Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробные мембраносвязанные пренилтрансферазы: солюбилизация и свойства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Микробные мембраносвязанные пренилтрансферазы: солюбилизация и свойства"

РГ6 од

/ ч ^РГрСХГдЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

УДК 577.127.4:577.152.2.25:577.152.2.278:577.352.2. 339

БУХТИЯРОВ ЮРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

МИКРОБНЫЕ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЕ ПРЕНИЛТРАНСФЕРАЗЫ: СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА

(специальность 03.00. (Н - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино -1993

Работа выполнена в лаборатории рефляции биохимических процессов Института

биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, чл.-корр.РАН И.С.Кулаев кандидат биологических наук Ю. А. Шабалин

Официальные оппоненты: доктор химических наук В. Н. Шибаев

кандидат биологических наук А. Б. Циоменхо

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А. Баха Р А Н

Защита диссертации состоится "¿/" 1993 г. в /т час.-^мин. на

заседании Специализированного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Р А Н, г. Пущино, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан 1993 Г-

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В. М. Вагабов

Актуальность проблемы. Изучение биосинтеза полипренолоч и долихола вляется одной из актуальных проблем современной биохимии. Роль и функции тих гидрофобных низкомолекулярных метаболитов в живой клетке до конца не зучены. Было показано участие фосфорилированных производных олиизопреноидных спиртов в процессах биосинтеза гликоконъюгатов в клетке, [ричем во всех живых организмах от архебактерий и эубактерий до высших рганизмов обнаружены липидные кофакторы полипренольной природы, частвуюшие в переносе гликозильных групп.

В исследовании биосинтеза полиизопреноидов особое место занимает [роблема изучения пренилтрансферазных реакций, в ходе которых происходит индексация пятиуглеродных изопреновых остатков с образованием тереорегулярной полиизопреновой цепи. Степень конденсации изопреновых веньев колеблется от единиц и десятков в случае долихолов и низкомолекулярных мстительных полипренолов до нескольких десятков тысяч, когда речь заходит о юлипренолах латекса гевеи или гуаюлы. Между тем, механизм ферментативной 1ренилтрансферазной реакции практически не изучен. Остается открытым вопрос о "ом, какие факторы влияют на длину синтезируемой полиизопреновой цепи, .тереорегулярность ферментной реакции. Решение этих и многих других вопросов, :вязанных с изучением механизма пренилтрансферазной реакции, могло бы 'юмочь в поиске новых перспективных латексоносов и улучшении свойств уже известных продуцентов натурального каучука.

Удобной моделью в таких исследованиях могли бы стать пренилтрансферазы микробного происхождения, участвующие в биосинтезе долихола. Биогенез долихола до конца не изучен, в особенности конечные его зтапы, на которых происходит насыщение двойной связи молекулы долихола, ее фосфорилирование и дефосфорилирование с образованием кофакторов гликозилирования. Каждому организму присущ свой компонентный состав долихола, причем невыясненным остается вопрос о том, каким образом осуществляется его регуляция.

Состояние вопроса. Пренилтрансферазы, участвующие в биосинтезе долихола, можно отнести к одним из наименее изученных ферментов. К настоящему времени охарактеризовано лишь несколько дегидродолихил-пирофосфат синтаз, в основном животного или растительного происхождения, часть из них удалось солюбилизировать. Существует лишь одна публикация посвященная исследованию поли-от-пренилтрансферазы из дрожжей Saccharomyces cerevhiae [Adair etal., 19S7], причем авторам не удалось солюбилизировать фермент и исследовать его свойства в свободном от мембранных частиц растворе. Что касается ферментов мевалонатного пути архебактериального происхождения, то здесь можно констатировать полное отсутствие литературных данных, несмотря на то, что мембранные липиды этих микроорганизмов имеют изопреноидную

природу, и имеются сведения об участии полиизопреноидных переносчиков в процессах гликозилирования у архебактерий.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось исследование свойств и солюбилизация из мембран дегидродолихилпирофосфатсинтазы из дрожжей 5ассК. саг1$Ьег%епзЬ, а также пренилтрансферазы метаногенных архебактерий Ме1ЫтоЬа&егшт ЛегтоаиШгорЫсчт. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

разработать метод препаративного выделения дрожжевого долихола, исследовать и определить его состав;

осуществить химический синтез субстратов пренилтрансферазной реакции, в т.ч. радиоактивно меченых;

разработать способы солюбилизации пренилтрансфераз из мембран дрожжей и архебактерий;

определить физико-химические свойства ферментов; охарактеризовать продукты пренилтрансферазных реакций в дрожжах и архебакгериях.

Научная новизна. Впервые в архебактериях обнаружен и охарактеризован фермент, осуществляющий. синтез полиизопреповой цепи. Впервые из мембран дрожжей и архебактерий солюбилизированы полипренилтрансферазы и определены основные характеристики реакций, катализируемых данными ферментами. Обнаружено, что синтез полипренилпирофосфатов, протекающий в присутствии мембранных препаратов дрожжей, сопровождается их дефосфорщшрованием. Показано, что компонентный состав образующихся полипренолов и их фосфорилированных производных совпадает с компонентным составом долихола дрожжей.

Практическая значимость. Способ солюбилизации пренилтрансфераз из мембран дрожжей и архебактерий может найти практическое применение при выделении других мембранных ферментов. Полученные данные по характеристике пренилтрансферазной реакции из дрожжей позволят лучше понять механизм биосинтеза долихола. Методические подходы и приемы, использованные для препаративного выделения долихола, синтеза субстратов пренилтрансферазной реакции, в том числе радиоактивно меченых, анализа продуктов ферментативной реакции и полиизопреноидных спиртов могут быть использованы для исследования пренилтрансферазных реакций в других объектах, в том числе с целью поиска новых перспективных продуцентов натурального каучука или улучшения свойств уже известных латексоносов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных соединений (Болгария, Варна, 1989).

Публикации. По теме работы имеются три публикации.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, <спериментальной части, включающей описание материалов и методов, а также зложение результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой итературы, включающего ссылки, из них работ отечественных авторов и абот зарубежных авторов. Работа изложена на ///"страницах машинописного ?кста, содержит^таблиц и^рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили дрожжи ЗассИаготусеБ саЛ$Ье,г£ет'и У-366 ЗКМ У-1173) и метаногенные архебактерий Мс'.Ьпг.Фпс^пит IИегтпаЫо-■орИкит ОУ (ВКМ 1851).

Дрожжи выращивали на среде с 2% глюкозы, 1% пептона и 0,5% дрожжевого кстракта при 30°С в конических колбах объемом 750 мл с 250 мл среды

Массовое культивирование архебактерий МЬ. (ИегтоаиШгорИ'юит проводили ри 55° в ферментере типа ОКА-2Ю на минеральной среде и смеси газов [2/С02 8020 (об/об) в качестве источника углерода и энергии.

Протопласты из дрожжевых клеток получали традиционным способом, спользуя лиофилизированный желудочный сок виноградных улиток в качестве «рментного комплекса, лизирукмцего клеточную стенку.

Суммарные мембранные фракции из дрожжей и архебактерий получали (етодом дифференциального центрифугирования бесклеточных ткстракток.

Солюбилизацию дрожжевой преннлтрансферазы проводили из суммарной гембранной фракции с помощью н-октил-0-(О)глюкопиранозида. К суспензии 1ембран в 50 мМ трис-НС1 буфере рН 7,5, содержащем 100 мМ №С1, 5 мМ М8С12 и мМ 2-меркаптоэтанола, добавляли равный объем 1%-ного раствора п-октил-/?-0)глюкопиранозида и выдерживали полученную суспензию в течение 2 часов, [ериодически суспендируя мембраны в стеклянном гомогенизаторе. После 1ентрифугирования (105 000 х 60 мин) супернатанг использовали в экпериментах течение 10 часов с момента получения.

Солюбилизацию архебактериальной пренилтрансферазы проводили из уммарной мембранной фракции с помощью Тритона Х-100. К мембранным [репаратам МЬ. 1>\егтоа1Л(Ягор1исшп добавляли раствор Тритона Х-100 так, чтобы онцентрация детергента составила 0,2%. При этом весовое соотношение ¡етергента к белку было приблизительно 1:1. Полученную смесь выдерживали при ' - 4°С в течение 10 часов и затем центрифугировали 1 час при 100 000 х g. К упернатанту добавляли 20% (по объему) глицерина и хранили полученные |репараты при -15°С.

Определение пренилтрансферазной активности провопили с ^пользованием радиоактивно меченых препаратов изопентенил-гарофосфата (1РР). Инкубационная смесь (общий объем 500 мкл) содержала прибл.

1 млн имп/мин [U-3H)IPP (16нмоль) или [1-14С]1РР (35 нмоль), Юнмоль фарнезилпирофосфата (FPP), 1 мкмоль MgCl,, 25 мМ фосфатный буфер, рН 7,0 и 300-600 мхг белка. В случае белковых препаратов Sacch. carisbergensis помимо перечисленных компонентов инкубационная смесь включала 5 мкмоль NaF, 5 мкмоль 2-меркаптоэтанола и 50 мМ трис-HCI буфер, рН 8,5, вместо фосфатного буфера. Смесь инкубировали при 29°С (дрожжевая пренилтрансфераза) или 40°С (архебактериальная пренилтрансфераза) в течение 30-60 мин. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл смеси хлороформ-метанол 32 (об/об). Верхнюю фазу отбрасывали, нижнюю фазу промывали и измеряли ее радиоактивность. Пренилтрансферазную активность выражали в имп/мин метки, содержавшейся в 1 мл экстракта.

Анализ продуктов пренилтрансферазной реакции у дрожжей включал разделение фосфоршшрованных и свободных полипренолов с помощью твердофазной экстракции на целлюлозе DE-52. Фосфорилированные продукты реакции гидролизовали до монофосфатов, которые анализировали с использованием адсорбционной тонкослойной хроматографии (ТСХ) и обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографи (ВЭЖХ). Нефосфорилированные продукты реакции анализировали с помощью адсорбционной и обращеннофазной ВЭЖХ.

Выделение долихола из дрожжей проводили тремя способами: 1) спирто-щелочной гидролиз сухих дрожжей с последующей экстракцией гидролизата гексаном; 2) экстракция сухих дрожжей смесью хлороформ:метанол 32 (об/об), спирто-щелочной гидролиз экстракта с последующим извлечением неомыляемой липидной фракции (НЛФ) гексаном; 3) разрушение клеток механическим способом, получение НЛФ аналогично второму способу.

Немеченый изопентеннлпирофосфат синтезировали из изопентенилтозилата согласно методу Дэвиссона с соавт. [Davisson et al, 1986], используя в качестве фосфорилирующего агента трис-(тетра-н-бутиламмоний)пирофосфат (ТБАПФ).

Радиоактивный [U-3H] изопентеннлпирофосфат получали из немеченого изопентенилпирофосфата бомбардировкой каталитически активируемым атомарным тритием по методу Богачевой с соавт. [Богачева с соавт, 1985].

Радиоактивный [а,0-3^Р]изопентенилпирофосфат получали фосфорилиро-ванием изопентенола с использованием трихлорацетонитрила согласно методу Крамера и Бема [Cramer & Eohm, 1959].

Радиоактивный [1-32Р] изопентеннлпирофосфат синтезировали с использованием морфолидата изопентенилмонофосфата в качестве активированного производного монофосфата изопентенола [Donninger el at., 1967].

Дважды меченый ,/J-32P] изопентеннлпирофосфат получали,

смешивая [и-3Н]изопентенилпирофосфат с [а,/3-32Р]изопентенщтирофосфатом.

Алл ильные пирофосфаты (диметилаллилпирофосфат, геранилпирофосфат и фарнезилпирофосфат) синтезировали по методу Диксита с соавт. [Dixit et at., 1981], в

отором ТБАПФ используется в качестве нуклеофильного агента в реакции с оответствующим аллилбромидом.

Монофосфат дрожжевого долихола получали химическим фосфорили-ованием долихола с использованием хлорокиси фосфора [Danilov et al., 1981].

Эксклюзионную препаративную хроматографию долихола проводили на :олонке (3,5 х 75 см) с сефадексом LH-20 с использованием в качестве подвижной [>азы смеси растворителей хлороформ-метанол (3:2, об/об).

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) выполнялись с icnoльзованием оборудования производства LKB (Швеция) и Laboratornie Pristroje ЧСФР). Обращеннофазнут хроматографию проводили на колонке Partisil ODS-3, },6 х 250 мм (Whatman Associates, Великобритания), используя в качестве системы растворителей смесь метанола с изопропанолом в соотношении 1:1 (об/об). Монофосфаты полипренола и долихола разделяли в той же хроматографической системе, за исключением того, что в качестве подвижной фазы использовали 20 мМ раствор фосфорной кислоты в смеси изопропанол-метанол (4:6, об/об). Для нор.малыгофязовой ВЭЖХ использовали колонку Separen SIX CN 3,3 x150 мм (Tessex, ЧСФР) и 0,05%-ный раствор изопропаыола в гексане в качестве системы растзорителей, скорость потока 1 мл/мин. Вещества обнаруживали по поглощению при 210 нм.

Препаративную ВЭЖХ индивидуальных гомологов дрожжевого долихола проводили на колонке 10 х 200 мм с предколонкой 10 х 80 мм, заполненных сорбентом Силасорб С18, размер частиц 12 мкм (Диагностикум, Россия). В качестве системы растворителей использовали смесь метанол-изопропанол (1:1, об/об). Регистрацию веществ осуществляли с помощью дифференциального рефраь-гометра.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполнял;' на пластинках Kieselgel 60 GF2j4 ("E.Merck", Германия), используя системы растворителей: 1) хлороформ-метанол -вод.аммиак(25%)-вода (6535:4:4, об /об); 2) бенгол-этилацетат (95:5, об/об); 3) изопропанол-вод.аммиак(25%)-вода (6-3:1, об/об); 4) ди лиловый эфир-гексан (3:17, об/об).

Авторадиохроматографнк» выполняли с использованием рентгеновской пленки QX-I6 ("Hindustan Photo Films Mfg Co.Ltd.", Индия). Для радиохроматографии с использованием ВЭЖХ элюат с колонки раскапывали непосредственно в ецшпилляционные флаконы с заданным интервалом времени с помощью коллектора фракций Redirac 2112 (LKB, Швеция).

Радиоактивность проб измеряли на сцинтилляционпом спектрометре SL-30 (Intertechnique, Франция) в стандартном коктейле на основе толуола с добавлением 5-10% метанола.

Масс-спектрометр ия с ионизацией термораспылением (ТСП-МС)

выполнялась на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8430 (Германия), к которому был присоедиенен ТСП-интерфейс производства той же фирмы. Образцы вводились в

поток растворителя, которым служил 80%(об.) водный метанол. Условия записи спектров: температура испарителя 151°С, температура аэрозоля 225°С, температура источника 23СРС.

Масс-спектрометрию с ионизацией Бомбардировкой ускоренными атомами (МС-БУА) проводили на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8430, снабженном атомной пушкой Ion Tech и системой обработки данных МАТ 300, согласно методу Дэвиссона с соавт. [Davisson et al., 1988].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и анализ долихола дрожжей Sacch. carisbergensis С целью поиска оптимальных условий выделения долихола из дрожжевых клеток были исследованы три различных способа экстракции неомыляемой липидной фракции, содержащей додихол. Наиболее эффективным следует признать метод, включающий спирто-щелочной гидролиз лиофилизированных дрожжевых клеток с последующей экстракцией органическим растворителем (метод 1). Выход долихола в этом случае составил 92 мг/кг. В случае, когда гидролитическая стация следовала за экстракцией лиофилизированных клеток органическим растворителем (метод 2), выход долихола составил всего 10 мг/кг. Предварительное механическое разрушение клеток (метод 3) повышало выход в 2,7 раза по сравнению с методом 2.

Эксклюзионная хроматография неомыляемой липидной фракции, полученной согласно методу 1. позволяла получить препарат дрожжевого долихола 95%-ной чистоты, судя по данным адсорбционной и обращенно-фазной ВЭЖХ. Для установления компонентного состава долихола дрожжей Sacch. carisbergensis была использована обращенно-фазная ВЭЖХ. Анализ показал, что исследуемый штамм дрожжей синтезирует долихол, состоящий из C^q-C^-гомологов, с мажорным компонентом, включающим 16 изопреновых остатков (Табл. 1).

Таблица 1. Компонентный состав дрожжевых долихолов (%).

Количество изопреновых звеньев Sacch. carisbergensis <°) Sacch. cerevisiae О О

13 - - 3,0 4,0

14 3,6 13,5 14,1 24,0

15 21,8 73,4 43,5 32,0

16 46,0 13,1 34,5 31,0

17 22,0 - 4,8 9,0

18 5,4 - - -

19 1,2 - - -

Результаты данной работы; [Wellburn et al., 1966b]; [Tavares et al., 1977]; г) [Adair et ai., 1987].

Для подтверждения структуры и длины изопреновой цепи дрожжевого олнхола его гомологи были выделены методом препаративной обращенно-фазной 1ЭЖХ и исследованы с помощью масс-спектрометрии с ионизацией ермораспылением. Этот метод ионизации позволяет получить масс-спектры олиизопреноидных спиртов с интенсивным молекулярным ионом и езначительной фрагментацией. Во всех случаях основной пик в масс-спектрах оответствовал ионам аддукта [М+НН4]+. Кроме того, наблюдались ионы [М+№]+, оторые облегчали идентификацию молекулярного иона (Табл. 2).

'аблица2. Основные ионы в масс-спектрах дрожжевых долихолов при использовании ионизации термораспылением.

Число изопре-новых звеньев Молекулярный вес [М+МН4Г т/г [М+Ыа]+

14 972 990 995

15 1040 1058 1063

16 1108 1126 1131

17 1176 11« 1199

18 1244 1262 1267

2. Синтез субстратов пренилтрансферазной реакции

Необходимым этапом экспериментальной работы по исследованию ■ренилтрансферазных реакций был синтез субстратов, в том числе радиоактивно леченых.

Немеченый изопентенилпирофосфат получали в соответствии с реакцией I Схема 1), и затем подвергали бомбардировке каталитически (Р1) генерируемым [томарным тритием, что приводило к образованию [и--'Н]изопентенил-1ирофосфата. В результате было получено 15,75 мКи препарата с удельной наивностью не менее 80мКи/ммоль и радиохимической чичтотой (по данным ГСХ) не менее 95%.

Для введения 32Р в лирофосфатную группу молехулы изопентенил-тирофосфата использовали конденсацию изопентенола с неорганическим 32Р]фосфатом в присутствии трихлорацетонитрила (реакция И). С целью получения /3-32Р]и'зопентенилпирофосфата был синтезирован немеченый монофосфат ?зопентенола, который превращали в фосфоморфолидат и затем в [/3-32Р]изопен-генилпирофосфат реакцией с Н33?Р04 (реакция III).

Аллильные пирофосфаты синтезировали из соответствующих тлилбромидов реакцией с трис-(тетра-н-бутиламмоний)пирофосфатом реакция IV). Для очистки диметилаллилпирофосфата прибегли к колоночной «роматографии на волокнистой целлюлозе, в то время как геранилпирофосфат выделяли ионобменной хроматографией на дауэксе, а для очистки фарнезил-

пирофосфата была предложена методика обращенно-фазной хроматографии на охтадецилсиликагеле.

Н

(I) рр

(ш)

ОР""Р

„Л^он Дл* йАло,

(IV) рр

Схема 1. Синтез изопреновдных пирофосфатов

а, толуолсульфохлорид; Ъ, трис-(тетра-н-бутиламмоний)пирофосфат; с, бис-(триэтиламмоний)[?2Р}фосфат + трихлорацетонитрил; <!, хлорокись фосфора; е, морфолин + дициклогексилкарбодиимид; £, Н332Р04; g, РВг3. И = СН3, диметилаллилпирофосфат; И = (СНз)2С=СН-СН2-СН2-, геранилпирофосфат; Я = (СН3)2С=СН-СН2-СН2-(СН3)С =СН-СН2-СН2-, фарнезилпирофосфат

3. Определение пренилтрансферазной активности.

Активность пренилтрансферазной реакции определяли по включению радиоактивности меченого изопентенилпирофосфата в гидрофобные продукты реакции, которые извлекались из инкубационной смеси экстракцией смесью

хлороформа и метанола. Поскольку в экстрактах наряду с меченым полипренил-пнрофосфатом обнаруживались монофосфат полипренола и свободный полипренол, то под пренилтрансферазной активностью в данном случае понимали включение метки как в полипренилпирофосфат, так и продукты его дефосфорилирования.

4. Влияние катионов металлов, EDTA и аллнльного пирофосфата на активность пренклтрансферазы дрвхжей Sacch. cadsbergensis

Для протекания реакции было необходимо присутствие в инкубационной среде аллильного пирофосфата, в качестве которого был взят фарнезилпирофосфат. Ионы Mg2+ в наибольшей степени способствовали протеканию ферментативной реакции. В то же время, EDTA и ряд катионов, таких как Zn2+, Са2 + , Fe2 + , а также катионы тяжелых металлов Си2*) ингибировали

пренилтрансферазную реакцию.

5. Солю5илизация пренилтрансферазы Sacch. caHsbcrgcnsfc

Для солюбилизации исследуемого фермента были опробованы неионные детергенты Тритон Х-100, CHAPS, н-окгил-/3-(0)глюкопиранозид, Твин-80 и Тергитол NP40 в диапазоне концентраций от 0,1% до 2,0%. В то время, как Тритон Х-100 и CHAPS приводили к потере ферментативной активности уже при 0,1-0,25%-ной концентрации, Тергитол NP-40 и н-октил-р-(0)глюкопиранозвд позволяли сохранить активность при 0,25-0,5%-ной концентрации детергента.

Уд. активность, тые.юш/мин/мг белка

1С

16

С

с

0

.Октилглюкоэид, %

-мембранные частицы —Солюбилнзат

Рис. 1 Удельная активность пренилтрансферазной реакции, обнаруживаемая в

высокоскоростном супернатанте и на мембранных частицах после обработки мембран Sacch. carlsbergensis н-октил-/3-(О)глюкопиранозидом.

Солюбилизация фермента достигалась при обработке суммарной мембранной фракции дрожжей Басск са^Ьег^епзк раствором н-октил-0-(О)глюкопиранозида. Максимальная удельная активность исследуемого фермента в солюбилизате достигалась при концентрации детергента 10-15 мМ (0,25-0,5%) (рис. 1). При концентрации свыше 30 мМ (1%) фермент полностью терял активность.

6. Температурная зависимость реакции и термостабильность преннл-трансферазы БассК саН^Ьег^егин в мембранных препаратах и солюбилизате

Температурный оптимум пренилтрансферазной реакции находится в пределах 30-40°С и для солюбилизата сдвинут в область более низких температур, что вероятно объясняется большей термостабильностью мембраносвязанного фермента по сравнению с солюбилизатом. Солюбилизированный фермент полностью теряет активность при выдерживании в течение 5 мин при 50°С, в то время как мембранный препарат в тех же условиях наполовину сохраняет ферментативную активность. По всей вероятности, липидное окружение фермента стабилизирует активную конформацию белковой молекулы, и его нарушение, вызванное обработкой мембран детергентом, приводит к лабильности фермента при повышенной температуре.

7. Зависимость активности пренклтрансферазы 5асск. саИзЬег^етн от рН

Исследуемый фермент проявляет активность в широком диапазоне значений рН, причем рН оптимум сдвинут в щелочную область (рис. 2). Обращает на себя внимание достаточно высокая ферментативная активность мембранного препарата при щелочных значениях рН (рН 9,5-10). Вместе с тем, продукты реакции при нейтральных и щелочных значениях рН не обнаруживают существенных различий при анализе методом ТСХ.

Рис.2

Зависимость пренилтрансферазной активности мембранных препаратов Засск саНзЬег^еюк (1) и солюбилизата (2) от рН.

8. Конденсация изопентенилпирофосфата с различными аллильными пирофосфатами

Помимо фарнезилпирофосфата, в качестве аллильного субстрата были исследованы диметилаллилпирофосфат и геранилпирофосфат, в молекулах которых содержатся один и два изопреновых остатка соответственно. Конденсация [1-1'*С]изопентенилпирофосфата с последними приводит к образованию ряда дополнительных продуктов, помимо тех, что наблюдаются при реакции с фарнезил-лирофосфатом (рис.3). Причем дополнительные полосы на ТСХ обнаруживаются как среди фосфорилированных продуктов реакции (рис. ЗБ), так и в смеси свободных полипренолов (рис. ЗА).

SF ^

4 SF

Pol ^

FOH

^ Ро1-Р 4 Poi-PP

ORI. Ъ — Ш — ^ ORI.

ОМАРР GPP FPP DN1APP GPP FPP

Рис. 3 Авторадиохроматограммы продуктов конденсации [1-14С]изопентенил-пирофосфата с диметилаллилпирофосфатом, геранилпирофосфатом и фарнезилпирофосфатом, взятыми в качестве аллильных субстратов. Для получения автографа А хроматограмму проявляли в системе растворителей 2. После автографирования хроматограмму проявляли вторично в системе растворителей 1 для получения автографа Б.

Какова бы ни была природа реакций протекающих в присутствии диметилаллилпирофосфата и геранилпирофосфата, важно отметить, что

использование фарнезилпирофосфата в качестве аллильного субстрата пренилтрансферазной реакции позволяет "вычленить" дегидродолихилпирофосфат синтазную активность из сложной совокупности ферментативных процессов, протекающих на мембранах дрожжей.

9. Продукты пренилтрансферазной реакции, протекающей на мембранных препаратах дрожжей Sacch. carlsbergensis

Обращенно-фазная ВЭЖХ свободных полипренолов, образующихся при инкубировании мембранных препаратов дрожжей Sacch. carlsbergensis с радиоактивным изопентенилпирофосфатом и фарнезилпирофосфатом, показала, что их компонентный состав совпадает с компонентным составом долихола, синтезируемого тем же штаммом дрожжей in vivo (рис. 4). Компонент нефосфорилированных продуктов реакции, содержащий 16 изопреновых остатков, был выделен методом обращенно-фазной ВЭЖХ и проанализирован в условиях адсорбционной ВЭЖХ. Результаты анализа позволили идентифицировать полученный спирт как полипренол-16, но не долихол-16.

Для анализа фосфорилированных продуктов реакции их подвергали спирто-щелочному гидролизу, при котором полипренилпирофосфат превращается в монофосфат. Анализ последнего методом обращенно-фазной ВЭЖХ показал совпадение его компонентного состава по сравнению с долихолом, образующимся in vivo.

10. Продукты пренилтрансферазной реакции, протекающей в солюбилизате суммарной мембранной фракции дрожжей Sacch. carlsbergensis

В отличие от мембранных ррепаратов, в солюбилизате происходил синтез только фосфорилированных продуктов реакции. Свободные полипренолы при этом не образовывались. Анализ фосфорилированных продуктов реакции методом обращенно-фазной ВЭЖХ показал совпадение их компонентного состава с компонентным составом продуктов реакции, протекающей в присутствии мембраносвязанного фермента. Наблюдалось повышенное содержание гомологов, в молекулах которых содержатся 18 и 19 изопреновых остатков.

Таким образом, солюбилизация из мембран дрожжей дегидродолихил-пирофосфат синтазы не приводит к заметному изменению длины синтезируемой полиизопреновой цепи. Вместе с тем, экстракция мембранных ферментов в раствор затрагивает комплекс ферментативных процессов, ответственных за превращение полипренилпирофосфата, образующегося в ходе пренилтрансферазной реакции, в долихол. Вероятно, молекула полипренилпирофосфата in situ подвергается ферментативному дефосфорилированию вплоть до свободного полипренола. Солюбилизация ферментов из мембран нарушает этот процесс, возможно в результате разрушения мембраносвязанного ферментного комплекса.

Время, мин

эис. 4 Обращенно-фазная ВЭЖХ полипренолов, образующихся в инкубационной смеси в присутствии мембранных препаратов Басск. саг1хЬсп;(:т1<.- (1), и долихола, выделенного из клеток того же штамма дрожжей (2).

11. Влияние ионов Мв2+ и Г, 2-меркаптоэтанола, фосфатного буфера на

активность мемВраносвязанной пренилтрансферазы архебактерий

МЬ.МегтоаиШгорЬкит. Для пренилтрансферазной реакции, катализируемой мембранными препаратами МЬ.МегтоаиМгорН'ют было необходимо присутствие ионов и аллильного пирофосфата, в качестве которого был взят фарнезилпирофосфат.

Меркаптоэтанол и ЫаР не оказывали влияния на включение метки в продукты реакции. В то же время, использование фосфатного буфера позволяет избежать нежелательных эффектов, обусловленных присутствующей в неочищенных

белковых препаратах фосфогидролазной ферментативной активностью. Так, при замене фосфатного буфера на трис-НС1, наблюдалось увеличение счета в контроле без фарнезилпирофосфата и снижение выхода продукта реакции.

12. Влияние структуры аллильного пирофосфата на активность пренилтрансферазы архебактерий

Активность исследуемой пренилтрансферазы в значительной степени зависела от природы аллильного пирофосфата. Из трех исследованных субстратов, а именно диметилаллилпирофофсата, геранилпирофосфата и фарнезилпирофосфата, наибольшая активность проявлялась в присутствии последнего, причем при уменьшении длины цепи аллильного пирофосфата на одно изопреновое звено активность архебактериальной пренилтрансферазы уменьшалась в несколько раз, достигая фоновых значений в присутствии диметил-аллилпирофосфата (таблЗ).

Таблица 3. Влияние природы аллильного субстрата на активность пренилтрансферазы МЬлкегтоаи1о1горЫсит

__Аллильный субстрат_Пренилтрансферазная активность, имп/мин

Без аллильного субстрата 620.+138

Диметилаллилпирофосфат (С5) 669+53

Гераиилпирофосфат (С10) 1114+47

Фарнезилпирофосфат (С]5) 5424+281

13. Зависимость активности архебактериальной пренилтрансферазы от количества белка в инкубационной смеси и температуры

Включение трития в хлороформ-метанольные экстракты увеличивается с ростом количества белка в инкубационной смеси вплоть до 2,5 мг. Температурный оптимум реакции находится в области 45-55°.

14. Солюбилизация пренилтрансферазы из мембран архебактерий

МЬ.ШегтоаиШгорккит

Исследуемый фермент сохраняет активность в присутствии 0,1 -1,0% Тритона Х-100, причем обработка мембран 0,1-0,5%-ным раствором детергента заметно повышает пренилтрансферазную активность. Степень извлечения мембраносвязанных белков из архебактериальных мембран существенно зависит от концентрации детергента. Наибольшая удельная активность фермента в экстракте достигается при обработке мембран 0,1-0,25%-ным раствором Тритона Х-100, что соответствует весовому соотношению детергент: белок = 0,5-1,5 (рис. 5). Солюбилизация архебактериальной пренилтрансферазы не

)про во ждалась заметным изменением хроматографической подвижности

родуктов реакции в условиях адсорбционной ТСХ.

Уд. активность, тыс.имп/кин/мг белка

---Мембранные частицы —>— Солюбилизат

ис. 5 Распределение удельной пренилтрансферазной активности между солюбилизатом и мембранными частицами при обработке мембран МЬЛкегтоШЫгсрЫсит детергентом Тритон Х-100.

15. Анализ продуктов пренилтрансферазной реакции, протекающей на мембранных препаратах архебактерий МЬ.ЛеппоаиМгорИкит

Хроматографическое разделение продуктов реакции, извлекаемых юроформ-метанольной экстракцией из инкубационной смеси, достигалось ТСХ а силикагеле в системе растворителей 1. На авторадиохроматограмме жаруживалось интенсивное пятно, предположительно изопреноидного онофосфата, подвижность которого была выше подвижности долихил-лрофосфата, но ниже подвижности монофосфата долихола. В некоторых случаях 5наруживалось второе пятно меньшей интенсивности, по-видимому ютветствующее изопреноидному дифосфату, подвижность которого на ТСХ была ^сколько ниже подвижности пирофосфата долихола.

При инкубировании мембранных препаратов МЪ.НютпоаиШгорЫсит с >ажды меченым [!_1-3Н,г,/?-32Р]изопентенилпирофосфатом в присутствии арнезилпирофосфата происходит включение обоих изотопов в продукты реакции, а рис. 6 приведены сцинтилляционные спектры продуктов реакции в сравнении > спектром исходного [и-3Н,а^-32Р]изопентенилпирофосфата. Интегрирование жвых в области счета трития и позволяет определить соотношение 3Н/32Р в зодуктах исследуемой реакции (табл.4). Соотношение счета 'Н/32Р в юпреноилном монофосфате (1^=0,2) было в 2 раза выше, чем в пирофосфате 1Г=0Д2), а по сравнению с исходным [и-^Н,а^-32Р]изопентенилпирофосфатом

отношение 3Н/32Р в продуктах реакции увеличивалось соответственно в 6 и 3 раза. Таким образом, в ходе реакции происходит конденсация по меньшей мере трех изопреновых остатков изопентенилпирофосфата с тремя изопреновыми остатками молекулы фарнезилпирофосфата.

Таблица 4. Величины отношения 3Н/32Р в исходном

32Р]нзопентенилпирофосфате и продуктах преиилтраисферазной реакции.

Объект Отношение 3Н/32Р

[и-3Н,а,/3-32Р]изопентенилпирофосфат 138+0,07

Продукт I, 7,9+0,1

Продукт II, =0,12 4,0+0,1

3Н 32р

О 20 40 «0 ,80 100

Номер канала счетчика

Рис.6 Сцинтйлляционные спектры субстрата [и-3Н,а,/3-32Р]изопентенил-пирофосфата (1) и продуктов его превращения I, ОД, (2) и II, 0,12, (3) в присутствии мембранных препаратов МЬ. Легто-аиШгорЫсит.

При инкубировании мембранных препаратов архебактерий с [<3-32Р]изопенте-нилпирофосфатом не происходило включения фосфорной метки в изопреноидный монофосфат, в то время, как в контрольном инкубировании с [1-14С]изопентенил-пирофосфатом наблюдалось его образование. Поскольку оба продукта конденсации [1Г-3Н,а,0-32Р]изопентенилпирофосфата содержали фосфорную метку, то можно

мшоложить элиминирование 0-РО4 из изопреноидного пирофосфата, >азующегося из [/3-32Р]изопентенилпирофосфата, приводящее к образованию леченого монофосфата.

ВЫВОДЫ

В мембранных фракциях дрожжей и архебактерий обнаружены активности ферментов, осуществляющих конденсацию изопентенилпирофосфата с аллильными праймерами пренилтрансферазной реакции с образованием полипренилпирофосфатов.

Впервые из мембран дрожжей УассА. саН$Ьег%ею1$ солюбилизирована

пренилтрансфераза, ответственная за синтез полиизопреновой цепи молекулы долихола. Экстракция активного фермента из суммарной мембранной фракции достигалась с использованием неионного детергента октил-/3-(0)глюкопиранозида при концентрации детергента 10 мМ и соотношении белок/детергент 23. Фермент активен в присутствии фарнезил- • пирофосфата и ионов проявляя наибольшую активность при

щелочных значениях рН и температуре 30-40°С. Солюбилизация фермента из мембран приводит к заметному снижению его термостабильности. Продуктами пренилтрансферазной реакции являются полипренилпиро-фосфаты, компонентный состав которых совпадает со спектром долихола, присутствующего в дрожжевой клетке. Синтез полиизопреновой цепи мембранными препаратами дрожжей БассН. саН^Ьег^епз'и сопровождается гидролизом образующихся полипренилпирофосфатов вплоть до свободных пренолов, а солюбилизация ферментов из мембран приводит к прекращению дефосфорилирования продуктов пренилтрансферазной реакции.

Впервые исследована и солюбилизирована из мембран метаногенных архебактерий МЬ. ЛегтоаиМгорИкит пренилтрансфераза, осуществляющая конденсацию по меньшей мере трех молекул изопентенилпирофосфата с молекулой фарнезилпирофосфата. Солюбилизацию фермента осуществляли с помощью неионного детергента Тритон Х-100 в диапазоне концентраций 0,1-0,25%. Температурный оптимум пренилтрансферазной реакции составляет 50°С. Для проявления активности необходимо присутствие аллильного пирофосфата и ионов Реакционная способность

аллильных субстратов возрастает в ряду диметилаллилпирофосфат <гера-нилпирофосфат < фарнезилпирофосфат.

Разработан эффективный метод выделения, и очистки дрожжевого долихола. •Впервые для анализа индивидуальных гомологов долихола использован метод масс-спектрометрии с ионизацией термораспылением.

5. Осуществлен химический синтез ряда субстратов пренилтрансферазн реакции, в т.ч. радиоактивно меченых: диметилаллилпирофосфа геранилпирофосфата, фарнезилпирофосфата, [и-3Н]изо пентен] пирофосфата, [а^-32Р]изопентенилпирофосфата и ■ [0-32Р]изопентен] пирофосфата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Bukhtiyarov, Yu. Е., Hamui,A, Shabalin, Yu. A, KuIaev.LS. (1989) Prenyltransfer; Reaction Catalyzed by the Saccharomyces carlsbergemis Membrane Preparati Proceedings of V-th International Conference on Chemistry and Biotechnology Biologically Active Natural Products. (Ed. Vlahov R.) Varna-Sofia. Vol.4, p324-3:

Бухтияров Ю. E, Шабалин Ю. А, Кулаев И. С. (1992) Солюбилизация и свойсп мембраносвязанной пренилтрансферазы архебакгерий Methanobacterii thermoautotrophicum. Биохимия Т. 57 (5), С. 701-711.

Bukhtiyarov, Yu. Е„ Shabalin, Yu. A, Kulaev, I. S. (1993) Solubilization a Characterization of Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase from Ye Saccharomyces carisbergensis. J. Biochem. Vol. 113, No. 6

12.04.93 г. Зак. 556IP. Тир. 130 экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН