Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Множественность путей переноса электронов в митохондриях в присутствии менадиона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Множественность путей переноса электронов в митохондриях в присутствии менадиона"

и

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. 3. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДС 577.23

КАРНАУХОВА Лидикла Вячеславовна

МНОЖЕСТВЕННОСТЬ ПУТЕЙ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ 8 МИТОХОНДРИЯХ В ЛРЛСУТСТВ/Л МЕНА1Я0НА

03.00.04 - биологическая хииия

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

° / > ' '

Работа выполнена в секторе биоэнергетики НИИ Физико-Химичгской Биологии им.,А. К. Белозерского МГУ им. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, глазный научный сотрудник Л. С. Ягужинский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская

кандидат биологических наук В. В. Чистяков

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, ПУЩИНО.

% ■■ 19Э2 г. в

Защита состоится " О " '(Л/к^я-сс^ь* 1992 г. в часов

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы. Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

п

Автореферат разослан " ¿Р " с-ос-б^-с* 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук /V,

Ю. Н. Лейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействие менадиона с дыхательной си- ' схемой митохондрий известно уже более 30 лет. Сравнительно недавно было выявлено новое свойство менадиона - стимулировать дыхание митохондрий в условиях блокирования цитохромоксидазы цианидом. Несмотря на то, что исследователи доено занимаются изучением дыхания митохондрий, систематическое изучение путей переноса электронов ß митохондриях в присутствии менадиона ( еит. К3, К3 ) до сих пер яэ проведено. Особенно интересным является вопрос о механизме электронного транспорта в митохондриях в присутствии менадиона в условиях цианрезистентного дыхания, которое детально описано в работах Колесовой с соавт. (Колесова др., 1967, 1989). Взаимодействую ме-надиона с электронтранспортной системой митохондрий в определенном смысле представляет из себя загадку, поскольку это соединение не обнаружено в тканях теплокровных в заметных количествах, однако существует специальный фермент в митохондриях (и в цитоплазме) - менадийн-редуктпза (ДТ-диафораза), который специфически катал!'.- ■ зирует восстановление окисленной формы вит. Kg. В этой связи ; представляется актуальным провести детальное исследовг:п;е специ-щ'^ичносг; взаимодействия вит. К3 с дыхательными пер&носчихьми мл-тохондр1гй. Необходимость этого исследования диктуется такхе тем, что в последние годы менадион начал использоваться в практической медицине для л-.чекия мышечной миопатки, связанной с Ероэдекными нарушениями работы дахательной цепи митохондрий. Цель работы заключалась в систематическом изучении путей переноса электронов в митохондриях в присутствии еит. К3. В работе била поставлена задача исследоЕать зависимость путей электронного транспорта в присутствии менадиона от конкрьтных услоенй опыта; определить факторы, контролирующие специфичность взаимодействия менадчона с отдельными переносчиками электронтранспортксй с и с те.'/л митохондрий.

Задачей работы било проведение ситематического ингибиторио: о анализа днхашгя митохондрий в присутствии различию: концентраций менадиона при двух значениях тоничности ерэды инкубации ( <¡00 и 120

мосМ ). Кроме того, в задачу входило сопоставление параметров д дыхания митохондрий, индуцированного менадионом, с параметра дыхания, которое индуцировано структурным аналогом менадиона - д

РОХ1ЛОНОМ.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы удало показать, что при цианрезистентном дыхании митохондрий реализуют даа основных пути переноса электронов, один из которых, включа О-цккл, он подавляется миксотиазолом; другой путь, нечувствитель най к миксотиазолу и дикумаролу, обусловлен прямым переносом эле тронов с млин - дегидрогеказного комплекса на кислород. Интенси кость этого пути резко возрастает при набухании митохондрий средах с низкой тоничносгью. Кроме того, получены данные в польз того, что в присутстьы еит. К3 реализуется "редуцированный" 0 -цикл, работа которого подавляется миксотиазолом и не подавляете питимищшом А; эффективность работы "редуцированного" а-цикла Т£ ке увеличивается при набухании нахточдруД. Таким образом, нзЖ способ рогуляцда путей герекоса электронное в митохондриях ъ присутствии вит. К3. Обнаружен центр связывания ионов цинка, I торые в низких концентрациях подавляют малат - дурохкнон-оксидо; дуктазу.

Проведенное исследование дало достаточно полную картину I тей переноса электронов в присутствии вит. К3 и выявило возмош способы их регуляции.

Практическое значение работы. В последние годы вит. К3 успе! используется для лечения врожденной мышечной миопатии, связанно! нарушением работы о-цикла з (митохондриях. Прозеденнке исследов?1 показали, что измене!ле концентрации вит. К3 приводит к качеств! ком" изменению системы электрешого транспорта в ипохондриях. : исследования выявили конкретные изменения напрар -ения потоков 'э, ктронон в митсхонодриях, связанные с изменением концентрации менадиона, а также обусловленные блокированием определенных зЕе: ев дыхательной цепи..Полученные результаты являются иредпосылко: направлонному. использованию вит. К3 при болезнях, обусловлен разлгшыми Бровденными дефектами дыхательной системы митохондр Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывали

- э -

точной йктивности" (Пущино, 1991).

Публикации. По материалам исследования опубликована 1 статья, 1 статья подготовлена к печати.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы в двух главах; описания материалов н методов исследования; изложения результатов и их обсундения в трех главах; еыводов п списка цитируемой литературы. Диссертации иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ' Митохон.^.ти выделяли методом дифференциального центрифугирования (Grierr,. Ыеуег, 1961 ), ореда выделения содержала 250 м.М сахарозу, с; мМ трИС-UCl, 250 мМ ЭДТА (pH 7,5).

Потребление кислорода суспензией митохондрии измеряли на ноляро-r'pa'le i:P-r- (4W-P) с самописцем TZ-21 с'помощью стационарного кислородного электрода Кларка при комнатной температуре ( 20°С ). Спектра цктохромон ь, а также c¡ +с регистрировал! на спектрофотометре HTTacni-557 (Япония) в двулучевом резкиме в области длин волн 530-560 ам. Спектры окисленной и восстановленной форм дурохинона регистрировали на спектрофотометре Hitacfci-557 (Япония) в двулучеты реагй ь области длин еолн 210-310 нм. Кинетику изменений сте тьни окксленности-ьоистаноап-'нности цитохромов b регистрирова ли на спектрофотометре Axolnco 2а UV/Vis (СИЛ) в двуеолноеом режиме, рабочая длина волнн-562 нм, оперная длина волны-575 нм.

Концентрацию ь.:Тохондркального бедка определяли гнуретоыт методом. Концентрация Салка в ячейке составляла 1 -1,5 мг/мл.

Среда инкубации содержали 20 мМ сахарозу, 0,15 М KCL, 10 с.'.', трнс- ¡iCi, ¿й m\í iúijh't^, р'ггу.ь, тоничность <100 мосМ; 20 мМ сахароз:', 20 м.4 KCl, 20 мМ KhgiO^, 10 мы тряс-HCi, тоничность 120 мосМ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЬДОЬАННИ И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящее исследование включает три основные главу, посвященные изучении путей электронного транспорта в митохондриях ¿ rip:i-сутеткин различных концентраций относительно полярных хиксиоь, обладяксщх различны:/-! окислительно-Еосстан:>£иТ0._ьшлм сотен^альми - дурохинона (Е0-6О мВ) и ыенадаона (2 - метил -1,4-на, isa пит» К3, или Kg), (Е0=20 мЗ).

В первой главе изучены пути переноса электронов в условиях работы ДТ-диг:форазного шунта (при окислении малата в присутствии ротенона).

Во второй и третьей главах изучены пути переноса электронов при цизцрезистентном дыханий в условиях окислении малата и в присутствии цианида. В работе удалось показать, что в митохондриях, кроме основного пути переноса электронов, в присутствии менадаона, а также дурохинона реализуются четыре шунта, соотношение интенсивно-стоЧ которых непостоянно и меняется в зависимости от таких параметров систелш, как концентрация хинона, его структура и степень набухания митохондрий.

I, ЕЗАЮЮДКПСТВУШ '.(БИЛЛИОНА И ДУРОХШОНА С О-ЦИКЛОМ В УСЛОВИЯХ

РАБОТЫ ДТ-ДИА'ЮРАЗНОГО ШУНТА. 1.1. Бзни;о де й стьке мечадиона с о-циклом в условиях функционирова-жОт-диНорязного шунта. ~

Подданным многих авторов, добавление менадиона к митохондриям печени вызывает снятие тормозящего эффекта ротеноидов, барбитуратов и других гидрофобных органичесглх соединений на дыхание митохондрий. ОЪномен объясняется функционированием ДТ-диафоразного шунта, который осуществляет перенос электронов с начального участка дыхательной цепи в обход ротенон-чувствителъного локуса дыхательной системы митохондрий.

В настоящей главе работы изучено влияние структуры хиконоз, их концентрат«:, а также объема матрикса митохондрий на пути переноса электронов в дыхательной системе митохондр.й при окислении малата в присутствии ротенона.

!'.п проведен ингибиторняй анализ системы электронного траис-ПС'': '. ,:лтохондрий в црисустстьии щтавдша К3 и ротенона ( в условиях окисления малата). Показано, что в состоянии 1р по Чансу К3 в концентрациях 6-15 мкМ восстанавливает подавленное ротеноном даха-ние на 50-80% (табл. 1). Дыхание полностью подавляется специфическим ингибитором ДТ-диафораэн - дикумаролом (75 нМ), а также цианидом, т. е., при этих концентрациях менадаона весь поток электронов прохода? "(.'рез ДТ - диа^рразу и цитохромоксидазу митохондрий. При н а з к и х концентрациях К3 (6 мкМ) как переносчика электронов дыхание практически полностью подавляется г.жсотиазолом (рис. кривая 1), антимицин А подавляет дыхание не более, чем

на 70-30.? (рис. 1,/7,а, кривая 1), последнее согласуется с данными ..лтературы (Х)апио1гоп ©1:. а1., 1962). очевидно, что в этих условиях все электроны от восстановленного при функционировали ДТ-диа-

■« R i

«M* s I

- ; „• " i Ь

• S " " " ! n

6 И

■ V Ï i Г «

в?*?:; I

£ , . r — ¿ -

ПОГЛОЩЕНИЕ O

V «: Di §

: - ' 'i yl

vi

/ / i /

1-е,

not ЛОПЕНИЕ Og,

w s

t- l-tl--^

J'74

» ' /

>"4

— б—

форазн К3Н2 поступают в <а-цикл на уровне о - центра, но с функционированием обычного о - цикла связано около 802 потока электронов. Остальная часть потока электронов ( около 20',1 ) не чувствительна и ангчдзщшу А, и, следовательно, не попе лае г в 1 - центр о - цикла. Следует предполагать поэтому, что существует дополнительный путг ьлектронов, шунтируквд!}: антимицкн Л - чувствительный 1-цонтр. Очевидно, что в этих, условиях окисленная, форма ыенздиона нечосредст-I-у.ко взаимодействует с восстановленными ( пра участии о-г >нтра ) цитохромами ь ( р'лс.2 ). Для детального изучения системы были про-проводеш спектральные измерения степени восстановленное™ цито-цитохромов ь и с^+с при работе К3 - шунта в разных условиях. Вши показано, что добавление миксотиазола в присутствии в мкМ К3 к визнвает. окисления цитохромов ъ, наблюдаемого при работе основно олектронтранспортной цепу,.а, напротив, приведет к увеличению сте пени восстановленное™ цитохромов Ь (рис. 3, кривые1,2). Последуя шее добавление в опытную кювету антпмпцша А дополнительно увели чнвэет степень восстановленное™ цитохромов ь { рис. 3 (1), криви 2.3 ). При обратном порядке добавок ингибиторов степень ьосстанои ленности цитохромов ъ ср^зу после добавки антшицина Л достит наскального значения (рис. 3(2), кривые 1,2,3,). Возрастание сте пони окисленности цитохромов ь при рабо-.е К3~ шунта после добавлю 1Г.!.ч миксотаэзолз регистрируется в условиях, когда поглощение ( оказывается практически полностью подавленным этим иь.ибиторо1 При этом К0Е,. образужкйся при работе ДГ-диафоразн после добавл! ния миксотиазола практически перестает окисляться; как слэдств» б системе с шксотиазолом резко повышается количество восстано ленной формя хииона и уменьшается количество окисленной формы нсн^. Соответственно сикается скорость реакции прямого окислен цитохромов ъ, минующего 1- центр, ( рис. "2 ) и нарастает скорос прямого восстановления цитохромов ь под действием КдН^ Добавлен антмиший А, блокирующего 1- центр, после миксотиазола повышг степень восстановленности цитохромов ь/ то есть, в услоьиях от через а-центр идет сток электронов с цитохромов ь. Это доказыЕае что наряд-' с процессом прямого окисления цитохромов ъ окислен! формой менкдиона реализуется также процесс прямого восстановле; этих цитохромов. В присутствии анткмнцина А окисление цитохромо] через 1 - центр блокирован нэ полностью, а только на 70 - 80

Табл.1. Активность ДТ-диафорззного шунта митохондрий в присутствии разных концентраций дурохинона и мепадаона при двух тоннчкостях ср<.*ды инкубации.

Тошгшость , Хннон. Концен- ' Скорость дь'хакйя Восста-

мосМ. трация кг ат 0/ мин мг белка новленное

хинона, в присут С7ЕНГ*: дыхание,

мкМ. УССР ¿'ССР + ротенон РССР + + ХИНСН 1- ■

Дурохнкон 6 52,5 5 .26 50

Дурохинон 15 59,3 3 33,7 62

120 ДурОХННОН 90 63,5 2 34 -19,6

мосМ Менадион 6 72 3 40 55

Менадион 15 ЕЬ О о 33 57

Менадион 90 • 63 2 25,3 40

ДурОУ.КНОН 6 50 1 40,2 60

Дурохинон 15 46.5 2 37,5 80

400 Дурохикон ЬО 58,5 2 40,1 75

мосМ Менадион 6 67,5 2 54 80

Менадион 15 52,7 1.5 44 63,5

Менадион 30 65,9 2 34 51 ,5

(г

М икСО'ПЧй^СЯ

1 V--

У 1

1 1

и"

1 .,1' .

1'»1С, 2. Схема перенос* -чсьтр.мпв к ,1ы\пт«'ЛЫ1«»и г» ¡.н ми1«-ч<.ид-|>11 и В условиях ряЛоты ДТ-дилфоц-пнмн шунт.» При ШМКИХ М»П-Х11МОНОВ. ___.... - — —

540 им

Л 400 мосМ ;

чанти А 3 «км чМиксо 3 ккМ !

К3 б мкМ

5С0 нм 1

+СН 1,5 мкМ; +Миксо 3 мкМ

+Анти А 3 мкМ! К3 6 мкМ

I

580 нм

54-0 ни'

540 нм,

1 Б 120 мосМ

560 нм

560 нм

,+Антк А 3 икМ'.

+мнксо 3

К3 6 мкМ 580 нм

I I ¡Сл I I

+миксо 5 ыкМ +Лнти А 3 мкМ

К3 6 мкМ

580 нм

Рис.Восстановление цитохромов Ь при добавлении ингибиторов о-цикла & условиях функционирования ДТ-диафоразы. В среда инкубации (состав см. в разделе "Материалы к методы исследований") добавляли малат/глутамэт-4 мМ; РСХЗР-0,94 мкМ; ротенон 4 мкМ и прописывали нулевую линию (не по- - --- —--------..-,„„.„■ тто пппита НпМйПЯ НЯ КПИЙНХ

- У —

Díte. 1. Уменьшений степени восстановленности цлтохромов ь при по-хледукщем добавлении мшссотиазола может рассматриваться как до-толнительный довод в пользу того, что в присутствии двух ингибиторов протекает быстрая реакция прямого восстановления цитохремов э менадионом (К^Нр), рис. 2.Таг.:™ образом, после добавления игги-Зиторов Q-цикла наря;цг с окислительно-восстановительными реакциями, протекающими с участием о- и i- центров Q-цикла в условиях на-них экспериментов, идет достаточно быстрый процесс переноса электронов на цитохром*. b (рис. 2). Указанные реакции контролируют степень восстановленности цитохромов b в присутствии двух кнгибигороз 3-циклз.

I р и средних концентрациях (15 мкМ) низкиj концентрации ииксотиазола почти полностью подавляют дыхание в присутствии мена-¡Хиона. На рис.1,(у, б,кривая 1) видно, что при 15 мкМ К3 (тоничность 400 мосМ ) максимальная степень подавления дыхания ьнтимицпнем Л ниха, чем при S мкМ хинона и не превышает 65й ( рис. 1,/у, а, кривая 1). Как цианид, так и дакумарол в этих условиях ингибпруют дыхание на 100«$. Очевидно, при увеличении концентрации кенадионэ увеличивается вклад поток.-! электронов, который идет в о5::од i- центра Q -цикла. Таким образом, при увеличении концентрации К3 до 15 уменьшается специфичность его взаимодействия с i- центром Q-цикла; в этих условиях увеличивается.вклад в дыхание антимицин ¿-нечувствительного шунта ( рис.1,Ц ,[У,а, кривые 1,2 ). Характер изменений степени восстановленности птохромов b при добавлении ингибиторов Q-цикла з присутствии 15 мкМ ■ сходен с таковыми в присутствии низких (6 мкМ) концентраций К3.

При высоких концентрациях мэкадиона (90 г.'.сМ) iíip.:'*"' орн Q -: цикла подавляют дыхание не более, чем на 60 - 70S, {рис. !,v.'). Существекно, что в этих условиях не только антимшуш А. ко к ь-гксотпазол не полностью подавляет дыхание. Появляется но-. b-jíí :Т'>ток электронов нь к:: с.-.-род, лстсрал иди в обход о-цантра.О-цнкла. Сродство ингибиторов к ферментам ь этих условиях достоверно умблшается в 4 - 5 раз.Шанлд в этих условиях подавляет дыхание только на 40-60% - г.эявл.-.ется ц.-аиртеист^-гасо дыхание, ( Колосова И др., 1989; Sáleme et al., 1969 )- .¿¡кумярол, добавленный после К3, такхэ не полностью подавляет дыхание, а приблизительно на БСй, откуда следует, что при этих концентрациях К3 5CS его восстанавливается непосредственно ИАЕН-дегидрогеназой. Таким образом, при пе-

--I о—

pjZOfi/) к высоким концентрациям мэнадаона характер его взаимодействия с переносчиками дыхательной цепи существенно изменяв"" я. Появляются новые пути, шунтирующие отдельные звенья дыхательной цепи митохондрий, В этих условиях только 50» окисленного менадиона спе-цкф/леекк восстакав.т/.ваетск до K3Hg при участия дт-даафоразы; 503 Kg взаимодействуют с иЛОК-дегкдрогеназой; уменьшается относительное сродство во с с ï а ко ы:е шых форм К3 к о - и i - центрам Q-цикла; кромо того, значительная доля ( 40-605 ) общего потока электронен попадает прямо на кислород без участия цитохромоксидазы.

Одна из поставленных в работе задач состояла в том, чтобы выяснять, какая из стадий электронного транспорта в дыхательной цеп; регулируется объемом матрикса митохондрий. В условиях гипотони (120 мосМ) в присутствии 6 мкМ К3 миксотиазол так же, как и в ела бой гипертонии ( 400 мос.М ), полностью подавля г дыхание, однако ттр:: этом сродство ингибитора к ферменту достоверно уменьшаете (примерно в два раза, рис.1,/Г,б, кривые 1,2). Антимицин А в гипо тонических условиях .ингпбкрует дыхание не более, чем на 25-ЗС (кспользоезкы концентрации ингибиторов до 1 мкМ), рис. KÏÏв, хри вче 1,2). В присутствии низких (в мкМ) к средних (15 мкМ) кокценч раций К3 в гпиотонячьских условиях цианид и дакумарбл полкост! подавляет дыхание, обусловленное функционированием ЛТ-диафоразно1 гунтя.

следовательно, в этих условиях весь К3 восстанавливается при уча! тип ДТ-диафоразы и окисляется в термальном участие дахатель» цени. Taira образом, при сравнены! действия ингибиторов Q-цжла условиях высокой ( 400 мосМ) и низкой ( 120 мосМ) тоничлости В2Х отметить, что во втором случае (120 мосМ) возрастает гклад антим шя Л-кечувствительного дыхания ( рис.1,// , /у.в, кривые 1, 2). Э значит, что при увеличении объема матрикса митохондрий доля злен ронов, которая перекосится ка терминальный участок дыхательной l к: через i- центр, уменьшена. Ряд косвенных данных подтверждав что это наблюдение можно объяснить возрастанием эффективности и] мого окисления цитохромов ъ окисленной формой менадиона. Приве. с/мму этих данных. Снижение тоничности среда инкубации млтохонд] ; ом. ) частично снижает скорость работы менадаонового пуз 1). С другой стороны, показано, что степень восстановлен от ini-rospc-MOB ь при 130 мосМ нк*з, чем при 400 моеU в у слови когда цитохре:© ь "вырезаны"'ИЗ системы электронного транспо

двумя ингибиторами - миксотиазолом и антимищшом л. В этой ситуации стенень восстановленности цитохромов ь должна определяться величиной соотношения К3Н2/К3 в условиях опита. Таким образом, снижение степени восстановленное™ цитохромов ъ при переходе к .низкой тоьичности означает увеличеш1е концентрации окислешой Форш К3 в системе. При общем снижении скорости дыхания при переходе к гипотонии эит Феномен мокет иметь только одно объяснение - уменьшение скорости восстановления К3. Повышение концентрации окисленного ме-надиона в свою очередь должно ускорять антимиция Л -нечувствитель-iüjü перенос электронов с цитохромов ъ на It3, что действительно наблюдалось в эксперименте. С другой стороны, снижение е<з личины соотношения Kgltg/Kg уменьшает эффективность взаимодействия K3IL^ с о-центром. При снижении тоничности появляется вклад миксотиазол-нечувстЕительного дахяния (рис.1,//, v/,6), которое подавляется ци-глгадом. Показано также, что после добавления цианида, полностью подавляющего' Дыуайй'/ ездйекь шсстановленности цитохромов ь, а также циюхройогё оДОй¥а«о&м? й изо- и гипотонии. В

таких условиях дбстЛг&Л'еЯ О&й'ЖбйбЗ/ йУйй максимальное восстановление К3 до K3Kg.

1.2. Взаимодействие дурохшона с Q-циклом в условиях функционировании ДТ-диафоразного шунта. !

Для исследования влияния труктуры ximoHa на специфичность ■его взаимодействия с дыхательной цепью была проведена серия аналогичных экспериментов с аналогом кенадаона - дурехинопом, который имеет Е0=60 мВ, близкий к окислительно-восстановительному потенциалу Cc.q.

Било показано, что как дикумарол, так и цианид полностью подавляют дыхание, обусловленное функционированием ДТ - даа<1>оразного шунта в присутствии 6, 15, 90 мкМ концентраций дурохи*:она. Ингибиторы й-цикла практически полностью подавляют дыхание, индуцированное дурохлноном в концентрациях 6, 15, ЭО мкМ (рис. 1.7", /7fV, ). Измерение тонпчности среда инкубации митохондрия с 400 мосы до 120 мосМ не изменяет степени иыгибиронания дыхания ¿нтим.щиюм л и м1жс0тн320л0м .

Кзмзненпя цитохромов Ь при функционировании дурохиноноьог'о аунга имеют качественно сходную картину с той, которая набдвдается при работе К3-шучта, (рис.3).

Таклм образок, можно сделать вывод о высокой спецвХичности

дурохинона в условиях работа ДТ-диафоразного шунта. Функционирование этого иунта протекает практически одааково при низких (6 /лкЛ!) средних ( 15 ыкМ ) и высоких концентрациях хинона. Во всех случаях дурохинон специфически восстанавливается при участии ДТ-диафоразы и окисляется в о - цикле, транспорт электронов осуществляется при участии цитохромоксидазы.

>1.3. Влияние тоничности среды инкубации митохондрий на скорость дыхгння в условиях работы ДТ-диафоразного шунта. 1

В настоящем исследовании изучалось влияние снижения юнично-сти ка скорость дыхания митохондрий в условиях работы ДТ-диафораз-ного шун-га в присутствии бит. К3 или дурохинона. Уменьшение тоничности среда инкубации митохондрий с 400 до 120 мосМ в условиях работы шунта вызывает достоверное уменьшение скорости дыхания в том случае, если в систему добавлен ротенон и 6 мкМ хинон ( табл.1 ).

койЦ-лтрашк хйнойэ до 15 мкМ ке увеличивает скорости дыхания. Очевидно, эффект снижения скорости дыхания, наблздаемый при сни^пии тоничности, ке связан с уменьшением доступности ДТ -диьОоразн или друпс; звеньев дыхательной цепи для окисленного, а т>:к^з восстановленного хинона. Этот эксперимент свидетельствует такхе в пользу того, что уменьшение тоничности не вызывает уменьшения сродства Д'г-догфорааи, а такге о- и ¿.-центров с-цигла к окисленной и восстановленной формам хинон:.. В то хе время эффект то-ннчкости специфически связан с работой шунта, поскольку сг.оросгь работы основной дыхательной цепи пр_ с жжении тоничности среда инкубации возрастает (КтазЬег, 196?; На1еа1:гар ех а!.; Ни21ойа Ы ). Следует тага» отметить, что в средах с низкой тоничностью ДТ-диафоразный шунт работает менее эффективно независимо от структуры используемого хинона (табл.1). 'Гагам образом, вероятнее Вое-го, -¡веном, ^фиктивность которого регулируется то^ичностью среда инкубации, является ДТ-дйафораза, которая либо м^цденно восстанавливает связанный хинон в гипотонии, либо медленно еосстанавливаэт-ся сама. Такие вывода косвенно подтверждаются дзнньми Халестрапа (?:а1ези-ар, 1929) о том, что скорость окисления восстановленного' дурохинона в митохондриях не изменяется при сникены тоничности среда.инкубации.

Таким образом, изучение зависимости работы ДТ - ¿дафоразногг шунта от концентрации хиноноь (менадиона и дурохинона! у. тоничности среды инкубация в дополнение к известным данным ощхзДапнло ус-

лоеия возникновения "редуцированного" Q-цикла в присутствии ме 'а-диона. При работе этого цикла электроны попадают с цитохромов ь на окисленный хинон, минуя i-цонтр янткмицин /-ночуьотвитвлышм путем S'I'Î^ктивкость работы этого аунгэ увеличивается при повышении копцек-рациа К3 и при снижении тошгшости среды инкубации митохондрий.

Работа шунта специфически зависит от структуры хинона. В присутствии дурохинона он практически не реализуется.

2. МИКСО'П'.ЛЗОЛ-НКЧУВСТКИТЫЬНОЕ ДЫУ-АГ'з 1/ж0х0ндрии.

Б настоящей главе приведено описа.'Ягс нового фзкомека-миксотна-зол - нечувствительного дыхания митохондрий, которое возникает в в присутствии высоких концентраций менадиона. Глава посвящена отлез нж ¿^номенологии этого явления, она включает сдедукидае разделы: 1 )-оии(;мние индукции миксотиазод-кёчуЕстьительного дыхания при. работе Ко-шунта (в присутствии ротенона); 2} - описание кинсотиазол-нечувствительного дыхания, которое индуцируется высокие; концент- . рациями К3 з присутствии цианида; 3) отдельная часть пуссядена изучений ингибироьания миксогаазол-нечуястЕИтельного дыхания низкими концентрациями ионов Zn+~.

a.i. пуржо электронов с Л1--..ц--'0?лаы кл "?£?М1;;?а.»ьннй участок

ДДСАТЕЛЫЮИ ЦЕПИ (В ОБХОД сЫР'КлА).

В настоящей части работы проведен детальный анализ данных, связанных с минсотиазол-нечувствительно^ компонентой К3-:::унтз, о ко-торDît упоминалось е предыдущей главе. Ьз результатов, нриведенных на рис. 1. V). Б,видмо, что при высоких ( '-»О ) концентрациях К^ значительная ДиЛА потока электронов оказывается нечувствительной к ингибитору о-центра а - цикл® миксотиазолу. Снижение тоничнссти среды инкубации с 400 до 120 мос.М увеличивает долю потока электронов, нечувствительного к действию миксотнззолэ (рис. 1,i7, Й, кривые 1, 2).Таким образом, относительная величина потока электронов, идущего в обход о-центра Q - цикла, регулируется обЪемсм матрккса митохондрий; сна существенно возрастает при набухании митохондрий.

Возможно существование двух типов мпксстизгол-нечуЕстнитольиого дыхания: ¡-высоко аутооксид&Сельный семнхин-.-н Н^ сбрасуетсл в лр-

вом комплексе дыхательной цепи, он может быстро окисляться молекулярным кислородом без участия о-цикла и цитохромоксидазы; 2-о0ра-еуетсн Ко-шунт ме:гду ДТ-диафоразой и терминальным фрагментом элек-тронтранспортной цепи в обход о - цикла. При этом окисляется К^ при участии цитохромоксидазы. В работе показано, что добавление цианида после внесония ь суспензию митохондрий вит. Кд и высоких концентраций миксотиазола вызывает полное подавление михоткэзол-нечуьствительную составляющую дыхания.*. Эти опыты дог.азив?. т, что миксотиазсл - нечувствительное дыхание при тжой постановке опыта обусловлено образованием иунтэ, осуществляющего перенос электронов с ДТ-ди£']юразы на терминальный участок дыхательной цепи е обход 0-цикла. Ниже будет показано, что работа этого_шунта специфически подавляется низкими концентрация® ионов 1п'г.

Таким образом, при существенном"повышении содержания бит. К3 в суспензии митохондрий возникает шунт, который осуиузотвляет транспорт электронов с. ДТ-диефоразы на терминальный участок дыхательной цепи в обход о-цикла. Интенсивность этого шунта регулируется путем изменения обЪема матрикса митохондрий и концентрацией К5 Схема электронного транспорта в этих условиях приведена на рис. 4, А. Су-щость&ншм фактором, контролирующим цианрезистентность миксотиазол - нечувствительного шунта является последовательность добавления менадиона и цианида. Цианид - чувствительный шунт возникает только при том условии, если цианид добавляется в конце пробы после вит. К3 и миксотиазола.

В следующем разделе будет приведено описание качественно иной системы - миксотиазол-нечувствительний шунт, который не подавляется цианидом; он индуцируется при обратном порядке добавления цианида "1 вит. Ко- •

*Эффект цианида зависит от начальных условий опыта. Если цианид добавлен после К3 ( и миксотиазола ), он вызывает полное ингибирова-ние дыхания. Если цианид добавлен к митохондриям до ка, в присутствии миксотиазола мозшо наблюдать вполне измеримое дыхание - изменяется механизм электронного транспорта.

а

дт-домраза-—------га~

1 ^ } I

' г----'

МАЛАТ-ЯГ------"АСН-ЛГ—^----°Н

и

-яг

/

•= 4 г

ЛТ-В1АМРАЗА----------^„„„„с, а.аз----~Ог

Л

N ,

-^Г \ "Ъя /

¡у

'кз

Рис. 4. А. Схема переноса электронов в условиях работы миксотиазл-нечувствительпого шунта. /Цианид добавлен после менадиона/.

Б. Работа О-цикла при цианрезистентнэм дыхании в присутет-вии менадиона. /Менадион добавлен после цианида/.

~а -- - - -

ДТ-ДКАЮРАЗА'

ИАЛАТ-ДГ-—КАШ-ДГ-

их ксотиаэол ¿.и

3

Рис. 5. Две альтернативные схемы электронного транспорта при работе миксотиазол -нечувствительного шунта в условиях цканрсзис-тентного дыхания.

2.2. АУТООКМСЛШМЕ ВОССТАНОВЛЕННОЙ ФОРМЫ К3, ОБРЛЗЗДЕИСЯ В

начальном участки тщательной системы митохондрии (миксотиаэ 1£шэд-нечувствитешш кд -шунт).

В настоявдй части работа описана система электронного транспорта митохондрий, которая не подавляется высокими концентрациями миксотиазола и цианида. Она индуцируется в присутствии Молата/глута-мата и ротенона в том случае, если высокие концентрации К3 добавляли к суспензий митохондрий после того, как был внесен ингибитор цктохромоксидаяы-цианвд. В ?тнх специфических условиях индуцируется См-^резистентное дыхание, которое только на 40-50* ингибируется миксотиазолом, (рис. 6,Б).

Таким образом, параметры потока электронов, нечувствительного к высоким концентрациям миксотиазола, качественно чзменяются в зависимости от начальных условий опыта. Такими свойствам обладают существенно нелинейные ггроцессы. Из сопоставления начальных условий опыта можно заключить, чти параметром,■с которым коррелирует эффективное образование аутооксидабольной формы вит.К3 в присутствии цианида, является степень восстановленное«! ьлектронтранспортной цехи в момент добавления К3. Если К3 добавлен лоеле цианида, индуцируется цианрезистентное миксотиазол - нечувствительное дыхание. Последующее добавление антимицина А не блокирует это дыхание. Питч лторный анализ показал, что антимицин А вызывает такой же аффект, как и миксотиазол - он ингибирует цианрезистснтное дыхание ир:э/ерно на 50* - половина потока Электронов не подавляется этим ингибитором. (рис.б.А.Б).

Тьким образом, дело не в специфическом блокировании о-центре с-ци-кла. Очевидно, что в этих условиях существенны?.', фактором является рпботи всего й-цикла. Существование миксотиэзол-нечуЕСТЕИТельного Ц'.'.анре?.:стентного дыхания было бы возможно по д^ум причинам: 1 -возникает сунт в обход <э-цш<ла, при этом в образовании еутооксида-сельной фермы К3 принимает участие фрагмент дыхательной цеци между с-центром и иитохромоксидазоП (Увк1ез1се и цитохромы с,+с), рис. 5"А Г.-шсоко а у 1-оок сидабельная форма К3 индуцируется непосред-

ственно а начальном участке дыхательной системы митохондрий (до 0-цпо.з). рис./Б.

ДГ-Дкафррзза

мкм мяксотиазол

Рис.6. Влияние антимицина А (А) и миксотиазола (В)

на цианрезистентное окисление малата/глутама-та в условиях функционирования ДТ-диафоразы. В среду инкубации (состав, см. в разделе

«Материалы-и метода исследований") добавлен .

ротенон 4мкМ; 1-тоничность 400 мосМ, 2 -тоничность 120 мосМ.

Ранее было показано, что ионы цинка специфически блокируют влектронный транспорт в области негемоього Уер1е„к9- В этих же работах говорится также, что МАШ - фумарат - рещктазная активность СМЧ не подавляется низкими концентрациями

Проведанный нами кнгибиторный анализ показал, что гпС12 в относительно низких концентрациях подавляет миксотиазол-нечувствительное дыхание митохондрий в условиях опыта (при последовательном добавлении к митохондриям малата/глутамата, УССР, СН~, 2п+2, К3), ■ рис. 7. Иагибирувд!й эф^кт ионов ц'ичка говорил в пользу образования шунта- в обход о - цикла. Однако, в митохондриях, в отх/чие от СМЧ, в систему электронного транспорта включена малат-дегидрогена-па, которая может являться объектом атаки ионов Нами были

пек, пилоны контрольные опыты, в которых исследовалась чувствительность к ионам цинка миксотиазол-нечувствителького цианрезистентно-го дыхнния б условиях, когда начальный участок дцхат иной цепи не икл&чоя г; систему электрончого аранспорта. Было показано, что ионы ци:<ка в низких концентрациях не икгибируют дыхания в такой системе (порядок добавок: мх, сукцинат, УССР, ротенон, См~, К3, мик-

соглазол /. При окислении сукцината, так же, как и при окислении малата, мпксстиазол подавляет цианрезистентное дыхание на 30 - БОЯ (при 400 мосМ). Присутствие ионов цинка практически не влияет на скорость оставшегося, мнксотиазол-нечувствительного дыхания. Этот р< ..льтат не согласуется с выводами о том, что в аналогичных условиях при окислении малата ге^сз1;е участвует в катализе оутоокис-леиия восстановленных форм менадиона. Напротив, он скорее говорит в пользу того, что процесс аутоокисления К3 инищшрувтс : в самс.м мачьле дыхательной системы митохондрий; при этом объектом атаки ионов цинка мокет бить мплат - дегидрогеназа ( возможно, что ионы цинка блокируют сопря.'иьаые с ней ферменты ц'шш Кребса). ■ П.З- ¡ГН.'.Р!!р03аш5 МЛЛАУ-^ТОХЩЮН-РКДУКТАЗЫ НИЗК'.Ш КОНЦЕНТРАЦИЯМ Г-'ГТ! Г^ГКА.

В предыдущем разделе Сило показано,-что непротиворечивое оОЪяс-снешм данных ингибиторного анализа выводов работ ( Зки1аоЬау ег л!., 1у<Э7: 1о:-ил£,о «а а1., 1991) состоит в том, что цианрезистент-иаэ 1.шксот1П1?ол-нечувстБит&льно--- дыхание в присутствии К3 обуслов-

лено образованием ьутооксидаОельнсй реакции К3 в начальном участке дахательной система митохондрия. Ионы цинка ингибируют этот процесс (рис. 7).

Как показал анализ имеющихся данных, Zn0l2 в низких концентрациях должен подавлять самые начальные стадии дыхательной системы митохондрий, например, малат - дегидрогеназу. в литературе тагам данные отсутствуют, однако, хорошо известно, что ионы цинка EiMeit-тирно подавляют Функцию FeRieske. Наиболее удобной системой, позволяющей на целых митохондриях исследовать действие ионов цинка hs начальные звенья системы окисления малата является малат-дуро-хинон-редуктаза. Опыты проводились в присутствии малата, антимици-на А, блокирующего работу Q - цикла и 150 мкМ дурохинона, которьй использовали как акцептор электронов. Протекание реакции изучали путем регистрации спектров дурохинона и дурогпдрохинона в интервале длин волн 210-310 нм. В условиях опыта происходило относительно медленное восстановление дурохинона в дурогпдрохинол. Полное восстановление происходило приблизительно за 10 миь. (р:гс.8,а). Когда в системе исходно присутствует дикумарол, 150 мкМ дурохинон и ан-тимицин Л, Процесс восстановления дурохинона эффективно подавлется ротеноном (рис.8,б). Если до добавления дурохинона в суспензию митохондрий вместо ротекона внесены 67 мкМ ионов цикка, процесс восстановления дурохинона рез) > замедляется (рис. 8,в). Эти опыты доказывают, что в начальном участке дыхательной системы митохондрий есть звено, которое подавляется ионами цинка.

В другой серии опытов-при рабо.-е ДТ - диафоразного шунта в присутствии высоких концентраций дурохинона и антимнцина л наблюдается аналогичная картина. Дурохинон эффективно восстанавливается с десятиминутной кинетцной (рис. 9,а). Процесс подавляется дикумаро-лом (рис. 8,6) и, что существенно, - низкими концентрациями znCip,, (рис.9,б).

Результаты не оставляют сомнения в том, что ионы цинка в ыпких концентрациях подавляют начальные стадии процесса пер^юса электронов с малата на дурохинон в митохондриях, то есть, малат-догзд-рогеназу или сопряженные с ней ферменты цикла Кребса.

MOjr

-20'

м

10

-V

о......20 "lo cr; so

Z N С i r, . И к И

230* irc

¿70 .л

310мм

Рис,7. Влп.иш:з ионов цинка на скорость цианрезистен'шого дыхания митохондрий в присутствии ЭС) ыкМ менадиепа. То-шчноси среды инкубации -400 ыосМ. 7,пС12 вносился перед добавкой К3: 1-скорость дыхания в первую минуту после добавки К3. 2-скорость дыхания через о мин. после добавки Кд.

Рис.8. Влияние низких концентрации хю"ов цинка на малат-дурохинон-редук-тазну» активность митохондрий. В среду инкубации добавляли: 0,5 мг /мл белка митохондрий; малат / глутамат - 4 мМ,

?ССР - 0,94 мкМ, антими-щщ А-2,5 мкМ; 8)-дику-марол-80 .".'.1 и прописали

'Ли. L 'j in ¿иОмМ 2Х**л

г'to мп

3l0nn

нумиуо .".i'.hhyi (к-.? юкгзанэ): 1-добьька дурохинена 150 мкМ; 2-то Zf .Чсу-з Ю My.h.; С )-д,!.кумьро.':-30 нМ, ротенон-ч икЫ и прописали ¿Qviii'yiv лини? ibi показан о): l-добавха дурлхинона 150 ккМ. 2-то члреэ 10 Kiui.; в )-дик}'Мйрол-60 нМ, ZnCl^-r? . кМ и прописали к;,лзш» ¡не показано): i-добавка дурохадона 150 мкы, 2-то • 'С ИЙ,

Таким образом, результата настоящей част.; раОоти с висе.'.ой степенью вероятности говорят б пользу того, что даханио. которое индуцируется высокими концентрациями к3 в присутствии ротенопа и цианид? и не подавляется мкксотиазолом, обусловлено катализом процесса аутоокисления восстановленной формы менадиона. Катализ реализуется в первом когиллексе дыхательной цепи митохондрий, процесс протекает только в том случае, если окисленный мэ;;йдаон добавляется к митохондриям, в которых Ферменты дыхательной цепи почти полностью восстановлены путем добавления цианида.

Кроме того, обнаружено еще одно место действия низких концентраций ионов цинка, а именно - на начальное звено дыхателмюй системы митохондрий.

Рис. 9. Влияние низких'концентраций ионов цинка на малат_-дурохи-нон-редуртазную активность митохондрий./ДГ-диафораза функционирует/,. К митохондриям добавляли:малат/глутамат-4 мМ, FCCP-0,94 мкМ, антимпцин А-2,5 мкМ: а)-ротенон-4 мкМ и прописывали нулевую линии /не показано/: I-добавка дурэх;:-нона 150 mkIJ; 2-td же через 10 глпн.j (JJ-ротенон -4 мкМ, 2лС£2-67 г/kjM и .прописывали нулевую линию /не показано/': I.-добавка дур эхин она -150 ¡жГ,1: 2- то же через 10 м;ш.

БЫВОДЫ

1. Показано, что менадион может индуцировать ь дыхь.ельной системе митохондрий несколько (четыре) альтернативных путей переноса электронов на кислород.

2. Обнаружены и охарактеризованы два пути миксотнээол -нечувствительного дыхания в присутствии менадиона.

3. Охарактеризована зависимость относительной интенсивности ллмч-рнативинх путей переноса электронов в присутствии полярных хпнонов ( '.:енадаона и дурохинонэ ) от ряда параметров: структуры и концентрации .хинсюв, топичности среды ингубацш! митохондрий, а так:.) от присутствия в систвмо ингибиторов электронного транспорта (ро'. нона, дикумарола и цианида), изменяющих степень восстановлен-ностй дыхательных переносчиков.

л. Обоснованы конкретные блок-схемы меяадион -зависимых путей |.локтронно1х> транспорты митохондрий при окислении малата.

5. Получены данные, показывающие, что низкие концентрации иоши цинка блокируют окисление малата в самом начале дыхательлой систомы ипохондрий - иа стадии восстановления МАШ+.

6. Высказано предположение о том, чао одним из ваип": пара-' .метров, опрвдблихшх относительную интенсивность путей электронно го транспорта в присутствии вит. Кд является соотношение окисленной ц восстановленной форм менада: зна в стационарном резшме дыхания.

РЛГ.СЛИ, ОПУВЖКОВЛННЫЕ ПО ТИЙ ДИССЕК.'Ац,Л . Колосова Г. М., Карнаухова Л. В., Ягукинсшй Л. С. Бза'людеист-ьио моьадпова и дурохинонн с о-циклом в условиях функционирования ДТ-дие<}оразы.//Биохимия. - 1991. - Г. 56, вып. 10,

Заказ ."• Ш от 6.05.— г. Тирах Ю0 экз.Отпечатано в отделе печати 1.ТУ