Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОСТАВ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ МРНП РАЗЛИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ РАСТЕНИЙ ДУРМАНА, ПОРАЖЕННЫХ Х-ВИРУСОМ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "СОСТАВ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ МРНП РАЗЛИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ РАСТЕНИЙ ДУРМАНА, ПОРАЖЕННЫХ Х-ВИРУСОМ КАРТОФЕЛЯ"

ОРДЕНА ЛШИ1Л И ОРДЕНА ДРУЕШ НАРОДОВ АКАДЗШ НЛУК УКРАИНСКОЙ ССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУССШОГШ им.Д.К.ЗАБОЛОтОГО

На правах рукописи

■" :. ШКСШЕИКО Людмила Александровна

'■ СОСТАВ И 'ФУНКЦИИ ШЛКОВ кРНП РАЗЛИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ РАСТЕНИЙ ДУРМАНА, ПОРАГЕНШХ Х-ВИРУСШ КАРТОШЯ

{03,00.06 - вирусология)

А в т о ре ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата йвологичеоких наук

' Киев - 1991

Работа выполнена в отделе репродукции вирусов растений ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии вирусологии им. акад. Д.К.Заболотного АН УССР

Научный руководитель: кандидат биологических наук*

ст.в.с. д.о.дадЕнко

Официальные оппоненты: доктор биол. наук, член-корр.УЛ АН

профессор Л.Ж.БОЙКО

кандидат биол.наук, ст.И.С. П.В.НЕСТЕРОВА

Ведущая организация: Московский государственный университет (кафедра вирусологии)

Защита состоится "ЛуОг, в Э ч. 30 мин на: на заседании спсциализиропогаогосовото Д.016.06.01 по при-сувденя» учояой. степени: доктора биологических наук.при Институте микробиология и вирусологии им.Д.К»Заболотногб АН УССР (252143, Киев-143, ул. акад.Д.К.Заболотного, 154). ■

С диссертацией мокло ознакошться*1Рбиси1потско Института микробиологии и:вирусологии им.Д.К,Заболотпого АН УССР .

. Автореферат разослан

Учений секретарь ,' ■

специализированного совета; ' *

каадидат бисш.лэугс - • - . У.Л.Коваленко:

Зак. в Форма? 60 х С4/1С. Уч.- изд.. л.1.0 . - ■ ; •ц0итисп11о к печати 9. ОТ. 199 Т 'г^Тигегк $00 тжзг " ' ■-'■ '"" Полиграфический участок.Института теоротичоскоИ.физики У1.УССР

ОВЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ Актуальность _теш. В связи о тем, что функционально * необходимы» компонентом вируса является белок, в последнее время исследователей привлекает изучение белоксинтезиругащей системы клетки, при помощи которой осуществляется скнтез на только клеточных, но и вирусных белков.

Основная касса информационной РНК цитоплазмы меток активно функционирует как матрица в синтезе белка и входят в состав белоксинтозирушлх структур - полирибосом (полисом). Наряду с полиссмама определенная фракция ы?НК, не участвующая в трансляции локализуется э цитоплазме и входит в состав специфических мШП (ннформосом). Дифференциальная экспрессия -мЕШС определяется набором ассоциированных с ней ' белков, формирующих структуру матричного рвбонуклеопротепда. Изучение состава и щункций этих белков в инфицированной вирусом клетке необходимы для понимания ыоле^лдрной основы взаимодействия вируса я клетки.:

•. Исходя из литературных данных {Спирин, 197Б; Зр1Пп, А^кЬогМп,'1905; Втпв^евИЭЙЭ; 13га»егиап» 1901) мшено допустить, что белки в составе вирусспецифкческвх : мРНП.могут регулировать процессы транскрипции и трансляция, ' играя существенную роль в синтезе компонентов вируса. Поэтому обнаружение в составе мЕКП ИЕС-за васиной РНК-полкме-разы.представляет значительный интерес в связи с расшифров-' кой сложных взаимодействий вируса с клеткой и последующей его репродукцией. .'

. Ранее отмочено ( Саи1паго-Ма«1пев,1973: Пае, 1979; ■'. негЫгву, 1904 )» '. что в эукарвотвческих клетках смена ■ белков информосом, при перемене матрицей своей внутриклеточной локализации осуществляется за счет фосфорилирования ин-формосомных белков. Однако в литературе нет сведений о составе фосфоцротеинов в информосомах растительного организма при вирусной илфокции.

Кроме того для модификации евнтезируешх белков необходимы протеази* Полученные наш. данные, с использованием метода шаунойлотинга, свидетельствуют в пользу того, что . '. мРНП инфицированных раотевиЦ. дугазана Х-вирусоы картофеля . (ШО^'^дерд^^й^ктуршй йэлок в продукты его протеолвза.

Цзн., ' Се.л»от:я| Кш. орд, Лшна мша», акад. в«. К.А. Тшрязг:а

В связи с этим возникло предположение, что белок ХЕК способен к.автолизу или во является субстратом'для действия клеточных протеаз содержащихся л составе мРНП.

Цель и задачи исследования« Целью настоящей работы било изучить состав и функции белков 1лРИП различной клеточной локализации растений дурмана, пораженных Х-вирусом картофеля., В процессе, выполнения работы были поставлены следующие задачи:

- определить влияние репродукции ХНГС на фосфорилирование белков в составе мИШ различной клеточной локализации, изучить фосфорилиревание вирусиого белка в системах in vitro

и in vivo ;

- выявить связь ИПС-реплипазы с различными мРШ-комллексами, выделенными из растений дурмана, пораженных ХЕК и идентифицировать белок с РНК-эависимоЙ PIIK-палимеразной активностью;. ,

- идентифицировать белок, ассоциированный о поли/Л/-нуклео-тидными последовательностями и определить его функции;.

- определить.протеазную активность в составо мРНП различной клеточной локализации.

Научная новизна. Ранее при изучении механизмов репродукции различных вирусов основное внимание уделялось вирусспе-ци$1Гческигл макромолекулам /РНК и белку/, участвующих в этих процессах.

Впервые на основании полученных данных показано, что в вярусспецифическом синтезе участвуют и клеточные белки, которые связаны с вирусспецифическими РНК. Эти клеточные белки связаны.с синтезом вирусных макромолекул за счет функциональных особенностей, которые удалось выявить в составе... инфорносом: В составе ыРНП обнаружена РНК-полимераза, поли/А/-синтотаза, цротеаза,. а.также способность вирусных и клеточных белков фосфорвлироваться. Мы допускаем,, что фосфорилиро-вание-дефосфорилированиа - это тот регуляторный механизм, пря помощи, которого в зараженной клатке ослабевают прочные , связи ИК-связнваших белков с ыРНК и таким образом становится возмояным изменение структурной организации белков,

что открывает доступ к активным центрам этих белков,в различных ферментативных реакциях, необходшаых для репродукции вирусов.

Практическая тонкость. Полученные результата имеют теоретическое значение для понимания роли белоксинтезирующей системы клетки-хозяина, пораженной вирусом в экспрессия вирусного генома. .

Идентифицированные белки о ферментативными свойствами могут найти применение в биотехнологии с использованием геннолн-жеяериых приемов для получения необходимых макромолекул.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на УП Съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989 г.)Всесоюзной конференции "Микробиологические я биотох-нологические основы интенсификации растениеводства о кормопроизводства (Алма-Ата, Т990 г.); 2ndlnternatioml Syraposium ■ on Positive Strand 1ШЛ Virueeo, 1989, Vienna. Austria.

Публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 9 печатных работах.-

Структурами объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (2 главы), обсуждения результатов, выводов и списка литературы (205 источников, из них 43 работы отечественных авторов и TS2 - иностранных). Работа иэлодеш «а Т24 страницах машинописи, иллюстрирована 32 рисунками и 7 таблицами.

КРАТКОЕ СОДЕРЖА! ШЕ РАБОТЫ

Объекты исследований. В работе использовали в качестве инфекционного агента Х-вируо картофеля /ХЕК/. Выбор обусловлен тем, что вирус легко передается механическим путем, системно поражает пасленовые и легко нарабатывается в необходимом дал исследований тличеотве. ХЖ размножается в цитоплазма клеток растений^ используя белоксиптезирущий аппарат метки для своей..репродукции.'

Исследовали белки мРШ различной клеточной локализации: мПШ свободных цитоплазмат ич е скнх полисом, мИШ мембраносвя-зашшх полисом, мРНП свободные цитоплазматические и мРНП

мембраяосвязанные, выделенные из листьев дурмана, инфицированных ХЕК, .*

Основные метода. Структурнай вирусный белок получали по методу R'u (1971).

£ -глобулина получали по методу, описанному фогт (1972). Выделение вирусспецнфкчоских мРПП различной клеточной локализации из инфицированных ХВК растений дурмана осуществляли до методу Ogawe о coqdt.(I983). Степень очистки контролировали щ спектрофотометре " spocord

Для вы?;елеяпя белков, связанных с мРНК использовали ., метод Айтасо&ина с coaвт.(1979),

Электрофорез белков в ПААГ проводили по Laemmli (1970). Для выделения поли/А/-Фрагментов из мЕШ частиц использовали модифицированный метод на основа методов Jain ; Serkar (1979) и Искакова с соавт.(1985).

Иммунойлопщг белков проводили по модифицированному методу TowMn (1979).

Определение FHK-за в а симой-РНК-долиие ра зной активности белков ыРШ-К0МШ19КС0в определяли ПО Brakke et вЦI9S3). ■ Включение метки в синтезируемый продукт определяли на счетчике Becktnan-XiC— 7800,

Полз/А/-полимбразйую активность поли/А/-связываювдих белков В мЕНП комплексов определяли по Rosa и Jacob (1979). Пробы белков наносили на фильтры Mlllipor 0,45 ммк, радиоактивность изглерялп с помощью жидкостного сцинтвлшщиояно-го спектрометра СЛ-30 (Интертехних, Франция).

Концентрацию белка в стандартной cue си определяли по Bradford (1976).

Протешкалазную активность структурного вирусного белка и ыРШ определили по методу De fciurcia et al- (1961). Пробы для счета наносили на фильтры (íatmaim ЗЩ. Фосфори-лированнне in vitro и in vivo белки' выявляли методом' радиоавтографаи на пленке PM-I.-

Цротеолнтпческую активность белка ХВК и мРШ опреде-. ляли используя методы Петровой и Викцшайте (1966) и Люблинской. (1970). ' . ". ..

В работе использовала центрифуги'типа К-70, К-24, К-25, У.АК-601 В Beekmann '

- 5 -

РЕЗУЛЬТШ ИССЛЕДОВАНИЙ

■ I. - Характаряст кка болков мР1ТП различной клеточной локализации

Из клеток растений дурмана, пораженных ХЕК и л окно иы окулированных растений выделаны нРНП различной клеточной локализации: мРКП свободных полисом, свободные цитоплазматвческве (непслвсоииые) ыРНП, мШГ мембраносвязанкых полисом и мембра-носвяэанше нололисомше мРШ, а такие вирус специфические мЕВД, . выделенные »¡адунопреципвтацией иммуноглобулинами к йслку ХВК за счет содержания в этих структурах вирусного белка.

' При:фракционЕрованви балков мРПП различной клеточкой локализации обнаружены белки,- которые характерны только для определенных структур. Кроме того отмечено, что в различных ыЕНП обнаруживаются белки, - сходные по молекулярному, весу. Так, состав белков яэ мР2П свободных полисом, выделенных из здоровых растений дурмана,.зараженных, а такие вирусспецифических (т.е. из полисом шмуяосорбированных иммуноглобулинам к белку ХВЮ имел некоторые различия. В пользу вирусспецифичности п олисо мосвязанного мРШ свидетельствует тог факт, что цРНК, выделенная из иммуносорбированных структур направляла синтез вирусного белка в системе трансляции in títro

Обнаруживается разница по молекулярному весу белков из мРШ свободных полисом и свободных нопслисомиых кРШ. Белки свободных нополпсомшх мИШ заражонгаос растений распределяются от 24 кД - 133 кД, в то время как белки неполисомиых мРШ здорошх растений ашют мол. нас су от 14 кД - 69 кД. Некоторое сходство шраксно в том, что как мРШ полисом, так а пеполисомние мШ1, выделенные из эаражешпос растений, икеит л своом составе высокомолекулярные белки I3S кД и 143 кД. Причем болок 143 кД выявлен только в вирусспэцифических стру-. ктурах. мРКП свободных полисом от свободных недоласомных ыРШ отличаются содержанием белка 126 кД. В неполисомшх мРШ обнаружен болок окало 39 кД, отсутствующий в мРШ полисом /табл.1/.

В состава мРШ мембраносвязанных полисом, выделенных из 8аразонных растений, также обнар^ужена высокомолекуляршо^^ белки 129, I3S в 143 кД, отсутствующие:в здоровом материале. Интересен факт обнаружения бейка около 90 кД, отсутствующего в

- в -

здоровом материале и превалирующее содержание.белка с мол. весом 78 кД. В мекбраиосвяэанных виформосомах, иммунопрэципитиру-емых иммуноглобулинами к.¿елку ХЕК также выявляется бэлок около .139-143 кДа. Кроме того, отмечается резкое увеличение содержания белков 78 и 90 кД по сравнению со здоро'вым материалом (табл. I, ряоЛ) •

В любом случае,' в структурах, выделенных из зараженных растений отмечается большее количество белков, что, по-видимому, связано о зиру специфическим и вирусиндуцируемым синтезом белков в клетках инфицированных растений.

Белки, полученные из мРНП мембраиосвяэашшх полисом и меябраносвязанных информоеом отличаются от болков мП1П свободных полисом и свободна* ненолисомшх мРНП содержанием в них белка 63 кДа. В основном, разница до набору белков выявляется, в целом, относительно структур из здорового и зараженного материала, шаду ¡¿ГШ различной клеточной локализации: мРНП свободных полисом и'иеполисомндаи мРНП, мГШ мембраноовяэанных полисом и мэмбраносвяэаншми (пеполисомшлли) мРНП (табл.1 , рис.1).

В результате проведенного шмуиоблотилга с использованием антисиворотки к белку ХЗЗК обнаружено, что в составе вирусспе-цифичесгсих мИШ полисом выявлены белки с мол.массами 29 , 50,

Рис.!. Электрофорвгрзмма белкюп мРШ.различной меточной локй-дизацки: 1,2,3 -мембраносвязаннме нчполисомешо, 4,5,6 -спобод-шо неполисомпие, 8,9,10- момбраноспязанних полисом, 11,12,ТЗ -СБОбедннх полисом. вируссяйцифических, зараженных в здорошх езответстввнно,'7 -маркеры

ТАБЛИЦА I Состав балков мРНП различной щеточной локализаций

мЕНП свободных полисом: ыЕШ мемйраносвязащш: по-: свободные неполпсошыэгмек^раяосвязакнио да-

• • : лясем : иРШ_:поляоомннз иРНП_

из здор.:из aa-îKJbyEO-: растея, :ражея. :прещш. ; :растел; 5;-к j : ítíanigr : ______ :ХВК ;

из здор, растений

из зара-:шлцуно- :яз здо-:яз зара-:с:.!цуяо:аз здор:из эа-:и:.шуно-кея,раст:дрэцип. ^:ровшс : медных ;поецвп:раст. :pas. :прзцш. :к <5елку :растен. :растен. i J* к : :растен; к :ХЕК : : :0елку : : :йелку : :ХЖ : :ХВК

133 130

90

78

139

143

136 „ 133 130 126 126 90 90

50

36 24'

78 67 50

36 29

24 20

79 67 50

36 29

24 20

85

78

67 63 50

36

26

130 90

78

63 50

36 29

2S 20

14 14

143 136

130 126 90 87 81 78

67 63 50

36 29

26

14

143 143

136 136 139

130

90'. 90 90 90

78 78 -, 78' 78 78

69

67 67 67 67

63 63 63

50 50 50 50 50 50

49 49 " 49 49

45 ' 45 45

39 39

36 36 36 36 36 36

29 30 30' 30

26 29 29

24 24 24 24 24

20 20

18 18 18

14 . 14 16 16

i

-ч!

I

- в -

Свободные иеполисомные мГШ, вцделшншс из инфицированных растоний содержат белки 20,29,50,07,90 и 14У кДа, пролвквиио -серологическое родство к белку оболочки ХЕК, Возможно белок с мол.массой 143 кД в споом составе имеет антнгонную детерминанту структурного белка ХШ, а полипептиды с моньшой молекулярной массой, проявившие со роло г ич е с ко о родство к белку оболочки ХЖ, явлпится продуктами расщепления полипептидо 143 кД. Можно сделать предположите, что oaiшрукива еми о высокомолекулярные полипептиды являются с и у ус с по цифи чс скими. :

2. Фос'^орчллрованио бел коп мНГСТ различной Плеточной • локализации. Влияние mmvcnoit иткжшит па Ооак?-

Р ИЛ И pq ПЗ 111)0 ^СОЛ КО П HtKjKipMOCOM

Предпосылкой дайной работы послужило то обстоятельство, что в доступной нам литературе нет сведений о составо фосфопро-тоинов в растительных информосомах и фосфорилироваиии инфо рмо-сочных белков в растительном организме при вирусной инфекции.

Как выяснилось* в составо мИШ свободных и ыеыоранесвязанных полисом, выделенных из заракенних растений, фосфорилируются 00Л1СИ с кол,массами 18,20,29^36,41,56 нДа, Кроме этого а мРНП ' мейэраносвязанных полисом выявляются фосфо рилироващше- белки с -мол.массами 63 кД и Ш кД, которые но обнаруживаются в составе , мРНП свободных полисом..Можно предположить, что баток.о мол. ' массой 63 кД,. возможно, играет какую-то фушециональную роль, определяпцую субклеточную локализации инфорыосом/.поскольку, V-пре кмушео тве нно, встречается в мемораносвяэанных структурах.

Ранее было установлено (Пархоменко, Диденко,. 1982), что структурный белок ХЕК прочно' ешкав о мЕЩ в структуре мРНП, - -изолированных из инфицированных- растениЙ. В реакцни'фосфорили-рования in vitro обнаружен фо^рилированшИбедок с'молеку-дярш»4 весом, близким к вирусному, белку. Возможно, что.а соота-ве информоооы фосфорилируется белок ХЕК и продукты его.расщеп--ления.. Выяснялось, что в результате фосфоршшрования-in Titro в составе свободных недолпеоышле нйШ, веде ленных'вэ.вдоровых.: растений фосфоралируются белки,с мол.массами Х7,18°и 20 кДа, а. из зараженных - Г7,18,20,29 и б2 кДг кимунопреципвтируемых им-муяоглобулинами к белку ХЕК - 18,20.29,39,45 и S6 кД*, : -

известно, фосфориллрованае белков каталиэиру1» цро-; •

. теинкина'зц,- которое отличаются к по оубстратйой специфичности и по механизмам регуляции их активности. Одним из активаторов про-теинкиназ является циклический аденоэинмовофосфат (цШФ) (Северин,. 1985). Однако известно, что именно в состава информосом, выделенных вз клеток эукариот обнаружена цАМФ-неза в ис емзя протеин-it ина за (Кребс, 1979). Исходя из этого, представлял интерес изучить белки"Информосом, фосфориируемые in vitro при наличии и отсутствии цЛМФ.

-При изменении условий проведения электрофореза (снижение рН разделяющего буфера),.проявляются свойства, замедлявшие маг-рацию белков..В этих условиях низкомолекулярные белки не выходят,, а. задерживаются на границе уровня маркерного красители бромфено-лового синего. При этом высокомолекулярные полипентиды входят в гель и создаются предпосылки для обнаружения высокомолекулярных ., и низкомолекулярных поляпептидов. Таким образом на автографе выявляются и 'более крупные фосфорилированные белки с мол.массой около 135 кД, которые содержатся в мРШГ свободных и мембраносвязанных полисом,■свободных неполисомных мРНП и кеибранесвязанных неполисомных мРНП,' выделенных из инфицированных растений. Кромо .'того,; инкубирование иРНП как свободных, так и мембраносвязашшх полисом, атакже' неполисомных мРНП с различным содержанием цАШ в инкубационной смеси влияет/ва фосфорилврование белков отих мРНП in vitro•

■";■■ Следует отметить, - что содержание в системе in vitro цШФ, ингибирувт фосфоршшрование инфосвдосомных белков. В случае продолжительного по времени электрофореза,-обеспечивающего миграцию в гель высокомолекулярных белков, при внесении в стандартную смесь для фосфорвлировалия БльМ цАШ, активируетсяфосфоршшрова-ние белка 149. дД, т.е. для фосфоршшрования белка 149 при определенных условиях необходимо присутствие цАЫФ (рио.2). С другов стороны, избыточное содержание цШФ, как правило, полностью пнгибировало фосфорилврование других вышеупомянутых белков» которые, вероятно, можно отнести к цШФ-неэавиоишм протега-киназам, цроме белка около 20 кД. '

Итак» фосфоридаровавие-шоокоыодйкуляршх шдашептидов (143^149 вД),; в основном,: индуцируется повышенным содержанием цДШ." Эти белки преиютеотванно обнаруаиваютоя в вярусспецифичао—

ких структурах иГНП,■ т.о. поделенных сорбцией иммуноглобулинами к бодну. ХЕК, и в структурах, изолированных из инфицированных

I П Ш U

-149 iOí.

-20 кД

Рис. 2. Влияние■5мМ■цАМФ на фосфорилированио баллов иИШ

о во б одних полисом: I - штубсщиошиш среда, И - пи-рус специфические мР1Ю, Ш -мГЛП иифнцирошнних растений, 1У - мРШ здорошх рпстпниЯ

раотений,' Есть основания,прядполагахь, что эти белки являются вируссиецяфическими, поскольку отсутствуют в здоровом материале, Возможно эти белки'функционируют в качестве ГНК-ропликаз, поскольку есть сведения в пользу того, что РНК-полнмеразы способны активироваться цАМФ (Jungman, 1974).

3. FHK-зависимая ТГОС-полпмарэзная активность мРНП

Ранее в полисомных и неполисемиик мРНП-комплексах, выделенных из пораженных Х-вирусой картофеля-раотений дурмана, обнаружена РНК-зависимая РНК-полимераза (Дидонко, Кушииренко и др. 1985). Представлял интерес изучить содержание РНК-поли-меразы в составе мРНП различной клеточной локализации. Как выяснилось, наиболее активное включение метки отмечалось в вирусспецифических структурах:<табл.2).

С целью идентификации РНК-полимераэн, информооомнне белки инфицированных растений фракционировали в 4-30$ ПМГ нативяой олстош." В этих условиях выявлен высокомолекулярный полипептид 155 кД, отсутствующий в мРНП здоровых растений. Изолированный в патпвпой система белок использовали для определения полшераз-пой активности in vitro Шл очищен продукт синтеза РНК

- II -"ТШИЦ.2

РНК-репликазная активность мРШ-комшюксов из инфицированных Ш{ и здоровых растений дурмана

Д Наименование препарата Включение ^Н УТФ

п/п (гмп/ыик/мг белка)

су^-арнцд гГШ1 полисом

1. из здоровых растений 38 700

2. Из инфицированных растений 33.900 '3. полученные :ц.:;луносорбцн ей /вирусспецифич./ 234 700

су?.:мап;тэ неполг?сош;ио гтРНП

4. аз здоровых растений 39 800

5« из инфицированных растений 64 600

6. подученные имдуносорбцией /вирусспецифич./ Т56 700

гДЩ свободных ПОЛИСОМ

7. из здоровых растений 24 400

8. из инфицированных растений 44 200

9. полученные иммуносорбцией /вирусспецифич./ 764 200

мРНП мс мбга но с улз а шшх полисом

10. из здоровых растений 299 300

11. из инфицированных растений 763 800

12. вирусспецифические 913 700

свободные нопшгисош то мРНП

13. из здоровых растений 12 300

14. из:инфицированных растений 47 ООО

15. вирусспецифкческио 231 400

■ момбраноопязпнкьк» каполисомнна иЗДТ

16. из здоровых растений 232 700

17. из инфицированных растений 276 ООО

18. вирусспецифнческие 521 700

' - 12 -

in vitro проанализирован в araрозs и экспонирован на плёнке PI.H. В качество маркера служила РФ ХЕК, выделенная из листьев дурмана, шфицироващшх ХВК. СннтеэпроваинаяРНК по злектрофо-.. ретичсской подвижности соответствовала 2-х цепочечной PltK и .;■.'. распределилась по мол.массам 3,8 х и 4,4 ^ICr дальтон. -■-.■"-.

Таким образом, цАМФ-завнсимый белок около 150 кД, обнаруженный в составе' информосом инфицированных растений обладает.. РНК-полкмеразной активностью.;. -

4. <5осДюпилпрованид белка ХЕК . ,'.''.

Поскольку некоторые-информосомпые белки, к которым-условно-можно отнести и структурный вирусный белок,, обладают, свойствами протеипкгшаз, представлял интерес изучить эти свойства у вирус-, ного белка. Для опроделопил п ротой гшшаз пой активности i" vitro вирусного балка," белок-ХЩ вносили в стандартною реакционную смесь, содсржащуп -Р)ЛТФ к Продукты ^сформи-

рования фракционировали в 1ШГ, гель высуживали и экспонировали на рентгеновской,пленке FM-I. Как видно из рис.3, белок ХВК фоо-форилкровался в системе in vitro содержащей (/-32Р)ЛТ$.-Это ' можно объяснить тем, что концевой фосфат ЛТФ играет главную роль в фосфорилировании. • ■. Г t

29 кД - .

■ —4 ' -

.:г\- и;-. • . Гис.З. Лвтораднография.струкхурпбго белка Х-вирусэ кортофелл : а системе in vitro , содоржащей: 'I- (} -Э2Р)ЛТФ, П - (¿-32Р)ЛК>;_ •_.._• ^ ; • . ; •'V/.--^ ' • ,

■ Следующим этапом работы было'шлсление* возможности фосфо-' , -рилкронаияя структурного белка ХВК in-vivo ; С этой цель». ' ] '. изолированные. листья дурмаЫ^<т1фнцированн«е' и ложновпокулиро- :

ванные) пводиля метку - ортофосфат ^Г. Затем из инфицированных 'листьев шдёлялн ХВК и подобную процедуру проводили о качества контроля и для ложноинокулированных листьев дурмана. Полученный материал'фракциониропали в ПЛАТ с последующим иммунобло— том на нитроцеллюлозо с использованием.иммуноглобулинов к белку ХЖ и антикроличьих антител, меченных дероксидазой. Методом! идауноблотинга обнаружен.структурный белок ХВК, а в контрольном материале вирусный белок не,выявлялся-*(рио,4). Затем нитроцеллюлозу о иммуноблотом экспонировали на рентгеновской пленке, п результате.чего получен автограф фосфорилированного структурного белка ХВК. Продукт протеоляэа такке фосфорилируются.

¿■í'v-t.v. = .

■

. р-.Ш

Ей; rf-,Tr - * ... '"' I 2 ■ 2 .- 'i a' . ' 6

Рис.4. Фосфорилирование структурного белка.ХЕК in vivo

а -иммуноблотипг, б - автограф; I-контроль,2-балок ХВК

Таким образом, нами впервые показано, что белок ХВК способен фосфорилироааться в системах in"vitro и in vivo . Обладая этим свойством структурный вирусный белок,.по-видимому, принимает участие в регуляция синтеза белков в инфицированной ., клетке.

: 5.Поли/АAnoлим8пазная активность в состава мРНП

В составе мРШ свободных и ыембрапосвязаншх полисом и йяформосом обнаружена поли/А/—полимеразная активность С табл.3). . С поли/Л/-посладовательностью исследуемях впрусспецпфическах . мРШ полисом связаны клеточные белки с мол.весом 67 и 73 кД (рис.5), которые в системе in vitro при раличии поли/А/ спо-

- 14 -

ТЛШИЦЛ 3

Пали/лАсиптотазная активность вирусспецифических мРШ различной моточной .локализации, изолированных шадю-химцческим способом и оеюлогичпых структур здоровых растений • "

Наименование препарата

Включение ЛТФ (имп./мин/мг белка)

Рипусе ПОЦЕКТЖЧОСКно мРПП

глРНП свободных полисом мРШ момбраносвязашшх. полисом свободнао пеполисошшо мПЩ

I

МРШ ЗД0П0РЫХ пастгжий

мРШ свободных ПОЛИСОМ

мРИП мсмб^аносшяанпнх полисом

свободны« нополисомйно-мГИП '

360 770 5 513 066 213 575

85 <779 I 337 ООО 39 3X6

собны катализировать включение мотки 3!1 ЛТФ, что свидетельствует о поли(Л)-синтетазпой природо поли(Л)-с вязи ваших белков.

Рис.

5. Электрофорегромма белков мШП, связанных о поли(Л)-пуклеотидкш.т последовательноетлми М - маркеры

- 15 -

Подучсшша дашшо свидотольстцуют в прльзу того, что анализируемые поли/Л/-связивающие белки обладают поли/А/-сиа-твтазяоН активностью. Этот вывод подтверждается результатами анализа продуктов синтеза полиадонилирования in vitro , направляемых этими' белками (рис.6).

. 'и 10

{ГУ.'Чыт^-Ч ' , J- ^

«5 ft

miи

№

Ряс.6 , Лвторадиогрэфия геля после электрофореза синтезированных поли/Ъ^нуклеотидоч, моченных 32Р, направляемых роли/А/-полимераэой из: I - мИИГ свободных полисом,.П - мЕШ мембрано-связанных полисом, Ш - свободных неполисокных мРШ, 1У - инкубационная среда без мШП

В системе', содержащей поли/А/-полимеразу,. синтезируются от 160 до 320 поли/Л/-лунлеотидов. В качество маркеров использовали 8-8,5 5 поли/А/-нуклоотцды и 43 -тРИК.

Ранее, в результате-сравнительного анализа мЕШ, выделенных, из различных животных и растительных клеток, были выявлены белки с общей антигенной детермикаптоЗ (Дидонко с соавт., 1986). В литараи-уре высказывалось предположение, что полц/А/-связиващие белки, возможно, являются серологически родст-^ • веишми. Данных сравнительного анализа между растительными и животными полн/Л/-свАЗивакпщши информосомшми белками не было. С целью более подробной идентификации поли/Л/-связывапщих бел-хсов, мы предприняли,попытку установить их серологическое родство с болками мРНП, выделенными из полисом пивотшос клеток, в частностиасцитных клеток шинной карцвНош.Эрлиха. С этой цель» била получена сыворотка.к мРШ клеток мышей и проведен вммуноблотинг поли/А/-связываклаих белков, выделенных из мЕШ растений дурмана с использованием иммуноглобулинов к мРШ клеток асцитной карциномы Эрлиха я антикроличьих антител, меченных перогссидазой. В результате проведенной пм-мунохимической реакции выявлены белки 67 и.73 кД (рис. 7).

Ряс. ? . Ймадуноблотипг. поли/Л/-связывагацих белков мРИП различной клэточной локализации растений дурмана, инфицирован- '■ пах.ХВК с использованием сыворотки к мИШ асцитных клеток, мышиной карциномы Эрлиха ■■

Таким образом, поли/Л/~связывашие белки мИШ кивот-, них и растительных меток имеют общую антигенную детерминан-

6." Оттрз/геленио ппотеолитячйской активности■ мРНП ■ .

Для определения протеолитической активности мРНП бил использован бысокочувствителышй синтетический субстрат бен-зил-оксикарбонил-алаиил-алапил-лейцвн-р-нитроанилид, специфический для сериновых протеаз. В результате определена про-теолитическая активность полисомных и свободных неполисом-ных мРПП, выделенные из-здоровых'и.инфицированных растений дурмана. Как.видно из габлици 4 , вирусная инфекция индуци-, рует нротеолитическу».активность в составе вирусспецифических мИШ свободных полисом и пеполисомных мРШ в ТО и 8 ; раз соответственно большую по'сравнению с аналогичными : . структурами, поделенными из здоровых растений. Белок ХЕК -практически не способен к автолизу.и скорее сам.является ' субстратом для действия плеточных протеаз,содержащихся .:'■.■ в составе мРНП, активированных вирусной, инфокцивй.*,: - "-.-'-■

- 17-

ТЛЕНКЦЛ 4

Протсазная активность в составе мРНП различной клеточной локализации растений дурмана,. порайонных ХЕК

п/п Образец

I. - ;лРЛЛ свободных полисом здореных растений 1,07

2. мРШ свободных вирусспоцвфичаских полисом 10,2

3. свободные неполисомныо «ИЛ здоровых растений 0,5

4. свободные пеполвсомшо вярусспоця-Фичсские г.ЙШ 4,2

5. болок 0,CG

б. бут^ер -

ви води

1. мРНП различной клеточной локализации отличаются друг от-друга по набору и когшчо с т по шюку содоргканиго белков. мРНП, изолированные из зарпконнтс растений содоргат белки 29,50, 20, 136 н 143 кдальтом, ссрологичоски-родственные структурному вирусному, болку и отсутствуют в здоровом материале. ■ . ,

2. В составе f.Ö1HT различной клеточной локализации обнаружены £Г"ос(1орилирувмы9 in vUro болки мРНП свободных полисом:

,17,18,20,24,29,30,39,41,45,56 кДа, о 63 и 83 кДа кроме указанных выше п с ос та по мРШмсмб рано связанных полисом. В состава свободных нополпеомшх мРНП фосфорплируютсл in ■ vitro белки 17,10,20,39,45,50, которые как и белки мРНП полисом индуцируются вирусной инфекцией. Структурный болок: ХЕК фосфорилируетсл.в системах in vitro и in vivo .

3. цШФ-зависишИ (Wkmc около 150 kÍI, обнаруженный в составе пирусспоцифичоскнх пнформосом» обладает РНК-полшарязной активностью и способен направлять в системе репликации

in vitro синтез 2-х цепочечной РНК около 4;4*1СРдальтон.

4; Пол и( А)-связывающие белки около 67 и 73 кД обладают поли (А)-

. полимеразной активность». Наиболее высокая активность отмечена в. вирусспецифичеснюсмИЛ мембраносвязанных немгясом. ,

Активность (сл.активности на I :.»г белка)

б. Поли (Л) -спязываюишо балки 07 и 73 кД из мГНП жнпотных и

■ раститолышк КЛ0Т0К ИМ0ЮТ общую (ШТИГОПНУЮ детормишшту,

6. Вирусная иифокцил шщуцируот п ротоол и ти чо ску ю активность в . состава в и рус с пс цифи че с к и х мР11П свободных полисом я свобод-, них цитоплазматичоскях мГ11П в 10 и В раз больше в opaвнении' , * с аналогичными структурами, виделошшми из здоровых растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации; -

1. Диденко Л.Ф.«Макоимоцко Л.Л,.Пархоменко H.H..Грабченко П.И., Кдаев В,Г. -Ясслодопаиио состава белков информооом различной КЛОТОЧНОЙ локализации В [»астениях Datura atrmnoniiun , пораженных Х-вирусом адртофюлп/Л1икроб.журп.,-198Э.-31,№4.е,36-43.

2. Краев В.Г.,Диденко Л.Ф, .Максимонко Л.Л,.Тромса Л.П.- После-доваиио нолисомосвлзапних мРОП, выделенных из листьев дурмана, порайонного Х-вирусом картофеля// Тез,доил.Всосого,конф, "Вирусы микроорганизмов",ЛущипоД981.-о.24-25,

3. Кроев В.Г. Дидопко Л.Ф. .Максимепко Л.А. Дронса Л.11. - Иссла-. . довапие полнеомоевнзаншх мР1Ш, видолешшх из листьев дурмана, пораженного Х-1)прусом картофеля// В кн. гйжториофаги!

сб.».трудов Пущине, ПЩМ ЛИ СССР, 1082.-е.16I-I67.

4. Диденко Л.Ф.,Макеимонко Л,А.,Пархоменко II,И»,Грабченко И.И., : Пальчиковская Л.И. - ti оли {Л) -по ли«о ра з пая активность мРШ. здорошх и инфицированных Х-варусом картофеля растений дурмана// Микроб.хурн,,-1У90.-Т,5й,Х4,-с.Б4-б9. - ; ; ■/ ' -

б. Диденко Л.Ф, ,Макоимепко Л^А; .Пархоменко П.И, ,Жолнер Л.Г.-Л Протеолнтичесгсая активность информосом, выделенных из растениЙ дурма на.пораже нных Х-вирусом картофеля// Микроб.щурн,— ;

6. Диденко Л.Ф..Максимеinto" Л.А. .Пархоменко И,И, - ГНК-зависимал ■ ГПК-полимораэа в состава мРПП растений дурмана,-повакешшх , Х-вирусом картофеля// Тез.докл.Всеоошн.конфер. "Микробиологические и биотехполошчоскне основы интенсификации растениеводства и коршпровзводотва? Алма-Ата,I9W¿-o,2I,^

7. Диденко Л.Ф,-,Пархоменко H.H. ,Макоименко Л.Л. - Фосфорялиро- , ваиие структурного белка Х- в и русака ртофеля//Тоз. докл. Во ее о-' юэной конфор. Микробиологические и биотехнологичеокне основы " интенсификации раотепиеводотва » кормопроизводства" Алма-Ата, 1990, -с. 22, .■ .: ' ■'■'■ 1 ' ; ■J ■

8. Диденко Л.Ф.,Макоим9Н1со Л.А, »Пархоменко И.И. .Грабчонко Н.И., - Состав^балков в информационных рибонуклеопротаидах СмИЩ) ■ различной клеточкой локализации из растений дурмана,инфицированных Х-вирусом картофеля/Дез, доюцУП Съезд Украинского v микроб,общества.-Черновцы, I989;,-ó.I7ü-I?I.

-9. L.F.Didenko,' K.r.farkhomenko, l.A.Maxlmenko. H.H.MuehkovBky : -Study of phosphorylation of plant tnRNPs infected with potato virus X// 2-nd International Symposium on Positive strand RNA Viruses. -Vienna, Austria,-19B9.-p.60.

¡/MptAk^