Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроразмножение, длительное депонирование и криосохранение in vitro малины красной

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микроразмножение, длительное депонирование и криосохранение in vitro малины красной"

Р Г Б OA 2 1 АПР 1998

На правах рукописи

МОХАММЕД АБДУЛВАСИ ИБРАХИМ

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ, ДЛИТЕЛЬНОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ И КРИОСОХРАНЕНИЕ IN VITRO МАЛИНЫ КРАСНОЙ

(03.00.23 — Биотехнология растения)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена во ВНИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова (Санкт-Петербург) и в Институте физиологии растений им. К- А. Тимирязева РАН (Москва).

Научные руководители: чл.-кор. РАН, акад. РАСХН, проф. Бутенко Раиса Георгиевна; кандидат биологических наук, доцент Калашникова Елена Анатольевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф. Мазин В. В.; кандидат биологических наук Высоцкий В. А.

Ведущая организация — Главный ботанический сад РАН.

Защита диссертации состоится . . . 1998 г.

в . /(. . часов на заседании диссертационного совета

Д.020.40.01 во Всероссийском научно-исследовательском

институте сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, ул. Тимирязевская, д. 42).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан ........ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат биологических наук

Меликова

Актуальность проблемы. Клрнальное микроразмножение имеет большое значение в оздоровлении и ускоренном размножении редких, генетически ценных растений, а также хозяйственно-важных и новых сортов сельско-хоэяйственных культур. Этот метод позволяет получить большое количество оздоровленного идентичного посадочного материала. Однако из-за отсутствия единого подхода к выявлению йптимальных условий выращивания растений, малины in vitro возникает необходимость их усовершенствование .

Постоянные пересадки растений in vitro довольно трудоемко. Поэтому важное значение в создании коллекции вегетативно размножаемых растений in vitro получает метод длительного беспересадочного хранение пробирочных растений при низких положительных температурах. Депонирование позволяет уменьшить затраты труда и времени, сэкономить расходы на реактивы. Однако поиск путей создания благоприятных условий для длительного беспересадочного хранения пробирочных растений является актуальной проблемой.

Особый интерес для сохранения генофонда вегетативно-размножаемых растений представляет криосохранение изолированных апексов меристем. Этот метод полностью прекращает рост растительных материалов в период их хранении. Изучение всего комплекса криоконсервации изолированных верхушечных меристем и регенерации эксплантов после криосохранения инеет большую практическую' и научную ценность.

Цель и задача исследования. Целью диссертационной работы являлось создание длительно хранящихся коллекции in vitro свободных от грибных и бактериальных инфекции, тестированных растений малины красной.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. исследовать возможность оздоровления растений методом культуры изолированных апексов;

2. изучить влияние состава питательных сред на разных этапах культивирования эксплантов;

.3. определить морфологические особенности разных сортов малины красной на всех этапах клонального кикроразмножения;

4. исследовать возможность применения жидкой питательной среды при клональнон микроразмножении;

5.' изучить влияние питательных сред разного состава на длительное беспересадочное хранение пробирочных растений малины при пониженной температуры (+2°С,слабое освещение);

6. определить сортовые особенности малины красной при длительно« беспересадочной хранении,пробирочных растений;

7. выяснить возможность криосохранение изолированных апексов меристем малины красной в жидком азоте.

Научная новизна. Усовершенствован процесс клонального микроразмножения растений малины красной. Проведен подбор питательных сред на всех этапах культивирования растений малины красной. Изучена зависимость размножения и укоренения микропобегов малины красной от минеральных и гормональных факторов питательной среды. Впервые изучали действие жидкой питательной среды На формирование боковых побегов и корней стерильных растений малины красной в цилиндрических сосудах на аппарате роллерного типа. Разработая эффективный способ повышения жизнеспособности пробирочных растений малины красной при их длительном беспересадочном хранении. Доказана возможность получения целого растения после крйохонсервации изолированных верхушечных меристем малины красной В жидком азоте.

Практическая значимость. Применение предложенной технологии клонального шкрораэмножения позволить оздоровить от грибов и бактерии Генетически ценные и хозяйственно-важные сортов, ускорить их размножения И обеспечить получение посадочного материала в необходимой количестве. Созданные условия культивирования способствует сохранение в течение 12 месяцев, при пониженной температуре (+2°С,слабое освещение или темнота) 60-100% пробирочных растений Малины красной. Разработанный способ получения цельго растения после криоконсер-вации изолированных апикальных меристем дает возможности сохранения генофонда растений Налимы красной.

Внедрение в практику. Растения разных сортов малины красной, полученные методой клонального микроразмножения использовались для закладки Иаточных насаждений на участке коллекции малины Павловской опытной станции ВИР. .

Публикации, По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Апробация работы. Передано в печдть 2 работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала и методов работы, обсуждение проведенных экспериментов, выводов и список литературы включающего 145 наименования. Работа имеет общий объем 104 страницы, содержит 11 таблиц и 34 рисунка.

Материалы и методы исследований

Объекты. Объектом исследований служили верхушечные меристемы малины красной (Rubus idaeus L.) различных сортов. Исследования проводили со следующими сортами малины российской и зарубежной селекции: Ласточка, Ивуяка, Глория, Ракета Высокая, Таганка, Дальняя, Новость Кузьмина, Раняя заря, Ки-таевская, Лесная, Скромница, фолгояд, Фестивал, Хайда, Роя-лити, Нова и Польша.

Применение техники in vitro дад клепального микроразмножения побегов малины. Почки 1-2 ннн. погрузили в раствор этилового спирта (70%) и трех-кратно проживали стерилизованной дистилироваяой водой. Затеи гючт стерилизовали 16% раствором перекиси водорода на 10 мин, Изолированные верхушечные меристемы с 2-лримордиальнами янеточкдки культивировали на среде индукции (среда НС, содержащая на 1/2 уменьшенные минеральные соли, 6-БАП и'ИУК - до 1цг/л).

На этапе микроразмножения растений нланш, микропобеги пересаживали на среду для размножения (среда МС, содержащая на 1/2 сокращенные солей нитрато», 6-БАП-1мг/л и ИМК~в,1мг/л). Побеги укореняли на более бедной питательной среда {среда КС, содержащая в S раз разбаяленные макроэлементы и ЮЖ-0,01иг/л). Укорененные пробирочные растения высаживали а торфо-яочвениый субстрат (3:1). на этих этапах эксперименты проводили со следующими сортами: Ласточка, Ирушка, Ракета, Глория, Высокая, фолгояд. Хайда, Роялити, Польша, выращивание пробирочных растений осуществляли при

температуре 25+2°С, освещении 5000лк., фотопериоде 16ч.

Применение жидкой среды при клональном микроразмножении побегов налины красной. В экспериментах по применению жидкой питательной среды для культивирования малины красной, исследования проводили с микропобегами сортов Ласточка, Ивушка, Глория, Фолголд и Хайда. Изучали действие различных жидких сред отличающихся друг друга по составу минеральных солей и гормонов. Микропобеги культивировали в циллиндрических сосудах на аппарате роллерного типа. Контрольными условиями были иикропобеги культивированные в аналогичной агаризованной питательной среде.

Хранение пробирочных растений при пониженной,температуре. В работе с длительным беспересадочным хранением растений in vitro в качестве объектов исследований использовали пробирочные растения малины красной сортов Ласточка, Ивушка (российской селекции); Фолголд и Хайда (зарубежной селекции). первоначально микропобеги культивировали на среде укоренения в течение 10 дней затем были пересажены на среду для хранения (в разных вариантах). Длительное беспересадочное хранение пробирочных растений осуществляли при температуре +2°С со слабым освещением или темнотой.

Криоконсервация изолированных апексов меристем малины красной. В опытах по криоконсервацию объектами исследований были изолированные апексы меристем закаленных пробирочных растений (+2-4°С,темнота) малины красной. Эксперименты проводили с эксплантами сортов Скромница и Ласточка. До замораживания, растительной материалы была обработана жидкой питательной средой содержащей DMSO. Быстрое и медленное замораживание зксплантов осуществляли в криоампулах, с раствором криопротекторов, в жидком азоте более 1 час. В процессе кри-оконсервации изолированных апексов меристем малины красной, изучали влияние сахарозы, глюкозы, б-БАП и TDZ. После • оттаивания в бани (+40°С) экспланты культивировали на агаризовант ной среде.

- 5 -

Результаты исследований

1. Клональное микроразмножание калины красной

Получение оздоровленных растения-регенерантов из изолированных апикальных меристем

Успех получения оздоровленных растения-регенерантов зависит от размера первичного экспланта. Как показали результаты исследований культивирование изолированных апикальных меристем размером О,3-0,5мм (с 2 примордиальными листочками) приводило к получению растения-регенерантов свободных от грибных и бактериальных инфекции. Однако использование экс-плантов в выше указанных размерах привело к снижению регене-рационой способности апикальных меристем малины красной. Уменьиение минеральных солей на 1/2 нормы среды Мурасиге и Скуги и добавление в среду б-БАЛ и ИУК - по 1мг/л способствовало к увеличению морфогенеза апикальных-меристем малины. В упомянутых условиях культивирования выход растений из иэо-

Приживаемость (%) эксплантов малины красной на этапе введения в культуру изолированных апикальных меристем(0,3-0,5мм)

приживаемость эксплантов (*)

п Ф

Г В X Л ФС РО И Р к лс н название сортов

Примечание: П-Польша, Ф-Фолголд, Г-Глория, В-Высокая, Х-Хайда, Л~Ласточка, ФС-Фестивал, И-Нвуака, Р-Ракета, К-Китаевская, ЛС-Лесная, Н-Нова

лированных апикальных меристем малины красной составлял 7-37% в зависимости от сорта. В данной среде побеги индуцировались непосредственно из меристемной ткани без формирования каллусов,. При проведении тестирования по выявлению бактериальных и грибных инфекции, полученные растения-регене-рантов в 100% случаях оказались оздоровленными.

Размножение растения малины красной в условиях in vitro

Культивирование микропобегов малины красной на питательных средах отличающихся друг друга по составу минеральных солей и гормонов приводило к различием по формированию боковых побегов.

Проведенные исследования показали, что при культивировании микропобегов в разных вариантах питательных сред, наилучшее формирование дополнительных боковых побегов и листьев происходило на средах с пониженной концентрации азотсодержащих солей в присутствии БАП-1мг/л, а также имк-0,1нг/л иди ИУК-1мг/л па сравнение с контролем (стандартная среда MCJ. По полученным результатам формирование относительна максимального числа боковых побегов н диеччмшх пластинок отмечалось на среде КС, содержащая 1/2 нормы азотсодержащих солей, БАП-1мг/д и ИМК-0,1мг/л. В данной среде в редких случаях, для некоторых сортов наблюдалось образование каллусной ткани в базальной части пробирочных растений, лриводяцне к снижении числа дополнительных побегов. В тоже время при культивировании микропобегов в другом варианте питательной среды (среда МС, содержащая 1/2 нормы солей нитратов, БАЛ И ИУК -по 1мг/л> формирование каллусообразных структур в базальной части пробирочных растений полностью отсутствовало. Однако из-за незначительного преимущества по образованию дополнительных боковых побегов, а также рост основных побегов р длину среда МС, содержащая на 1/2 уменьшенную азотсодержащих солей, БАП-1мг/л и ИМК-0,1мг/д была подобрана хак наиболее эффективной и применена для определения сотовых особенностей мадику красной в условиях in vitro.

Влияние состава питательных сред размножений на развитие пробирочных растений калины краской

Ласточка Польша

название среды длина. побега число листьев число боковых побегов длина побега число листьев число боковых побегов

среда-N 1 среда-N 2 среда-N 3 49,8+0,6 95,3+7,8 78,9+4,4 25,3+3,0 47,0+7,1 41,1+2,6 2,4+0,4 3,9+0,6 3,8+0,4 59,3+5,1 83,0+6,3 61,7+3,3 48,5+4,6 68,9+7,2 36,3+3,4 2,9+0,6 5,1+0,8 4,3+0,6

Примечание: среда-N 1 - среда МС, содержащая БАП-1кг/л и ИМК-0,1мг/л

среда-N 2 - среда МС, содержащая на 1/2 уменьшенные азотсодержащих солей, БАЛ-1мг/л и ИМК-0,1мг/л

среда-N 3 - среда МС( .содержащая на 1/2 еокращенные азотеодержащие солей, Бал и иук по хмг/л

Сортовые особенности растений малины красной в условиях in vitro на среде размножения

Культивирование микропобегов на подобранной среде размножения показало, что все исследуемые сорта в разной степени реагировали на условия выращивания. Эти различия проявились в интенсивности роста основного побега, формировании дополнительных боковых побегов и листовых пластинок.

В проведенном эксперименте была установлена, что интенсивность роста микропобегов завесить от сортовых принадлежности. Результаты наших данных показали, что средние высоты пробирочных растений у разных сортов колебался от 24-65мм. Причем сорта с минимальной "Фолгояд" и с максимальной высотой побегов "Хайда" различались почти в трое. Одновременно с учетам интенсивности роста михренвбеГов были отмечены сортовые различия в способности основного И боковых побегов формировать листовых пластинок. Полученные результаты показали, что сорта Польша/ Фолголд, Роялити, Ивушка, Ласточка способны были образовывать в средней по 45 йт. и более листьев на одной пробирочном растении, в То время сорта как Ракета и Высокая - менее 35 шт.

Несомненно, основное преимущество клонального микро-

размножения перед традиционными способами является получение высокого коэффициента размножения. Культивирование микропобегов малины красной сортов Фолголд, Ласточка, Роялити, Ивушка, Польша, Хайда, Глория и Ракета проводило к образованию в среднем больше 5-9 дополнительных боковых побегов. В то время сорта как Высокая способен был формировать лишь 3 микропобега с одного основного побега.

Таблица N1

Морфологически особенности пробирочных растений разных сортов малины красной на среде размножения (среда МС, содержащая 1/2 солей нитратов, БАП-1мг/л и ИКК-0,1нг/л)

название х число lim до- х длина lim X число lin

сорта дополни- долол- побега длины листьев числа

тельных тельных (мм.) побегов (шт.) листьев

побегов побегов (мм.) (®т.)

(шт.) (шт.)

Ласточка 7,7+0,7 3-13 50,0+4,7 23-80 60,4+6,4 27-97

Ивушка 6,4+0,8 3-12 55,5+9,2 19-118 52,2+7,1 13-109

Глория 5,1+0,4 3-8 47,4+6,4 17-96 37,1+4,3 13-63

Ракета 4,8+0,5 3-9 39,5+4,4 18-72 33,3+4,1 16-65

Высокая 3,3+0,6 ' 1-7 40,0+4,5 13-74 28,9+4,4 12-72

Фолголд 8,5+0,7 4-15 23,7+2,0 13-33 47,8+6,5 20-93

Хайда 5,4+0,6 2-16 64,9+5,4 32-115 39,4+5,4 13-88

Роялити 6,6+0,7 4-13 50,8+5,2 26-94 50,0+3,1 16-90

Польша 5,9+0,7 3-13 32,6+2,8 18-55 45,9+5,4 17-96

Сортовые особенности растений малины красной в условиях in vitro на среде укоренения

Культивирование микропобегов разных сортов'малины красной на среде укоренения {среда МС, содержащая в 5 раз разбавленные макроэлементов и ИКК-0,01иг/а) к нормальному росту побегов с одновременным формированием корневой системы. Однако было отмечено различие между сортами по укореняемости никропобегов в одинаковых условиях культивирования.

Как показали результаты нагих данных, на выше указанной среде, сорта Высокая, Ракета, Польша,Ласточка, Ивушка, Глория обеспечивали в&сохий процент укореняемости побегов (больше 90%), в тоже время сорта Роялити, Фолголд и Хайда проявили пониженную способность к укоренению (70-75%). Во всех вариантах наблюдалось формирование в среднем от 3 до 6

шт. корней со средней длиной главного корня от 10 до 30мм.

Культивирование михропобегов малины красной на среде укоренения способствовало к росту побега с одновременным формированием листьев. Однако нами была отмечена зависимость средней длины побега от сортовых особенностей пробирочных растений. В проведенном эксперименте, после 4 недельного культивирования, сорта Польша, Ракета, Глория, Хайда и Ласточка имели наивыспие средние длины побегов (42-55мм). В тоже время сорта Ивушка, Высокая, Роялити и Фолголд проявили относительно пониженную активность к росту, побегов (35-40).

Таблица и2

Морфологические особенности пробирочных растений разных сортов малины красной на среде укоренения (среда МС, содержащая 1/5 нормы макросоли и ИМК-0,01мг/л)

название х длина х число X число х длина % укоре-

сорта побега листьев корней главного няемости

(мм) (шт.) (шт.) корня

(мм)

Ласточка 42,4+2,7 11,1+0,5 4 ,5+0,4 30,2+2,8 98,0+2, 0

Ивушка 40,0+2,6 11,6+0,8 5 3+0,5 29,6+2,9 97,0+2, 9

Глория 44,5+3,1 12,1+0,6 4 3+0,5 24,1+1,6 91,0+2, 7

Ракета 52,2+2,9 14,5+0,6 4 ,5+0,4 25,6+2,2 98,0+0, 9

Высокая 39,7+3,1 12,3+0,7 5 ,9+0,5 26,6+2,1 100,0+0, 0

Фолголд 34,6+3,5 15,3+0,9 2 ,8+0,4 22,1+2,0 75,0+0, 4

Хайда 44,3+1,7 18,6+1,3 2 ,6+0,3 27,8+1,8 71,0+2, 0

Роялити 37,2+3,1 14,1+1,1 3 ,4+0,4 20,3+1,4 73,0+4, 7

Польша 55,4+3,9 16,0+1,3 5 ,2+0,4 16,3+1,9 ^8,0+1, 7

Культивирование микропобегов на среде укоренения приводило к снижению формирования листьев, что положительно влияет на адаптацию при переносе на почвенные субстраты. На среде укоренения побеги формировали листьев в среднем 11-16 пт. в зависимости от сорта. Полученные результаты могут ккеть определенное значение в селекционной работе малины красной.

- 10 -

Перенос выросших в пробирках растений малины красной в почвенные субстраты

Проведение предварительной акклимитиэации укоренившихся побегов непосредственно в пробирках к окружающей среды и адаптации к торфо-почвеннык субстратам, при переносе пробирочных растений в нестерильные условия, обеспечивало высокий уровень приживаемости растений малины красной. В период адаптации растения были покрыты баночками, чтобы снизить уровень транспирации на 2-3 недели и сохранить их в влажном состоянии. Одновременно с этим растения поливали растворами (1/2 минеральных солей среды МС и ИМК-1мг/л) в течение 3 недель с момента переноса пробирочных растений в почвенной субстрат,а дальше водопроводной водой. В указанных условиях адаптации в теплице выживали 100% растений сортов Ласточка, Хайда и Польша, 90% растений. сортов Ивушка, Ракета и Рояли!1»» и лишь 83% сорта Фолголд. Будучи пересаженными растения на поливой участок коллекции малины ВНШР все адаптированные растения нормально росли и плодоносили.

Таблица КЗ

Приживаемость растений (%) разных сортов малины красной при переносе пробирочных растений в почвенные субстраты

название сорта в торфо-почве-ных горшочках на участке растений малины

Польша 100 100

Хайда 100 100

Ивушка 90 100

Ракета 90 100

Глория 90 100

Роялити 90

Ласточка 85 100

Фолголд 83 100

Развитие побегов калины красной в жидкой среде на аппарате роллерного типа

Для изучения влияния условий культивирования на формирование боковых побегов и корней, микропобеги пересаживали на жидкую и агаризованную среды. Первоначально, в проведен-

ном исследовании было отмечено, что культивирование микропобегов в стандартной жидкой среде МС, содержащая БАП-1мг/л и ИМК-0,1мг/л привело к снижению формирования дополнительных боковых побегов по сравне! но с аналогичной агаризованной средой. При выращивании микропобегов на жидкой среде МС также наблюдалось такое явление как оводнение стеблей и листовых пластинок верхушечной части побегов.

В связи с этим нами было изучено влияние состава питательных веществ на общее развитие побегов в условиях in vitro на жидкой среде. Было установлено, что уменьшение концентрации NH4N03, KNQ3 в 2 раза и увеличение КН2Р04 в 2 раза по прописью среды КС, а также добавление на среду Ca(N03)2-708нг/д, сахарозы-6%, БАП и ИУК - по 1мг/л способствовало к улучшению формирования морфологически нормальных дополнительных боковых побегов и листовых пластинок.

Однако оценить эффективность предложенной питательной среды возможно лишь при сравнении ее с аналогичной твердой средой. Полученные результаты показали, что культивирование микропобегов сортов Ласточка и Хайда на жидкой среде наблюдалось через 5 днеГ* с момента культивирования, а на твердой среде через 2 недели* Скорость формирования дополнительных побегов и их рост свидетельствует, что необходимые для развития компоненты питательных веществ легко усваиваются на жидкой среде чек на твердой.

При возвращении побегов из жидкой среды на агаризован-ную среду морфологические отклонения в их развитии отмечено не были.

Таблица N4

Развитие побегов малины красной на жидкой и твердой средах in vitro (седа МС, содержащая в 2 уменьшенное NH4M03, КШЗ и в 2 раза повышенные КН2Р04 по прописьо среды МС, а также Са(Ж>3)2-708мг/л, сахарозы-б%, БАП и ИУК - по 1нг/л

название сорта число микропобегов (шт.) укорененных побегов (%) число микропобегов (шт.) укорененных побегов (%)

Ласточка 6,4+0,7 67,0 3,1+0,4 0,0

Глория 4,6+0,7 25,0 4,4+0,5 0,0

Фолголд 5,3+0,4 8,5 5,7+0,4 0,0

Хайда 4,6+0,5 34,5 2,8+0,4 0,0

Длительное хранение растений малины красной при пониженной температуре в условиях in vitro

Культивирование побегов малины красной при пониженной температуре (+2оС,слабое освещение) в условиях in vitro приводило к медленному использованию питательных веществ и задержанию роста пробирочных растений. Однако была установлена зависимость жизнеспособность хранящихся стерильных растений малины красной от состава питательных сред.

Результаты проведенных экспериментов показали, что культивирование побегов малины красной на безгормональной среде МС способствовало к сохранению пробирочных растений в жизнеспособном состоянии, в течение 12 месяцев, 60-93%, а добавление на данную среду АБК-Змг/л привело к снижении жизнеспособности побегов до 7-57% в зависимости от сорта. На безгормональной среде пробирочные растения сортов Ласточка и Ивушка (российские селекции) лучше сохранились чем Фолголд и Хайда (иностранные селекции), а на среде с АЕК наоборот.

Наилучшее сохранение жизнеспособности пробирочных растений малины красной отмечалось также на модифицированной среде МС,в которой СаС12 заменена на Ca(N03)2 (708нг/л) и концентрации КН2Р04 увеличена в 2 раза с присутствием биологически активного вещества 6-БАП (1мг/л). Культивирование микропобегов в данной среде и хранение их при пониженной температуре (+2оС,темнота) в течение 12 месяцев, для обследуемых сортов обеспечивало высокий процент жизнеспособности пробирочных растений (71-100%). Добавление в выше указанную среду вместе 6-БАП осмотический ретардант - манит (4000нг/л) привело к снижению жизнеспособности побегов при их длительном хранении. В данной среде, в течение 12 месяцев хранения, жизнеспособные пробирочные растения составляли 36-57% в зависимости от сорта.

Возвращение пробирочных растений в нормальные температурные условия (25+2оС) способствовало к восстановлению их ростовых процессов спустя один год хранения при пониженной температуре. А обновление питательной среды (среда размножения) приводило к формированию многочисленных дополнительных побегов. Результаты наших данных показали, что в обновленной

Таблица N5

Влияние состава питательных сред на длительное хранение пробирочных растений малины красной при пониженной температуре (+2оС)

тип пита тельных сред условия хранения срок хранения н а з в а ь и сор т а

Ласточка Ивушка Фолголд Хайда

среда N 1 слабое 1.. 78,6 93, 3 64 ,3 60,0

освещение месяцев

среда N 2 слабое 12 14,3 7 , 1 40,0 57,1

освещение месяцев

среда N 3 темнота 12 71,4 100, 0 78,6 78,6

месяцев

среда N 4 темнота 12 49,9 35, 7 49,9 57, 1

месяцев

Примечание: среда N 1 - безгормональная среда МС среда N 2 - среда КС с АБК

среда И 3 - среда КС, в которой СаС12 заменена на Са(N03)2 и содержащая

КН2РОД-3 4Омг/л, 6-БАП-1НГ/Л среда N 4 - среда КС, в которой СаС12 заменена на Са(НОЗ)2 и содержащая

КН2Р04-3 4 Омг/л, канит-4000мг/л

среде микропобеги формировали дополнительные побеги 9,4-12,2 ИТ.в зависимости от сорта, а до хранения этот показатель находился в пределах 5,4-8,5 шт. Образовавшие новые микропобеги морфологически не отличались от исходных форм.

Криоконсервация изолированных верхушечных меристем малины красной

С целью повышения жизнеспособности апексов малины красной при криоконсервации испытывали влияние цитокининов 6-БАП, ТОЙ; сахарозы, глюкозы на питательных средах' и в растворе криопротекторов.

Результаты проведенных экспериментов показали, что добавление сахарозы (6%) и тог (0,6мг/л) на средах для закаливания маточных растений в холоде (+2-4оС,темнота) и в жидкой среде для обработке для обработки изолированных апикальных меристем с ЭМБО (7%) обеспечивало высокий процент приживаемости эксплантов после прямого их замораживания с криопро-текторами (сахароза-6%, 0М50-Ю%) в жидком азоте (-196оС). В

указанных условиях 70% изолированных апикальных меристем малины красной сорта Скромница приживались и регенерировались. Замена сахарозы на глюкозы в этом варианте привела к снижению жизнеспособности эксплантов до 33%, а использование 6-БАЛ внесте ТО 2 при прямом замораживании не дало положительных результатов.

Таблица N6

Влияние состава питательных средзакалевания и раствора криопротекторовх и цитокининов на регенерацию изолированных апексовх малины красной сорта Скромница после быстрого и медленного глубокого замораживания замораживания

среда закаливания* раствор криопротекторов % регенерации экспл.

при быстром замораживании при медленно« замораживании после прям, заморажив. после медл. заморажив.

сахароэа-6% TDZ-0,бмг/л сахароаа-6% DMSO-lG% сахароза-6% DMSO-7% 7 0,0 21,5

глюкоза-6% TD2-0,бмг/л глюкоза-6% DMS0 - 10% глюкоза-6% DMSO-7% 33,0 3,5

сахароза-6% БАП-5мг/л сахароэа-6% DMS0 - 10% сахароэа-6% DMSO-7% 0,0 45,0

глюкоза-6% БАП-5мг/л глюкоза-6% DMSO - 10% глюкоза-6% DMSO-7% 0,0 12,5

* среда MC, модифицированные для закалевания in vitro растений малины красной (t=+4oC, темнота)

Иная картина наблюдалось при медленном замораживании изолированных апексов малины сорта Скромница. Применение сахарозы (6%) и 6—БАЛ обеспечивало наивысшее жизнеспособности и регенерации эксплантов после медленного замораживания в жидком азоте (45%). В этом варианте замена 6-БАП на TDZ привела к снижению жизнеспособности эксплантов Скромница до 21,5%, а использование глюкозы вместе сахарозы стало малоэффективным (ниже 13%).

Применение в качестве цитокининов б-БАЛ и TDZ на фоне сахарозы, для другого сорта Ласточка после медленного замораживании, также приводило к регенерации изолированных апексов меристем на и соответственно.

Таблица N7

Регенерация изолированных апикальных меристем малины красной сорта "Ласточка" после медленного замораживании

среда заклевания* состав раствора криопротекторов регенерация эксплантов

сахароэа-6%. сахароэа-6% 23,1

БАП-2мг/л 0МЭ0-7%

сахароза-6%, сахароза-6% 46,7

ТОг-О,4мг/л ШБО-7%

растений малины красной ^=+2оС,темнота)

Во всех вариантах морфологические отклонения, в развитии побегов , после регенерации эксплантов наблюдено не было.

Таким образом удалось установить, что сахароза является лучшим криопротектором при прямом и медленном замораживании изолированных апексов малины красной. Наиболее эффективным при прямом замораживании эксплантов оказалось присутствие в питательных средах ТОЙ чем БАЛ, а при медленной замораживании существенного различия между ними обнаружено не было.

Выводы

1. В результате проведенных исследований был установлен размер эксплантов (О,3-0,5мм) введенных в культуру для получения растений-регенерантов малины красной свободных от потогонных балезней.

2. Из испытанных комбинаций питательных сред,*хреда Му-расиге и Скуга содержащая в 2 раза разбавленные минеральные соли, БАЛ и ИУК - по 1нг/л способствовало индуцированию побегов из эксплантов маленьких размеров малины красной.

3. Уменьшение концентрации азотсодержащих солей в 2 раза по прописи среды Мурасиге и Скуга и внесение 6-Бензилами-нопурина 1мг/л на среду приводит к максимальному формированию боковых побегов.

4. Разбавление макроэлементов в 5 раз и добавление в среду ИМК - 0,01мг/л обеспечивает укореняемости микропобегов малины красной до 70-100%. Побеги укоренившиеся на данной среде адаптируются при переносе в почвенные субстраты от 83-100%.

5. Применение жидкой питательной среды на этапе микроразмножения позволяет повысить коэффициент размножения некоторых сортов малины красной более в 2 раза по сравнению с аналогичной твердой средой.

6. Разработанные способы длительного беспересадочного хранения пробирочных растений при пониженной температуре (+2°С со слабым освещением) обеспечивают сохранение жизнеспособности ряда сортов малины красной в течение 12 месяцев до 60-100%.

7. В проведенном исследовании была доказана возможность хранения изолированных апексов меристем малины красной в жизнеспособном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С) и получения из них, после криоконсервации целого растения без морфологического откланения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мохаммед. А. И., Бутенко Р. Г., Калашникова Е. А. Длительное хранение пробирочных растений малины красной при пониженной температуре//3-й ежегодный симпозиум физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. М., 1997. С. 41.

2. Мохаммед А. И., Бутенко Р. Г., Калашникова Е. А. Применение жидкой питательной среды для размножения малины красной in vitro при пониженной температуре// 3-й ежегодный симпозиум физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. М., 1997. С. 42.

3. Высоцкая О. М., Мохаммед А. И., Бутенко Р. Г. Крио-консервация меристем малины (Rubus idaeus L.) // Тез. докл. 7-й междун. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда», М., 1997. С. 519— 520.

Объем .1 п. л.

Заказ 182

Типография Издательства МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44

Тираж 100