Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ, ДЛИТЕЛЬНОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ И КРИОСОХРАНЕНИЕ IN VITRO МАЛИНЫ КРАСНОЙ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ, ДЛИТЕЛЬНОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ И КРИОСОХРАНЕНИЕ IN VITRO МАЛИНЫ КРАСНОЙ"

h~31b1i

На правах рукописи

МОХАММЕД АБДУЛВАСИ ИБРЛХИМ

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ, ДЛИТЕЛЬНОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ И КРИОСОХРАНЕНИЕ IN VITRO МАЛИНЫ КРАСНОЙ

(03.00.23 — Биотехнология растения)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 190S

с//&/ШМЙ

Работа выполнена во ВНИИ растениеводства им, Н. И. Вавилова (Санкт-Петербург) и в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (Москва).

Научные руководители: чл.-кор. РАН, акад. РАСХН, проф. Бутенко Раиса Георгиевна; кандидат биологических наук, доцент Калашникова Елена Анатольевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф. Мазин В. В.; кандидат биологических наук Высоцкий В. А.

Ведущая организация — Главный ботанический сад РАН.

Защита диссертации состоится . '.¿7 ^/¿у-з, . 1998 г.

в . /(. . часов на заседании диссертационного совета

Д,020,40.01 во Всероссийском научно-исследовательском

институте сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, ул. Тимирязевская, д. 42),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан........ 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета — кандидат биологических наук

С. Л. Мелнкова

Актуальность проблемы. Клональкое кикрораэмкожение имеет Оольягое значение в оздоровлении и ускоренном размножении редких, генетически ценных растений, а также хозяйственно-важных и новых сортов сельско-хозяйственных культур. Этот метод позволяет получить большое количество оздоровленного идентичного посадочного материала, однако из-за отсутствия единого подхода к выявлению бптинальных условий выращивания растений калины in vitro возникает необходимость их усовершенствование.

Постоянные пересадки растений in vitro довольно трудоемко. Поэтому важное значение в создании коллекции вегетативно размножаемых растений in vitro получает метод длительного беспересадочного хранение пробирочных растений при низких положительных температурах. Депонирование позволяет уменьшить затраты труда и времени, сэкономить расходы на реактивы. Однако поиск путей создания благоприятных условий для длительного беспересадочного хранения пробирочных растений является актуальной проблемой.

Особый интерес для сохранения генофонда вегетатив-но-размиожаемых растений представляет криосохраненне изолированных апексов меристем. Этот метод полностью прекращает рост растительных материалов в период их хранении. Изучение всего комплекса криоконсервации изолированных верхушечных меристем и регенерации эксплантов после крносохранения имеет

Цель н задача исследования. Цельо диссертационной работы являлось создание длительно храняяихся коллекции in vitro

дом культуры изолированных апексов;

2. изучить влияние состава питательных сред на разных этапах культивирования зкспдактов!

■ ' . 3. определить морфологические особенности разных сортов малины красной на всех этапах клонального инкроразмножения; 4. исследовать воэножность лрщенения жидкой питатель-

большую практическую' и научную ценность

свободных от грибных и бактериальных инфекции, тестированных растений малины красной.

В работе были поставлены следующие задачи: 1. исследовать возможность оздоровления растений ието-

5. изучить влияние питательных сред разного состава на длительное беспересадочное хранение пробирочных растений малины при пониженной температуры (+2°С,слабое освещение);

6. определить сортовые особенности малины красной при длительной беспересадочной хранении,пробирочных растений;

7. выяснить возможность крносохранение изолированных апексов меристеи налины краской в жидком аэоте.

Научная новизна. Усовершенствован процесс клокального микроразкножения растений напины красной. Проведен подбор питательных сред на всех этапах культивирования растений малины красной. Изучена зависимость размножения и укоренения ' никропойегов налины красной от минеральных и гормональных факторов питательной среды* Впервые изучали действие жидкой питательной среды на формирование боковых побегов и корней стерильных растений малины красной в цилиндрических сосудах на аппарате роллерного типа. Разработан аффективный способ повишения жнэнеспособности пробирочных растений калины красной при их длительной беспересадочном хранении. Доказан* возможность попущения целого растений после криоконсервации изолированных верхушечных меристем налмш красней ь жидко» азоте.

Практическая значимость. Применение предложенной технологии клепального нихрораэннажения позволить оздоровить от грибов и бактерии генетически ценные и хозяйственно-важные сортов, ускорить их размножения И обеспечить получение посадочного Материала в Необходимо« количестве. Созданные условия культивирования способствует сохранении в течение 12 не-сяцев, при пониженной температуре {+г°С,слабое освещение или темнота) 60-100% пробирочных растений налины красной, разработанный способ получения целого растения после криоконсервации изолированных апикальных меристем дает возможности сохранений генофонда растений налины красной.

Внедрение в практику. Растения разных сортов налины красной, полученные методом клонального микроразмножения использовались для закладки неточных насаждений на участке коллекции малИНУ па&лбйск&й опытной станции ВИР.

Публикации, По теме диссертации »публиковано 3 работы.

Апробация работы. Передано в печать 2 работы.

Структура диссертации. Диссертация соатеит на введения, обзора литературы, экспериментальной части, вкяючасщай описание материала и методов работы, обсуждение проведенных экспериментов, выводов и список литературы включающего 145 наименования. Работа инеет обаий объем 104 страницы, содержит 11 таблиц н 34 рисунка.

Материалы и методы исследований

Объекты. Объектом исследований служили верхушечные меристемы калины красной (Rubus idaeus L.) различных сортов. Исследования проводили со следующими сортами малины российской и зарубежной селекции: Ласточка, Ивумка, Глория, Ракета Высокая, Таганка, Дальняя, Новость Куч*, мина. Ран я я заря, Китае век ая , Лесная, Скромница, ФоягаЯЯ, *рстивал, Хайда, Роя-лити, Иова и Польша.

Применение техники in vitro &ия «лриддьного никрораэм-ножения побегов калины. Почки 1~2 НИН, погрузили в раствор этилового спирта (701) и трех-кратко лрокыеали стерилизованной днетилирова ной водой. Затем гючш стерилизовали 16% раствором перекиси водорода на 10 нин, Изолированные верхушечные меристемы с г-прииордиальныин досточкани культивировали на среде индукции (среда КС, содержащая на 1/2 уменьшенные минеральные СОЯИ, 6-ЕАП Н'ИУК - ПО 1КГ/Я).

На этапе нихрораэкноження растений микропобеги

пересаживали на среду для размножения (среде НС, содержащая на 1/2 сокращенные солей . нитратов, 6-БАП-1мг/л и та.-а,1нг/в). Побеги укореняли на более бедкой питательной .сред« <среда КС, содержащая в 5 раз разбавленные макроэлементы и ЮОС-0,й1иг/л). Укорененные пробирочные растения высаживали в ■торфо-яючвеиный субстрат <3:1). На этих этапах эксперименты проводили со следующими сортами; Ласточка, Ивулка, Ракета, Гяорм», высокие, -Фолгвлд, Хайда, Роллити,

а. выращивание про&ирочльпе рлепенмй »существаяли при

температуре 25+2°С, освещений ЗОООлк. , фотогтериода 16ч.

Применение жидкой среды при клонайьнон никрораэнножении побегов налимы красной. В экспериментах по применении жидкой питательной среды для культивирования малины красной, исследования проводили с иикрогтобегаки сортов Ласточка, Ивушка, Глория, Фолголд и Хайда. Изучали действие различных жидких сред отличающихся друг друга по составу генеральных солей и гормонов. Микропобеги культивировали в циплиндрических сосудах на аппарате роллерного типа. Контрольными условиями были микропобеги культивированные в аналогичной агаризавЪаной_питательной среде.

Хранение пробирочных растений при пониженной, температур' ре. В работе с длительным беспересадочным хранением растений in vitro в качестве объектов исследований использовали пробирочные растения малины красной сортов Ластова, Ивушка (российской селекции); Фолголд и Хайда (зарубежной селекции). Первоначально микропобеги культивировали на среде укоренения в течение 10 дней затеи были пересажены на среду для хранения {в разных вариантах). Длительное беспересадочное хранение пробирочных растений осуществляли при. температуре +2°С со слабым освещением или темнотой.

Криоконсервация изолированных апексов меристем малины красной, в опытах по криоконсервацию объектами исследований были изолированные апексы меристем закаленных пробирочных растений (+2-4°С,темнота) малины красной. Эксперименты проводили с эксплантами сортов Скромница и Ласточка. До замораживания, растительной материалы была обработана.жидкой питательней средой: содержащей DM50. Быстрое и медленное замораживание эксплантов осуществляли в крноанпулах, с раствором криолротекторов, в жидком азоте более 1 час. В процессе кри-оконсервации изолированных алексов меристем малины красной, изучали влияние сахарозы, глюкозы, 6-БАЛ и TDZ. После 'оттаивания в баш (+40°С) экспланты культивировали на агарисованной среде.

Результаты исследований

1. Клональноо никрораэгшожение калины красной

Получение оздоровленных растения-регенерантов из изолированных апикальных меристем

успех получения оздоровленных растения-регенерантов зависит от размера первичного экспланта. Как показали результаты исследований культивирование изолированных апикальных меристем размером 0,3-0,ьмм (с 2 лринордиальными листочками) приводило к получению растения-регенерантов свободных от грибных и бактериальных инфекции. Однако использование экс-плантов в выше указанных размерах привело к снижению ре гене-рацноной способности апикальных меристем малины красной. Уменьшение минеральных солей на 1/2 нормы среды мурасиге и Скуги и добавление в Среду б-БАЛ и ИУК - по 1кг/л способствовало к увеличению морфогенеза апикальных меристем малины. В упомянутых условиях культивирования выход растений из иэо-

Прижиеаемость (4) эксилантов налимы красной на этапе введения в культуру изолированных апикальных иеристен(0,3-0,5мм)

приживав' мость эк-сплантов

55 -50 -45 ■

и

Ф г ВХ ЯФС РОИ название сортов

Р К ЛС Н

Примечание: П-Польша, ф-фолголд, Г-Глория, В-Высокая, Х-Хайда, Л-Ласточка, ФС-4-естивал, И-11вушка, Р-Ракета, К-Китаевская, ЛС-Лесная, Н-Нова

лированных апикальных меристем малины красной составлял 7-37% в зависимости от сорта. В данной среде побеги индуцировались не пас родственно из керистекной ткани без формирования каллусов. При проведении тестирования по выявлению бактериальных и грибных инфекции, полученные растения-регене-рантов в 100% случаях оказались оздоровленными л

Размножение растения «алнны красной в условиях in vitro

Культивирование микропобегов малины красной на питательных средах отличающихся друг друга по составу минеральных солей и гормонов приводило к различием по формирование боковых побегов.

Проведенные исследования показали, что при культивировании микропобегов в разных вариантах питательных сред, наилучшее формирование дополнительных боковых побегов и листьев происходило на средах с пониженной концентрации азотсодержащих солей в присутствии БАП~1нг/л, а также ИНК-0,1мГ/Л или ИУК-1мг/л по сравнении о контролем (стандартная среда МС), По полученный реэульт^фам формирование относительно максимального числа боковых побегов и ли<г*едмх па&сттюк отмечалось на среде МО, содержащая 1/2 норм« азотсодержащих соней, БАП-1НГ/Л и ИМК-0,1мг/л. В данной среде я редких случаях, для некоторых сортов наблюдалось образование кадлусной ткани в 6азальной части пробирочных растений, .приводящие к снижению числа дополнительных побегов. В тоже время при культивировании микропобегов в другом варианте питательной среды (среда НС, содержащая 1/2 нормы солей нитратов, ЕАП и ИУК -по Хкг/л) формирование халлусообраэных структур я базальнов части пробирочных растений полностью отсутствовало, Однака из-за незначительного преимущества по образованию дополнительны* боковых побегов, а также рост основных побегов £ длину среда МС, содержащая на 1/2 уменьшенную азотсодержащих солей, &АП-1ИГ/Я и ЧИК-о,1пг/,и била подобрана как наиболее эффективной и применена длд определения сотовых особенностей малину красной в условиях in vitro.

Влияние состава питательных сред размножений на развитие пробирочных растений малины красной

Ласточка Польша

название среды длина побега число листьев число боковых побегов длина побега число листьев число боковых побегов

среда-N 1 среда-К 2 среда-N 3 49,8+0,6 95,3+7,8 72,9+4,4 25,3+3,0 47,0+7,1 41,1+2,6 2,4+0,4 3,9+0,6 3,8+0,4 59,3+5,1 8 3,0+6,3 61,7+3,3 48,5+4,6 68,9+7,2 36,3+3,4 2,9+0,6 5,1+0,8 4,3+0,6

Примечание: среда-N 1 - среда 11С, содержащая БАП-1кг/л и ИМК-0,1кг/л

среда-Н 2 - среда КС, содержащая на 1/2 уменьшенные азотсодержащих солей, БАЛ-1нг/л и ИМК-0,1МГ/Л

среда-N Э - среда ИС( .содержа Да я на 1/2 сокращенные азоТйоДерйамИХ солей, ВАЛ и ИУК tie 1мг/л

Сортовые особенности растений малины красной в условиях in vitro на среде размножения

Культивирование микропобегов на подобранной среде размножения показало, что все исследуемые сорта в разной степени реагировали на условия выращивания. Эти различия проявились в интенсивности роста основного побега, формировании дополнительных боковых побегов и листовых пластинок.

В проведенном эксперименте была установлена, что интенсивность роста микропобегов завесить от сортовых принадлежности. Результаты наших данных показали, что средние высоты пробирочных растений у разных сортов колебался от 24-65нм. Причем сорта с минимальной "Фолгвяд" и с максимальной высотой побегов "Хайда" различались почти в трое* одновременно с учете« интенсивности роста кикрапвбеГо» были отмечены сортовые различия Ш способности основного и боковых побегов формировать листовых Пластинок. Полученные результаты показали, что сорта Польша, Фолголд, Роялити, Ивушка, Ласточка способны были образовывать а средней по 45 шт. И более листьев на одном пробирочном растении, в Го Ьреия сорта как Ракета и Высокая - менее 35 шт.

Несомненно, основное ПреИмувёйтво клонального микро-

размножения перед традиционными способами является получение высокого коэффициента размножений. Культивирование кикропо-бегов калины красной сортов Фалголя, Ласточка, роялити, Ивушка, Польша, Хайда, Глория и Ракета проводило к образованию в среднем больше 5-9 дополнительных боковых побегов. В то время сорта как высокая способен был формировать линь 3 минропобега с одного основного побега.

Таблица И1

Морфологически особенности пробирочных растений разных сортов малины красной на среде размножения (среда МС, содержащая 1/2 солей нитратов, БАП-1нг/л и ККК-0,1кг/л)

название х число lia до- х длина lin x число lia

сорта дополни- допол- побега длины листьев числа

тельных тельных (мм. ) побегов (ат.) листьев

побегов побегов (ат. )

(шт. ) (шт. )

Ласточка 7,7+0,7 3-1Э 50,0+4,7 23-SO 60,4+6,4 27-97

Ивушка 6,4+0,В 3-12 55,5+9,2 19-118 51,2+7,1 13-109

Глория 5,1+0,4 3-S 47,4+6,4 17-96 37,1+4,3 13-63

Ракета 4,8+0,5 3-9 39,5+4,4 18-72 33,3+4,1 16-65

Высокая 3,3+0,6 1-7 40,0+4,5 13-74 23,9+4,4 12-72

ФолголД 8,5+0,7 4-15 23,7+2,0 13-33 47,8+6,5 20-93

Хайда 5,4+0,6 2-16 64,9+5,4 32-115 39,4+5,4 13-88

РоялКТИ б,6+0,7 4-13 50,8+5,2 26-94 50,0+3,1 16-9©

Польша 3,9+0,7 3-13 32,6+2,8 18-55 45,9+5,4 17-96

Сортовые особенности растений налины красной в условиях in vitro на среде укоренения

Культивирование никропобегое разных сортов'малины Краской на среде укоренения <среда НС, содержащая в s раз разбавленные макроэлементов и ИКК-0,01иг/д) к нормальному росту побегов с одновременный формированием кормевоЯ системы. Однако было отмочено различие кежду сортами по укореяяемостн иикроггобегов в одинаковых усяовмях культивирования. '

Как показали речультвтм на**х данных, к* внве указанной среде, сорта Высокая, пакета, Полым,Ласточка, Нвувка, Глория обеспечивали високмЛ процент укореня«мости побегов {больае в тоже время сорта Роя дитя, Фол го л д и Хайда

проявили пониженную способность к укоренению (70-75*). Во всех вариантах наблюдалось формирование в среднем от 3 до 6

от. корней со средней длиной главного корнй от 16 до ЗОкн.

Культивирование михропобегов палиям красной на средо укоренения способствовало к росту побега с одновременный формированием листьев. Однако нами была отмечена эависиность средней длины побега от сортовых особенностей пробирочных растений, в проведенном эксперименте, после 4 недельного культивирования, сорта Польша, Ракета, Глория, Хайда и Ласточка имели наивысшие средние длины побегов (42-5Ьмн). В тоже время сорта ивушка, Высокая, Роялити и Фолголд проявили относительно пониженную активность к росту побегов (35-40).

Таблица N2

Морфологические особенности пробирочных растений разных сортов малины красной на среде укоренения (среда МС, содержащая 1/5 нормы макросоли И ИМК-0,01кг/л)

название х длина X число X чнело х длина % укоре-

сорта побега листьев корней главного няемости

(им) (шт.) (шт.) корня (ми)

Ласточка 42,4+2,7 11,1+0,5 4,5+0,4 30,2+2,8 98,0+2,0

Ивуока 40,0+2,6 11,6+0,6 5,3+0,5 29,6+2,9 97,0+2,9

Глория 44,5+3,1 12,1+0,6 4,3+0,5 24,1+1,6 91,0+2,7

Ракета 52,2+2,9 14,5+0,6 4,5+0,4 25,6+2,2 98,0+0,9

Высокая 39,7+3,1 12,3+0,7 5,9+0,5 26,6+2,1 100,0+0,0

Фолголд 34,6+3,5 15,3+0,9 2,8+0,4 22,1+2,0 75,0+0,4

хайда 44,3+1,7 18,6+1,3 2,6+0,3 27,8+1,в 71,0+2,0

Роялити 37,2+3,1 14,1+1,1 3,4+0,4 20,3+1,4 73,0+4,7

Польша 55,4+3,9 16,0+1,3 5,2+0,4 16,3+1,9 ^8 ,0+1,7

Культивирование микропобегов на среде укоренения приводило к снижение формирования листьев, что положительно влияет на адаптацию при переносе на почвенные субстраты. На среде укоренения побеги формировали листьев в среднем 11-16 «т. в зависимости от сорта. Полученные результаты могут нкеть определенное значение в селекционной работе малины храсход.

- 10 -

Перенос выросших в пробирках растений малины красной в почвенные субстраты

Проведение прелварительной акклимитизации укоренившихся побегов непосредственно в Пробирках к окружающей среды и адаптации к торфо-почвенным субстратам, при переносе пробирочных растений в нестерильные условия, обеспечивало высокий уровень приживаемости растений малины красной, в период адаптации растения были покрыты баночками, чтобы снизить уровень транспирации на 2-1 недели и сохранить их в влажном состоянии. Одновременно с этим растения поливали растворами (1/2 минеральных солей среды МС и ИМК-1мг/л) в течение з недель с момента переноса пробирочных растений в почвенной субстрат,а дальше водопроводной водой. В указанных условиях адаптации о теплице выживали 100% растений сортов Ласточка, Хайда и Польша, 90% растений сортов Ивушка, Ракета и Роялити и лишь сорта Фолголд. Будучи пересаженными растения К*

поливой участок коллекции налимы ВНИИР все адаптированные растения нормально росли и плодоносили.

Таблица ИЗ

Приживаемость растений (%) разных сортов малины красной при переносе пробирочных растений в почвенные субстраты

название сорта в торфо-почве-ных горшочках на участке растений калины

Польша 100 100

Хайда 100 100

Ивушка 90 100

Ракета 90 100

Глория 90 100

Роялити 90

Ласточка 85 100

♦олголд 83 100

Развитие побегов малины красной в жидкой среде на аппарате роллерного типа

Для изучения влияния условий культивирования на формирование боковых побегов и корней, микропобеги пересаживали на жидкую и агариэовдкную среды. Первоначально, в проведен-

- Il -

НОИ исследовании было отмечено, что культивирование никроло-бегов в стандартной жидкой среде МС, содержащая БАП-1нг/л и ИМК-0,1иг/л привело к снижению формирования дополнительных боковых побегов по срааке! 1Ю с аналогичной агариэованной средой. При выращивании микропобегов на жидкой среде МС тлк- _ же наблюдалось такое явление как оаоднение стеблей и листовых пластинок верхушечной части побегов.

В связи о этим нами было изучено влияние состава питательных веществ на общее развитие побегов в условиях in vitro на жидкой среде. Было установлено, что уменьшение концентрации KH4N03, КМОЭ в 2 раза и увеличение КН2Р04 в 2 раза по прописью среды НС, а также добавление на среду Са(N03)2-708мг/л, сзхароэы-б*, ВАЛ и ИУК - по 1нг/л способствовало к улучшению формирования корфологически нормальных дополнительных боковых побегов и листовых пластинок.

Однако оценить эффективность предложенной питательной среды возможно лишь при сравнении ее с аналогичной твердой средой. Полученные результаты показали, что культивирование никролобегов сортов Ласточка и Хайда на жидкой среде наблюдалось через 5 дней с ноиента культивирования, а на твердой среде через 2 недели, скорость формирования дополнительных побегов « их рост свидетельствует, что необходимые для развития компоненты питательных веществ легко усваиваются на жидкой среде чем на твердой.

При возвращении побегов из жидкой среды на агаризован-ную среду морфологические отклонения » их развитии отмечено ие были.

Таблица N4

Развитие побегов малины красной на жидкой и твердой средах in vitro (седа МС, содержащая в 2 уменьиеннов NH4N03, ККОЗ н в 2 раза повышенные КН2Р04 по прописью среды МС, а также са(КОЗ)2-7О0иг/л, сахарози-6%, БАП и ИУК - по 1мг/л

название сорта число иик-ропобего'в (шт. ) укорененных побегов (%> число микропобегов (шт. ) укорененных побегов (*)

Ласточка 6,4+0,7 67,0 3,1+0,4 0,0

Глория 4, $+0,7 25,0 4,4+0,5 0,0

Фолголд 5,3+0,4 8,5 5,7+0,4 0,0

Хайда 4,6+0,5 34,5- 2,3+0,4 0,0

Длительное хранение растений малины красной при пониженной температуре в условиях in vitro

Культивирование побегов малины красной при пониженной температуре (+2оС,слабое освещение) в условиях in vitro приводило к медленному использованию питательных веществ и задержании роста пробирочных растений. однако была установлена зависимость жизнеспособность хранящихся стерильных растений малины храсной от состава питательных сред.

Результаты проведенных экспериментов показали, что культивирование побегов малины красной на безгормональной среде ИС способствовало к сохранению пробирочных растений я жизнеспособном состоянии, в течение 12 месяцев, 60-93%, а добавление на данную среду АБК-Змг/л привело к снижению жизнеспособности побегов до 7-57* в зависимости от сорта. На безгормональной среде пробирочные растения сортов Ласточка И Нвуыка (российские селекции) лучше сохранились чем Фолголд и Хайда (иностранные селекции), а на среде с АЕХ наоборот.

Наилучшее сохранение жизнеспособности пробирочных растений малины красной отмечалось также »а модифицированной среде КС,в которой сас12 заменена на Са(Ж>3)2 (70Эмг/л) и концентрации КН2Р04 увеличена в 2 раза с присутствием биологически активного вещества 6-БАП (1мг/л). Культивирование никропобегов в данной среде и хранение их при пониженной температуре (+2оС,темнота) в течение 12 месяцев, для обследуемых сортов обеспечивало высокий процент жизнеспособности пробирочных растений (71-100%). Добавление в выше указанную среду вместе 6-БАП осмотический ретардант - манит (4000МГ/Л) привело к снижению жизнеспособности побегов при их длительном хранении. В данной среде, в течение 12 месяцев хранения, жизнеспособные пробирочные растения составляли 36-57* в завис н кости от сорта.

Возвращение пробирочных растений в нормальные температурные условия (25+2оС) способствовало в восстановлению их ростовых процессов спустя один год хранения при пониженной температуре. А обновление питательной среды (среда размножения) приводило к формированию многочисленных дополнительных побегов. Результаты наших данных показали, что в обновленной

Таблица N3

Влияние состава питательных сред на длительное хранение пробирочных растений калины красной при пониженной температуре (+2оС)

тип питательных сред условия хранения срок хранения название сор т а

Ласточка Нвуака фолголд Хайда

среда N 1 слабое 1, 78,6 93, 3 64,3 60,0

освещение месяцев

среда Н 2 слабое 12 14,3 7,1 40,0 57,1

освещение месяцев

среда N 3 темнота 12 71,4 100,0 78,6 78,6

Месяцев

среда N 4 темнота 12 49,9 35,7 49,9 57,1

месяцев

Примечание; среда N 1 - безгормональная среда МС среда N 2 - среда МС с абк .

среда N 3 - среда КС, в которой СаС12 заменена на Са(Н01)2 и содержащая

КН2Р04—3 4 Омг/л, 6-БАП-1иг/л среда К 4 - среда КС, в которой СаС12 заменена на Са(КОЗ}2 и содержащая

КН2Р04- 3 4 Омг/л, манит-4000мг/Л

среде микропобеги формировали дополнительные побеги 9,4-12,2 шт.в зависимости от сорта, а до хранения этот показатель находился в пределах 5,4-8,5 шт. Образовавшие новые иикропобе-ги морфологически не отличались от исходных форм.

Криоконсервация изолированных верхушечных меристем малины красной

С целью повышения жизнеспособности апексов малины красной при криоконсервации испытывали влияние цитокининов 6-БАП, тог; сахарозы, глюкозы на питательных средах и в растворе криопротекторов.

Результаты проведенных экспериментов показали, что добавление сахарозы (61) и Тог (0,6мг/л) на средах для закаливания маточных растений в холоде (+2-4сС,темнота) и в жидкой среде для обработке для обработки изолированных апикальных меристем с СМЭО (7%) обеспечивало высокий процент приживаемости эксплантоа после прямого их замораживания с криопротекторам и (сахар0за-б%,0М50-ю1) в жидком азоте (-19боС). В

указанных условиях 70% изолированных апикальных меристем малины краской сорта Скромница приживались и регенерировались. Замена сахарозы на глюкозы в этом варианте привела к снижении жизнеспособности зксплантов до 33%, а использование 6-БАП вместе Т02 при пряном замораживании не дало положительных результатов.

Таблица N6

Влияние состава питательных средзакалевания и раствора криопротекторовх и цитокининов на регенерацию изолированных апексов* налины красной сорта Скромница после быстрого и медленного глубокого замораживания заноражнвания

среда закаливания* раствор криолротекторов % регенерации экспл.

при быстром замораживании при медленном замораживании после прям, эаморажив. после недл. заноражнв*

сахароза-6% TDZ-0,бмг/л сахароза-61 DMSO-10% сахароэа-6% DKSO-7% 70,0 21,5

Глюкоза-6% TDZ-0,бмг/Л глюкоза-6% DMS0 - 10% глюкоэа-б% DMSO-7% 33,0. 3,5

Сахароза БАП-5НГ/Л сахароза-б% DMSO - 10% сахароза-6% DMSO-7% 0,0 45,0

глюкоза-6* БАП-5КГ/Л глюкоэа-6% DMSO - 10% глюкоза-бt DMSO-7% 0,0 12,5

* среда не, кодифицированные для закалевания in vitro растений малины красной (t=+4oC, темнота)

Иная картина наблюдалось при медленном замораживании изолированных апексов малины сорта Скромница. Применение сахарозы (6%) и 6-БАП обеспечивало наивысшее жи^неспособности и регенерации экслланто» после недленного замораживания в жидком азоте (45%). В этом варианте замена 6-БАП на TDZ привела к снижению жизнеспособности зксплантов Скромница до 21,5*, а использование глюкозы вместе сахарозы стало малоэффективным (ниже 13%).

Применение в качестве цнтокинииов 6-БАП и TDZ на фон» сахарозы, для другого сорта Ласточка после медленного замораживании, также приводило к регенерации изолированных апексов меристем на 334 и ilfl соответственно.

Таблица N7

Регенерация изолированных апикальных меристем малины красной сорта "Ласточка" после медленного замораживании

среда заклевания* состав раствора х риопроте к торов регенерация зкеплантов

сахароэа-6%. сахароза-б% 23,1

БАЛ-2мг/л 0М5О-7%

сахароэа-6%, сахароэа-б* 46,7

ТО2-0,4МГ/Л ШЗО-7%

растений малины красной ("Ь=+2оС,темнота)

Во всех вариантах морфологические отклонения, в развитии побегов , после регенерации зкеплантов наблюдено не было Таким образом удалось установить, что сахароза является лучшим криопротектором при прямом и медленном замораживании изолированных апексов калины красной. Наиболее аффективным при прямом замораживании зкеплантов оказалось присутствие в питательных средах ТОг чем ВАЛ, л при медленном замораживании существенного различия между ниии обнаружено н<а было.

Выводы

1. В результате проведенных исследований был установлен размер экспяантов (0,3-0,5 ми) введенных в культуру для получения растений-регенерантов калины красной свободных от потогонных балезней.

2. Из испытанных комбинаций питательных сред,'.среда Мура сиге и Скуга содержащая в 2 раза разбавленные минеральные соли, БАЛ и ИУК - по 1мг/л способствовало индуцированию побегов из эксплантов маленьких размеров малины красной.

3. Уменьшение концентрации аэотсодержащвх солей в 2 раза по прописи среды мурасиге и Скуга и внесение 6-Бензилакинопурина 1мг/л на среду приводит к максимальному формирование боковых побегов.

4. Разбавление макроэлементов в 5 раз и добавление в среду ИНК - 0,01мг/л обеспечивает укореняеностн ннкропобегов малины красной до 70-1001. Побеги укоренивниеся на данной среде адаптируются при переноса в почвенные субстраты от 83-100%.

5. Применение жидкой питательной среды на этапе микроразмножения позволяет повысить коэффициент размножения некоторых сортов малины красной более в 2 раза по сравнению с аналогичной твердой средой.

6. Разработанные способы длительного беспересадочного! хранения пробирочных растений при пониженной температуре (+2°С со слабым освещением) обеспечивают сохранение жизнеспособности ряда сортов малины красной в течение 12 месяцев до 60-1004.

7. В проведенном исследовании была доказана возможность хранения изолированных апексов меристем малины красной в жизнеспособном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С) и получения из них, после криоконсервацни целого растения без морфологического откланения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мохаммед А. И., Бутенко Р, Г., Калашникова Е. А. Длительное хранение пробирочных растений малины красной при пониженной температуре // 3-й ежегодный симпозиум физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. М.( 1997. С, 41.

2. Мохаммед А. И., Бутенко Р. Г., Калашникова Е. А. Применение жидкой питательной среды для размножения малины красной in vitro при пониженной температуре // 3-й ежегодный симпозиум физико-химические основы физиологии растений и биотехиология. М„ 1997. С. 42.

3. Высоцкая О. М., Мохаммед А. И,, Бутенко Р. Г. Крио-консервацня меристем малины (Rubus idaeus L.) //Тез. докл. 7-й междун. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда», М., 1997, С. 519— 520.

Объем I п, л.

Заказ 132

Типография Издательства МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44

Тираж 100