cholinesterase electrodes for environmental analysis.// Current Separations.- 1993.- V.12.- №2.- P. 122.

159. Nunes G.S., Skladal P., Yamanaka H., Barcelo D. Determination of carbamate residues in crop samples by cholinesterase-based biosensors and chromatographic techniques.// Anal.Chim. Acta.- 1998.- V.362.- № 1.- P.59-68.

160. Nwosu T.N., Palleschi G., Mascini M. Comparative studies of immobilized enzyme electrodes based on the inhibitory effect of nicotine on choline oxidase and acetylcholinesterase.// Anal.Letters.-1992.- V.25.- №5.- P.821-835.

161. Palchetti I., Cagnini A., Del Carlo M., Coppi C., Mascini M., Turner A.P.F. Determination of anticholinesterase pesticides in real samples using a disposable biosensor .// Anal.Chim.Acta.- 1997.- V.337.- P.315-321.

162. Palleschi G., Lavagnini M.G., Moscone D., Pilloton R., D'Ottavio D., Evangelisti M.E. Determination of serum cholinesterase activity and dibucaine numbers by an amperometric choline sensor.//Biosens.Bioelectron.- 1990.- V.5.- P.27-35.

163. Rapport annuel de l'UIPP (Union des industries de la protection des plantes)/ 1986.

164. Recueil de normes d'agropharmacie AFNOR.// Chimie, eau, techniques agricoles, forêts.-1983.-Tout Europe.- 92080 Paris La Défense CEDEX 07.

165. Rehak M., Snejdarkova M., Hianik T. Acetylcholine minisensor based on metal-supported lipid bilayers for determination of environmental pollutants.// Electroanalysis.- 1997.- V.9.- № 14,-P. 1072-1077.

166. Ripoll D.R., Faerman C., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase.// Biochem.-1993.-V.90.-P.5128-5132.

167. Rippeth J.J., Gibson T.D., Hart J.P., Hartley I.C., Nelson G. Flow-injection detector incorporating a screen-printed disposable amperometric biosensor for monitoring organophosphate pesticides.//Analyst.- 1997.- V.122.- P.1425-1429.

168. Ristori C., Del Carlo C., Martini M., Barabaro A., Ancarani A. Potentiometric detection of pesticides in water samples.// Anal.Chim.Acta.- 1996.- V.325.- P.151-160.

169. Rogers K., Foley M., Alter S., Koga P., Eldefrawi M. Light addressable potentiometric biosensor or the detection of anticholinesterases.// Anal.Letters.-1991.- V.24.- № 2.- P.191-198.

170. Rogers K.R., Williams L.R. Biosensors for environmental monitoring: a regulatory perspective.// Trends in Anal.Chem.- 1995.- V.14.- № 7.- P.289-294.

171. Rogers K.R., Gerlach C.L. Environmental biosensors. A status report.// Environ. Sci Tech-nol.- 1996.- V.30.- № 1.- P.486A-491A.

172. Sadar M.H., Kuan S.S., and Guilbault G.G. Trace analysis of pesticides using cholinester-ase from human serum, rat liver, electric eel, bean leaf beetle, and white fringe beetle.// Anal.Chem.-1970.-V.42.- № 14.- P.1770-1774.

173. Satoh I. Colorimetric biosensing of heavy metal ions with the reactor containing the immobilized apoenzyme.// Ann.N.Y.Acad.Sci.-1990.- V.613.- № 10.- P.401-404.

174. Satoh I. An apoenzyme thermister microanalysis for zinc(2+) ions with use of an immobilized alkaline phophatase reactor in a flow system.// Biosens.Bioelectron.- 1991.- V.6.- №4.-P.275-279.

175. Schmid R.D., Karube I. Biosensors and bioelectronics.// Biotechnol., Rehm H.J., Reed G. Editors, VCH Verlag, Weiheim.- 1988.- V.6b.- P.317-365.

176. Schumacher M., Camp S., Maulet Y., Newton M., MacPhee-Quigley K., Taylor P. Primary structure of Torpedo Californica acetylcholinesterase, deduced from cDNA sequences.// Nature.- 1986.- V.319.- P.407-409.

177. Simon D., Helliwell S., Robards K. Analytical chemistry of chlorpyrifos and diuron in aquatic ecosystems.// Anal.Chim.Acta.- 1998.- V.360.- P. 1-16.

178. Skladal P. Determination of organophosphate and carbamate pesticides using a cobalt phtalocyanine-midified carbon paste electrode and a cholinesterase enzyme membrane.// Anal.Chim.Acta.-1991.- V.252.- P.ll-15.

179. Skladal P., Mascini M. Sensitive detection of pesticides using amperometric sensors based on cobalt phtalocyanin-modified composite electrodes and immobilized cholinesterases.// Biosens. Bioelectron.- 1992,- V.7.- № 5.- P.335-343.

180. Skladal P. Detection of organophosphate and carbamate pesticides using disposable biosensors on chemically modified electrodes and immobilized cholinesterase.// Anal.Chim.Acta.-1992.- V.269.- P.281-287.

181. Skladal P, Pavlik M, Fiala M. Pesticide biosensor based on coimmobilized acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase.// Anal.Letters.- 1994.- V.27.- № 1.- P.29-40.

182. Skladal P, Fiala M, Krejci J. Detection of pesticides in the environment using biosensors based on cholinesterases.// Inter.J.Environ.Anal.Chem.- 1996.- V.65.- P.139-148.

183. Skladal P, Krejci J. Performance of the amperometric biosensor with immobilized butyrylcholinesterase in organic solvents.// Coll.Czecjoslloovak.Chem.Commun.- 1996.- V.61.- № 7.-P.985-991.

184. Skladal P. Biosensors based on cholinesterase for detection of pesticides.// Food Tech-nol.Biotechnol.- 1996.-V.34.-№ 1.-P.43-49.

185. Skladal P, Nunes G.S, Yamanaka H, Riberio M.L. Detection of carbamate pesticides in vegetables samples using cholinesterase-based biosensor.// Electroanalysis.- 1997,- V.9.- № 14.- P.1083-1087.

186. Sounders B.C., Holmes-Siedle A.G, Stark B.P. Peroxidase. The properties and uses of a versatile enzyme and of some related catalysts. London: Butterworths, 1964.- 271 p.

187. Spear R.C, Poppendorf W.J, Spencer W.F, Milby T.N.// J.Occup.Med. -1977.- V.19.-P.411.

188. Stanley Ch. New approaches to immunoassays and biosensors.// World Biotech. Rept.-1988.- P.291-299.

189. Starodub N.F, Kanjuk N.I, Kukla A.L, Shirshov Yu.M. Multi-enzymatic electrochemical sensopr: field measurements and their optimization.// Anal.Chim.Acta.- 1999.- Vol.385.-P.461-466.

190. Stedman E, Stedman E, Easson L.H. Cholinesterase. An enzyme present in the blood-serum of the horse.// Biochem.J.- 1932,- V.26.- № 8.- P.2056-2066.

191. Su Y.S, Cagnini A, Mascini M. Screen-printed biosensor alkaline-phosphatase based for environmental applications.// Chem.Amalityczna.- 1995.- V.40.- № 4.- P.579-585.

192. Sussman J.L., Harel M., Frolow F, Oefher C., Goldman A., Toker L, Silman I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: A prototypic acetylcholine-binding protein.// Science.-1991.- V.253.- P.872-879.

193. Tran-Minh C. Immobilized enzyme probes for determing inhibitors.// Ion-Selec.Electrode Rev.- 1985.- V.7.-P.41-75.

194. Tran-Minh C., Pandey P.C., Kumaran S. Studies on acetylcholine sensor and its analytical application based on the inhibition of Cholinesterase.// Biosens.Bioelectron.- 1990.- V.5.-P.461-471.

195. Trevan M.D. Immobilized Enzymes./An Introduction and Applications in Biotechnology.-Ed. J.Wiley and Sons.- 1980.- Chichester.

196. Turdean G, Peter I., Popescu I.C., Oniciu L. An acetylcholinesterase amperometric microbiosensor for the detection of dipterex.// Rev.Roumane de Chimie.- 1997.- V.42.- № 9.- P.879-883.

197. Turner A.P.F. New trends in biosensor development./ NATO Advanced Research Workshop Kiev (Vorzel), July 6-9. 77 p.

198. Turner A.P.F. Current trends in biosensor research and developement.// Sensors Actuators.-1989.-V.17.- P.433-450.

199. Uris L. Trinité.// Laffont R.- S.A.- 1977.

200. U.S. EPA Pesticide Industry Sales and Usage: 1992 and 1993 Market Estimates.// Office of pesticide programms.- Washington, DC.-1984.

201. Villatte F., Marcel V., S.Estrada-Mondaca, Fournier D. Engineering sensitive acetylcholinesterase for detection of organophosphate and carbamate insecticides.// Biosens. Bioe-lectron.- 1998.- V.13.- № 2.- P.157-164.

202. Vlasov Y., Bratov A., Levichev S., Tarantov Y. Enzyme semiconductor sensor based on butyrylcholinesterase.// Sensors Actuators B.-1991.- V.l 1.- P.283-286.

203. Wallace K.B., Kemp J.R. Species specificity in the chemical mecanisms of organophospho-rus anticholinesterase activity.// Chem.Research.Toxicol.-1991.- V.4.- №1.- P.41-49.

204. Walters S.M. Clean-up techniques for pesticides in fatty foods.// Anal.Chim.Acta.- 1990.-V.236.- P.77-82.

205. Weintraub H.J.R., Hopfinger A.J. Molecular and quantum pharmacology./ Ed. Bergmann E., Pullman B., D. Reidel Pub.- 1974,- P.131.

206. Wiles R., Davies K., Campbell C. Overexposed: Organophosphate Insecticides in Children's Food./ Environmental Working Group.- 1998.- Washington, DC.

207. White S.F., Turner A.P.F., Schmid R.D., Bilitewski U., Bradley J. Investigations of platinized and rhodinized carbon electrodes for use in glucose sensors.// Electroanalysis.-1994.- V.6.- № 8,- P.625-632.

208. Wolfbeis O.S., Koller E. Fiber optic detection of pesticides in drinking water.// Biosensors: Fundamentals, Technologies and applications.- Scheller F., Schmid R.D. Editors, GBF Monographs.- 1992.-V.17.- P.221-224.

Информация о работе

Гоголь, Эллина Владимировна
кандидата химических наук
Казань, 2000
ВАК 03.00.16

Диссертация

Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы