Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОДЕЛИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АССОЦИАЦИИ КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ — БОБОВОЕ РАСТЕНИЕ (НА ПРИМЕРЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ КАЛЛУСОВ КОРНЕЙ ЛЮЦЕРНЫ)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "МОДЕЛИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АССОЦИАЦИИ КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ — БОБОВОЕ РАСТЕНИЕ (НА ПРИМЕРЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ КАЛЛУСОВ КОРНЕЙ ЛЮЦЕРНЫ)"

министерство СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

МОДЕЛИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АССОЦИАЦИИ КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ — БОБОВОЕ РАСТЕНИЕ (НА ПРИМЕРЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ КАЛЛУСОВ КОРНЕЙ ЛЮЦЕРНЫ)

На правах рукописи

МАМЕДОВ КУРБАН ЮСИФ ОГЛЫ

(Специальность 03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1979

/ &

Работа выполнена в Азербайджанском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте хлопководства.

Научные руководители — доктор биологических наук профессор В. К. Шнльннкова, кандидат биологических наук Г, Ф. ХаЙлова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Б. А. Ягодин, кандидат биологических наук Б. И. Голод.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, г. Ленинград. ^

Защита диссертации состоится ££> 1979 г.

в^£~час. на заседании Специализированного совета Krl20.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им, К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 47.

Сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан 1979 г.

Ученый секретарь '

Специализированного совета Кандидат биологических наук доцент

р. Г- Марьей

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для повышения симбиотической продуктивности бобовых растений необходимо знать закономерности и механизмы взаимодействия микро- и макросимбн-онтов с целью изыскания возможностей их регулирования. Такие закономерности удобнее изучать на упрощенных модельных системах {изолированных корнях с клубеньками или культурах растительных тканей, инфицированных клубеньковыми бактериями).

Модели позволяют избежать многих трудностей, встречаю, щнхся при работе с симбиотической системой in vivo. Они дают возможность выращивать клетки в стандартных одинаковых условиях в изолированных системах и на базе автономных исследований отдельных партнеров симбиоза при достаточно полном подтверждении натурным экспериментом решать сложнейшие вопросы всей системы бобово-ризобиальиого симбиоза в целом, п частности, связанные с познанием инфекционного вопроса. Модельные системы позволяют глубже понять характер взаимодействия составляющих системы, установить влияние на них исследуемых факторов и дают материал для рационального прогнозирования наиболее эффективных симбиозов.

Переход к системам меньшего масштаба ведет к необходимости выявления условий, при которых тождественны натурные и модельные ассоциации. Эти обстоятельства к выдвигают на первый план требования, связанные не только с созданием моделей, но и значительным расширением круга решаемых с помощью таких методов задач, обогащением арсенала . методов исследования сим биотических систем новыми экспериментальными* и теоретическими подходами. Длятого, чтобы метод моделирования был удобен для применения в практике, необходима унификация условий выращивания, которая может быть отработана лишь при всестороннем исследовании отдельных моделей в каждом конкретном случае, т. е. почти для всех групп известных нам бобово-ризобиальных симбиозов.

Цель-и задачи исследований. Цель работы —получение

У .. i i

..чг ИГ, Г * Тт.:'. :""*, I

имитационной модели бобово-рнзобйального симбиоза на штаммовой культуре тканей корней люцерны при бактеризации ее соответствующей быстрорастущей культурой клубеньковых бартернй. В случае отработки условий ставились задачи—методами световой, в частности, люминесцентной, а также электронной сканирующей и электронной трансмиссионной микроскопии в сочетании с обычными методами микробиологических исследований изучить процессы локализации, приживаемости, расселения и внедрения клубеньковых бактерий в каллусной культуре растения-хозяина.

Научная новизна. Впервые получена модельная ассоциация бобово-ризобнального симбиоза на штаммовой культуре кал-лусных тканей корней люцерны при инфицировании ее Rh. meliloti. Первые попытки пол учить-модельные азотфикси-рующне системы на изолированных корнях были предприняты в 30—50-е годы (Lewis, McCoy, 1933; McGonagle, 1944;. Raggio et al., 1957), первая успешная попытка, завершившаяся созданием системы культуры ткани, была.осуществлена Хол-стеном с со а вт; (Holsten et al., 1971). С тех пор во многих лабораториях мира были получены симбиотнческие азотфиксн-рующне ассоциации, однако в основном с'медленнорастущими клубеньковыми бактериями.

Разработан режим культивирования эффективной ассоциации штаммовой; культуры тканей корней'Medicago sativa АзННХИ-262 с Rh. meliloti. Впервые разносторонне с использованием разнообразных методов микроскопии прослежены расселсниенлокализаиия клубеньковых бактерии на поверхности растительных клеток в динамике. Создание высокоэффективной (по нитрогеназной активности) имитационной системы бобово-ризобнального симбиоза, завершившейся актом внедрения ризобий в цитоплазму клеток каллуса, позволило решить ряд вопросов, связанных с выяснением' характера взаимосвязей макро- н мнкроснмбионтов и высказаться в пользу существования паразитической стадии, предшествующей стадии, установления снмбнотнческих взаимосвязей в бобово-ризобиальном симбиозе.

Практическая ценность. Симбиоз с быстрорастущими культурами был. получек только в работах Pao (Rao, 1974) с Rh.: legummosarum на культуре тканей гороха, Н. М. Шемаха новой, Г. Л. БонарцевоЙ (1977) на культуре тканей донника при инфицировании.его Rhizobium meliloti.. Штаммовая культура тканей вследствие того, что состоит из более однородных популяций клеток, может служить надежной экспериментальной моделью для решения разнообразных теоретических вопросов бобово-ризобнального симбиоза, поскольку методы имитационного моделирования дают возможность, во-первых, установить состав веществ, необходимых для обеспечения функцно-

п '

ннрования ннтрогеиазы, которые в условиях in vivo поступают в систему нэ надземных органов; во-вторых, обеспечить стационарные условия для проявления активности питрогеназы, например, за счет постоянного снабжения системы источниками энергии (сахарами); в-третьнх, выяснить влияние гормо- , налытых веществ на создание и функционирование снмбноти-ческой азотфикснрующей системы;

Апробация работы. Результаты работы докладывались на заседаниях кафедры микробиологии ТСХА, лаборатории био--химии микроэлементов ИФР АН СССР, научных конференциях молодых ученых ТСХА (1977, 1978), на республиканской конференции «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур» (г. Каунас, 1978). Статья «Симбнотическая ассоциация каллусов корней люцерны с Uhizobium meliloti получила III премию на конкурсе «Лучшая работа 1977 тл ИФР АН СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи.

Объем работы. Диссертация состоит из 126 стр. машинописного текста, 17 табл., 24 рис. Список литературы содержит 222 наименования, из них 154 на языках иностранных авторов.

Автор выражает искреннюю признательность зав. кафедрой микробиологии ТСХА профессору В. Т, Емцеву за предоставление возможности выполнять микробиологические исследования на кафедре микробиологии ТСХА, зав. лабораторией биохимии микроэлементов ИФР АН СССР, доктору биологических наук Г. Я. Жизневскон за предоставление возможности вести исследования с культурами тканей и всем сотрудникам кафедры п лаборатории, способствовавшим выполнению данной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований — штаммовые культуры тканей корней люцерны Medicago sativa сорт АзНИХИ-262 и клубеньковые бактерии люцерны- Rhizobium meliloti (8 штаммов). Штаммы 87 н 441 получены из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Пушкин — Ленннград), штаммы ЛЗ, Л4 и Л6 — вирулентные, штаммы Л1, Л2 и Л5 —слабовирулентные, выделены из клубеньков люцерны сорта АзНИХИ-262 в хлопково-люцерновом севообороте опытных полей НИИ хлопководства на светло-каштановой почве Азербайджана. Проверку клубеньковых бактерий люцерны на вирулентность осуществляли в лабораторных стерильных опытах на агарнзованной среде С. А, Ковровцевой (1933), а также в микровегетационных опытах на песке.

Для получения культуры тканей корней люцерны из семян их стерилизовали (ГЗиЬпап; 1949),проращивали.)! затем высевали в пробирки с агаризованной средой Ковровцевой; От первичных 4 см корней проростков на расстоянии^ 1,5—2 см от кончика в стерильном боксе, в капле I %-ного раствора аскорбиновой кислоты, стерилизованного через бактериальный фильтр (Сынпор ЧССР), вырезали по два 5 мм кусочка. Полученный эксплантат, состоявший только из зрелых клеток тканей корня, помещали на агариэованную среду В-5 (ОатЬо^

а!.. 1968) с комплексом витаминов по Стаба. На I л среды, кроме того, перед автоклавированием добавляли (в мг): 2,4-Д 4, кинетина 4, гидролизата казеина 100 и инозита 80; рН среды 6,0,

Эксплантаты выращивали в фитотроне Института физиологии растений ЛН СССР при 26X^1°, относительной влажности воздуха 70±1%, в темноте. Через 10 суток от интенсивно растущих на сегментах корней каллусов брали трансплантаты массой 25—50 мг и пересевали в среду с меньшим содержанием 2,4-Д, аденина п кинетина {2; 1 и 1,5 мг/л соответственно). Ткани пересевали каждые 21-е сутки, т. е. продолжительность каждого пассажа—последующего культивирования культуры каллусных тканей равнялась 21 суткам, О характере и интенсивности роста культуры тканей корней в течение пассажа судили по изменению ее сырого и сухого веса, изменению числа клеток в ней и соотношению живых и мертвых клеток

Культуры тканей корней ризобнями инфицировали на 10— 12-е сутки. С целью активизация нитрогеназной активности ризобий ткань через 5—7 суток совместного культивирования переносили на «обедненную» среду (рН 6,0), содержавшую 20% связанного азота (в форме (КН^)2504) от его количества в основной среде и не содержавшую 2,4-Д и кинетин. На этой среде ткань инкубировали в течение одних или четырех суток.

Ацетиленвосстанавливающую активность ассоциаций на обедненной среде определяли на разных образцах. Образовавшийся в течение 24 час. этилен определяли на газовом хроматографе Хром-4 (ЧССР) при условиях: колонка 120x0,3 см3 наполнена окисью алюминия, пропитанной щелочью: температура колонкн 40°, детектор пламенно-ионизационный; газ-носитель — аргон; расход водорода — 30, аргона — 38 мл/мин,, воздуха — 0,5 л/мин. В каждом опыте использовали по 7— 10 проб. Для определения нитрогеназной активности применяли газовую смесь состава (в %): аргон — 70, кислород — 20, ацетилен— 10, углекислый газ — 0,03, Пробы (после заполнения смесью) поддерживали в термостате при 26—27°. В таких условиях ннтрогеназиая активность ризобий хорошо проявлялась. Если пробы оставляли на суткн при 18—20й, азотфнкса-4

ции не наблюдалось. Эндогенный этилен определяли в см№1 (в %); аргон 80, Ог 20 н СО^ 0.03.

При изучении процесса инфнцнровання культуры тканей люцерны клубеньковыми бактериями использовали методы светлопольной, частности люминесцентной, микроскопии, а также сканирующей электронной к трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии.

При определении содержания цитокннннов анализировали верхнюю часть корней (приблизительно на 1 см выше корневых кончиков и на несколько миллиметров ниже шейки корня), боковые корни и кончики корней 7- и 15-суточпых растений люцерны, не бактеризованных и бактеризованных культурой Г?Ь. теШоИ 441. Цитокининную активность определяли в куль-туральной жидкости 8 штаммов гпеШоН методом биотеста (Кулиева, 1973), способность штаммов рнзобнй енптеэн-. ропать соединения типа ауксинов — методом Р, X. Турецкой (19С0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика роста.каллусов и их морфологические особенности

Характер роста культуры тканей корней люцерны мало изменялся от пассажа к пассажу. Полученная культура каллус-них тканей корней люцерн!,1 имела следующие особенности роста. С момента пересева до в-го дня пассажа ткань находилась в лаг-фазе: деления клеток не происходило (увеличения числа клеток и массы культуры тканей не наблюдалось).

Интенсивное деление клеток в культуре тканей происходи* ло между 6—9 и 12—15-мн сутками; число клеток в эти периоды быстро увеличивалось. С 15-го дня число клеток увеличивалось медленно, а прирост сухой и сырой массы ткани шел интенсивно. Отсюда можно заключить, что с эюго дня большая доля клеток растительной ткани находится в фазе растяжения. После 17—18 дней роста культуры тканей усиливался процесс отмирания клеток (табл. 2). На 17-й день пассажа процент мертвых клеток составлял около 20% всей массы клеток культуры, на 21-й — около 30%. Такой характер роста ткани заставил нас не превышать продолжительность пассажа свыше 21 суток, так как это может привести к гибели культуры. Однако при пересевах на свежую питательную среду каждые 21-й день культура тканей характеризовалась довольно интенсивным ростом.

Ингибировалне каллусных тканей клетками клубеньковых бактерий it стимулирование клубеньковых бактерии каллусными культурами

Подбор доз ннокулюма. Важнейшим условием создания эффективной ассоциации ризобии— культура растительных тканей—является подбор оптимальной инфекционной нагрузки (число рнзобнн на 1 клетку культуры тканей корней люцерны п момент инфицирования), так как показано (Шлмшш с соавт., 1975; Юркова с соавт,, 1976; Шемаханова, Бонарцева, 1977), что инфицирование культуры тканей клубеньковыми бактериями ускоряет процесс отмирания ее клеток. Проверка подбираемой величины инфекционной нагрузки осуществлялась методом титра.

Симбпотическис азотфнксируюшие асшшаипн нам удалось получить только при уменьшении инфекционной^ нагрузки с 30—10 в среднем до 5—7 клеток прокариот на одну клетку эукариог.

Определение характера влияния разных доз инокулюма на _ каллускые ткани корней люцерны. Полученные культуры каллусных тканей корней люцерны имели рыхлую структуру, были белого цвета, слегка с кремовато-желтоватым оттенком. Незаряженные ткани оставались такими в продолжение всего пассажа. Ткани, зараженные ризобнямн (штаммы <441 и S7) при оптимальной инфекционной нагрузке, после 5—7 суток становились серо-корнчневатимп в верхней части. Процесс коричне-вення связывается (Phillips, 1974; Velicl;y, La Rue, 1967). с лиг-ннфнкацией клеток ткани при ннокулиннн ее ризобнямн. При внесении высоких доз ннокулюма (30—36 бактерий на одну растительную клетку) уже на 3—5-е сутки культуры каллус-ных тканей темнеют и покрываются слизистыми колониями клубеньковых бактерий. Развитие инокулнрованнон каллусной культуры происходит в условиях, резко отличных от стерильной культуры каллуешлх тканей. Здесь возникают взаимосвязи разных по уровню эволюции систем (прокариоты — эука-рноты), здесь возможно их взаимовлияние, выражающееся либо в равновесном взаимодействии, либо в усилении влияния одного компонента системы на другой. Имеющиеся » литературе данные об ингнбмровании растительной ткани рнзобня-ми (Шамцян с соавт., 1975; Шемаханова, Бонарцева, 1977), об усилении развития рпзобпй вокруг клеток культуры растительных тканей (Rao, Rao, 1976) и в присутствии метаболитов ткани (Лрутюнян с соавт., 1976), а также данные о необходимости высоких доз инокулюма для успешной нитрагннизацин растений (Калниньш, 1961; Дороснпский, 1970; Шатта, 1975) требуют расшифровки ряда моментов и при установлении эффективного симбиоза культуры тканей растения с ризобнямн.* 6

Б см:ш с этим и было предпринято изучение последовательных этапов развития ризобип поело инокуляиин ими культуры тканей корне» люцерны.

При снесении клубеньковых бактерий люцерны в культуру тканей их число начинает довольно быстро повышаться (табл. 1). На 3-н сутки после внсссння 5—7 клеток прокарнот на одну клетку эукарнот число рнзобнй составляет уже 70,4 клеток. Такая нагрузка практически не отражалась на-внешнем виде каллуса. На 5-е сутки число рнзобнй повышается до 2G2 бактерий на одну растительную клетку. Об усиленной «необычно высокой» пролиферации клеток рнзобнй фасоли при инокуляции изолированных корней фасоли на среде с сахарозой, особенно нитратами, сообщалось ранее (Ragpio et а)., 1957). Это ведет к изменению внешнего вида каллусов — они становятся серо-коричневым». В этот срок нам не удалось обнаружить ацетилен восстала вливающую активность у рнзобнй, инфицирующих растительную ткань, при перенесении культур на обедненную среду. На 7-е сутки на одну растительную клетку приходилось только по 83,1 клетки рнзобнй. Снижение числа клеток рнзобнй па поверхности растительной ткани можно объяснить их внедрением внутрь растительных клеток или их адсорбцией поверхностью ткани. Определение нитрогеиазной активности инфицированных культур тканей корней люцерны в этот срок дало четкие положительные результаты.

При внесении рнзобнй свыше 40 клеток на одну клетку культуры ткани на 3-й сутки совместного инкубирования.их число возрастало до 368,9. Растительные клетки при таком количестве бактерий-коричневели. На 5-е сутки численность рнзобий соетавляла'493,1 на одну растительную клетку, В этот срок вся поверхность культуры ткани была покрыта слизистыми массивными колониями клубеньковых бактерий. На 7-е сутки количество ризобнн при внесении больших доз иноку-люма превышало таковое при оптимальной инфекционной нагрузке почти в 5 раз (табл. 1). При этом азотфнксирующая ассоциация не создавалась; восстановления ацетилена не обнаруживалось.

После 10 суток инкубирования и до конца эксперимента (25 суток совместной культуры: возраст ткани — 35—37 суток) численность рнзобий стабилизировалась как в случае пониженных, так и повышенных доз ннокулюма. Очевидно, клубеньковые бактерии развивались за счет отмерших растительных клеток как сапрофиты, 10-е сутки совместной культуры тканей и ризобнн — это 20-е сутки пребывания ткани и пассаже, т. е. это—конец пассажа. К концу пассажа даже в неин-фнцпрованиой ткани интенсивно идет процесс отмирания ее клеток.

Таблица 1

Динамика развития ЙИ. теШоМ Л4 на культуре тканей корне А люцерны

Продолжительность совместного инкубирования рнзобий и культурм тканей Среднее числи риэо-Они на куль, туру тканн Среднее число ризобий па одну растительную клетку Среднее число ризобнй на культуру ткани Среднее число ризобий на одну растительную клетку

Исходная инокулиро-

вэнная культура

кзллусних тканей . 1,01 - 10' 6.3 1,23-10' 42,4

,3 суток ..... 2,04 ■ 10* 70,4 1,07-101 368.9

"5 суток...... 7,6 • 10* 262,0 1,43-10" 493.1

7 суток..... 2,45 * 10* 83,1 1,23* 10» 424,1

10 суток . .... 3,11 • 10» 107.2 9,7-10« 334,4

1Т) суток..... 8,1 - 10' 279,3 1,31 • 10® 401,7

¿0 суток ..... 8,6- 109 296.5 1,26* 10' 434,4

25 суток ..... 7.3 •10" 251,7 1,29-104 444.8

Внесение ризобнй в культуру каллусных тканей усиливает гибель растительных клеток (табл. 2). В культуре каллусных тканей к концу пассажа накапливается значительное количество мертвых клеток даже при нормальных условиях ее культивирования. В условиях нашего опыта к концу пассажа не инфицированная ризобнями ткань (контроль) лочтн на 30% состояла из мертвых клеток. Гибель ткани предотвращается регулярным ее пассированием. Пассирование тканей стимулирует их меристематическую активность. Начинается интенсивное деление клеток ткани, вследствие чего доля мертвых клеток, которые составляли значительную часть трансплантата .(хотя он и берется из наиболее молодых участков ткани), по мере увеличения числа клеток в нем уменьшается.

Таблица 2

Влияние ризобий на скорость отмирания клеток культуры тканей корней люцерны

Дни пассажа Количестпо клеток, в

контроль заражены ЙН.-шеШои штамм .44

жипие мертвые живые мертвые

Исходная культура . 67.3 32,7 —шш __

13 ...... . 8Г..0 14,4 69.1 30,9

15........ 82,1 17,9 54,1 45,9

17 ....... 80,7 19,3 40,8 54,2

П| 70,8 29.2 28,2 71.8

Минимальное содержание мертвых клеток (14,4%) было у 13-диевной культуры каллусных ткано», затем процент мертвых клеток в ткани увеличивался н на 21 -й день пассажа достигал 29,2%.

Бактеризация тканей ускоряла процесс отмирания клеток. Уже на 3-й день совместного культивирования (13-й деньпас-еэжа) мертвые клетки составляли 30,9% против 14,4% и контроле. На 17-й день пассажа (7-й день совместного культивирования, когда измерялась ннтрогеназная активность ри-зобнй) ткань наполовину состояла из мертвых клеток. На 21-й день (11-й день совместного культивирования ризобий н культуры тканей корней люцерны) ткань почти на 73% состояла из мертвых клеток. Увеличение числа клубеньковых бактерий с 5—7 до 30—30 клеток на одну клетку культуры каллусных тканей еще более усиливало процесс отмирания растительных клеток (табл. 3). Уже на 3-й день совместного культивирования более 70% растительных клеток отмирало. На 5-е сутки в парианте с увеличенной инфекционной нагрузкой наблюдалась гибель всех растительных клеток. Когда инфекционная нагрузка составляла 5—7 ризобий на одну растительную клетку, ткань погибала на 15-е сугкн совместного культивировангш, т" с. на 25—27-е сутки пребывания ее в пассаже. В этот период и неинфиинронаннад ткань состоит на 70—75% из мертвых клеток.

Таблица 3

Процент жи&ых и мертвых клеток в зквнеймости от инфекционной нагрузки иа одну клетку каллуса корней люцерны

Прол"лж!1тс.-ьноеп. совместного ипкуЛк-ровзшш ризобнЛ II культуры ТКШК'Й Внесено 5—7 клеток ризобий Внесено 30—36 клеток ризобий

живые каллу си и о клетки мертвые каллусные клетки живые кал-лусные клетки мертвые кзллусныс клетки

3 суток..... 71.2 28,8 од п 70,8

Я суток ..... 59.-1 • 40,6 — 100

7 суток ..... -15,8 54,2 — —

10 суток ..... 29,1 70,9 — —

15 суток..... 100

Высокий процент мертвых клеток в культурах тканей корней люцерны при их инфицировании не позволяет рассматривать сформировавшуюся в условиях нашего опыта азотфик-сирующую ассоциацию категорично, как спмбнотическую. Наряду с установлением симбногических отношений (о чем свидетельствует проявление питрогеназной активности ризобий,

инфицирующих растительную ткань) между двумя партнера-минаблюдались и явные признаки паразитизма п поведении рнзобнй, Признаки паразитизма у клубеньковых бактерий наблюдаются и о природе на первых стадиях инфицирования ими растения-хозяина (Гойман, 1954; Шилышкова с соавт., 1969). Безусловно, а условиях нашего опыта эти особенности клубеньковых бактерий проявились сильнее. Этот факт говорит о том, что в наших опытах не были созданы псе необходимые предпосылки для возникновения истинно симбиотнческнх взаимоотношений макро- и' мнкропартнеров.

Локализация, цнтокининов в корневой системе ннокулнрованных растений люцерны ;

В корнях бобовых растений, особенно тюкулированных ризобиями, повышено содержание ауксиноподобных веществ, что, по мнению M. X, Чайлахяна; Н, Л-Каладжяна .(1970), имеет значение для установления высокоактивной симбиотической ассоциации. Очевидно, высокий уровень ауксинов в зоне активного инфицирования (верхняя и средняя часть корня в первые сроки инокуляции) определяет растяжение клеток растення-хоэяина и способствует процессу внедрения клеток ризобмй в ткань корня. Вместе с тем известно (Phillips, 1970; Ошкая с соавт., 1973; Зикманис,-1975), что и цитокпннны, синтезируемые клубенькооимн бактериям«, играют важную роль в пролиферации клубенькопой ткани.

Однако,.если ауксины способствуют процессу внедрения ркзобнй в корень (Шнлышкона, Та rues, 1963), то цптоккшшьг основную роль, очевидно, выполняют уже в процессе формирования клубеньков. Эти положения характеризуют бобово-рн-зобиальный симбиоз în vivó. Вместе с тем наблюдения, проведенные с модельными симбиотнческнми азотфнкенруюишми системами, демонстрируют необходимость исключения из среди кииетина для проявления нитрогеназной активности рпзо-бнй (Holsten et al.,. 1971; Child, La Rue, 1974; Phillips, 1974).

Все исследованные культуры клубеньковых бактерий люцерны, независимо от степени их вирулентности, продуцируют ауксины, но интенсивность их образования различна. Среди вирулентных штаммов обнаружен наиболее активный продуцент ауксинов (Лб) и культуры со средней активностью (ЛЗ, Л4); среди слабовнрулентных— активные продуценты ауксн-поа (Л2, Л5) и шгам,чьг, обладающие этой способностью в наименьшей степени—J11.

Способность продуцировать цитокпннны у рнзобпй люцерны не коррелирует с вирулентностью. Так, среди слабовнрулентных культур встречаются штаммы с наибольшей (Л5) и наименьшей (Л2) кшшшюи а кт и п костями. В случае небакто -10

рнзопанпых 7-суточных растений содержание цптокннинов наиболее аысоко*в апикальной части корня. При бактеризации уровень цнтокннино» у проростков этого возраста снижается, что, очевидно, связано с усиленным выделением корневой системой растений не только корневых выделений, стимулирующих размножение клубеньковых бактерий, но и ингибиторов процесса инфицирования (Ranga Raoet al., 1973; Шнльннкова с соавт., I97i>), особенно а зоне апекса (Egeraat van, 1971). Не исключено, что метаболизм цнтокиннноп м.ингибиторов каким-то образом взаимосвязан и, возможно, взаимозависим.

Поскольку синтез цитокшшнов в корневой системе бактеризованных растений снижается в период, предшествующий внедрению клубеньковых бактерий в ткань корня, это может быть связано с усилением продукции корпе.м ингибиторов процесса инфицирования в этот период. Очевидно, в модельной системе каллусов могут происходить подобные явления, что и требует исключения из состава среды иитокининов. Локализация цитокннннов в корневой системе бактеризованных растений 7- и 15-суточного возраста подтверждает ранее установленные явления зональности и ярусности действия клубеньковых бактерий в процессе инфицирования растения-хозяина.

Установление симбиотических взаимоотношений клубеньковых бактерий с каллусами корней люцерны;

Ннтрогеназную активность рнзобнн, инфицирующие куль, туру каллусных тканей корней люцерны, проявляли только и случае, если заражалась ткань, растущая в пассаже и течение 10—12 дней. При всех сроках заражения в течение 7-ми дней ннфнинрованная ткань содержалась на основной среде, затем на сутки переносилась на обедненную среду (стр.

Ни с одним из испытанных штаммов (табл. 4) не возникала азотфнкенруюшая асоциация, если инфицировалась ткань, растущая в пассаже в течение 7-ми дней. При заражении ткани на 10-й или 12-й день штамм 87 был более эффективен по сравнению с другими штаммами. '

Таблица.4

Зависимость образования азотфиксируюших ассоциаций , от возраста ткани в пассаже

Образование CaHi, нмолсЛ/г сухого вещества/час

Возраст ткачи (сутки)

шгамм 87

taran« 441

штамм Л1

7 10 12

0

78.3 ¿11,7 78,2 i 15,3

0

41.4^11,1

36,3Ü2,3

0

34.22:7,8 38,6^6.3

П

Н; М. Шемаханова к Г, Л. Бонарцева (1977) установили, что и культуре ткани донника наиболее эффективная ассоциация достигается при заражении ее в 2-неделыюм возрасте по сравнению с аналогичным вариантом заражения 4-недель-ной культуры. В наших опытах, однако, такая азотфикснрую-щая активность проявлялась только в случае, если инфицированные ткани переносили на обедненную среду и содержали их на ней не менее суток.

Увеличение продолжительности инкубации ассоциаций на обедненной питательной среде с 1 до 4-х суток почти в 2 раза усиливало их а цетиленвосста на вливающую активность (табл. 5). Как уже говорилось, в условиях нашего опыта нит-рогеназная активность ризобнй проявлялась только, если нп-фицированные-имн растительные ткани какой-то срок (по

Таблица 5

Влияние продолжительности инкубации ассоциации ма оОедненно» среде на витрогеназную активность 87, и молей/г сухого вешества/час

По вто рн ость 24 часа инкубации 06 часов инкубашш

• 1 84,5 f 60.0

О 76,6 124 ÍJ

3 62.8 —

4 90,3 —■

крайней мере сутки) инкубировались на среде с небольшим количеством азота и без стимуляторов роста, В подавляющем большинстве работ (Phillips, 1974; Child. La Rue, 1974; Rao, Rao, 1976 и другие) азотфиксирующие асоциации между клубеньковыми: бактериями и культурой растительных тканей (или клеток) образуются только при соблюдении этих двух условий; 1) снижения содержания связанного азота в питательной среде (или полном его исключении — Phillips, 1974), 2) исключении из нее ростовых веществ (Child, La Rue, 1974; Phillips, 1974). Необходимость соблюдения таких условий легко объяснить, исходя из современных представлении об условиях образования эффективного симбиоза между ризобнями и бобовым растением. Известно, что наличие связанного азота в питательной среде подавляет образование снмбиотнческой системы, приводит к деструкции ранее создавшейся системы в условиях in vjvo. Известно также, что в условиях in vivo нитрогеназную активность ризобии проявляют только в тех клетках клубенька, которые уже закончили свой рост, т. е. в таких клетках, где почти нет ростовых веществ.

Однако в литературе имеются сообщения о создании сим-12

биотических азотфиксирующих ассоциации, когда не соблюдалось какое-нибудь одно или оба из упомянутых условий (Holsten et al., 1971; Юркова с солвт., 1976; Шемаханова, Бо-нарцева, 1977). Объяснить такие факты пока затруднительно.

Известно, что при длительном непрерывном культивировании (обеспечивающемся регулярным пересевом тканевых трансплантатов на свежую питательную среду) ткань часто теряет некоторые свойства (например, способность к биосинтезу вторичных веществ, которой ткань обладала в момент введения ее в культуру). В этой связи представляло интерес проверить полученную нами культуру каллусных тканей корней люцерны на способностью образовывать азотфикснрую-щие ассоциации с рнзобнями при поддержании ее в длительной непрерывной культуре.

Первые азотфнксируюшие ассоциации клубеньковых бактерий люцерны мы получали на тканях корней люцерны, только что введенных в культуру (ткани,.растущие в 1-м пассаже). Это, естественно, были ткани, полученные от каллусов, возникших на разных эксплантатах. В этот период ог одной наиболее интенсивно растущей культуры нами была получена штаммо-вая культура каллусных тканей корней люцерны. Все последующие опыты по получению азотфиксирующих ассоциаций проведены со штаммовой культурой тканей корней люцерны.

Как видно из табл. 6, на протяжении длительного отрезка времени ткань (при соответствующих условиях питания) способствовала проявлению нитрогеназной активности рнзобнн. Следует отметить, что ацетиленвосстанавливающая активность ассоциаций, находящихся в течение различного срока в непрерывной культуре, практически оставалась на одном уровне. Таким образом, культура каллусных тканей корней люцерны, полученная нами, сохранила свою способность стимулировать проявление нитрогеназной активности у соответствующего вида клубеньковых бактерий.

Таблица 6

Лзотфнкснруюшая способность ассоциаций Rh. mellloti 87 с кадлусными культурами в различных пассажах

№ пассажа HMo.ieft/CiH«/r сухого вещества/час средние данные опытов

t 78.3*11,7

6 71,062: 9,4

8 63,9 i 9,4

12 78,2 й 15,3

Лзотфикснруюшие ассоциации между клубеньковыми бактериями люнерны всех трех штаммов (87, 441 и Л4) и культу-

рой тканей корней люцерны образовывались почти в 100% случаев бактеризации - тканей. В этом отношении данные табл. 7 типичны.

Таблица 7

Нктрогеназная активность (С2НЧ, нмолей/г сухого ветсства/чзс) Rh. melitotl в ассоциациис культурой ткани корней люцерны

Повтормость опыта Культуры тканей 6-го пассажа Культуры ткал с Л 12-го пассажа

штамм 87 штамм 441 штамм 87. штамм Л1

i 84.6 32,2 85,1 39.1

2 82.3 40,7 73,9 41,6

3 55,7 67,3 109,5 39.4

4 79,2 30,5 99,4 25.5

5 85,2 34,8 18.4 51,8

6 88.1 39.2 66,9 42.6

7 40,4 ■ 28,0 78,7 £3.7

8 87,4 61,7 76,4' . С 6,4

9 "79,1 31,4 85,4 —

10 63,6 42,2 86,4 —

В среднем 74,06—9,3 4 0,8 S 9,7 78,2 i 15,3 33.6 ±6.3

Культура изолированных.тканей растений способна продуцировать этилен (Gamborg, La Rue, 1971). В отличие от этилена, образующегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, он назван эндогенным этиленом. Способность продуцировать этилен у тканей разных растений и в разные фазы их роста в пассаже различна. Принимая во внимание такую способность тканей, во всех опытах перед определением нитрогеназной активности устанавливалось содержание эндогенного этилена в сосудах с тканями, инфицированными и не инфицированными ризобнями, а также его содержание в среде. Ни в одном случае в условиях нашего опыта эндогенный этилен не образовывался.

Приживаемость клубеньковых бактерий в ткани каллуса корней люцерны

В литературе имеется ряд сообщений, когда авторам {Holsten et al., 1971; Rao, Rao, 197G) удалось наблюдать проникновение pu зоб и il внутрь растительной клетки о условиях модельных: ассоциаций. В других случаях сообщается, что азотфнксируюшую активность проявляют свободножнвушне риэобни, находящиеся на поверхности растительных клеток. Причем большую долю составляют ризобнн в бактерондной форме (Шемаханова, Бонариевз, 1977).

В это» связи было интересно проследить поведение.бакте-рпй при формировании а зотфнксируюшейсим биотической ассоциации в условиях нашего эксперимента. Проводились микроскопические наблюдения, начиная с 3-го дня инкубации ризобнй и растительных тканей. Наблюдения под световым микроскопом на 3-й сутки совместного инкубирования показали, что бактерии, активно размножающиеся в этот период, сосредотачиваются вблизи растительных клеток. При сканировании в это же время установлено, что одиночные бактерии находятся и на самой поверхности каллусных клеток. Нередко, особенно в кратеровидных углублениях поверхности растительных клеток, наблюдалось формирование .колоний клубеньковых бактерий. Популяции составляли рнзобин палочковидной формы. Размер палочек был различен. На 5-е сутки на поверхности каллусных клеток видны более крупные колонии ризобнй. Характер* расположения колонии на поверхности каллусной клетки весьма своеобразен: в некоторых местах они приподнимаются над поверхностью оболочки клеткн-хозянна и состоят из ризобнй, расположенных как бы в несколько слоев и склеенных слизыо. В других участках бактерии располагаются монослоем на поверхности клеточной стенкн каллусной клетки, но, так же как в первом случае, покрыты слизью.

В момент проявления нитрогеназной активности у ризобий, находящихся в ассоциации с клетками каллусных тканей корней люцерны, наблюдались случаи внедрения бактерий в растительные клетки (7-й день совместного инкубирования растительных и бактериальных клеток). Однако нам не удалось наблюдать переход ризобий в бактерондную форму. Они сохранили палочковидную форму.

Выводы

1. Получена модельная ассоциация бобово-ризобналыюго симбиоза на штаммоной каллусной культуре корней люцерны при инфицировании ее Rhizobium meliloti. Пользуясь выравненной ио скорости роста штаммовой культурой, удалось получать надежную экспериментальную модель для изучения взаимосвязей бобового растения с клубеньковыми бактериями.

2. Отработан режим для получения эффективной имитационной ассоциации штаммовая культура каллусных тканей — быстрорастущие клубеньковые бактерии (на примере инфицированных клетками Rhizohium meliloti каллусных тканей корней люнерны MetHcago sativa ЛзНИХИ-262).

3. Получены ростовые характеристики штаммовой культуры каллусных тканей корней люцерны: выявлен наиболее благоприятный срок инфицирования каллусов клубеньковыми

бактериями; подобрана оптимальная инфекционная нагрузка клубеньковых бактерий — 5—7 клеток ризобий на 1 клетку каллуса корней люцерны; подтверждено, что ннкубированне ассоциаций на среде, содержащей небольшое количество азота и без 2,4-Д и кинетина, способствует лучшему проявлению нитрогеиазной активности ассоциаций.

4. Установление ассоциативных взаимоотношений между клубеньковыми бактериями и клетками: культуры,каллусных тканей корней люцерны, оцениваемое по критерию нитрогеиазной активности, сопровождалось усилением процесса отмира-иия растительных клеток в период наивысшей инфекционной нагрузки и расселением активно размножающихся клубеньковых бактерий на поверхности клеток культуры каллусных тканей корней люцерны в первый период после инфицирования.

5. С помощью люминесцентной, световой и сканирующей электронной микроскопии прослежены расселение н локализация клубеньковых бактерий на поверхности клеток культуры тканей корней люцерны в динамике. Методом электронной трансмиссионной микроскопии установлен акт внедрения клубеньковых бактерий люцерны в клетки культуры тканей ее корней. Внутри растительных клеток бактерии обнаруживались на 7-й день инфицирования тканей растения-хозяина.

6; Нитрогеназная активность модельных систем усиливалась при увеличении сроков инкубации ассоциаций (с I до 4-х суток) на среде без стимуляторов роста, содержащей небольшое количество азота,

7, Содержание цнтокинннов в 7- и 15-суточных проростках люцерны, бактеризованных активным 'и вирулентным 441-штаммом клубеньковых бактерий люцерны, меняется в завися мости.от возраста растения и зоны корня. В период, предшествующий внедрению клубеньковых бактерии в ткань корня, синтез цитокининов в корневой системе снижается, что, очевидно, связано с усилением продукции корнем ингибиторов процесса инфицирования в это время.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Хайлова Г. Ф„ Мамедов К. Ю., Шнльникова В. К., Ильясова В. Б. «Симбиотнческая ассоциация каллусов корней люцерны с ИЫгоЫит теШои». Изв. ТСХЛ, 1977, № А, 18—22.

2. Мамедов К. Ю„ Марьснко В. Г., Шнльникова В; К. «Локализация цнтокинннов в корневой системе ипокулированной люцерны». Изв. ТСХА 1978,.ЛЬ 2, 21—24.

3. Мамедов К. Ю., Хайлова Г. Ф., Шнльникова В. К. «Выявление характера взаимосвязей ассоциации каллусов корней люцерны с 1?Ы2оЫит те)Мои». В сб.: Микробиологические

процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур. Вильнюс, 1978 г., 214.

4. Шильннкова В. К., Мамеяов К. Ю„ Хайлова Г. Ф. «Приживаемость НЫгоЫит теШоН в каллусных тканях корней люцерны». Изв. АН СССР, сер. Онол., 1978, № 5, 778—780.

Л 70301 3/1—ГЭ Г.

Объем I'Д п, л. Заказ 2187. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К, Л. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул.. 44