Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и изучение возможности их использования в промышленности и сельском хозяйстве

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и изучение возможности их использования в промышленности и сельском хозяйстве"

На правах рукописи

ЩуТ-г - -

ДУНАИЦЕВ ИГОРЬ АНАТОЛЬЕВИЧ

ВЬЩЕЛЕНИЕ ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ И СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

- 9

1 № 2010

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0боленск-2010

004615681

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Дятлов Иван Алексеевич

кандидат биологических наук Бикетов Сергей Федорович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Степанов Алексей Вячеславович

доктор биологических наук, Коломбет Любовь Васильевна

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и

микроорганизмов РАН, г. Саратов

Защита состоится 10 декабря 2010 года в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская область, Серпуховский район, Оболенск, ФГУН ГНЦПМБ, тел. (4967)360003, факс (4967)360010, e-mail: fursova@obolensk.org.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан « gfi tvMJtJ) 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Н.К. Фурсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фосфор (Р) является критически важным элементом для жизнедеятельности человека, широко используется в разнообразных отраслях промышленности и для обеспечения продуктивности в сельском хозяйстве. Его получают из водонерастворимого сырья в химической фосфорной индустрии. Доказанных мировых запасов фосфатов существует примерно на 60-80 лет, отмечается постоянный рост спроса на сырье. Переработка сырья и производство фосфорсодержащих химических веществ и удобрений с использованием сильных кислот - энергоемкий и дорогой процесс, создающий к тому же десятки миллионов тонн отходов бедных фосфатных руд, отходов фосфогипса и шламов. Культурные растения ассимилируют только 10-25 % от вносимого с минеральными удобрениями фосфора. Как следствие, происходит эвтрефикация водоемов и переосаждение фосфора в почвах. Из-за высокой стоимости многие развивающиеся страны практически не используют химические фосфорные удобрения. В связи с этим встает вопрос о разработке более дешевых и эффективных фосфорных удобрений и способов их применения.

Альтернативой для существующих химических методов извлечения фосфора может служить процесс прямого микробиологического высвобождения (солюбилизации) фосфатов из нерастворимого сырья. Процесс основан на использовании метаболической активности фосфатсолюбилизирующих (ФС) культур. Они встречаются в природе в различных экологических нишах и способны медленно переводить нерастворимые фосфаты из фосфатсодержащих рудных материалов в растворимую форму в ходе своей жизнедеятельности. Прямая микробная мобилизация фосфатов может служить основой для использования в агротехнологиях в виде биофосфорных удобрений. Кроме того, эту микробиологическую активность можно было бы применить для более эффективного использования исчерпаемого сырья с извлечением остаточного фосфора из бедных руд, из вторичных продуктов переработки сырья, тем самым снизив экологическую нагрузку на окружающую среду. Однако, широкое применение ФС свойств микроорганизмов в сельском хозяйстве и, в особенности, в промышленности затруднено в силу ряда причин: недостаточно изучена биохимия процессов микробной ФС, нет полного представления о биоразнообразии

фосфатсолюбилизирующих микроораганизмов (ФСМ) и экологических нишах их обитания, нет данных о влиянии состава фосфатных руд на ФСМ. В целом проблема имеет междисциплинарный характер, и ее решение требует комплексного подхода с привлечением знаний в различных областях, Таким образом, представляется актуальным вопрос о разработке новых технологий и препаратов, базирующихся на ФС свойствах микроорганизмов, для чего требуется отобрать наиболее активные по фосфатсолюбилизации культуры, и исследовать микробную ФС в новом поколении биологических удобрений, а также в процессах утилизации отходов фосфатной индустрии и извлечении остаточного фосфора.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлись выделение активных ФСМ из различных экологических ниш и изучение возможности их использования для разработки биофосфорных удобрений и в процессах высвобождения фосфора их фосфатсодержащих бедных руд и отходов. Задачи исследования включали:

1. Поиск и выделение активных ФС культур в широком спектре экологических ниш;

2. Характеризацию ФС изолятов, включая исследование ФС в модельных средах, ключевых метаболитов, биодоступности различного фосфатного сырья;

3. Изучение возможности применения выделенных ФСМ для создания технологии микробных фосфорных удобрений и ее экономическая оценка;

4. Исследование перспективы использования ФСМ для прямого извлечения фосфатов из фосфатсодержащих отходов, бедных руд.

Научная новизна результатов исследований. Впервые для поиска, выделения и оценки распространенности ФСМ был предложена и использована панель скрининга разнообразных экологических ниш и показано, что активные ФСМ эффективно выделяются не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. Полученные результаты позволяют более глубоко понять процессы микробной ФС: выявлено значительное влияние компонентов питательной среды на состав метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов, с использованием широкого круга микроорганизмов детально изучен механизм высвобождения фосфатов с помощью группы

глюконовых кислот, позволяющий наиболее эффективно использовать для этой цели углеродный субстрат. Изучена доступность спектра фосфорных руд отечественных и мировых месторождений воздействию отобранных наиболее активных микроорганизмов. Выявлено несколько групп фосфатного сырья, наиболее доступных микробной фосфатсолюбилизации. Впервые показана возможность микробиологического высвобождения фосфатов низкой концентрации из фосфорсодержащих материалов: фосфогипса и рудных отходов.

Практическая значимость. Разработаны микробиологические и биотехнологические основы для использования процессов прямой микробной фосфатсолюбилизации в промышленности, сельском хозяйстве и природоохранных технологиях. Выделены культуры, способные к прямой микробной фосфатсолюбилизации из нерастворимого рудного сырья. Отобраны для практического использования наиболее перспективные штаммы, не уступающие или превосходящие по ряду свойств и ФС активности лучшие мировые аналоги. Разработаны лабораторные методики приготовления фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, выделения и селекции фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, лабораторные Регламенты производства фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и производства комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами. В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонированы два штамма ФСМ. Показано повышение урожайности зерновых и декоративных растений при использовании экспериментальных образцов биофосфорных удобрений. Отобраны наиболее биологически доступные группы фосфатного сырья, выбраны наилучшие по биодоступности отечественные фосфатные руды. Разработаны формоустойчивые волокнистые носители, позволяющие эффективно соиммобилизовать биомассу и сырье в процессе непрерывной обработки руд. Предложена технология использования ФС культур и ФС процессов для извлечения фосфатов из бедных руд и для утилизации фосфатсодержащих отходов промышленности (фосфогипса).

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦПМБ 16 июля 2010 года. Материалы

диссертации доложены и представлены на 12 международных и российских научных конференциях: 8-м Европейском конгрессе по биотехнологии (17-21 августа 1997 г., Budapest, Hungary); Международном конгрессе «Вода: экология и технология» (25-30 мая 1998 г., Москва, Россия); Международном семинаре «Evaluation of sponsored biological studies in Russia for new millennium» (02-04 сентября 1999 г. Новосибирск, Россия); Международной научной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (22-25 мая 2000 г., Оболенск, Россия); Международном Форуме «Биотехнология и современность» (17-18 июня 2003 г., Санкт-Петербург, Россия); Канадско-Российском Коллоквиуме по биологическим наукам (15-17 Сентября 2004 г., Москва); 34-м Международном Семинаре Япония/Россия «Biotechnologies in Russia/CIS» (17 Июня 2005 г., Tokyo, Japan); 3-м Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (14-18 марта 2005 г., Москва, Россия); 3-м Международном Симпозиуме «Phosphate Dynamics in Soil-Plant Continuum» (14-19 мая 2006 г., Uberlandia, Brazil); 10-й Международной Конференции «Soil-Water Systems Consoil-2008» (03-06 июня 2008 г., Milano, Italy); Юбилейном Международном Симпозиуме МОББ «Биоценотическая регуляция. Основы современных фитосанитарных технологий» (21-25 мая 2007 г., Санкт-Петербург, Россия); 2-м Международном Экологическом Форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (01-04 июля 2008 г., Санкт-Петербург, Россия).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 17 научных публикациях, включая 7 статей и патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, раздела материалов и методов, результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 170 работ, из них 121 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 56 рисунками и 34 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Обзор литературы.

В главе дан обзор литературы по текущему состоянию и проблемам фосфорных ресурсов и индустрии переработки фосфатного сырья, использованию

4

микроорганизмов в обработке руд и решении экологических проблем их добычи и переработки. Рассмотрены механизмы микробного высвобождения фосфатов из нерастворимого сырья, подходы к выделению фосфатсолюбилизирующих культур и использованию микроорганизмов для улучшения фосфорного питания растений.

2. Материалы и методы.

Объектами исследований служили коллекционные штаммы микроорганизмов, а также изоляты ФСМ, выделенные в ходе экспедиционных работ.

Для оценки фосфатсолюбилизирующей активности и исследования процессов метаболизма ФСМ применяли методы на основе использования минеральных питательных сред, в которых в качестве единственного источника фосфора содержались нерастворимые фосфорсодержащие руды или трикальцийфосфат. Кроме этого, в работе использовали общепринятые микробиологические, биохимические, газохроматографические, аналитические, биотехнологические, агротехнические методы.

3. Результаты и обсуждение.

Использование фосфатсолюбилизирующего штамма Burkholderia cepacia Е-37

Штамм Burkholderia cepacia Е-37, являющийся одним из самых активных ФС штаммов, описанных в научной литературе, был предоставлен для исследований д-ром R.D. Rogers (INL, Айдахо, США). Изучен механизм высвобождения фосфатов из модельного фосфорсодержащего сырья трикальцийфосфата (ТКФ) под воздействием этого штамма, технологические особенности этого микроорганизма и возможность использования его в качестве основы для биофосфорного удобрения.

Для изучения механизма высвобождения фосфатов под действием Е-37 было исследовано влияние концентрации источника углерода (глюкозы), посевной дозы и растворимых фосфатов на динамику этого процесса. Как видно из рисунка 1, повышение концентрации глюкозы увеличивает растворимость фосфора за счет образования кислых продуктов (рисунок 16).

О 10 20 30 40 50 60

30 40 50 60 . u

- О- 1 -Я--2 —*—3 14

П— 2

а б

Рис. 1. Влияние концентрации глюкозы на динамику изменения концентрации фосфора в растворе (а) и рН (б) для штамма В. cepacia Е-37 (посевная доза 5,0*10 КОЕ/мл): 1- 0,15% глюкозы; 2 - 0,3% глюкозы; 3 - 0,6% глюкозы.

При этом величина перешедшего в раствор фосфора и время достижения максимума увеличивается прямо пропорционально концентрации глюкозы (рисунок 1а). До сих пор в литературе не описаны микроорганизмы, высвобождающие большее количество фосфора на единицу углеродного субстрата. На рисунке 2 представлено влияние посевной дозы на время достижения

а б

Рис. 2. Влияние посевной дозы на динамику перехода фосфора в растворимое состояние и величину рН для штамма В. cepacia Е-37: 1 - 4,0* 107 КОЕ/мл; 212,9* 107 КОЕ/мл; 3 - 3,8* 108 КОЕ/мл.

максимальной растворимости фосфатов для штамма Е-37 при одинаковой концентрации глюкозы (0,6%). Повышение посевной дозы не увеличивает концентрацию растворенного фосфора (рисунок 2а), но снижает время достижения

максимума концентрации растворенного фосфора за счет ускорения образования кислых продуктов (рисунок 26).

На рисунке 3 представлено влияние растворимого фосфата (КН2РО4, КФ) на динамику высвобождения фосфора из Саз(Р04)2, размножение клеток и продукцию кислых метаболитов под действием Е-37 в жидкой минимальной среде.

МИОЮмМ КФ.

ШС*20иМКФ.

о г.мме

А- Г К, ММС

О КГК, ММС

- - Г, MMOKKiM КФ

• • ГК. ММ('+1ПмМ КФ -К1К. MMC'+KKiM К'1>

—♦—е. ммс+:омм

а б

Рис. 3. Влияние растворимого фосфата а) на динамику высвобождения фосфора из Са,(Р04)2 и размножение клеток; б) на потребление глюкозы и продукцию кислых метаболитов под действием В. cepacia Е-37 в МСС среде (1% глюкозы) при концентрации КФ: ОмМ, ЮмМ и 20мМ КН2РО4.

В отсутствии КФ количество перешедшего в раствор фосфора почти стехиометрически соответствует сумме глюконовой и кетоглюконовой кислот, образующихся из глюкозы под действием ферментных систем Е-37. Присутствие изначально растворенного фосфора в среде приводило к снижению максимального количества фосфора, высвобождаемого под действием Е-37. При этом отмечалось снижение концентрации кетоглюконата в после 4-х часов культивирования, обусловленное, скорее всего, его потреблением в процессе размножения клеток. Подтверждением этого вывода могут служить данные по КОЕ (рисунок За): в присутствии КФ к 4-м часам роста КОЕ возрастает в 4 раза, тогда как в отсутствие КФ, размножение клеток начинается только через 20 часов культивирования после достижения максимальной концентрации фосфора в растворе.

Таким образом, на примере наиболее известного по ФС эффективности штамма Е-37 показано, что для него солюбилизация фосфатов сопряжена со стехиометрическим окислением глюкозы до глюконовых кислот. На первой фазе

выращивания идет окисление глюкозы до глюконовой и кетоглюконовой кислот, которые вызывают растворение фосфатов. После исчерпания глюкозы в среде начинается размножение клеток.. В отсутствие растворимых фосфатов для таких микроорганизмов глюкоза, по-видимому, является ингибитором размножения. Поскольку на другие цели субстрат в начальной фазе культивирования практически не расходуется, а лишь стехиометрически переходит в другие формы, процесс солюбилизации фосфора для такого штамма, как Е-37, наиболее эффективен в расчете на единицу углеводного субстрата,.

Технологические особенности штамма В. cepacia Е-37 исследовали в условиях периодического и проточного культивирования. Для выращивания культуры Е-37 использовали богатую питательную среду (на основе гидролизата рыбокостной муки (ГРМ) с содержанием аминного азота в среде 100 мг%) и минеральные обогащенные среды с различными источниками углерода (глюкоза, ацетат). В качестве микроэлементов добавляли Fe, Си, Mn, Zn. Для оптимизации состава среды, выяснения оптимальных физико-химических условий роста культуру выращивали в качалочных колбах. На основании измерения максимальной удельной скорости роста цмах установлено, что оптимальными являются температура роста (28±2) °С и рН (6±1). Культура хорошо росла в богатых средах: показывая высокую скорость роста и выход биомассы. На минеральных средах рост был значительно слабее. Ацетат не утилизировался. Добавка ГРМ (5mg%) существенно не влияла на результат роста.

С культурой В. cepacia Е-37 проведено 12 циклов культивирования, в том числе 8 процессов в лабораторных ферментерах (15л), 4 процесса в пилотных ферментерах (100-130л). Масштабный переход не оказал влияния на основные показатели процесса (выход биомассы ОПко„, время культивирования т, максимальная удельная скорость роста |л„ах), что говорит о пригодности продуцента и процесса для промышленной разработки. Все процессы вели в управляемом режиме с контролем и поддержанием параметров Т°, рН, р02, уровня ценообразования, в регулярно отбираемых пробах определяли ОП590, чистоту популяции на отсутствие пмф, титр КОЕ.

Таблица 1. Основные параметры культивирования штамма Е- 37 в периодическом режиме на лабораторном и пилотном уровне.

№ Основные показатели Среда выращивания Примечания

ГРМ среда Полусинт. среда

1 Основной источник "С" Глюкоза Глюкоза Na„, 100мг%

2 Основной источник "Ы" ГРМ NH4CI 1 - 2 % всего

3 Среднее время роста т, ч 12-15 14-16

4 рН, едрН б,0±0,2 6,0±0,2

5 Диапазон рОг,% 10-100 10-100

6 Температура, °С 28±0,2 28±0,2

7 Выход БМ по ОПко„ 27,3±4,7 14,7±3,4

по сухому весу, г асв/л 8.3±1,4 5.1±1,2

КОЕ, млрд./мл 20,5±8,2 12,6±5,7

8 Макс, удельная скорость до 0.58 до 0,35

роста, ц „„, ч"'

Как видно из данных таблицы 1 по глубинному выращиванию штамма Е-37, он показал хорошие результаты на обеих средах и дальнейшее использование данных в экономических расчетах себестоимости биомассы привели к необходимости исследовать возможность интенсивного культивирования штамма Е-37 в проточном режиме.

Культивирование в проточном режиме проводили в биореакторе вместимостью 1л с контролем и поддержанием параметров Т°, рН, р02, скорости подачи стерильной среды (протока Б, ч"1), уровня ценообразования. В регулярно отбираемых пробах выходного потока КЖ определяли ОП590, чистоту популяции на отсутствие пмф и КОЕ. Производительность процесса

исследовали в диапазоне протока среды 0,1 - 0,4 ч"1 , добиваясь после смены каждого режима протока стабилизированной величины ОП на выходе КЖ из аппарата. Использовали 2% концентрацию глюкозы. Как видно из рисунка 4, максимальные значения ОП достигаются при величине протока

Скорость г^отока

Рис. 4. Зависимость концентрации биомассы (ОП590) на выходе от скорости протока среды при культивировании В. cepacia Е-37.

0,15-0,3 ч"1.

1 2 3

КЬнцентрац1Я ггкжозы,%

Рис. 5. Влияние концентрации входного субстрата проточного культивирования штамма Е-37 на выходную ОП культуральной жидкости.

Влияние исходной концентрации источника углерода на продуктивность (ОПвых) проточного процесса культивирования Е-37 определяли при величине

протока 0,1 ч"1 и диапазоне концентраций глюкозы 1-3 %. Как видно из рисунка 5, практически нет различий по выходу биомассы между концентрациями 2% и 3%, то есть субстрат сжигается неэффективно. При росте концентрации субстрата вдвое (с 1% до 2%) наблюдается прибавка биомассы (ОП) всего на 6%, что показывает неэффективность такого повышения концентрации субстрата. Поэтому была выбрана рабочая концентрация глюкозы 1%.

На основании данных оптимизации процессов как периодического, так и непрерывного культивирования для В. cepacia Е-37 была проведена экономическая оценка себестоимости процесса и разработки масштабной технологии получения биоудобрения на основе этого ФСМ. В расчетах использовались оптовые цены 2010 года на компоненты сред из различных источников. Стоимость сухой биомассы культуры (по сырью) составила более 3100 руб. или более 103 $, что делает потенциальный биофосфорный препарат (куда добавятся и другие сырьевые компоненты) чрезвычайно дорогим. Это связано с использованием дорогостоящего компонента: вклад ГРМ в себестоимость составляет 85% от всех сырьевых затрат. Поэтому выращивание штамма Е-37 на богатой среде, содержащей ГРМ и глюкозу не перспективно. На полусинтетической среде стоимость 1кг сухой биомассы культуры составила около 49$ как при периодическом, так и при непрерывном культивировании, что является гораздо более приемлемым результатом для разработки препарата на ее основе.

На следующем этапе из биомассы В. cepacia Е-37 были приготовлены и испытаны экспериментальные образцы гранул экспериментального биофосфорного удобрения, включавшего сухую биомассу штамма Е-37 или ассоциации

10

микроорганизмов, фосфоритную руду, глюкозу и стеарат натрия для ее инкапсуляции, а также полимерную добавку в качестве связующего вещества при формировании гранул (таблица 2). Ассоциация микроорганизмов включала, кроме В. cepacia Е-37 еще два ФС штамма Pseudomonas sp. AD, выделенный из фосфатной руды, и Lactobacillus salivaris. Использовалась фосфоритная мука, приготовленная из фосфоритов Егорьевского месторождения. Контрольный препарат гранул не содержал микроорганизмов и был приготовлен на основе одной фосфоритной муки Мелкоделяночные испытания вариантов биофосфорных удобрений проводились в открытом грунте в п. Оболенск (Серпуховский район

Таблица 2. Состав гранул биофосфорных удобрений.

Гранулы Концентрации компонентов, %

Высушенная биомасса Фосфоритная руда Глюкоза Стеарат натрия Связующая добавка р205

Без микробов 0 99 0 0 1 14.85

В. cepacia Е-37 4.88 70.81 14.65 7.32 2.34 10.6

Ассоциация микроорг-мов 4.88 70.81 14.65 7.32 2.34 10.6

Московской области) в летний период. Результаты биометрических измерений (рисунок 6) показали, что, применение биогранул способствовало более

интенсивному росту и развитию растений по сравнению с контрольным вариантом без внесения Р205 и практически не уступало по эффективности варианту с внесением двойного суперфосфата (ДСФ). По степени кустистости растений биогранулы также не уступали ДСФ. Применение гранул фосфорной руды без микроорганизмов (вариант 3) оказалось малоэффективным, на уровне контроля без внесения PjOj.

Таким образом, изучена ФС активность и подтверждена возможность применения ФСМ В. cepacia Е-37 в

гЬ

4,00 ? 3,00

ч &

£ 2,оо

о.

« 1,00 о.

и

0,00

1 2 3 4 5 Вариант

Рис. 6. Средний вес растений ячменя на делянку, варианты: 1 -без добавления фосфатов; 2 -ДСФ; 3 - гранулированная руда; 4 - биогранулы с Е-37; 5 - гранулы на основе ассоциации ФСМ.

качестве основы для биологических удобрений. В то же время, высокая себестоимость получения биомассы штамма, особенности ФС процесса культуры, заключающиеся в быстром пиковом высвобождении фосфора в среду без удержания растворенных фосфатов на стационарном уровне - настоятельно требуют поиска новых высокоэффективных по ФС культур, способных расти в минеральных средах и лучшим по технолого-экономическим характеристикам.

Выделение и свойства фосфатсолюбилизируницих микроорганизмов

Для выделения новых наиболее активных ФСМ были спланированы и проведены 7 экспедиций в различные регионы РФ и СНГ с целью максимально охватить предполагаемый спектр экологических ниш (известных в литературе и новых). Панель для скрининга экологических ниш (всего 100) включала двухуровневое сочетание: района поиска (всего 10 районов в группе) и типа пробы для селекции ФСМ (всего 10 типов образцов в группе). В ходе экспедиций собрано и обработано 640 образцов ризосферных почв, минеральных пород, растительных тканей, скальных и донных отложений.

В процессе оценки ФС активности выделяемых из объектов окружающей среды изолятов оказалось, что общепринятый полуколичественный метод селекции и оценки ФС активности по соотношению диаметра зоны растворения с диаметром колонии (Оа/с1к) на МСС агаре с трикальцийфосфатом дает неоднозначные результаты. На примере четырех ФС культур было показано, что параметр Е)а/<1К

Рис. 7. Рабочая схема выделения и селекции активных ФСМ

значительно варьирует в зависимости от концентрации источников углерода и азота в среде, их соотношения, дозировки культуры и не имеет однозначных корреляций с изученными факторами.

В результате, была выработана развернутая схема выделения и селекции чистых культур (ЧК) фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, которая позволила, за счет количественного контроля активности ФС изолята в жидкой среде, не терять при отборе активные ФС культуры. Схема представлена на рисунке 7.

Результаты селекции показали, что среди отобранных изолятов, растворяющих не менее 25% ТКФ в жидкой среде, более половины плохо или совсем не формируют зоны растворения на агаре с ТКФ (таблица 3).

Таблица 3. Распределение ФСМ, отобранных из образцов 7 экспедиций, по формированию зон просветления на МСС агаре.

Размер зон на агаре с ТКФ Всего ФСМ доля %

- 97 21,5

+ 150 33,1

++ 106 23,5

+++ 64 14,2

++++ 25 5,5

+++++ 10 2,2

Всего 452 100,0

В ходе выделения ФСМ было отмечено, что они часто встречаются на поверхности разрушающихся минеральных пород, а эффективность обнаружения ФСМ для эрозионных пород была в 2,1-4,8 раз выше, чем для аналогичных цельных пород (рисунок 8). Из разрушенных гранитов "рапакиви" (Карелия) были выделены несколько самых активных ФСМ (Pseudomonas sp. Krl-181a и др.). Наличие ФСМ в биоценозе разрушаемых минералов хорошо объясняется способностью таких культур извлекать труднодоступные питательные компоненты из эрозионной породы. Электронная микроскопия минерала после недельного воздействия двух ФСМ (Acinetobacter sp. Ка\'-305 и Pseudomonas sp. Krl-181a) в МСС среде на кристалл рапакиви - показала наличие повреждений поверхности кристаллов, что показало возможность участия культур такого типа в разрушении минеральных пород.

Хортта все Хартид эроз. пробы_ гранит

7 эюпсд эрроз. породы

1.0

Рис. 8. Эффективность выделения ФСМ из цельных и эрозионных пород для отдельных и всех экспедиций

Данные по эффективности выделения (ЭВИ) изолятов ФСМ за весь период показали, что имеется несколько групп - "районов поиска", которые сравнимы или значительно превосходят (0,65-1,16)

общеизвестные (поле, лесной массив). Среди них выделяются районы с недостатком питательных

компонентов: места подземных выбросов (минеральные источники, вулканы), пещеры, ущелья, скалы. К «богатым» по ФСМ группам проб из экониш, дефицитным по питательным веществам, можно отнести эрозионные породы, наросты или корни растений со скал, которые сравнимы или превосходят (0,690,90) общеизвестный тип проб «ризосферная зона растений».

исследование динамики фосфатсолюбилизации в жидкой среде проявило

различный характер высвобождения фосфатов, что, по-видимому, обусловлено

особенностями метаболизма (рисунок 9). В частности, для штамма Е-3 7 характерно

наличие острого максимума, что

свидетельствует о быстром возврате

фосфора в нерастворимое состояние. У

других микроорганизмов наблюдали

наличие «плато». Такие культуры

способны длительное время

поддерживать определенную

концентрацию фосфатов в растворе,

обеспечивая тем самым их дальнейшее Рис. 9. Динамика высвобождения

растворенного фосфора: 1 -Р. поглощение растениями. Именно этот /¡иогеэсет Р469;2-Вас. ¡иЫШз ИПМ

тип культур можно считать перспективными для создания биофосфорных удобрений.

215; 3 - Т. 1опфгаЫаШт№29\А-Т. а.чрегеИшп штамм №16\ 5 - В. серааа Е-37.

Для наиболее активных выделенных ФС изолятов, которые полностью высвобождали фосфаты из ТКФ, мог наблюдаться различный характер выхода растворенного фосфора на максимум (рисунок 10). У некоторых культур отмечался лаг-период до 2 суток, когда требовался промежуточный синтез ферментов и метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов. Другие культуры могли сразу показывать максимум скорости растворения. Для таких активных культур наблюдался интенсивный синтез кислот глюконовой группы при трансформации глюкозы, типичная картина процесса представлена для культуры Kav-282 на рис. 11. глюкоза практически полностью превращается в кислоты. При этом глюконовая кислота довольно быстро окисляется в кетоглюконовую, которая является значительно более сильной кислотой. Из сравнения рисунков 10 и 11 видно, что динамика накопления фосфора в растворе практически совпадает с накоплением

кетоглюконовой кислоты.

Для такого рода штаммов, как и ранее для a. cepacia £-j/, показано, что

добавление в среду растворенных фосфатов снижает ФС способность микроорганизмов, если она обусловлена продуктами

первичного окисления глюкозы -глюконовой и кетоглюконовыми кислотами. Если ФС способность микроорганизмов (как для В. subtilis ИПМ-215) обусловлена продуктами более глубокой переработки субстрата, то растворенные фосфаты могут не

Рис. 10. Кривые накопления фосфора в растворе под действием наиболее активных изолятов (2% глюкозы).

-глюкоза

I

- глюконат |

- кетоглюконат

10 20 30 40 50 t,h

Рис. 11. Динамика окисления глюкозы в глюконовую и кетоглюконовую кислоты под действием изолята Кау-282 (1% глюкозы)

оказывать отрицательного влияния на ФС.

Результаты определения эффективности расходования углеродного субстрата для высвобождения фосфатов (ФСЭ) у штаммов P. fluoresceins Р-469 и изолята Kav-282, как и для В. cepacia Е-37, показали, что наиболее высокие значения ФСЭ демонстрируют штаммы, у которых глюкоза расходуется только на образование кислых продуктов, обеспечивающих растворение фосфатов. Повышение в среде содержания источника азота (хлорид аммония) при ФС процессе изменяет соотношение кислот, образующихся при прямом окислении глюкозы, что влияет на ФС эффективность.

Важной характеристикой ФС продуцентов с точки зрения создания перспективных биотехнологий является их способность эффективно растворять

конкретное природное

фосфатсодержащее сырье. На рисунке 12 представлены данные по максимальному количеству высвобожденного фосфора из 5 разных видов фосфатных руд за 7 суток в присутствии 4 различных ФСМ. Из представленных данных следует, что фосфатные руды по биодоступности различаются более, чем в 100 раз. Кроме этого, очевидны также различия в ФС активности разных штаммов по отношению к одному и тому же сырью. Это необходимо учитывать при разработке препаратов и технологий для любого вида регионального сырья. Исследование групп фосфорного сырья (по 2-3 руды в группе) показало, что наибольшей биодоступностью обладают океанские фосфориты шельфого залегания, желваковые, зернистые и, в меньшей степени, ракушечные фосфориты, а апатиты малодоступны (рисунок 13).

□ Ковдорский апатит

□ Фосфорит со дна Японского моря

□ Фосфорит шельфа Намибии

□ Фосфорит. Марокко

■ Егорьевский

фосфорит □ Фосфорит Каратау. Казахстан

K3V 305 Krt 181 B.subtitis PS. Fluor

Рис. 12. Результаты солюбилизации 5 видов фосфатного сырья с использованием ФС культур Ps. fluorescens 469, Вас. subtilis 215, Acinetobacter sp.305 и Pseudomonas sp.181

200

—ШЛФ Яп море

-•-ШЛФ Намибия 160

-*-ШЛФ Чили

—♦—ЗРН Иордания Е а 120

—*—ЗРН Мрк £

Хурибга -♦-ЖЛВ Вятка 60 (р

-•-ЖЛВ Егорьевск 40 Ii л

- ЖЛВ Чилисай ; 0 L

АЛТ Кирове* -•-АЛТКовдор ■ АПТ Новололтае ♦ МЭР Каратау

МЗР Китай -*-РКШ Кабала — РКШ Кингисепп

KHTCiepci -*- КНТ Обладжан еут

Рис 13. Высвобождение фосфора штаммом Acinetobacter sp.305 из океанических шельфовых (ШЛФ), желваковых (ЖЛВ) и зернистых (ЗРН) фосфоритов, микрозернистых (МЗР), ракушечных (РКШ), континентальных метасоматических (КНТ) фосфоритов и группы апатитов (АПТ)

В коллекции культур ФСМ, отобранных в результате экспедиционной деятельности, присутствуют микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам. Около четверти принадлежат к грамположительным бациллам и коккам, более 20 процентов - это дрожжевые культуры, остальные ФСМ относятся к различным группам грамотрицательных бактерий. Более пятидесяти перспективных ФС культур прошли биохимическую идентификацию. На основе совокупности полученных о ФС изоляте данных, включая глубину, скорость и характер ФС, эффективность ФС, степень высвобождения фосфатов, способность к растворению биологически слабо доступного сырья (апатитов), технологичность культуры при выращивании и переработке, другим дополнительным свойствам и с помощью экспертных оценок, были отобраны для испытаний в качестве биологической основы биоудобрения ФС штаммы Acinetobacter sp. Kav-305 и Pseudomonas sp. Krl-18la, а для использования в биореакторе по обработке фосфатсодержащих отходов был селекционирован консорциум ФСМ из Bacillus megaterium Lhv-7lb, Acinetobacter sp. Kav-282 и дрожжевого изолята Yarrowiasp. Lhv-llb..

Использование процессов микробной фосфатсолюбилизацин

Исследования по влиянию различных физико-химических факторов на процесс роста и выход биомассы при выращивании выбранного активного ФС штамма Pseudomonas sp. Krl-181a проводили в режиме глубинного периодического

•—Эк. Коэф Y Н-Ск ростам

культивирования в минеральной среде с использованием термостатируемых

качалок. В качестве источника углерода использовали сахарозу, которая не уступала глюкозе по скорости роста и выходу биомассы, но более доступна по цене, что существенно для разработки недорогого препарата. На рисунке 14 представлена зависимость основных ростовых показателей от содержания источника углерода. Штамм отличает высокий показатель скорости роста уже при низких концентрациях субстрата (оптимум при концентрации субстрата более 0,2%). Также были оптимизированы другие показатели: pH 5,5-7,0, температура роста 28-32 °С. Внесение в среду факторов роста (дрожжевой экстракт до 0,4%) практически не увеличивало скорость роста (0,48 ч"1), но существенно удорожало среду. В оптимизированных условиях проведены циклы культивирования в лабораторных ферментерах и получены следующие результаты (таблица 4).

Таблица 4. Основные параметры культивирования Pseudomonas sp. Krl-181 в периодическом режиме в лабораторном ферментере (Юл).

Рис. 14. Влияние содержания сахарозы на основные показатели роста культуры Pseudomonas sp. Krl-181, макс, удельную скорость роста fiMX и экономический коэффициент У

№ Основные показатели Среда выращивания Примечания

БС среда Синт. среда

1 Основн. источник "С" Сахароза Сахароза NaM100Mr%

2 Основн. источник "К" ГРМ NH4C1 1 - 3 % всего

3 Среднее время роста т, ч 10-13 14-18

4 Рабочая рН, едрН 6,0±0,5 6,0±0,5

5 Диапазон рОг,% 10-100 10-100

6 Температура роста, °С 28±0,2 28±0,2

7 Выход БМ по ОПи,,, 28,3±6,4 13,7±1,2

по сухому весу, г асв/л 7.1 ±2,3 4.9±0,7

8 Макс, удельная скорость до 0.56 до 0,45

роста, цма„ ч"1

Результаты свидетельствуют об эффективном росте культуры на богатых и минеральных средах. Поскольку первая имеет несколько лучшие результаты по длительности процесса и выходу биомассы, но чрезвычайно дорога по

себестоимости, в дальнейших работах по изготовлению биомассы и расчетах экономических параметров была использована минеральная среда. Экономические расчеты себестоимости получения биомассы штамма Krl-I8la по сырью благодаря недорогим средам и высоким показателям роста дали величину 12,3 $/кг асв, что существенно лучше, чем у известного в литературе штамма Е-37 и является перспективным для разработки недорогих препаратов биоудобрений.

Таблица 5. Описание вегетационного опыта по оценке ФС свойств штаммов Kav-305 и Krl-I81a на декоративных растениях Tagetes patula

№№ Форма БМ штамма Источник фосфора

1 порошок нет нет

3 порошок нет фосфорит

5 гранулы нет нет

7 гранулы нет фосфорит

9 порошок Kav-305 нет

11 порошок Kav-305 фосфорит

13 гранулы Kav-305 нет

15 гранулы Kav-305 фосфорит

17 порошок Krl-I81a нет

19 порошок Krl-181a фосфорит

21 гранулы Krl-181a нет

23 гранулы Krl-I8la фосфорит

В вегетационном опыте на декоративных растениях Tagetes patula были

испытаны два перспективных ФС

штамма Acinetobacter sp. Kav-305 и

Pseudomonas sp. Krl-181a. В качестве

источника фосфора использовали

Егорьевский фосфорит (фосмука),

биомасса штаммов находилась в виде

лиофилизированного порошка или в

составе биогранул. И в свободном

виде, и в составе гранул оба штамма

давали достоверный прирост урожая Рис. 15. Сухой вес растений бархатцев,

сформированный по подгруппам (рисунок 15). Одновременно, (триады) с контр0льными вариантами.

отмечали прирост содержания

фосфора в цветочной части растений, наиболее требовательных к его наличию. Представленные данные позволяют отнести ФСМ штаммы Acinetobacter sp. Kav-

305 и Pseudomonas sp. Krl-181a к перспективным в качестве компонента биоудобрения.

В дальнейших экспериментах на примере нескольких ФС изолятов изучали возможность высвобождения микроорганизмами фосфатов из низкосортных российских руд и фосфатсодержащих отходов производства минеральных фосфорных удобрений. При этом можно было ожидать остановки процесса вследствие накопления ингибирующих метаболитов и растворимых компонентов руд в периодическом режиме процесса. Для проверки возможности непрерывного цикла высвобождения фосфатов был испытан огьемно-доливной процесс фосфатсолюбилизации с использованием 5 разных руд и штамма Kav-305 (рисунок 16). В этих условиях со всеми видами руд и полной сменой среды количество высвобожденного фосфора

увеличилось почти вдвое. Таким образом, была продемонстрирована возможность микробиологического высвобождения фосфатов в непрерывном процессе.

В процессе дальнейших исследований возникла

технологическая проблема,

связанная с тем, что медленный процесс ФС фосфорсодержащего сырья требует использования аппаратов с длительным временем удержания в объеме реактора. Такой процесс обычно реализуется в колонных системах, в которых быстро происходит заиливание верхних слоев руды. Вместе с этим, необходима иммобилизация ФС ассоциации для долговременной эксплуатации системы.

Для решения этой проблемы в целях одновременной соиммобилизации руды и биомассы ФСМ культур было предложено использовать проницаемые формоустойчивые волокнистые носители биомассы в виде цилиндрических патронов (ВФПН). Этот тип носителей превосходит известные материалы по

■-Фосфорит. Kimmn

т-Чтефорит, Егорьевск

•-Фссфсриг Марокко,

-Апатит Селтдар

фосфорит Каратау

Рис. 16. Отъемно-доливная обработка различных Р-руд штаммом Ка\>-305 для высвобождения фосфатов

удельной сорбционной емкости в 2,5-4 раза и показывает в биопроцессах хорошие эксплуатационные характеристики. Например, для нестационарного процесса

очистки вод от

нефтепродуктов в режиме переключения от режима поддержания непосредственно на рабочий

1,0(105.3)

15(10,6)

щт

Эффективность оч]1сп:н (керамигт), Чо Эффективность очисти! (полштрлшен),

Прот«, л/п сут (концентрация НП на «аде. «г/п) прот(Ж применение Вфпн в

сравнении с известным носителем керамзитом

Рисунок 17. Эффективность биологической очистки стоков, загрязнённых НП, при переключении "режим поддержания / рабочий режим"

показало его существенные преимущества (рисунок 17).

На основе ВФПН была создана колонная установка, где были соиммобилизованы фосфорсодержащиее сырье и биомасса ФС культур. В качестве биокомпонента использовали неантагонистический консорциум ФСМ, включая ВасШия п^Шепит Ып'-71Ь, АстеШЬаМег зр. Кт-282 и дрожжевой изолят Уаггопча $р. Ьку-ПЬ.

Окрпь гчюкка, Лсут

Овфоаъ прокжа, !*<ут

а б

Рис.18. Мобилизация фосфора (за сутки) из фосфорфосодержащего сырья: а) фосфогипса, б) низкосортной руды.

В режиме непрерывного протока более 3 месяцев отмечено стабильное высвобождение растворимых фосфатов при всех скоростях протока (рисунок 18), что подтвердило возможность использования процесса микробной

фосфатсолюбилизации для рекуперации фосфатов из различного

фосфатсодержащего сырья.

ВЫВОДЫ.

1. Изучено распространение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов в природных экологических нишах и выявлены новые ниши, сравнимые или превосходящие известные на сегодня по эффективности выделения целевых культур. Установлено, что активные ФСМ могут эффективно выделяться не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород.

2. В дополнение к методу зон просветления на плотных средах с нерастворимым фосфатом для выделения активных ФСМ предложен комплексный метод, включающий дополнительное использование жидких селективных сред.

3. Детально исследованы ФС свойства штамма В. cepacia Е-37, оптимизирована технология получения его биомассы, сделана экономическая оценка ее приготовления, показана его эффективность в составе опытного биоудобрения в полевых вегетационных экспериментах на ячмене. Отмечено, что технология приготовления его биомассы достаточно дорога и не дает устойчивых результатов.

4. Выделены и охарактеризованы штаммы, которые по своим ФС и технолого-экономическим свойствам превосходят один из лучших мировых аналогов В. cepacia Е-37 и перспективны для создания ФС препаратов и технологий.

5. Получены новые данные о существенном влиянии содержания источников питания, растворенных фосфатов, дозы ФСМ на эффективность протекания ФС.

6. Выявлены группы фосфатсодержащих руд, наиболее доступных воздействию микроорганизмов при использовании в ФС процессах.

7. В лабораторных вегетационных и мелкоделяночных испытаниях опытных образцов фосфорного биоудобрения подтверждена их эффективность: достоверно повышалась урожайность растений и содержание в них фосфора.

8. Разработана технология непрерывного высвобождения фосфатов из низкосортных фосфорсодержащих материалов на основе использования ФСМ. Эффективный непрерывный процесс высвобождения фосфатов был реализован

за счет подбора носителей и соиммобилизации в них рудного сырья и ассоциации ФСМ.

Список условных сокращений

асв абсолютно сухой вес биомассы, мг асв/мл, г асв/л

БМ биомасса

ВФПН волокнистые фильтрующие полимерные носители биомассы

ГРМ гидролизат рыбокостной муки

ДСФ двойной суперфосфат

кж культуральная жидкость микроорганизмов

КОЕ колониеобразующая единица

КФ калия фосфат однозамещенный

МСС минимальная солевая селективная среда

оп оптическая плотность суспензии, измеряемая спектрофотометрически

пмф Посторонняя микрофлора

ТКФ трикальцийфосфат, нерастворимый фосфат

ФС фосфатсолюбилизация, фосфатсолюбилизирующий

ФСМ фосфатсолюбилизирующий микроорганизм

ФСЭ эффективность фосфатсолюбилизации

ЧК чистая культура

эви эффективность выделения изолятов ФСМ

рН показатель рН

Ро2 парциальное давление растворенного кислорода в среде

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Makarevich A.V., Pinchuk L.S., Dunaitsev I. A. Perfection of polymeric microorganism carriers for water purification systems. // Proceedings of 8th European Congress on Biotechnology. - Budapest, 1997. - P. 306.

2. Макаревич A.B., Пинчук Jl.С., Дунайцев И.А, Новые полимерные носители микроорганизмов в фильтрах биологической очистки сточных вод. // Доклады АН Беларуси. - 1997. -т.41. -№1. - С. 114-118.

3. Дунайцев И.А., Кондратенко В.М. Разработка технологии и установок биологической очистки сильнозагрязненных стоков, воздушных выбросов с использованием нового поколения полимерных носителей биомассы. // Материалы Конф. "Наука и техника - городу". - Москва, 1998. - С.195.

4. Jigletsova S.K., Dunaitsev I. A., Kondrashenko V.M. Development of the technology of deep purification of phosphate-polluted sewage water. // Int. Congress "Water: ecology and technology". - Moscow, 1998. - P. 261.

5. Dunaitsev I.A., Makarevich A.V., Pinchuk L.S. The development and selection of carriers of immobilized microorganisms in engineering systems of the intensive biological oxidation of hydrocarbon contamination. // Proceedings of Int. Workshop "Evaluation of sponsored biological studies in Russia for new millennium". -

Novosibirsk, 1999. - v.l. - P. 60-74.

6. Патент BY №2753 CI. Носитель биомассы фильтров для биологической очистки сточных вод. / Макаревич А.В., Дунайцев И.А., Пинчук Л.С. // Опубл. Афщыйны бюл. Дзяржавн. Ведамства Рэспублкы Беларусь. - 1999. -№1. - С. 110.

7. Дунайцев И.А., Макаревич А.В., Пинчук Л.С., Кондратенко В.М. Разработка технологий и установок биологической очистки сильнозагрязненных стоков, воздуха с использованием селективных носителей биомассы. // Материалы Конф. «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии»: - Оболенск, 1999.-С. 170.

8. Левчук В.П., Лунева Н.И., Иванов С.А., Дунайцев И.А., Перелыгин В.В. Использование микроорганизмов для мобилизации фосфатов из фосфатсодержащих руд. // Материалы Межд. Конф. «Проблемы биологической и экологической безопасности». - Оболенск, 2000. - С. 405-406.

9. Makarevich A.V., Dunaitsev I.A., Pinchuk L.S. Aerobic treatment of industrial wastewaters by biofilters with fibrous polymeric biomass carrier. // Bioprocess Engineering. -2000. - V. 22. - P. 0121-0126.

10. Ноздрин B.H., Дунайцев И.А., Перелыгин В.В. и др. Разработка микробиологических методов утилизации фосфорных соединений из различных источников. // Отчет о НИР (заключительный): ГНЦ Прикладной Микробиологии. - Оболенск, 2001,- кн.6, инв. 5920. - С. 25-40 и С. 75-77.

11. Дунайцев И.А. Иммобилизация клеток как инструмент интенсификации биологических процессов. // Сб. трудов Межд. Форума «Биотехнология и современность». - С.-Пб., 2003. - С. 25-26.

12. Dunaitsev I.A. Fibrous formstable biomass carriers to be used for biopurification needs. // Proceedings of Canadian Biological Science Colloquium, ISTC. -Moscow, 2004.-P. 112.

13. Dunaytsev I.A., Zhigletsova S.K., Klykova M.V., Kondrashenko T.N., Aitov R.S., Boyko A.S., Aripovskiy A.V. Screening phosphate solubilizing microorganisms and quantative evaluation of their efficacy. // Proceedings of 3rd Int. Symp. "Phosphate Dynamics in Soil-Plant Continuum". - Uberlandia, Brazil, 2006. - P. 240-241.

14. Дунайцев И.А., Старшов A.A., Перелыгин В.В., Клыкова М.В., Кондратенко Т.Н. Эффективность экспериментальных образцов микробиологических фосфорных удобрений на ячмене. // Агро XXI. - 2008. - №1-3. - С. 35-36.

15. Dunaytsev I.A., Zhigletsova S.K., Aitov R.S., Klykova M.V., Kondrashenko T.N., Starshov A. A., Boyko A.S. Utilization of phosphate containing wastes by direct microbial phosphates mobilization. // Proceedings of ISTC workshop at the Int. Conf. on Soil Contamination "ConSoil-2008". - Milano, ISTC/ConSoil, 2008. - P. 84-88.

16. Жиглецова C.K., Дунайцев И.А., Бесаева С.Г. Возможности применения микроорганизмов для решения задач экологической и продовольственной безопасности. // Агрохимия. - 2010. - №6. - С. 83-96.

17. Dunaytsev I.A. Compact biosystems with immobilization and fibrous formstable

biomass carriers to be used for biopurification needs and air decontamination. // Osteuropa workshop auf dem 22 Kasseler Abfal- und bioenergieforum. -UniKasselTransfer. -2010. - P. 10-11.

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям д.м.н., профессору И.А. Дятлову и к.б.н. Бикетову С.Ф., чей богатый опыт, внимание и поддержка помогали в проведении данной работы и в завершении труда, а также к.х.н. С.К. Жиглецовой, к.б.н. В.В. Перелыгину за большую помощь в организации экспедиционного поиска, экспериментальных исследований и в обобщении результатов. Автор считает своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Формат А5, (148x210). Гарнитура Тайме, Печать офсетная, Бумага офсетная. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ПЕЧАТАЙ.РУ Москва, Ленинский пр-т, д. 35

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дунайцев, Игорь Анатольевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ

И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фосфор как важный биогенный элемент.

1.1.1. Фосфатные ресурсы и основное фосфоросодержащее сырье.

1.1.2. Особенности современной фосфорной индустрии.

1.2. Использование микроорганизмов для разработки биофосфорных 22 удобрений.

1.2.1. Выделение и характеристика ФС микроорганизмов.

1.2.2. Механизм высвобождения фосфатов микроорганизмами из нерастворимого минерального сырья.

1.2.3. Доступность различных фосфатсодержащих рудных 27 материалов воздействию микроорганизмов.

1.2.4. Использование ФС микроорганизмов для улучшения 29 фосфорного питания растений.

1.3. Использование микроорганизмов в обработке руд и решении экологических проблем их добычи и переработки.

1.3.1. Микробное выщелачивание руд.

1.3.2. Подходы к микробному извлечению фосфатов из рудного сырья.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и изучение возможности их использования в промышленности и сельском хозяйстве"

Актуальность проблемы.

Фосфор (Р) является критически важным элементом для жизнедеятельности человека, широчайшим образом используется в разнообразных отраслях промышленности и для повышения продуктивности в сельскохозяйственном производстве. Как минеральный ресурс фосфор существует в виде нерастворимых рудных фосфатных соединений кальция, и в меньшей степени - алюминия и железа. Доказанных мировых запасов фосфатов имеется примерно на 60-80 лет, возрастание же спроса на фосфор вызвано как исчерпанием рентабельных месторождений, так и ростом потребности в продовольствии и экспоненциально возрастающим производством биотоплива [11, 36, 74, 102, 114]. В технологиях производства химических фосфоросодержащих продуктов, включая минеральные удобрения, важнейшим этапом является перевод труднорастворимых соединений фосфорной кислоты в растворимые формы. Фосфорную руду измельчают и обрабатывают сильными кислотами. При этом образуются летучие кислоты, жидкие и твердые отходы, которые сильно загрязняют окружающую среду. Производство Р-содержащих химических удобрений и других фосфорных соединений - энергоемкий и дорогой процесс. Кроме того, добыча и изготовление фосфорных удобрений' создают десятки миллионов тонн отходов бедных фосфатных руд, отходов фосфогипса и накопленных шламов на иловых полях, которые приводят к серьезному загрязнению окружающей среды. Так, отходы фосфогипса составляют приблизительно 4,1-5,4 тонны на тонну Р2О5. Остаточный фосфор, содержащийся в отходах, не извлекается для практических нужд по соображениям рентабельности [1, 74, 102,104, 126].

В сельском хозяйстве как основной отрасли, потребляющей фосфорные продукты, острая проблема дефицита доступного Р в почве решается путем регулярного внесения растворимых минеральных удобрений. Растворимость фосфорных удобрений имеет обратную сторону: только 10-25% вносимого с химическими удобрениями фосфора ассимилируется растениями, а большая часть фосфатов переходит в труднодоступную форму либо вымывается с грунтовыми водами. При этом в настоящий момент известные формы химических минеральных удобрений подошли (по показателям усвоения растениями и снижения потерь в окружающую среду) к своему пределу совершенствования, как в самом производстве, так и в применении продукта. Таким образом, низкая эффективность использования фосфора из существующих удобрений и возрастание потребностей сельского хозяйства при росте населения увеличивают глобальные экологические проблемы, возникающие при добыче/производстве и применении фосфорных удобрений, и ускоряют истощение невосполняемых месторождений богатых руд. Из-за высокой стоимости многие развивающиеся страны практически не используют химические фосфорные удобрения. В связи с этим встает вопрос о разработке более дешевых и эффективных фосфорных удобрений [13, 74, 101, 146].

Альтернативой для существующих химических методов извлечения Р и приготовления удобрений может служить процесс прямого микробиологического высвобождения (солюбилизации) фосфатов из нерастворимого сырья. Процесс основан на использовании метаболической активности фосфатсолюбилизирующих (ФС) культур, которые встречаются в природе в различных экологических нишах и способны медленно переводить нерастворимые фосфаты из Р-содержащих рудных материалов в растворимую форму в ходе своей жизнедеятельности [59, 137, 155]. Следует отметить, что отечественные исследователи являлись пионерами в изучении процессов микробной мобилизации фосфатов из нерастворимых соединений [26, 29]. В мире появились первые сельскохозяйственные препараты («1ишр81аЛ», КоуогушеБ, Дания и «Рг70», ЗвВ, Австралия), основанные на использовании ФСМ, что подтверждает дальнейшее развитие научного и промышленного интереса в этой области [163, 167]. Прямая микробная мобилизация фосфатов может быть применена шире, чем только в агротехнологиях, и в целом преимущества использования процесса можно представить как:

- "Зеленые" технологии использования нового поколения микробных удобрений, дополняющих или замещающих существующие химические;

- более эффективное использование исчерпаемого фосфорного сырья и снижение эвтрофикации окружающей среды (почв, грунтовых вод);

- возможность утилизации фосфатсодержащих отходов предприятий химической индустрии (фосфогипс, иловые осадки прудов-накопителей) и бедных руд с рекуперацией остаточного фосфора в индустриальном цикле;

- возможность улучшения экологической обстановки и снижение расходов по обеспечению безопасности на существующих производствах добычи/обогащения сырья и получения минеральных удобрений;

- относительная простота и малая энергоемкость технологического процесса изготовления биопрепаратов и экологических биотехнологий, что может обеспечить экономическую целесообразность внедрения новых процессов.

К сожалению, недостаточная изученность процессов микробной фосфатсолюбилизации (ФС), биоразнообразия фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов (ФСМ) и доступного разнообразия фосфатных руд, отсутствие технологических проработок, и, в целом, обширный междисциплинарный характер проблемы - не позволили к настоящему времени использовать процессы микробной ФС в достаточном спектре практических разработок.

В связи с этим, представляется актуальной разработка микробиологических и биотехнологических процессов, в которых будут использована способность микроорганизмов солюбилизировать фосфор для приготовления нового поколения биологических удобрений, а также в технологиях утилизации отходов фосфатной индустрии и извлечении остаточного фосфора.

Целью исследования являлись выделение активных ФСМ из различных экологических ниш и изучение возможности их использования для разработки биофосфорных удобрений и в процессах высвобождения фосфора из фосфатсодержащих бедных руд и отходов.

Задачи исследования:

1. Поиск и выделение активных ФС культур в широком спектре экологических ниш;

2. Характеризацию ФС изолятов, включая исследование ФС в модельных средах, ключевых метаболитов, биодоступности различного фосфатного сырья;

3. Изучение возможности применения выделенных ФСМ для создания технологии микробных фосфорных удобрений и ее экономическая оценка;

4. Исследование перспективы использования ФСМ для прямого извлечения фосфатов из фосфатсодержащих отходов, бедных руд.

Научная новизна. Впервые для поиска, выделения и оценки распространенности ФСМ был предложена и использована панель скрининга разнообразных экологических ниш и показано, что активные ФСМ эффективно выделяются не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. Полученные результаты позволяют более глубоко понять процессы микробной ФС: выявлено значительное влияние компонентов питательной среды на состав метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов, с использованием широкого круга микроорганизмов детально изучен механизм высвобождения фосфатов с помощью группы глюконовых кислот, позволяющий наиболее эффективно использовать для этой цели углеродный субстрат. Изучена доступность спектра фосфорных руд отечественных и мировых месторождений воздействию отобранных наиболее активных микроорганизмов. Выявлено несколько групп фосфатного сырья, наиболее доступных для микробной фосфатсолюбилизации. Впервые показана возможность микробиологического высвобождения фосфатов низкой концентрации из фосфорсодержащих материалов: фосфогипса и рудных отходов.

Практическая значимость. Разработаны микробиологические и биотехнологические основы для использования процессов прямой микробной фосфатсолюбилизации в промышленности, сельском хозяйстве и природоохранных технологиях. Выделены культуры, способные к прямой микробной фосфатсолюбилизации из нерастворимого рудного сырья. Отобраны для- практического использования' наиболее перспективные штаммы, не уступающие или превосходящие по ряду свойств и ФС активности лучшие мировые аналоги. Разработаны лабораторные методики приготовления фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, выделения и селекции фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов, лабораторные Регламенты производства фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов и производства комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами. В Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонированы два штамма ФСМ. Показано повышение урожайности зерновых и декоративных растений при использовании экспериментальных образцов биофосфорных удобрений. Отобраны наиболее биологически доступные группы фосфатного сырья, выбраны наилучшие по биодоступности отечественные фосфатные руды. Разработаны формоустойчивые волокнистые носители, позволяющие эффективно соиммобилизовать биомассу и сырье в процессе непрерывной обработки руд. Предложена технология использования ФО культур и ФС

11 процессов для извлечения фосфатов из бедных руд и для утилизации фосфатсодержащих отходов промышленности (фосфогипса).

Внедрение результатов работы. Результаты исследований послужили основой для разработки научно-технической документации: Методики Лабораторной МИ 15.444-2002 «Приготовления фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов»,

Лабораторного Регламента ЛР 00001927-15-82-2003 «На производство фосфорных удобрений с использованием фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов», Лабораторного Регламента ЛР 78095326-77-2009 «На производство комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами» и Методики Лабораторной МЛ 78095326-007-2010 «Выделения и селекции фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов». Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности и других факультетов Пущинского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активные фосфатсолюбилизирующие микроорганизмы могут эффективно выделяться не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. •

2. Поиск в разнообразных экологических нишах позволяет выделить штаммы, которые по своим ФС свойствам в модельной среде не уступают мировым аналогам, лучше их растворяют природное Р-сырье, а по технологическим и экономическим показателям могут превосходить.

3. Использование биоудобрений на основе выделенных ФСМ позволяет повысить количество и качество урожая.

4. Возможно создание технологии, позволяющей в непрерывном процессе с помощью фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов высвобождать фосфаты из низкосортных фосфоросодержащих материалов горнохимической индустрии: фосфогипса и рудных отходов.

5. Прямая микробная солюбилизация фосфатов из нерастворимого минерального сырья является эффективным микробиологическим процессом и перспективна для практического использования в различных отраслях.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУНГНЦПМБ 16 июля 2010 года.

Материалы диссертации доложены и представлены на 12 международных и российских научных конференциях: 8-м Европейском конгрессе по биотехнологии (17-21 августа 1997 г., Budapest, Hungary); Международном конгрессе «Вода: экология и технология» (25-30 мая 1998 г., Москва, Россия); Международном семинаре «Evaluation of sponsored biological studies in Russia for new millennium» (02-04 сентября 1999 г. Новосибирск, Россия); Международной научной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (22-25 мая 2000 г., Оболенск, Россия); Международном Форуме «Биотехнология и современность» (17-18 июня 2003 г., Санкт-Петербург, Россия); Канадско-Российском Коллоквиуме по биологическим наукам (15-17 Сентября 2004 г., Москва); 34-м Международном Семинаре Япония/Россия «Biotechnologies in Russia/CIS» (17 Июня 2005 г., Tokyo, Japan); 3-м Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (14-18 марта 2005 г., Москва, Россия); 3-м Международном Симпозиуме «Phosphate Dynamics in Soil-Plant Continuum» (14-19 мая 2006 г., Uberlandia, Brazil); 10-й Международной Конференции «Soil-Water Systems Consoil-2008» (03-06 июня 2008 г., Milano, Italy); Юбилейном Международном Симпозиуме МОББ «Биоценотическая регуляция. Основы современных фитосанитарных технологий» (21-25 мая 2007 г., Санкт-Петербург, Россия); 2-м Международном Экологическом Форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (01-04 июля 2008 г., Санкт-Петербург, Россия).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 17 научных публикациях, включая 7 статей (в том числе 3 статьи, опубликованные в журналах, включенных в список ВАК) и патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 49 отечественных работ и 121 работу зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и 34 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дунайцев, Игорь Анатольевич

выводы

1. Изучено распространение фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов в природных экологических нишах и выявлены новые ниши, сравнимые или превосходящие известные на сегодня по эффективности выделения целевых культур. Установлено, что активные ФСМ могут эффективно выделяться не только из ризосферной зоны растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород.

2. В дополнение к методу зон просветления на плотных средах с нерастворимым фосфатом для выделения активных ФСМ предложен комплексный метод, включающий также использование жидких селективных сред.

3. Детально исследованы ФС свойства штамма В. cepacia Е-37, оптимизирована технология получения его биомассы, сделана экономическая оценка ее приготовления, показана его эффективность в составе опытного биоудобрения в полевых вегетационных экспериментах на ячмене. Отмечено, что технология приготовления его биомассы достаточно дорога и не дает устойчивых результатов.

4. Выделены и охарактеризованы штаммы, которые по своим ФС и технолого-экономическим свойствам превосходят один из лучших мировых аналогов В. cepacia Е-37 и перспективны для создания ФС препаратов и технологий.

5. Получены новые данные о существенном влиянии содержания источников питания, растворенных фосфатов, дозы ФСМ на эффективность протекания ФС.

6. Выявлены группы фосфатсодержащих руд, наиболее доступных воздействию микроорганизмов при использовании в ФС процессах.

7. В лабораторных вегетационных и мелкоделяночных испытаниях опытных образцов фосфорного биоудобрения подтверждена их эффективность: достоверно повышалась урожайность растений и содержание в них фосфора.

8. Разработана технология непрерывного высвобождения фосфатов из низкосортных фосфорсодержащих материалов на основе использования ФСМ. Эффективный непрерывный процесс высвобождения фосфатов был реализован за счет подбора носителей и соиммобилизации в них рудного сырья и ассоциации ФСМ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубочайшую благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору И.А. Дятлову и к.б.н. Бикетову С.Ф. за высокий интерес к результатам этой работы, помощь в формировании научной концепции работы и неизменную систематическую поддержку в завершении труда.

Приношу искреннюю благодарность заведующему отделом биологических технологий, к.б.н. В.В. Перелыгину и с.н.с., к.х.н. С.К. Жиглецовой за идейное руководство, мудрую поддержку и большую помощь в организации технологических и биохимических исследований данной работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность официальным и неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе рассмотрены современное состояние фосфорной индустрии и проблемы переработки Р сырья и применения продуктов. Исследованы современные данные в области микробной фосфатсолюбилизации, выделения активных штаммов ФСМ, механизма действия и возможного их применения.

В работе изучено распространение ФСМ в разнообразных экологических нишах и впервые показано, что активные ФСМ эффективно выделяются не только из ризосферной части растений, но и из бедных по питательным веществам экологических ниш, в том числе из разрушающихся (эрозионных) минеральных пород. Полученные результаты позволяют более глубоко понять процессы микробной ФС: выявлено значительное влияние компонентов питательной среды на состав метаболитов, обеспечивающих растворение фосфатов. Для выделенных по усовершенствованному методу культур определен наиболее распространенный механизм растворения фосфатов микроорганизмами через формирование группы глюконовых кислот. Отмечено, что некоторые коллекционные штаммы микроорганизмов проявляют ФСА. Изучена доступность разнообразных фосфорных руд отечественных и мировых месторождений воздействию отобранных наиболее активных микроорганизмов. Выявлено несколько групп фосфатного сырья, наиболее биодоступных микробной фосфатсолюбилизации. Впервые показана возможность высвобождения фосфатов низкой концентрации из фосфоросодержащих материалов: фосфогипса и рудных отходов.

Работа имеет высокую практическую значимость. На основе обширной экспедиционной работы по обследованию разнообразных экологических ниш и климатических регионов РФ/СНГ выделены культуры, способные к прямой микробной фосфатсолюбилизации из нерастворимого рудного сырья. Модифицирована методология селекции активных ФС культур, перспективных для использования в промышленности и сельском хозяйстве, за счет использования контроля ФС в жидких средах, что позволило дополнительно селекционировать на 25-50% высокоактивных ФСМ. Отобраны для практического использования наиболее перспективные штаммы, не уступающие или превосходящие по ряду свойств и ФСА лучшим из описанных культурам. В коллекцию живых культур ФГУН ГНЦПМБ депонированы два штамма ФСМ.

На примере наиболее активных из известных в литературе штаммов показано, что наиболее эффективно высвобождают фосфаты штаммы, стехиометрически окисляющие глюкозу до глюконовой и кетоглюконовой кислот. При этом глюкоза сначала полностью окисляется в эти кислоты, которые вызывают растворение фосфатов и начинают усваиваться микроорганизмами только после окисления всей глюкозы в среде. Соответственно, до полного превращения глюкозы в кислоты не происходит размножения клеток. В отсутствие растворимых фосфатов для таких микроорганизмов глюкоза, по-видимому, является ингибитором размножения.

При использовании в биофосфорном удобрении микроорганизмов, осуществляющих растворение фосфатов по вышеуказанному механизму, можно точно рассчитать соотношение фосфатной руды и источника углерода, что позволит использовать вводимые в биофосфорное удобрение компоненты наиболее эффективно. Вводимое в удобрение количество клеток будет определять время «работы» такого препарата в почве.

Проведена технологическая оптимизация приготовления биомассы для 2 ФС культур и связанный с этим экономический расчет стоимости биомассы. Показано, что вновь выделенный штамм ФС, растущий на минеральных средах имеет низкую себестоимость и перспективен для создания препарата биоудобрения. Показано повышение урожайности зерновых и цветочных растений при использовании экспериментальных образцов биофосфорных удобрений.

Отобраны наилучшие по биодоступности отечественные фосфатные руды, отобраны наиболее биологически доступные группы фосфатного сырья. Для различных групп фосфорного сырья показано наилучшее высвобождение фосфатов ФС культурами из морских фосфоритов шельфового залегания, из зернистых и желваковых фосфоритов. Разработана технология использования ФС культур и ФС процессов для извлечения фосфатов из бедных руд и для утилизации фосфат-содержащих отходов промышленности (фосфогипса).

В целом, разработаны микробиологические и биотехнологические основы для использования процессов прямой микробной фосфат-солюбилизации в промышленности, сельском хозяйстве и экологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дунайцев, Игорь Анатольевич, Оболенск

1. Ангелов A.A., Левин Б.В., Черненко Ю.Д. Фосфатное сырье. Справочник . М.: Недра. 2000. - 120 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы. - 1962. -180 с.

3. Бабенко Ю.С., Тырыгина Г.И., Григорьев Е.Ф., Долгих Л.М., Борисова Т.И. Биологическая активность и физиолого-биохимические свойства фосфатрастворяющих бактерий // Микробиология. 1984. - Т. 53. - №4.- С. 533-539.

4. Бабкин В.В., Бродский A.A. Фосфорные удобрения России. Изд-во Маргус.-1995.-460 с.

5. Батурин Г.Н. Рудный потенциал океана // Природа. 2002. - №5. - 20 с.

6. Батурин Г.Н. Фосфатонакопление в океане / отв. ред. Ю.А. Богданов. М.: Наука. -2004. -464 с.

7. Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. В 2 т. М.: Мир. -1989.- 1288 с.

8. Борисов В.М., Ажикина Ю.В., Гальцов A.B. Физико-химические основы получения сложных фосфоросодержащих удобрений. М.: Химия. 1983.- 260 с.

9. Быков В.А., Винаров А.Ю., Шерстобитов В.В. Расчет микробиологических производств. Киев: Техшка. 1985. - 248 с.

10. Волошин A.B., Майстерман С.А. Минералы Кольского полуострова. Мурманское Книжн. Изд-во. 1983. - 112 с.

11. Гиляров А. Исчерпание запасов фосфатов серьезная угроза человечеству // ELEMENTY.RU: интернет-изд. 2010. URL: http://www.elementy.ru/news/431172 (дата обращения: 19.05.2010).

12. ГОСТ 20851.2-75. Удобрения минеральные. Методы определения фосфатов (ИСО 5316-77, ИСО 6598-85, ИСО 7497-84). М.: Изд-во стандартов. 1997. — 37 с.

13. Дементьева Ж., Лисун В. Фосфор. История. Современность // NPK. -2008. 2. - С. 26-34.

14. Дурынина Е.П., Егоров B.C. Агрохимический анализ почв, растений, удобрений. Изд-во Моск. ун-та. 1998. - 113 с.

15. Заключительный Отчет. НИУИФ. Исследовать параметры технологичности отечественного и зарубежного фосфатного сырья, разработать теоретические основы его оптимального использования. /1619