Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ ЛЮЦЕРНЫ И СОИ, ПОКАЗАТЕЛИ ИХ ВИРУЛЕНТНОСТИ, СОЛЕУСТОЙЧИВОСТЬ RHIZOBIUM MELILOTI

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ ЛЮЦЕРНЫ И СОИ, ПОКАЗАТЕЛИ ИХ ВИРУЛЕНТНОСТИ, СОЛЕУСТОЙЧИВОСТЬ RHIZOBIUM MELILOTI"



МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи КАМАР Раза Раме

УДК 576.851,155 : 633.31 +633;34

КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ ЛЮЦЕРНЫ И СОИ, ПОКАЗАТЕЛИ ИХ ВИРУЛЕНТНОСТИ, СОЛЕУСТОЙЧИВОСТЬ кшговшм МЕЫДОП

(специальность 03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1985

/¿¿¿/¿г- \г6

Диссертационная работа выполнена в Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

• Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Шильникова В. К.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Умаров М. 'М.; кандидат биологических наук Романов В. И. Ведущее предприятие—ВНИИ с.-х. микробиологии, Ленин-

Защита состоится 1985 г.

в.-7® —- час. на заседании Специализированного совета К-120.35.01 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва И-550, ул. Тимирязевская, д. 49, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « ё » г.

Ученый секретарь *

Специализированного совета— 'ргО^"

доцент /7^// Н. А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В целях использования дешевого биологического азота в настоящее время во Многих странах наблюдается тенденция увеличения посевных площадей бобовых культур; большое внимание уделяется практике применения бактериальных удобрений. В Пакистане среди зернобобовых культур люцерна и соя занимают особое место, как повсеместно распространенную и в большинстве областей страны культивируемые дважды в год. Однако, несмотря на большое значение этих культур, их урожайность невысока. Агротехнический прием инокуляции бобовых растений клубеньковыми бактериями достаточного распространения в земледелии Пакистана не получил, хотя о значении биологического азота в стране известно давно.

В связи с большой ролью биологического азота в земледелии Пакистана, а также его высокой экономичностью, важно как можно полнее изучить особенности наиболее распространенных в стране видов клубеньковых бактерий, (люцерны, сои, клевера), поскольку полноценное их использование в сельскохозяйственном производстве зависит от понимания их взаимоотношений с растением-хозяином;

Важной задачей пакистанских агрономов и почвоведов является также использование засоленных и кислых земель, площади которых ежегодно растут. В последнее время все больше внимания в стране уделяется вопросам агротехнических приемов улучшения этих почв и попыткам нахождения устойчивых культур к таким условиям. Нейтрализация кислых почв путем гипсования проводится для выращивания риса и пшеницы, кормовые же бобовые культуры, такие как соя, люцерна; и клевер, как оказалось, тоже дают хорошие результаты на засоленных почвах и симбиотическая азотфик-сация при этом не прекращается.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы было найти показатели вирулентности клубеньковых бактерий люцерны и сои и оценить отношение этих культур к засолению. В задачи нтрчпиания входило: ......

ЦЕНТРАЛЬНАЯ ,

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА -

Mort. со^сксхоз. академии ►'М. К. А. Тимирязоед

_Инп. К'ГЧ^Г¿.2.0SH

— выяснить характер инфицирования растении люцерны при бактеризации высоковирулентными и слабовирулентными штаммами клубеньковых бактерий,

— выявить возможную зависимость между «прямым» показателем вирулентности — сроком появления первого клубенька с количеством инфицированных, специфически искривленных корневых волосков на корнях инокулированных растении люцерны на первых этапах инфицирования, а также с реакцией штаммов на антибиотики и с их каталазной активностью,

— определить оптимальную дозу' инокулюма («запас инфицирующего .начала», «инфекционную нагрузку») для формирования эффективных клубеньков на корнях растения-хозяина,

— изучить влияние разных концентраций NaCl на кубень-ковые бактерии в чистой культуре и в условиях симбиоза.

Научная новизна. Впервые изучен характер инфицирования растений люцерны при бактеризации разными по степени вирулентности штаммами клубеньковых бактерий на первых этапах инфицирования с целью выявления возможности корреляции, прямого показателя вирулентности с косвенными. .Установлено отсутствие связи степени вирулентности штаммов клубеньковых бактерий люцерны с их реакцией на низин, олететрин, грамицидин и полимиксины. Выявлена тенденция повышения каталазной активности у более вирулентных культур клубеньковых бактерий. Подтверждена солеустойчи-вость клубеньковых бактерий люцерны как вида (Subba Rao, 1974). Впервые при изучении действия хлористого натрия на клубеньковые бактерии разной степени вирулентности на плотных средах (в отличие от ранее применяющихся суспензионных культур) показано, что скорость их пролиферации в присутствии 1—2% соли снижается, а в присутствии 3% наблюдается длительный лаг-период адаптации к соли. Солевой стресс не влияет на вирулентность клубеньковых бактерий и установление с растением-хозяином эффективных симбиотических отношений.

Практическая ценность. Наивысшая скорость образования клубеньков на корнях растений люцерны проявлялась в мае-июне. В опытах, проводимых, в марте и октябре-ноябре с одним и тем же штаммом клубеньковых бактерий, процесс инфицирования задерживался на 5—7 суток. Выявленную зависимость процеса инфицирования растения-хозяина, от сезонности года следует учитывать при отборе штаммов клубеньковых бактерий для производства при оценке степени их вирулентности. . .

Обнаруженная тенденция повышения уровня каталазной активности у высоковирулентных клубеньковых бактерий люцерны может в случае распространения данного явления на разные виды клубеньковых бактерий иметь практический выход, служа дополнительным косвенным критерием вирулентности. Эта закономерность дает новую информацию при разработке одной из важных проблем — эволюции симбиоза (Парийская, Клевенская, 1979; Жизневская с соавт., 1979). С одной стороны, генетические детерминанты клубеньковых бактерий как сапрофитов и экзогенных возбудителей инфекционного процесса могут выступать при взаимодействии с растением-хозяином, а с другой стороны, изменения метаболизма микросимбионта (повышение каталазной активности), по-видимому, закреплялись генетически под влиянием растения-хозяина в ходе сопряженной эволюции симбиоза.

Результаты изучения отношения клубеньковых бактерий люцерны к хлористому натрию позволяют надеяться на возможность создания эффективного симбиоза с инокулирован-ными растениями люцерны в условиях хлоридного засоления почв Пакистана.-

Апробация работы. Результаты работы были доложены на научной конференции ТСХА в июне 1985 г., на VII съезде Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985 г., объединенном заседании кафедр микробиологии и агрономической и биологической химии ТСХА в 1985 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

Структура и-объем работы.. Работа состоит из введения, четырех глав и выводов. Текст диссертации изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы н 13 рисунков. Список литературы включает 182 наименования, в том числе иностранных 95. Во введении показано значение биологического азота в современном сельском хозяйстве, в частности в земледелии Пакистана, обоснована актуальность темы. В главе I дан анализ современного состояния проблемы биологической азотфиксации и путей ее повышения. Особое внимание уделяется характеристике свойств клубеньковых бактерий, в частности, природе их вирулентности и соле-устойчивости. В главе II излагаются объекты и методы, в главах Ш и IV — резулъаты исследовании.

Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту раздела диссертации по солеустойчивости клубеньковых бактерий кандидату биологических наук Г. Ф. Хай-ловой за ценные советы и помощь при выполнении данной работы. •

!

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследования

Исследования проводили в лабораторных, микровегетационных и полевых условиях на кафедре микробиологии ТСХЛ, лаборатории солевого обмена и солеустойчивости Института физиологии растений АН СССР и Опытной станции полеводства и льнонодства ТСХА. Использовали штаммы КЫгоЫит теШоН и №. з'аротсшп, полученные из коллекции культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, Ленинград, а также выделенные из люцерны АзНИХИ-10 и АзНИХИ-262 (Тагиев, 1966).

Проверку клубеньковых бактерий люцерны на вирулентность осуществляли в лабораторных стерильных опытах на агаризованной среде С. А. Ковровцевой (1933). Семена растений стерилизовали по Натману (<Ми1тап, 1949); Для изучения устойчивости клубеньковых бактерий люцерны к антибиотикам использовали грамицидин «С», низин, полимиксин «М», полимиксин «Б» (получены на кафедре антибиотиков биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова) и олететрин (аптечный препарат). Штаммы высевали на чашки штриховым методом. Растворяли по 10 мг антибиотика в 10-мл" дистллиро-ванной воды или в спирте и эту суспензию добавляли к 200 мл среды, стерилизовали 30 мин. при давлении 0,5 атм и разливали по чашкам. Каталазную активность клубеньковых бактерий определяли на газометре по выделению Ог (Галстян, 1966).

При изучении процесса инфицирования (опыты проводили при 23°С, влажности 70%, длине светового дня 10 час., освещении ксеноновыми лампами) в течение 15 дней ежедневно вели наблюдения за корневой системой инокулнрованных растении люцерны. Корни просматривали под световым микроскопом по всей длине участками по 3 мм, подсчитывали на каждом участке общее количество корневых волосков, число искривленных волосков, число специфически искривленных и корневые волоски с инфекционными нитями. В полевом опыте с растениями сои, сорт Северная 5, проводили фенологические наблюдения, биометрический анализ, определяли содержание леггемоглобина в клубеньках по Федорову (1948), активность нитратредуктазы ацетиленовым методом, содержание азота в растениях микрометодом Кьельдаля. Данные полевого опыта подвергали статистической обработке (Доспехов, 1968).

При изучении влияния №С1 клубеньковые бактерии люцерны выращивали в чашках Петри на ПИМТЕЛ(,НС<Ч. НГЛрС.

С САХАРОЗОЙ, содержащем 0,25, 0,50; 1,0; 2,0 и 3,0% соли." Контроль — среда без соли. Подсчет числа проросших клеток ризобий (число колоний) и измерение диаметра колоний проводили ежедневно до остановки роста. Диаметр колоний из-.'" меряли гибкой линейкой через крышку чашки Петри,с по-», мощью лупы Зх. В каждом варианте измерено 90—150 колоний. Последействие соли на способность штаммов клубеньковых бактерий-образовывать клубеньки изучали, выращивая растения в условиях асептики в пробирках с агаризован-ной безазотной средой Ли (Lie, 1969) в течение 4-х недель при 25°С, относительной влажности воздуха 70%, освещенности 12—14 тыс. лк.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

*

Выявление дозы инокулюма как возможного косвенного показателя вирулентности клубеньковых бактерий

У 10-ти штаммов клубеньковых бактерий люцерны выявляли разные дозы < инокулюма, или разный «запас инфицирующего начала», или разные дозы «инфекционной нагрузки», необходимые для осуществления заражаемости растения-хозяина. Проростки люцерны инокулировали на 3 сутки после посева. Если, количество клеток (например, штамм 20в в 1 мл содержал 0,003 тыс. клетки,- а штамм 2а 0,002 тыс.) было ниже 0,005, тыс/мл, в колбу вносили не 1 мл, а 2 или 3, чтобы приравнять численность инокулюма (табл. 1). Для заражения проростков в последующих опытах использовали 2, 3-ю и 7—9-ю дозы инокулюма.

Наиболее вирулентными оказались штаммы 1аг 87, 442, 2а, 26, 12а, если судить по сроку образования клубенька в дозе 79700—54300. Если судить о вирулентности штамма .по наименьшей дозе, то наиболее вирулентным оказался штамм 1а — он сформировал клубеньки в самые ранние сроки даже при количестве 8 бактериальных клеток на 10 растений. Для других штаммов требовались более высокие дозы инфекционной нагрузки. Поскольку лучшими дозами клубеньковых бактерий для осуществления процесса инфицирования оказались все же высокие — сотни и десятки тысяч клеток'на семя, надо полагать, что «запас заразного начала» должен быть количественно высоким, иначе вирулентные свойства будут не реализованы. В полевых условиях инфекционная нагрузка должна быть выше (Шатта, 1975).

Аналогичные результаты были получены "нами в полевом опыте с растениями сон.

• .,,. ..... Таблица!

Дозы инокулюма (тыс, клеток на 10 растений), используемые для выявления степени

вирулентности клубеньковых бактерий (ИЫгоЫшп теШоН) ''

Штамм

Доза 87 422 1а 20 34 2а 26 12а 20а Зв

1 . 643000 624000 797000 758000 496000 193000 | 677000 50000 327000 790000

2 . 64300 02400 79700 75600 49600 19300 67700 54300 ЗЙ700 79000 •

3 6430 6240 7970 7580 4960 1930 6770 5430 3270 7900 .

4 643 624 797 758 496 193 677 543 327 790

5 (ИД 62,4 79,7 753 49,6 19,3 67,7 54,3 32,7 79

0 6,43 6,24 7,97 7,58 ,4,96 1,90 6,77 5,43 3,27 7,9 :

• 7 0,613 0,624 0,797 0,758 0,496 0,193 0,677 0,543 0,327 0,79

' 8 0,064 0,062 0,079 <\075 0,049 0,019 0,067 0,054 0,032 0,079

. 9 0,006 0,006 • 0,008 0,008 0,005 0,003 0,007 0,005 ' 0,003 0,008

Выявление сроков искривления корневых волосков корней растения-хозяина как возможного фактора вирулентности клубеньковых бактерий, влияние сезонности года на процесс инфицирования

Число корневых волосков у люцерны возрастало в онтогенезе, сохраняясь примерно на одном уровне, независимо от численности клеток клубеньковых бактерий. При бактеризации семян слабовирулентными и неактивными штаммами число корневых волосков несколько ниже, чем при бактеризации вирулентными и активными, хотя это нестойкая закономерность, так как в более поздние сроки (на 20, 25, 30-е сутки) количество искривленных корневых волосков при бактеризации слабовирулентными и неактивными штаммами оказывалось даже выше.

Процесс искривления корневых волосков начинается раньше, чем появление специфически искривленных корневых волосков, хотя последнее зависит от дозы инфекционной нагрузки.

Если опыт ставится в марте или октябре-ноябре, срок появления первых клубеньков резко удлиняется по сравнению с опытами, проводимыми в мае-июне (сдвиг в сроке появления клубеньков на 5—7 суток под влиянием одного и того же штамма). При этом даже увеличение инфекционной нагрузки не играет существенной роли. Это следует учитывать при оценке для производства степени вирулентности и активности производственных штаммов. Возможно, здесь проявляется разная восприимчивость растения-хозяина к заражению под влиянием эколого-географических условий.

Отношение разных по степени.вирулентности, штаммов клубеньковых бактерий люцерны к антибиотикам

В природных условиях клубеньковые бактерии должны обеспечить себе селективные преимущества • в микробных ассоциациях ризосферы растения-хозяина. :

Результаты исследований по выяснению характера влияния антибиотиков разных групп на клубеньковые бактерии различной степени вирулентности представлены на рис. 1.

Низин влиял в наименьшей степени на клубеньковые бактерии, поскольку он активен, главным образом, в отношении грамположительных бактерий. Однако штаммы ИИ. теШой Аз и 35 все же реагировали на его присутствие и рост их восстанавливался только на 6—8-е сутки развития- соответственно.

Наиболее сильно.рост клубеньковых бактерий люцерны

как грамотрииательных форм угнетали полимиксины «Б» и «М».

Убедительной связи вирулентности с реакцией на антибиотики не установлено (рис. 1). Получение результаты свидетельствуют, что при условии взаимодействия растения-хозяина с клубеньковыми бактериями как потенциальными экзогенными возбудителями инфекционного процесса прежде всего выступает значение их штаммовых особенностей.

Каталазная активность клубеньковых бактерий люцерны разной степени вирулентности

•Данных по изучению активности этого фермента у клубеньковых бактерий практически нет, хотя Желоза (Gelosa, 1962) отмечает его связь с вирулентностью у патогенных культур, Г. С. Ким (1968)—с активностью клубеньковых бактерий, а Кук и Кводлинг (Соок, Quadling, 1962) пытаются связать каталазную активность ризобий с наличием в клетках ризобиофага.

В наших опытах (табл. 2) наметилась тенденция более высокой каталазной активности у высоковирулентного штамма по сравнению со слобовирулентным. Эта закономерность прослеживается достаточно четко во все сроки ее определения (через 1, 2 и 3 мин.).

Í' ..'.-у . Таблица 2

Каталазная активность Rhizobium melllotl

(условные единицы, 02/мл)

Показатель Штамм 425 (вирулентный), через мин.: Штамм 434 (сла-бовиру. лентный), через миа.:

1 2 3 1 2 а

1 2 3 Средн. 1,86 1,73 U5' 1,»1 3,40 2.21 2,38 2,33 2,93 2,59 2.97 2,83 1,45 1,44 1,39 1,42 1,89 2,01 2.20 2,03 2.25 2.31 2,33 2.29

Приведенные данные не могут рассматриваться как общая закономерность-для бобово-ризобиальных симбионтов, однако исследования в этом направлении могут дать дополнительную информацию, при разработке проблемы эволюции симбиоза, а в случае распространения данного явления на разные виды клубеньковых бактерий служить дополнительным Косвенным критерием вирулентности.

I I

1 I

а

s.a \

V Ю

аь

Ш

1. Грамицидин . С Z. Низин

3. Полимиксин. Sf'

4. Полимиксин .Б'

5. Олететрмн

О.

12 3 4 5 12343 12345 ' 12345

/73 • 35 425а 434

(Ыауяектный (С*а$о6ирупеитный (бируШТныи (Це Вирулентный штаммJ штамм) штамм) штамм) •

влияние днтибиотикобнярост мзны* штаммов

RUIZOBIUM MBU LOT! ( по 5-tu бальной системе)

Солеустойчивость. клубеньковых бактерий люцерны в чистых культурах

У всех штаммов на солевых фонах 0,25—2% колонии появлялись, как и" в контроле, на 3-й день - инкубации. Обнаружены различия между штаммами по их ростовым реакциям на соль. У штаммов 422а и 425а при внесении соли даже в концентрации 0,25% наблюдалось некоторое снижение числа колоний, равномерно увеличивающееся с повышением концентрации от 0,5 до 2%. У штамма 450а число клеток, образующих колонии, несколько .уменьшалось на среде с 0,25% соли. Однако при повышении концентрации до 0,5 и 1% число проросших клеток оставалось таким же, как и в присутствии соли в концентрации 0,25%. При концентрации 2% резко уменьшалось число проросших клеток. У штамма 441а число колоний не менялось по сравнению с контролем, при содержании соли в среде от 0,25 до 1% и только при 2,% соли число проросших клеток составило 80% контроля. Данные таблицы 3 показывают, что штаммы имеют достаточно выраженные индивидуальные свойства, связанные с особенностями их биологии и экологии.

Таблица 3

Число проросших клеток разных штаммов клубеньковых бактерии люцерны на 3-й день культивирования -

(среднее из 20 определений)

Концентрация К'аС1, % Штамм

422а 425а 441а 450а- 434

Контроль (без К'аС1) 253 155 631 545 274

0,25 227 133 6-10 424 283

0,5 175 89 643 404 213

1,0 ' 153 82 540 466 203

'2,0 106 68 580 1.88 129

Влияние соли проявлялось не только в снижении числа колоний, но и в подавлении скорости размножения клеток, о чем свидетельствует изменение размера колоний трехдневных культур (табл. 4). Степень ингибирования скорости размножения клеток коррелировала со степенью засоленности среды, увеличиваясь с 0,25 до 1 % и достигая максимума при дозе 2%. При длительном культивировании клубеньковых бактерий на солевых средах эффект ингибирования практически исчезает, в частности, это касается различий в размере колоний.

Более того, при увеличении срока инкубирования начинают

прорастать клетки клубеньковых бактерий на средах, содержащих N301 в концентрации 3%, Такая доза, как казалось

Таблица 4

Размер колоний штаммов клубеньковых бактерий люцерны при длительном культивировании их на средах с разной концентрацией №С1 (среднее из 50—90 измерений)

5 I* Сраки культивирования, сутки

Конце райи* NaCl, . 3 4 .5 6 ' t 8 11 12 13 15

Штамм 425а

О

(125 0.50 1,0 2,0 3.0

О

.0.25 0.50 1.0 2.0 3.0

3.21 4.75 5,15 4,9 5,53 6,08 5,49 5,63 5.71 6,13

2,67 3.94 ,4,76 4,79 5.2 5,40 5,27 5.28 5,25 5,58

2.06 2.41 2.90 3,25 3,73 3.69 4,57 4,70 4,55 4,46

1,66 2,0 2,74 3,02 3,65 4.02 4.31 4,45 /4,46 4,29

0.93 1.20 2,04 2,36 2.41 3.30 3,29 3,17 3,70 3.90

— 0,60 1,53 1,77 2,44 3,0 , 4,15 4,34 4.10 4,17

Штамм .450а

Штамм 434

2,13 417 2.50 2,84 2,95 3,10 3,15 3.22 3,42 3,72

2.17 2.81 1,97 2.39 2.70 2,93 2,89 2.95 3,05 3.30

2,22 2.63 lj66 2,20 2,34 2,73 2,76 2,52 2,77 2,86

1,64 1,76 2,13 1,80 1.81 2,39 2,42: 2,62 2,80 3,14

1,13 1,09 2,12 1,41 1.71 2,06 2,28 2,46 2,42 2.68

— 0.60 1,39 1,02 1,55 1.93 1,82 1,99 1,99 2,06

0 3.15 3.24 3.08 4,23 5.03 5,33 .5,46 7.1 6,86

Q.2S 2,91 3,07 2,86 3.2 3,85 4,3 .4,4 5,50 5,78

0.50 2,45 3,15 2,35 3,01 3.1 3.94 3,91 4.9 5,40

1.0 1,84 2.66 1,88 2.5 2,54 3,10 3,55 4.06 3.60

2,0 0,90 1,51 1,36 1,78 1.83 2.21 2.45 2.83 2,95

3.0 — — — 0,55 0,79 1,25 2,23 2,22 2,49

7.51

5.95.

5,74

4.08

3.08

2,55

по результатам наблюдений на 3-й сутки, была для них летальной.

Наши данные о том, что устойчивость к засолению является особенностью вида клубеньковых бактерий люцерны, согласуются с результатами Субба Pao (Subba Rao, 1972), Стейнборн и Рафли (Steinborn, Roughley, 1974,1975). Неви-рулентныи штамм 434 проявлял те же закономерности роста на засоленных средах, что и вирулентные активные штаммы. Надо полагать, что устойчивость к засолению среды и способность к инфекции растения-хозяина у клубеньковых бактерий люцерны.не взаимосвязаны. • 10

Снижение скорости деления клубеньковых бактерий под действием соли подтверждается наличием обратной корреляции между степенью снижения размеров колоний под влиянием «ЧаС1 в разных, концентрациях на 3-й день инкубации клубеньковых бактерий и продолжительностью времени, необходимого для достижения ими размеров колоний, наблюдаемых в контрольном варианте на 3 сутки культивирования.

По мере увеличения концентрации соли размер колоний, появившихся на 3-й день инкубации, падает. В варианте с 3% соли колонии в этот момент отсутствуют. С увеличением срока культивирования колонии, выросшие на засоленной среде, достигают размеров колоний, развивающихся в условиях незаселенной (контрольной) среды. При ' концентрации 0,25% МаС1 это происходит на 4, при 0,5%—на 6, при.3% МаС1 — на 11-е сутки. Надо отметить, что все штаммы в наших опытах на среде с солью в концентрации 3% способны развиваться после 11 дней инкубации.

Поскольку в условиях засоления клубеньковые бактерии люцерны сохраняют способность размножаться, очевидно» они могут накапливаться в засоленных почвах в местах культивирования люцерны.

Влияние МаС1 на процесс инфицирования растений люцерны

Высоковирулентный (450а) и слабовирулентный (434) штаммы образовали клубеньки на 12-е сутки после посева (табл. 5, 6). Однако, если штамм 450а сформовал клубеньки на среде с 0,25,%' соли, даже если клетки предварительно не пассировали через хлористый натрий, то штамм 434 на 12-е сутки сформировал только один клубенек в варианте без соли и без предварительного пассирования.

Следует отметить, что общая численность корневых волосков возрастала в процессе онтогенеза растения-хозяина, но существенно зависела от концентрации соли в среде. С повышением дозы хлористого натрия численность корневых волосков, падала, независимо от, того, пассировали или не пассировали клубеньковые бактерии через солевые среды. Изменения в численности искривленных: и специфически искривленных корневых волосков были в основном аналогичны. . . ,

Влияние ЫаС1 на клубеньковых бактерий люиерны• вирулентного1 штамма (450а) на процесс инфицирования:растения-хозяина. Доза инокулюма 6 тыс. клеток на1 семя-;

МаС1, % Бактерии предварительно выращены на среде с 3% соли Бактерии выращены на среде без соли1

общее кол-во корневых волосков кол-во искривленных корневых волосков кол-во слециф искривленных корневых волосков и в * ~ » СО с> О О И йа м к* /.-зга Ч а: о. О о ж о — общее кол-во корневых волосков кол-во искривленных корневых волосков кол-во слециф искривленных корневых 1 волосков кол-во клубеньков на 1 растение

Контроль * 0,25 0,50 0,70 78 68 43 19 26 17 9 3 9 дней 8 7 4 о после 0 0 0 0 посева 84 78 6823 33 29 13 5 12 9 8 4 0 0 0 0

I

12 дней после посева^

Контроль 92 30 9 Г. 107 37 26 4

0.25 79 21 7 0 91 36 21 2

0,50 51 10 5 0 70 15 14 0

0,70 30 68 2 0 25 8 7 0

15 дней после посева

Контроль 151 5 10 1 172 88 31 9

0,25 143 32 9 0 163 85 27 6

0,50 79 25 5 0 107 17 14 1

0,70 46 13 3 0 52 а 9 О

* Здесь и в последующих таблицах — контроль среда без внесения соли.

Влияние пассирования клубеньковых бактерий через среды-с №С1 на развитие инокулированных растений

люцерны;

Активные вирулентные штаммы 425а, 450а, перенесшие солевой стресс, сохранили способность образовывать клубеньки и активно фиксировать (восстанавливать ацетилен) азот. Растения, симбиозирующие с такими бактериями, развивались даже несколько-интенсивнее по сравнению с растениями, инокулированными клубеньковыми бактериями, выращен-12

Влияние ЫаС( на клубеньковых бактерий.люцерны слабовирулентного штамма (434) на:процесс инфицирования растения-хозяина. Доза инфекционной нагрузки 6 тыс. клеток на 1 семя

NaCl, % Бактерии предварительно вырэшелы на среде с 3% >\'аС1 Бактерии выращены на среде без N30

общее кол-во корневых волосков кол-во искривленных корневых волосков кол-во спсаиф. искривленных корневых волосков кол-во клубеньков на 1 растение о ш S * а W 3 о í, т << 8 а ол ООО 9 л а кол-во искривленных корке-вых волоскоз х 3 Я я <i* Я ы а о 5 й о п з о О со Ш и ? g. a s 3 s 8-S * я а. Л кол-во клубеньков на 1 растение

9 дней после посева

Контроль 52 13 3 0 &S 15 9 0

0.25 43 11 2 0 63 16 7 0

0.50 22 5 1 0 24 7 t 0

0,70 20 5 0 0 22 5 0 0

12 дней после посева

Контроль §7 19 4 0 175 20 6 1

* 0,25 59 11 2 0 '147 13 3 0

- 0.50 50 7 2 0 73 9 2 0

0,70 37 5 0 0 42 6 О 0

1S дней после посева

Контроль 182 19 4 0 230 36 8 2

0.25 176 15 3 О 214 29 7 1

0,50 92 а 2 0 98 12 3 0

0,70 51 i 0 0 71 10 0 0

ными на обычной среде. В специально проведенных опытах показан характер влияния засоления на развитие растений люцерны на безазотной (табл. 7) среде и среде со связанным азотом (табл. 8).

Первый вывод, который следует из таблицы, — развитие растений люцерны на контрольной среде (без соли) с инокуляцией штаммами клубеньковых бактерий и. без инокуляции, но в присутствии минерального азота, значительно более высоко, чем в вариантах на солевых средах. Второй вывод — то, что повышение концентрации соли, особенно начиная с 0,5,%, подавляет развитие растений. Следует учесть также, что соль ингибировала и первые этапы инфицирования (табл. 5, 6). *

влияние хлористого ■ натрия ■ на развитие инокулированных растений люцерны (среднее из 8—12 повторностей) -- Растения в возрасте 6 недель

Сырой вес клубеньков, мг/раст. Сухой

' Концентрация -^'аС1. % Кол-во клубеньков . Длина корня, см* Высота растения, см Кол-то листьев вес 1 растения без клубеньков, мг

Штамм 450а

Конторль 6,в' 11.3 7Л ■ 5.4 18,8 8,9

0.25 6.8 11,3 5.8 4,8 15,7 8Л

0.50 5,0 16,5 5.9 4,4 16,8 8.0

0,70 3,0 103 4,1 3,5 11.3 6.25

* Штамм 422а

Конторль 3,8 14.3 7.6 5,0 17.7. 11,33

0,25 5.8 16.1 7.6 5.8 18,9 8,9

0.50 5.2 14,7 5.9 4.2 18,0 8.8

0,70 4,3 10.8 4,4 3.6 18,0 7,1

. И, наконец, здесь вырисовывается явление, о котором мы не предполагали, проводя опыты с чистыми культурами; скорее даже, напротив, на основании данных литературы (БиЬЬа Изо е1 а1., 1973; ЬакзЬпи-китап е1 а1„ 1974), мы

Таблица 8

Влияние хлористого натрия на развитие неинокулированных растений люцерны при внесении в среду минерального азота (1 норма по Прянишникову). Растения в возрасте в недель

Концентрация МаС1, % Кол-во клубеньков- Длина корня, см Высота растения, см Кол-во листьев Сырой вес клубеньков, мг Сухой -вес 1 растения без клубеньков, ыг

Контроль _ц 7,6 20,9 8,8 12,13

0,25 — 7,8 .19.7 8,0 — 12,91

0,50 — 7,6 .14.8 6.9 _ 10,00

0,70 8,6 13,7 6,4 ' 10,54

полагали, что на солевых средах в лабораторных условиях развития бобово-ризобиального симбиоза не произойдет. Однако он сформировался и даже дал неплохие результаты (табл. 7).

выводы

1. Показано отсутствие корреляции степени вирулентности штамма - клубеньковых бактерий, оцениваемой по «прямому» показателю вирулентности — сроку появления первого клубенька, с количеством инфицированных и специфически искривленных корневых волосков на корнях инокулированных растений люцерны на первых этапах инфицирования. Отсутствует также четкая связь между прямым критерием и количеством " клеток клубеньковых бактерий, необходимых для осуществления процесса инфицирования. Только некоторые высоковирулентные штаммы (.\*о 1а) способны осуществлять «заражение при .низком «запасе» инфицирующего " агента (единицы-дес5Лки клеток) с той же скоростью, что и при высокой дозе.

2. Установлено отсутствие связи степени вирулентности штамма с их реакцией на антибиотики, такие как низин, грамицидин, олететрин, полимиксины.

3. Выявлена тенденция повышения каталазной активности у высоковирулентных штаммов клубеньковых бактерий люцерны по сравнению со слабовирулентными.

4. В опытах с одним и тем же штаммом, проводимых в марте и октябре-ноябре, процесс инфицирования растения-хозяина задерживался на 5—7 суток по сравнению с аналогичными опытами, поставленными в мае-июне. Выявленную зависимость процесса инфицирования от сезоннности года необходимо учитывать при отборе штаммов для производства при оценке степени их вирулентности в лабораторных условиях.

5. Доза «инфекционной нагрузки» (или «запас инфицирующего начала»), необходимая для осуществления надежного инфицирования растения-хозяина, должна быть достаточно высокой (сотни-десятки тысяч клеток клубеньковых бактерий люцерны и сои на семя), иначе вирулентные свойства клубеньковых бактерий могут быть не реализованы. В полевых условиях (на дерново-подзолистых почвах Подмосковья) при одинаково высоких дозах внесения разных по степени вирулентности и активности штаммов клубеньковых бактерий сои большая эффективность симбиоза получена в случае более высоковирулентного и активного штамма. Низкая доза последнего такого эффекта не обеспечивала.

6. Развитие колоний клубеньковых бактерий люцерны на среде с 3% МаС1 после длительного лаг-периода свидетельствует об их способности адаптироваться к хлоридному засолению. На средах с 1—2% соли скорость пролиферации клеток несколько снижена.

7. Солевой стресс (пассирование на среде с 3% соли) не

влияет на вирулентность штаммов клубеньковых бактерии люцерны.

8. При выращивании инокулированных растений люцерны на среде с солью в концентрациях 0,5—0,7% наблюдается задержка процесса инфицирования, особенно в случае слабовирулентных культур. Однако на среде с 0,25—0,7% NaCl образование клубеньков происходит. У 6-недельных растений, симбиотизирующих с высокоэффективными шаммами, иногда не наблюдается различий в массе клубеньков.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах автора:

1. Хайлова Г. Ф.^ Камар P.P., Л ар ьк о в а Т. П., Шиль-к и к о в а В. К., С т р о г о н о в Б. П. Реакция штаммов Rhizobium meliloti на разные концентрации хлористого натрия в питательной среде. — Изв. TOCA, вьш. 4, 1985, 91—95.

2. К а м а р Р, р. Солеустойчивость клубеньковых бактерий люцерны.—Деет. рукопись, 1985.

3. X а й л о в а Г. Ф„ К а м а р Р. Р., Л а р ь к о в а Т. П., С т р о-гоиов Б. П., Шильнихова В. К. Влияние NaCl на выживаемость, пролиферацию и способность к инокуляции Rhizobium meliloti. — Тезисы VII съезда Всес. микробиол. об-ва, «Достижения микробиологии — практике», т. 8, Физиология, биохимия и организация микроорганизмов. Алма-Ата: Наука, 1985. с. 155.

4. К а м а р Р. Р. Процесс инфицирования растения-хозяина клубеньковыми ^бактериями люцерны и сои. — Деп. рукопись, 1985.

íx К а м а р Р. Р. Каталазная активность и отношение к антибиотикам клубеньковых бактерий люцерны разной степени вирулентности.— Деп. рукопись, 1985.

Объем 1 п. л.

Заказ 1967.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академия им. К. Л. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно