Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВОЙСТВА КОМПОНЕНТОВ МРНП - КОМПЛЕКСОВ В РАСТЕНИЯХ ДУРМАНА, ПОРАЖЕННОГО Х-ВИРУСОМ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "СВОЙСТВА КОМПОНЕНТОВ МРНП - КОМПЛЕКСОВ В РАСТЕНИЯХ ДУРМАНА, ПОРАЖЕННОГО Х-ВИРУСОМ КАРТОФЕЛЯ"

лиши' И ОРДЕНА ДРУКШ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ШСТИТУТ МЩРОШОЖЗГИИ 'И ВИРУСОЛОГИИ им.Д.К.ЭАБОЛОТНОГО

11а правах рукописи

ПАРХСШШ) Нина Иэсифовна

УДК 578.224

СВОЙСТВА КОМПОНЕНТОВ МРНП - КОМПЛЕКСОВ В РАСТЕНИЯХ ДУРИЩА, ПОРАЖЕННОГО Х-ВИРУСШ КАРТОФЕЛЯ

( 03,00,06 - вирусология )

Авто реф е р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа шполнена в отделе репродукции вирусов растений ордена-Трудового Красного Знамени Института микробиологии:и вирусологии ишД.К.*За болотного АН УССР

Научный руководитель:, кандидат биологических наук,

' ст.н.с. Л.Ф. ДВДЕНКО

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

1КС. ДШ8С0

кандидат биологических наук, ст.н.с., В.Г, ШШЗГОЯ1К0

. Ведутая организация; Киевский государственный университет

иы.Т.Г. ГСавчешсо (кафедра вирусология)

Защита состоится "ЛО"; иО-/СТУ(Сг^ 1991 г. а 9 ч. . 30 ыцн ва заседании специализированного совета Д.016.06.01 по присуждении ученой степени доктора биологических/наук при Институте микробиологии- и вирусолога»^ш'. Д.К. Заболотного ЛН У ССР (252143,Киев-143, ул.акад;-Д.К.Заболотного, 154),.' ■ -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ' микробиологии-и вирусологии^, им. Д.К.Заболотного АН'УССР

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь , ' ' .• *

специализированного.совета. > ' *••'. ~

кандидат биол. пази , "" .А.»^озленко

Зак. (9 5ор»ат 60 х &7/16. Уч.- изд. ].0 Подписано к печати a5.0I.I93I г. Тираж 100 акэ.

Полигрия^ическиЛ участок-Кк. " ."•^•'стичаской физики А!1 УСС?

• - I -

_ ОЩШ ХЛРЛКТБРИСИПО. РАБОТЫ

V • . ' Ч

Актуальность теми. В настоящее время установленным.<£ак- . том- считается, что мРНК d клстках эу ка ри о т сущсстзуат в ш-лексо о белками, , образуя'при этом шссещютр-риболушгсопрото-

комплекс - иРШ или ипфоршеош. Ркбоиуклоопротевдкне кошлоксц d клетках оукариот принимают участие в реализации. генетической информации, отличаясь при этом как'по своей ~ структуре, так нпо функциям (Спирин А.С.,1978).-Так, ипфор-' шеемкая PIIK в сроцсссс трансляции, как правило, существует в ассоциации с кнфОрмосошигли волками'в виде мРШ. Эти структура входят в состав полисом, а остальная часть мРНК не транслируется и представлена,,в оспошои, свободными цитоплазматичес-кими мРШ. Причем каждому типу клеток, по-видимому, присуши, свои варианта взаимоотношений мевду транслируемой п нетранс-лируемой mPHIí; зависящие от специфических регуляторнше-механизмов. \

Р1К большинства вирусов растений обладает матричной активностью. и входит в состав вирусспсцифическпх полисом,. принимая участие в синтезе вируеспсцифичсских белков. Белкошй синтез является составной.частью общего пути экспрессии генов. По литературным дашшм (Laraon, 1987 ■) мРНП полисом отличается по свои« физико-химически« свойствам, а такя® по белковому составу, определяющему, их биологические свойства., функциональная роль ЕНК-связивагщих белков заключается, по-вадамому, - в обеспечений стабильности структур вяформосом, в регуляции их.трансляции, а таюке'в определения их-субклеточной локализации специфических мРШ.-Отличия.в составе белков свободных и'полисомных1 мРШ свидетольствуют о том, что процесс 'трансляции- контролиру-' -ется хотя cía.частично мРНК-ассоципроваяными белками.-

..Информационные РНК вирусов животных и растенпЗ такза обнаруживаются в комплекса с белками в составе взрусспецифачес-кюс информосом,\В составе вирусспецвфическше мРШ кроме клеточных белков входят и' вирусспецифические ( Box, 1976,. Soder-itmd: , I978¿,\Tard- , 1?72)«,Вирусспецифическяе белка выявлена а в. составе. мРШ., . содержащих клеточную информационную РНК (Калинина , 1980)Возможно,. вируоопзцифичвекие: белки такгсе йункцао-

Цент?, излиаз СгШотеса Кма. о;д. Леша егшм, шд. кн. КД. Tisifiusi

ниругат э качество регуляторних белков на уровне трансляции, уча' стиуя в экспрессии вирусного генома,. * ' ' Данная работа посвящена проблема, связанной с выяснением свойств изолированию: структур мРШ разлившей клеточной локализации из растений, дурмана, инфицированного Х-вирус ом картофеля. Как yxte отмечалось,^в клетках эукариот информационная ШС представлена в виде комплексов с■белками, которые имеют отношение и. биогенезу н футцмлм иИЖ, а тагам к регуляции се активности. Поласомше и нспслисомгио рибонуклоопротеидше комплексы отлк- ■ чаются по С1хлш диэкко-хшичоекпм свойствам, а -Taicte по белковому состав/, определяющему их биологические свойства.

! Цблт. и зпдпчи " ксК^е дотация. Учитывая ва;:;кость значения структурно о со do шюс те il мРШ в процессах бпогоноза ннформессм-1шх ИЖ целыэ настоящей работа било изучение свойств компонентов îjplin-комплоксов различной клеточкой локализации в растениях дурмана, нора^ешшх Х-варусом картофеля, В процессе выполнения работи'били поста aie ни слодутане задачи: ' - - ' - - изучений wii3inco-xiîi.îti4QCK[ix свойств структур кРШ различной клеточной локализации в раечт'елышх клетках, внфициросан-. aux X—вирусом картофеля; . -выяснение локализации мЙЖ, кодирующей белок ХБК;

- определение белкового состава свободных цптоплазматичееких мКШ.пмРНП из полисом;

- нселедевапиз матричной активности нРШ из полисомних.п не-полисошых JwPIîH в босклеточной система iR vitro.

Нпуч.чпя нопязпа.Впервые показано наличие балка оболочки ХБК в составе кРНЛ аз полисом растений дурмана, - пораженных ХВК. В составе свободных цктоплазматцческих мРШ обнаруживается балок серологически родстаешый.ио не идентичный,вирусному белку, Установлено, что белок оболочки ХВК прочно связан с мРНК в составе iiPim из полясои и слабо связан с мРШСв составе свободных цитоплазматичоских мРПП,.В составе свободных и мембраносвя-заншх иРШ из пораненных ХЕК : растений дурмана содержатся мРНК с молекулярной массой 2 х 10s, 0,56, 0,8, 0,3 кДа, которые отсутствуют в здоровых растениях. - Впервые видела на из ищуносор-бпрованкых вирусспецифических полисом.мРНК.о молекулярной.мао-, сой 0,3 кДа, синтезирующая in vitro белок оболочки ХЕК, вирус-

специфическая природа которой установлена розультатамк Dot-гибридизации. Впервые установлена субклеточная локализация мНЕС, содержащей геп структурного вирусного белка. Эта субго- -номная Р1Ж обпарудета в соскте свободных и мембракоспязаншос -полисом, что подтверждено трансляцией мРНК в белоксяятезируто-щей системе m vitro и результатами иммуноблотвнга продуктов трансляции. Показана возмсгшостъ аутогенного контроля синтеза вирусного белка in vitro , усиливающаяся в результате фосфора-' дарования белка оболоади ХЕК. -

. Практическая ценность. Выяснение механизмов регуляции синтеза болка в клетке представляет собой одну из центральных проблем молекулярной биологии. В этой связи наиболее важным направлением является изучение механизмов, обеспечивающих и кон-троли'рущих отдельные этапы функционирования информационных РНК ОйРКК) , что может служить основой для йэучонея процессов

синтеза вирусного белка в клетке и найти применение в будущем. Полученные результаты имеют теоретическое значение дая понима-ния-$ункциональянх особенностей. матрячкщ:.нуклеопротеиднцх комплексов различной субклеточной локализации в процессе вирусной инфекции. Дальнейшее исследование механизмов функционирования ыРНК в процессе белкового синтеза имеет большое значение при изучении экспрессии'вирусного генома в клетках зукариот и, возмогло, для управления протекания вирусной инфекции, что представляет iiecoMiieiiiiuii теоретический и практический интерес.

Апробация работы. Материалы диссертации'докладывались на 71 и УН сьсздах У1.10 (Доцоцк, 1984; Черновцы, IS89 ), . gth Соп-cresa of the Huncariea Society of Ш.сгоЪ1о1оеу ( Budapest, ' 1903), Sixtii International Солегевз of Virology (Japan, 1934), 16—я конференция Федерации Биохимических Обществ (Москва, 1985) Всесоюзная конференция "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства'ЧАлма-Ата, -1990 ) «. ...

Публикация гтаультатип иссдогсопаиия.Основные полокения диссертационной работ« опубликоваш в 13 печатных работах.-

Птруктупа и объем рпбот». Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (2 главы ), экспериментальной

' _ - 4 - • . .

части (4 главы), обсуждения результатов, выводов и-списка литература (184 источника,, из них 48 работы отечественных авторов в 123 - иностранных)., Работа. излокенд: на., 140 страницах ма— шинописи, иллюстрирована:36 рисунками и.3.таблицами.

КРАТКОЕ СОДЕРДАШПЗ V РАБОТЫ

Объекты иссладотнйй.- Жработе использовали Х-вирус картофеля,., которкй является удобной моделью для решения составлен^ ннх задач: системное порайонно растений дгрмаиа,. который .выб—. ран в качестве растения-хозяина;: механический.перенос инфекции возшмость^пслучсняя вирусного препарата в достаточных количествах,* нео<{ходкгллх"для исследования. ' "

' Для исследований.такке использовали структуры ыРНП различной клеточной.локализации (свободные.и'мембраносвязан--вые мРКП,-свободные и мембраносвязанные полисош и изолирован. ные кз них мРШ) и кРВК,. выделенная из этих структур.

Осиовгою ют толп. Выделение ХЕК проводили по методу Новикова: (кафедра,вирусология ИГУ), который:состоит, в осацдении вируса пелиэтялепглкколем (ПОТ с мол.массой G0QQ ), pecycneipui-ровапвем в фосфатном буферо и.несколькими:циклаш нкзкоскорост-вего центрифугирования.

Структурный дояслкмеризовашшй белок ХЕК получали по методу-;7ц,. Bruening,. (1971). Концентрацию содержания вируса и' белка в препаратах определяли по методу Koonig, (1378). Сыворотку, к Д-бел<у'2Ж получали-по методу Shapiro, (1974). Из. аодучеппой сыворотки выделяли иммуноглобулины;(Фогт, 1977) , , которые освобождали от PtIK-аз (Гинсберг, 1972).

Выделение мембраносвязапшх и свободных полисом осуществляли по кодифицированному методу o^ava с соавторами.(1983). Полкеомы, синтезкруодис вирусный белок,, выделяли сорбцией иммуноглобулинами к структурному белку ХЖ ( Mueller- Lantascb, 1976; Or-en,. 1901). мРШ полисом получали путом диссоциации ■ полисом в буфере, содержащем-50 Ш ЭДТА по шэтоду,..предложенным Исвавокал и Лйтхожиншг (1979). -

Электронную микроскопию проводили по методике Сатаро-воП (12G0). Плавучую плотность.полисом'определяли■по Дорохову -с соавторами (I3S0). .

>: 5 - -

■ Ваделепиз мРНК из мРШ различной клеточной локализации .проводили по - Steele, (1978), а электрофорез РНК в'ПЛАТ-по . Peacock и Dingman, (I9G7). Для синтеза белка in vitro .использовали лкзат р а т пкулоцат о в кролика, обработанный микрококковой нуклеазой по Маииатясу с соавторами (1984), Белоксинтезируодую систему готовили по1методу Клемеиса (1987)

Продукты трансляции анализировала методом электрофореза в ПААГ (с содержанием акриламида и бисакриламида в соотношении-150.: I ")'по методу Laemmlt ,{1Э70).

* Нммунойлотипг продуктов трансляции осуществляли методой -Tov/liin,(X979) с некоторой модификацией. При фосфорилкрованки белка ¿SK in vitro использовали, метод Не Uurcia,(I98G).

; РЕЗУЛЬХЛТи КССВДОВ/ШИЙ .

I. Оизико-химлческае характеристика мРНП ;

Дня выделения структур использовали иискулпрованные Х-ви-русом картофеля листья дурмана на 4 - 5 день.после зараяешш в период наиболее интенсивного синтеза вирусного белка. В качест-. ве контроля- использовали ложно кнокулировакше листья дурмана. На всех этапах'выделения структур i/РШ различной клеточкой локализации использовали спектрофотометрический анализ. Спектр поглощения ультрафиолетового излучения (УФ-спектр) для исследуемых фракций определяли d зоне 220 - 300 нм. Для свободных по-" лисом и свободных цитоплазматических мРНП максимум поглощения

в;УФ-спектре обычно соответствовал в области 260 нм. В то время как для мембраносвязаныых полисом и мРШ максимум поглощения

определялся при длине волны 270 нм. , . Этот факт| по-видимому, объясняется присутствием некоторого количества мембран во фракции полисом. Выделенные из свободных и момбрайоспязашшх. полисом'мРШ имели пик поглощения в ' УО-спектре при длине волны 260 юл. ' "'

При.фракционировании тотальных препаратов полисом в градиенте концентраций сахарозы 12,55? - 50# профиль распределения полисом осуществляется следующим образом: в здоровом махориало, в основном, выявляются свободные рибосомы, а в случае вирусной ипфокцаи наблюдается резкое перераспределение, свободных рибосом в полпеош (Рйс. I) ,г

. ■ . . ' Дно ... ■ ^ ■ \ Дло

rJS фракций '" ; ' ■■ ШГфракций

Рис.1. . ' ' ■

Профиль'распределения в.гра- Профиль распределения в градиен-. диеиго концентрации сахароза те концентрации .сахарозы (12,5 -(12,5 - 50р) полисом из здо- 50£) полисом из. инфицированных-роит: растений-* . ."растений .

Фракционирование" а градиенте концентрации сахарозы полисом,, оставшихся поело иммунопреципитацви показало, что- инкуби- ■ ровзнио их с иммуноглобулинами*ш разрушило полисош, /лишь незначительно возросло содоркание рибосошльных субьединиц и'сни-кено количество трк-поняакеров в связи с их иммуносорбцией. Тот йагст, что поело'иммупопреципитации количество.пеитасом.сокращается (Рис.2.), даот основание предположить, что вирусспоцифичес-кио полксож в основной являются понтонерами,.что согласуется с получепншп седкмектогршлыаш. ' г

Одной из. осцовпИх характористик.ввдоляошх структур ин-фсрмосогл является значение - их' плапучой плотности в преформиро-,

ЛД- фракций ■ Рис.

-Проекта распределения сугЛ-■ парних полисои из инокурированных ХВ1С растений в гра-. дкэите.концентрации сахарозы до. иммупопрецкпктацяи ■

Л];! фракций

Профиль распределения.суммарных ■полисом яз нкокулировашшх ХЕК растений в градиенте концентрации сахароза поело нкму-нопреципитации

зашюм градиенте С£С1 показало, что свободные пол-лосю имеют плавучую плотность 1,52 г/см"*, в то врет как плавучая плотность мемЗранооЕЯзашЕнх полисом составляла 1,48 г/см'*. По-видимому, такое.различие в значениях плавучей плотности-связано с наличием значительной примеси белка в ыембраносвязанных полйсомах. При фракционировании ыембраносвязанных и свободных полисом' в преформированном градиенте С5С1 выяснилось, что исследуемые структура не содержат примеси свобоД1шх_мРКП. {Рис.3), что является одншл из основных'.условий для* изучения биологических функций мВДК ,в составе полисом.

. При использовании ЗДТА с целью диссоциации субъединац ря-босач,;вцделены мРНП полисом,, плавучая плотность которых соот-вэтетвовала 1,41 г/с.мЭ.

При'фракционировании , в п рефори и рова ином градиенте С$С1. свободшсс Цатоплазматических■и меыбраносьязанних мРНП значение .их'плавучой-шготности соответствовало 1,42 г/см? и 1,44' г/сы^ {РИ1.4), .

0,600 о,*« о, го»

10 20 эо //М ФРАКЦИЙ

Рис.З.

'Плавучая плотность свободных полисом в градиенте ' плотности СаС1 ■■ «агл

-8 -

•'"ИМ1» ! о* ■

КО ни

1.50

I,« 1.000-

■ 1.10 -

1,К 0.800

. Г.ЭО

0,700

• 1.23 0.600

. 1,20 0,500

. 1,11

,1.10 о.*оо

. 1.01 0,?00

0,200

////<ррАЩий ■

Ркс.4.

Плавучая плотность свободных цатоплазматических мРНП в градаенто плотности СЬС1

Плотность Ос1 г/сн'

10 20 А/А/ <РРЯКЦИМ Плавучая плотность мекбраносвязанных^ полисом в градиенте плотности С«С1

ОС1 г/ои'

1,10

ю го „ м

лгл/фрдтии

Плавучая плотность мембраносвя-зашшх мрШ в градиенте плотности СЬСГ

- 9 - '

- ..Как видно из.представленного'материала в составе нембра-носвязанных и свободных мИШ в значительном количество содер-нится-белок, а -тайно привесь рибосом и полисом.

Таким образом, иРШ различной клеточной локализации отличаются по свош плотностшм и спектральным характеристикам» Это отл'ичио обусловлено, по-видкмому, прочностью'связи структур с мембранами. Так с помедъя электронной микроскопии было показано, что несмотря на.проведо1шую солюбилизацям мембрано-связанных полисом тритоном X-IOQ и последующее фракционирование в градиенте*концентрации сахарозы, некоторое количество полисом было связано с мембранами. ■ ' ■

2. Состав белков полнеомкых и неполисомкых МРШ

Одной из шшшх'фуккцЕЙ белков,.ассоциированных с мЕНК, являотся ах участие в процессах регуляции трансляции. Аналогичные функции, по-видимому, осуществляют и вирусные белки, обнаружение наряду с кязточшиш в составе вирусспоцифичосках поли-сомшх мРШ в клэтках оупаргют, ипфнцнроваяшх различными вирусами. Вирусслецкфачйскнз белки выявлены и в составе мИШ, содержащих клеточную информационную РНК. На основании этих дан- -них допускается возможность их участия в регуляции синтеза клеточных белков ( Хдагзоп , ISS7), Поэтов представлял интерес выявить структурой вирусный белок ХВК в составе полис омшх и ие--полисомншг (свободных цитоплазматическях) мРШ, выделенных.пз листьев.дурмана, порайонных Х-вирусом картсфелл.

Шявлоняо ■ вирусного белка в исследуешх образцах проводили методом двойной .диффузии-в агаре по Оухтерлони, используя ан-тисы воротку к деградированному болку ХВК с титром: I : 64.

• Иммунологический анализ.белков мЕНЛ,.выделенных из полисом листьев дурмана на 5-й день.после заражения,- показал, что данные. структуры содержали белок сорологически идентичный свободному белку ХЕК. . ,

В соке из зароненных растоний такке обнаругсивался'белок;, серологически идентичный структурному белку ШС.,.По-вядямовду.

в соке зараженного растения lia 5-й день после зараяенпя находится некоторое количество свободного белка ХЗЗК, достаточное для -, его обнаружения методом двойной иммукодвффузиа в геле; *

Анализ цитоплаз ка т нчсских. f/РШ, полученных из пограничного слоя сахарозы и представляющих собой-нетранслируемую.форму клеточных мРШ (цатоплазматяческио: анформосокы), показал- ■ . наличие в лих белка, серологически - родственного структурному ■белку ХШ, по ко идентичного ему, о чем евидетельствуот "шпора" в реакции двОПиоЙ шя^унодиффузии- по OuoMarlony . При этом в контрольных препаратах цятоплэзматнческих мРШ, выделенных из здоровых растений, белок, серологически родственный. , ■ структурному болку, не выявлялся.

Таким образом 'показано,, что в мРШ ви рус с из цифиче ских ■ ■ суммарных (¿вободиих н мсмбраиосвязашшх) полисом, идаукопре-"цапитируемых иммуноглобулинами-к деполикеркзованкоиу белку X-вируса картофеля, присутствует1белок, серологически иденткч- -ьий белку Х-вяруса картофеля, тогда. как: .в цитоплазматйчзских " суммарных мРШ содержатся.белок, серологически.родственный, но не идентичный вирусному белку.. Исходя из этого представляло ин торсс более подробно ■исследовать состав белков :.-,РШ вируселс цпфичсскнх полисом, сиптезирующих,структурный белок ХВК,

' Чтобы исключить возможную копрецапзтацкго цптоплазматя-чесикх вирус специЗ мчо скнх пнформосом, содоргащюс белок, 'серологически родственный ■ бету оболочка вируса,. от вирус специфических полисом использовалось центрифугирование постмитохонд-раальной фракции через плотные 1,5 - 2 И слои сахарозы СИска-it ов, Мтхеглш, 1979). Таким образом,. цитоплазматические ыРШ ■ отделяли центрифугированием через двухслойную сахарозу (1,5 -2 11) и использовали ах для шлмуносорбциа специфической фракция мРШ. - . - '■ ..■

При изучении состава бежов суммарных цитойлазматичес-ках и суммарных ;,1РШ полисом фракционированием их в ПЛАТ уста-нойлено,.что состав.белков мРШ из полисом отличался от состава бежов цитоплазматических мРНП. Сравнивая полученные нами результаты с литературными данными следует отметить, что в ци тогшазтических мРШ к мРНП полисом содержатся белкисмолз-куляркой массой, близкой по значений к ,белкам' ШМ различных ; эукариот. Б.состава мРШ, .выделенных из;индивидуальной;фракция полисом, сорбируемых итдаоглобулияащкД-бвлку.ХВК,, об-напуг.ены • основине • полире птиды с молекулярной массой* 90, 78, • " 57 , 25, 22,5 килодальтон. ;.' ' ; ■ '-.'' г -

: • -ii - ■■

В цитоллазматичоских'мРШ, прешшйтируеаых иммуноглобулинами к Д-белку ХБК, шяалиш пола пептида с молекулярной кассой: 92, 75, 55, 25, 23,килодальтопа. Полипептид о молекулярной массой 25 килодальтои, обнаруженный в составе.цитоплазма тическихыРШ. и jd?Iin полисом, сорбируемых иммуноглобулинами к. белку ХШ,'представляет собой структурный болок Х-вируса кар-тси^едя. "■' .1

Учитывая естественную афинкость; белка оболочки ХЕК к в и русс пэ цкуиче екни РНК, 'представлял " интерес выяснить: логко-дкссоциирусшм пли прочнссвягзгшым является структурный белок ХВК, обнаруживаемый в в ярус специфических мШГС,. выделенных из . заражении ХЩ растений дурмана, а такт.е установить прочность связи клзточнше белков в составе вирусспецифическкх мРНП,

Для выяснения прочности связи tsFÜK с ее специфическими белками проводили обработку суммарных мРШ'полисом■и суммарных цитоплазматических. мРИП растворами KCl различной полярности (': 0,3.14, 0,4-М п 0,5 И) по методу. Иска нова и Айтхоетпа . (1279 )..БЬлок с-молекулярной массой 25 - 29 нллодальтон в составе .цитоплазматическвх мРНП улавливаются только посла обра-

■ ботки 0,3 Н KCl, а при. обработке'. 0,4 Ii KCl и 0,5 М KCl не об-

■ наруживаотся.' ' • •

Данные.об идентичности выявляемого белка о молекулярной массой 25 - 29 килодальтон методом электрофореза в ПАДГ с, белком.оболочки ХВК подтверждается реакцяой двойной имгду-нодиффузии, в геле (Рис.-6.). Содержание этого белка в соста- ' во вирусспецифаческих i.tPIUI». связанных о полисоками, эначцтель-" во ниже по сравнению с юяеточккмп белкамп 78 н 52 кшюдальто-на, однако.для болка 25 - 29 кнлодальтон,. также как it для. белков 78-ц 52 килодальтона, . характерна прочная связь с мРНК.

' На основании подученных данных, можно предположить, , что болки;цитоплазматических мРШ характеризуются не нее прочной связью в сравнении с белками ыРНП полисом. По-видимому, .нотранслируемая форма мРШ1 не. предполагает наличия достаточно' прочной связи белков, в отличие от транслируемой Форш,-, кото- „ ' руо представляют кИШ полисом..

1 ■ { пол.мРНП P*"^ '

• Л , V

•¡Я О / VPG!

fц.мРНП! • -

- 0,3 M KCl ."'.".■ 0,4 М KCl • 0,5 М KCl

. ,/ а • ' б 4 " '' в

Рис. 5,.Реакция белков, выявляемых в состава мРШ из

• ' ' листьев дурмана, инфицированных ХБК'<после ии. курирования препаратов мРНП в растворах KCl.в ' ; концвнтрации.0,3 li /а/, 0,4 М /б/, 0,5 М/в/ _ * .-'И последующей обработки РНК-азой) с антксиво-

- ■ роткой к депо'лймерязошнному белку оболочки ХЖ: ■ в центральной лунке антисыворотка к Д-бел- -ку ХЕК; ■ ■■-.:'■ ;

, -, ,б депо ли ко риз оранный белок ХЖ; _ ' пол.ыИИ "- препарат мРШ полисом; .

' ц.мШГ - препарат цитоплазматических мРНП. _

Два основных Полипептида' с молекулярной массой 7ö_ и кшюдальтонЗ, .обдарузгздваеше- в препаратах вирусспецифических мШ полисом после;их' инкубирования в растворах.высокойгкон-' цеитрацяи KCl, йлизки по молокулярной даосе к полипептидам,, вияшиешм' в составе/мРШ1 полисом различных эукариот.

По-видимому, эти белки выполняют регуляторную функцию па*' уровне тхйнелнций. ■ Поскольку для белка ХЩ, выявленного в составе вирусспецифических мРШ'полисом, характерна"прочная связь с мРПК, мокло предположить, что характер связи вирусного белка, по-видимому,, играот определенную регуляторнув роль в синтезе вирусспоцифичёских болков.

•■}поллл?НП t 1 Г : ¡ пол.мРНПГ

О О £

В О,!'" О 16

•'•'••': Гй.ыРНп! . V ! » . i ц.к-рш[...„_

■ - 13 -

3. Г/атричная активность мИШ п выдолсшшх из них мШК различной субклеточной локализации в белоксинтези-рувдой системе in vitro -

В связи с различно]! локализацией синтеза вирусспоцифичес--i;jix белков лля ряда вирусшХ - инфекций. в нащу задачу входило выделение свободных-и мсмбрапосвязаншх полисом из клоток растений-дурмана,. пнСуицированлш: ХВК,.. и установления их роли D-Сиптозо белка оболочки вируса».В результате^проведенных исследований из: вируоспецифических: полисом, - выделенных методом непрямой иммуно- . преципитации с использованием иммуноглобулинов к белку: оболочки ХНК, била изолирована мРНКо молекулярной.массой 0,33 кДа. Ви-русспецифичность видело шой мРНК подтверждали методом гибридизации с клонированной. ДНК ХШ; полученной с;помощью ревертазы наг ка£едро вирусологии ЬПТУ(Рпо.б)

- ' ~ iv J - If . - ■ ~ .' >

• Ш - gV •

/*

i.tPllK

-itr

РНКХЩ.

мРНК. из здоровых 1 - . растений.

Рис. 6.Dot —гибридизация мРНК с мол.ыассой 0,3 кда,. вы— .

долоннал из вирусспецифических мРНП полисом.-Информационная РНК-с мол.массой 0,3 кДа присутствовала !) : составе мРПП свободных и:мсмбраносвязашш: полисом, выделенных сорбциой иммуноглобулинов к болку ХВК(Рис.7)

В снстсмо трансляции из■ротинулоцитов кролгла in vitro mPIIK 0,3 кДа направляло синтез болка с:мол.массой около 29 кДа. Параллельно прооедол иммунохимиюский анализ белков поело Их переноса с геля на нитроцеллюлозные фильтры'с использошпием сыворотки болку ХВК Л-йнтикроличьих-антител, меченных пероксядазой.

Рис. 7 . Уле ктрофор е"грамма РНК, изолированной из мРНП полисом, прощшктвруемых игедупоглобулинами к белку ХЕК; а - мембраносвязанные полисов; б - свободные полисомы; в - даркерпая РНК вируса мозаики костра; г - РНК ХШ * _

- В результате проводелних исследований установлено, что в -системе трансляции из рвтпкулоцитов кролика la vitro мРНК направляла синтез белка, который по электрофоретичоской подвижности я результатам проведенного шмуноблоткнга соответствует структурному белку ШС (Рис,8)

, 1 ■ . ■ ч

I

Рис. О, Анализ продуктов трансляции методами авторадиогро-. фин (I) и ишуноблотирования (2): ■ , I оЕ1догешшй синтез; 2 - синтез белка, направляем ui . иИКиз t.ici.id ¡юносвязашппс полисом; " 3 - ci:]itg3 бплг'.а,- направляемой мРШ{ пз* свободных но лисом . - ' "."'...■

■ н

; . .. -15- ■ ;

Таким образом, н,свободный, и мембраносвязаншэ полисош клеток дурмана, инфицированного ХЕК, содержи информационную РКЕ^ кодирующую вирусный белок оболочки.'' _ ■

Cy6reiiOMtiaH ТЕК мол.маесой 0,3 кДа.обнаруживается также в . ооставо свободных цитоплазма тнческих и мембраносвязанных кЭД1,*' выделенных из растений дурмана, порайонных ХЕК. Кроме того, в составе шшоуказашшх Структур обнаруживаются мРНК с мол.шссой 0,8 . и 0,56 кДа, которые отсутствуют, в здоровом■ материале.

В паши интересы такяе входило изучение матричной активности мРШ1 различной клеточной локализации из инфицированных ХБК ■ растений дурмана. Для выявления матричной активности мРНП из листьев дурмана, тюкулагювапшзс. ХЕК, были изолированы мВШ: свободные и мембраносвязащше, а такие мРНП свободных и мембраносвя-заншх полисом. 'Данные структуры фракционировали в градиенте кон. цонтрации сахарозы (12,5 - 50 % длл мРЩ полисом и 10 - ÍQ% - для мембраносвязаннйх и свободных мРШ). Отдельные фракции мРКП вносили.в систему «трансляции in vitro. В результате включение метка отмечали в обоих'случаях, причем момбраносвязанные полисомные и неполисомкые мРШ направляли синтез белка болое интенсивно в сравнении' со .свободными цитоплазмат ическкми мРНП и мШ1.свободных полисом. , ' . ■..-..

Таким образом, полисомные и нелолисомпые мРШ различной субклеточной локализации в бесклеточпой системе in vitro направляли синтез аналогичных вирусных белков, как и выделенная из этих структур мРНК. .

' ' Как было ■ отмечено ранее, структурный белок ХВК прочно связан с мРНК.Кроме того установлено,: что белок ХВК способен фосфо— ршшроваться in vivo ц in vitro- . Эти данные, позволяют предположить о возможной * регуляторной функции структурного белка ХВК на трансляционном уровне.

. ' Для выяснения этого - предположения предпринята' попытка исследовать 'возможность аутогенного контроля вирусного белка в системе. трансляции. С этой цель» вирусспецифическую. полисомнута мРНК, кодирущую белок оболочки вируса транслировали; в бе скде точной системе in vltro при разном;содеряании вирусного белка (от 5мкг/мл до 105;мкг/млК Вию установлено,: что белок в концентрации ,45мкг /мл - '65 икр/мл незначительно подавляет процесс трансляция в срав-

- 16 -

liemiii с начальной концентрацией 5 мкг/wi,- -

Однако при внесении в белоксицтезиругащ> систому фосфори-лирояшшого болка ХШ в концентрациях от 5 мкг/ш. до 25 шг/ьш и при использовании л качество ттрнцц 'вирусспецифпческой РНК свободных полисом било установлено, что белок ХЕК в концентрации 25 мкг/мл полностью подавлял синтез белка .'Следовательно, мокно .предположить, что фосфорилирошщшй болок ХЕК более активен и: играет определенную роль в регуляции трансляции.. 1

При фракционировании в ПЛАТ свободных и ыембраносвязанных. мИШ был обнзруяол белок о молекулярной массой ЗЭ кДа, - который, возмозшо,. бта^чаот за bi ty триил аточную локализацию мРНП и является болком-ропрсссорш,. ток как.отсутствует в составе полисом!Шх мРШ (свободных и мембрапосвязашт).. Для.проварки этого предпо-ловдния белок ЗЭ-цДа изолировали с помощью аяектрофореза в ПЛАТ в пативной системе и вносили в систему трансляции in vitro , где в .качестве, матрицы использовали мРНК вирусспецифических uFffll свободных полисом,. Только.в случае трансляции вврусслоцифнческих мРПП полисом,, присутствий белка с мол.массой 39 кДа снижает включение мотки, в синтезируемый продукт на 30%. Учитывая то, что . болок вносили в количество только 5 мкг/мл,.можно предположить, что он обладает свойствами репроосора.-Необходимо отметить, что предполагаемый репроссор влияот, в основном,-на синтез^ направляемый мРПК в структуре^ полисовдого мРНП, т.е. в комплексе с со-путсгвумщши: информосоы'пши балкам^,.

I.-Из растоний дурмана, пораженных ХЕК, выделены мРНП различной клеточной локализации: мРНП свободных^й мембраносвязанннх мРНП,. свободные и ыембраносвязэнные mFHU. Значение плавучей плотности в проформированном градисито СэС1 свободою:- и ыеиб рано связанных мРНП,соответствовала 1;42 г/см^"и 1,44 г/см^; свободшос И мембраносвязанных полисом - 1,52 г/см3 и 1,48 г/см3, а значение^ плавучей плотности мРНП, выделенных изевободныхимембраноевя--заниых полисом составляло 1,41 г/см"*. '

2.. В составе свободных п мембраносвязанных мРНП из пораженных ХЕК растений дурмана содержатся mPHK.о мол.массоЙ 2 х 1(гДа, 0,8 кДа, ■ 0,56 кДа и.0,3 кДа, которые отсутствуют в здорошх рао-тениях дурмана; '*

3, .В составе мРНП.из полисом содержится балок сорологичео-

ки идентичный белку оболочки ХЕК, а в составе чихоплаоматичес---кпх мИШ. выявляется белок серологически родственный,. но не идентичный вируспсму белку,

4. Установлено; что поляпоптиди с молекулярными массами 73:и 52 кДа прочно связаны с цитоплазмэтичоскими мРИП и мРНП: полисом,, в то.время как структурный белок ХВК*прочно.связан с мРНП-полисом и слабо - с цитоплазматическими мРНП.

5. С помощью сорбцшг иммуноглобулинами. кД-белку ХВК выделены . вирусспсцифическпо полисош, содержащие цРЯК с молекулярной массой О,3 кДа,'вирусепецифичаекая природа.которой подтверждена результатами pot. -гибридизации.,

6,. Определена субклеточная локализация мЕНК.с молекулярной массой 0,3 иДа,.кодирутааая белок оболочки. ХЕК. Субгеномная РНК обнаружена в составе свободных и мемброносвязашшх полисом,, что подтверддено трансляцией мРНК in vitro и.результатами им-муноблотинга продуктов трансляция..

7. Выявлена матричная активность в бесклеточной системе трансляция in vitro,, как полисомгвж, так и.яополисомгшж мРШ различной клеточной локализации. ■

8. Показана возможность аутогенного контроля синтеза белка ХВК в бесклоточпой система трансляции in vitro.

Список.публикаций по тема-диссертация

1. Dideiiko L.F., ICrejev V.G., Parkhomenko 1T.I,,, Kaximen-ko L.A. - Study of (dIIHA.3 from Datura stramonium L. leaf tissue with potato vlrua X. // 9th Congreaa of the Hungarian society of microbiology.- Budapest, 1993, p. 136.

Z., Krajev V.C,, Dldenko L.F., Parkhoraenko If.I.- Proteins . identified in mRHP from Datura stramonium L. learn infected with potato virus X.// 9th Congress.of.the Hungarian eooletyof microbiology . Budapest, 1983, p. 143.

3. KraJev V.O., Dldenko L.?.,.P&rkbomenko Я.Х. - Polyri-bosorae-aasociated ribonuoleoproteins from Datura leava infected with potato viruaXi // Sixth International Congress of Virolo-cy.SendaljJ^pan, 1984.P.226.

, 4. Краов В'.Г., 'Дидопко Л.Ф., Пархомепко II.H. - Иммуноло-гичоский анализ белков мРШ,, ввдаленнше из .листьев дурмзяа пораженного Х-вирусом картофеля.//Микроб. гхя,- 1984,- 45.- 3,- с, 64-68.

5..Дидопко Л,0.Краев В.Г., Пархоменко И.И. - Выделение . вирусспепифических полисом «их ИЖ из лкстъсв Datura otramoni- ■ um пораженных Х-вирусом картофоля./Аезисы докл.УТ Съезда Украинского микроб,общества.-Допоив; 1984.-ч.2.-стр.175.

6. Дяденко Л.Ф., Краев В.Г., Пархоменко Н.'Л,- Состав бол-ков вирус с п о пифических полисомосвязанншс мРНП из листьев Datura: , etremonium L. пораженных Х-вирусом карто0сля./Д1нкроб.п->лг .. 1985.- т.47,- 2.- стр. 66.- 70.

7. Краев В.Г,, .Дидонко Л.Ф.-,, Пархоменко H.H. - Исследование белков и мРШС в составе мРШ цитоплазматичоских полисом пз листьев patera ntramonium L., пораисшшх Х-вирусом картофеля. //16-я Конференция ОЕБО, Х9С5,- стр.233.

8. Пархоменко II. И., Дндевко Л.О., Краов В.Г.- Связь бел- * ков с мРНК в составе мРШ, обнаруженных в листьях дурмана, инфицированных Х-вирусом каутофе ля.//.1 ик гоб. .-п-л,1985.-47.-6.-61-64.

Э.Дидекко Грабчегасо Н.П., Пархоменко Н.И., Уакси-

менво Л.Л.\ Натовский H.H., Краов В.Г. - Исследование свободных и мембраносвязаиных полисом из листьев дурмана, инфицирован-, ных Х-вирусом картофеля,//МпкроЗ.г,-л,-I0S3.- 5I.-4.-c.32 - 36.

10. Дидзнко Л.О., Макспмепко Л.Д., Парходапко Л.А., Граб-ченко H.H., Краев В.Г, - Исследование состава белков информосом различной клеточной локализации в растонплх Datura stramonium L., пораненных Х-вирусомкартофеля.//Макроб.г:-л, 1989,-51.-4.-35-44.

11. Дидегасо Л.5., Грабченко H.H., Пархоменко H.H., Краев В.Г. - Исследование субгеномкой РНК Х-вируса картофеля,в составе ыембраносвязанных и свободных полисом из листьев дурмана.// Тез.докл.УIX Съезд Украин.микроб.об-ва.-Черновцы.-1989.-ст.169-17а

12. Двдэнко Л.Ф., Максименко Л.А., Пархоменко Н.И., Грзб-ченко Н.И. - Состав белков винформационных рибопуклеспротеидах («РЕП) различной клеточной локализации из растений дурмана* инфицированных Х-вирусом картофеля./Аез.докл. У11'Съезд Украинского микроб.общества.- Черновцы.- 1989.- ст,Г?0 - 171.

13. Дпденко Л.Ф., Пархоменко Н.И., Максименко Л.А,Фоо-форилврованае структурного белка Х-вируса картофеля,//Гез;докл. УП Всесоюзной конференции ***Jккробиологичоскиэ и. биотехнологические основы интенсификация растениеводства в кормопроизводства Алма-Ата.- 1990.- ст.22.