Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроорганизмы деструкторы полихлорированных бифенилов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микроорганизмы деструкторы полихлорированных бифенилов"

я МВ&9

На правах рукописи КАПРАНОВ Владимир Владимирович

МИКРООРГАНИЗМЫ ДЕСТРУКТОРЫ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Ми'"-Л

Работа выполнена в отделе л^олоп шестой биотехнологии Государственного научно чсследсвательского центра токсико-лоп гн и г [гненической регламентации биопрепаратов Феде ральнюго управлеыш медикэ биологических и экстремальных проблем

Научные р\ к о в о д ч т с л ч

доктор медицинских наук Н. Р. Дядищев, доктор биологических наук Г. А. Жариков.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор В. К. Шильникова; кандидат биологических наук Г. К. Васильева.

Ведущее учреждение— ВНИИ сельскс хозяйствегн ш микробиологии Iг Пушккн)

на заседании ди^сертаи I К 120 35 06 в Москов-

ской сельскохозяйственной акадсм„"л им К А Тимирязева Адрес 127550, Москва, Ттырязевскан ул , 44 Ученый совет М.СХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ НСХ \

Защита состоится

2000 г в /у ч

Автореферат разослан

2000 I

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат биологических наук

Л. В. Мосина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Полихяорированные бифенилы (ПХБ) относятся к хлорорганическим соединениям, диоксиноподобным веществам первой группы опасности. Они входят, по списку UNEP, в "черную дюжину" наиболее стойких и опасных органических загрязнителей, угрожающих окружающей среде планеты. .

Pix начали производить с 30-х годов, с целью применения для нужд электротехнической промышленности. С начала 80-х годов производство этих опасных соединений свернуто. Сейчас ведутся работы по их планомерному уничтожению, но проблема ПХБ," попавших в окружающую среду, так'и остается нерешенной ввиду их очень высокой химической и биологической инертности.

В настоящее время очистка почв, загрязненных ПХБ, ведется физико-химическими методами, что приводит к неблагоприятному изменению свойств почв и к возникновению их вторичных загрязнений. Альтернативным способом является метод деградации ПХБ микроорганизмами, который позволяет не только понизить концентрацию ПХБ в почве, но и свести к минимуму ущерб для окружающей среды.

Как и в случаях с разнообразными ксенобиотиками, естественным источником микроорганизмов-деструкторов ПХБ является почва, длительное время загрязненная высокими концентрациями ПХБ. '

Высокая деструктивная эффективность почвенных микроорганизмов при разложении ПХБ установлена только на лабораторном уровне. Не отработана технология и научно-методические условия использования микроорганизмов в полевых условиях. Отсутствуют данные о наиболее эффективных дозах внесения микроорганизмов-деструкторов в ' почву, не ' исследованы взаимоотношения интродуцированных в почву микроорганизмов-деструкторов с аборигенной почвенной микрофлорой. Полностью отсутствуют данные о безопасности микроорганизмов-деструкторов ' ПХБ дня теплокровных животных и человека, а также сведения о токсичности санированной почвы для теплокровных животных. .

Ht/F- " """чи исследования. Целью исследования является разработка метода'микробиологической деструкции полихлорбифенилов • загрязненных почвах in situ.

Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи: '

- выделить из загрязненных почв и • идентифицировать штаммы микроорганизмов, разлагающие полихлорбифекилы;

- провести токсикологические испытания выделенных штаммов микроорганизмов на безопасность для теплокровных животных;

L'c; : I гл ! г' 'ля

НАУЧ i • it;IKA Mos«, сйл. - -. .аамии К4 U. :сва

Ина i:-J

- найти оптимальный температурный интервал и определить наиболее эффективную концентрацию вносимой микробной суспензии при проведения микробиологической деструкции ПХБ в почве,

-изучить динамику содержания микроорганизмов-деструкторов'ПХБ в почве Изучить их взаимоотношения с естественной почвенной микрофлорой,

- провести полевые испытания разработанного метода биоремедиации на участках почвы, подвергшихся длительному и массированному загрязнению ПХБ,

- сравнить токсичность почвы, загрязненной ПХБ, до и после проведения биорем идиации, для теплокровных животных и дафний

На защиту выносится система мероприятий по экологически безопасной санации т situ загрязненной полихлорированными бнфениламк почвы с помощью микроорганизмов-деструкторов Научная новизна;

- разработан метод санации почвы т situ с помощью микроорганизмов-деструкторов ПХБ Alcaligenes latus TXD-13 и Hansenula califomica AT,

- впервые показано, что для деструкции ПХБ могут быть использованы дрожжи Hansenula califomica, способные активно разлагать эти ксенобиотики,

- в полевых условиях изучено взаимоотношение микроорганизмов-деструкторов и аборигенной почвенной микрофлоры,

- предложена методика определения токсичности почв в процессе микробиологической санации с помощью животных-биотестов

Практическая ценность:

- организован музей микроорганизмов-деструкторов ПХБ Штаммы Alcaligenes latus TXD-13 н Hansenula califomica AT депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В 75-05 и Y-2284. На них получены две международные патентные заявки PCT/RU 98/00036 и PCT/RU 98/00037 соответственно и оформляются два патента Российской Федерации;

- на основании лабораторных и полевых испытаний разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для детоксикации почв, загрязненных ПХБ.

Работа прово-члась в рамках научных исследований по проекту № 228 Международного Научно-технического Центра.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на совместном заседании кафедр микробиологии и экологии и безопасности жизнедеятельности ТСХА в 2000 г. Материалы, изложенные в диссертации, доложены на Российских и Международных научных и научно-практических конференциях, опубликованы в журнале "Токсикологический вестник", оформлены в виде международных патентных заявок РСТ, патентов Российской

Федерации, лабораторных регламентов, отчетов к проекту № 228, методик, инструкций. Всего по теме диссертации опубликовано 15 работ.

. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы; описания методов исследования, изложения полученных результатов, выводов и практической рекомендации.. Работа изложена на 107 стр. машинописного текста, включает 27 таблиц, 12 рисунков, список-использованной литературы включает 56 наименований, в том числе 18 на иностранном языке.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в период 1994-1999 гг. на базе НИЦ токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов, на почвах Серпуховского АО "Конденсатор" и прилегающих территориях.

Образцы почвы отбирали с глубины 5-10 см, отбор и обработку их вели в соответствии со стандартными методиками.

Определение полихлорбифенилов в исследуемых образцах проводили методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе "Кристалл - 2000 М" (Россия) с детектором электронного захвата и капиллярной колонкой ВИТОКАП А-1-0,3. Условия хроматографирования: Т колонки—180°С, Т испарителя—300°С, Т детектора—300°С.

- Идентификации микроорганизмов деструкторов ПХБ были проведены на основании изучения культурально-морфологических, хемотаксономических, и физиолого-биохимических признаков, в соответствии с общепринятыми методами идентификации. ""

Изучение характеристик' комплекса микроорганизмов дерново-подзолистой почвы проводили следующими - методами: . прямым микроскопическим исследованием, параллельно с прямыми микроскопическими исследованиями из тех же образцов почв был проведен высев микроорганизмов на питательные среды, аппликационным методом с использованием льняной ткани, метод - инициированного микробного сообщества, численность водорослей определяли методом прямого счета.

Рпределение безопасности штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных проводили по следующим показателям: средневирулентная доза (ЫЭи) исследуемых^" штаммов, токсичность, токсигенность и диссеминация во внутренних органах.

Определение интегральной токсичности почвы с помощью дафний. Для оценки токсичности почвы до и после биоремедиации нами была разработана методика биотестирования почвенных проб, загрязненных ПХБ. Методика основана на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при

з

воздействии на них токсических веществ, содержащихся в водной вытяжке из загрязненной почвы

Статистическую обработку полученных результатов проводили по Ашмарину И П и Воробьеву А А "Статистические методы в микробиологических исследованиях", а также с помощью прикладной компьютерной программы EXCEL

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выделения микроорганизмов-деструкторов ПХБ использован метод прямого высева почвенных микроорганизмов на минимальную-солевую среду с ПХБ в качестве единственного источника углерода

В качестве накопительной использовали агаризованную питательную среду следующего состава (№ЦЪНРОд - 1,5г, КН2РО4 - 0,7г, NaCI - 0,5г, M&SO* - 0,8г, Вода диет - до 1 литра, pH - 7,2 ед ,ПХБ - 10-200 мг/л

В ходе эксперимента из проб почвы, отобранных на территории завода "Конденсатор" и вдоль речки Боровлянка, выделен 121 штамм почвенных микроорганизмов, из которых 18 пггаммов были способны к росту на минимально-солевой среде, содержащей ПХБ в количестве от 10 до 200 мг/л, Концентрация ПХБ, равная 200 мг/л, соответствовала среднему уровню загрязнения почвы в районе отбора проб Все выделенные культуры способны в той или иной степени к росту на средах, содержащих различные концентрации ПХБ

Способность к устойчивому росту на средах с высокими содержаниями ПХБ проявили микроорганизмы родов Bacillus АТ-8, Pseudomonas ТХД-12, Alcaiigenes ТХД-13, дрожжи Hansenula AT. Эти штаммы удовлетворили требованиям к микроорганизмам-деструкторам, так как средний уровень загрязнения почвы ПХБ составляет 200 мг/кг. Штаммы Acmetobactet CT, Corynebactertum АТ-2, АТ-29, Arthrobacter АТ-7, Bacillus ТХД-1, ТХД-6, АТ-9. Pseudomonas АТ-11, АТ-14. АТ-16, АТ-19, АТ-21, АТ-23, АТ-24 имели устойчивую способность к росту на средах с более низким содержанием ПХБ, что не соответствовало требованиям к отбираемым штаммам

Таким образом, из почвы, загрязненной ПХБ, выделены и идентифицированы до рода штаммы микроорганизмов-деструкторов родов Bacillus, Pseudomonas, Alcaiigenes, дрожжи Hansenula

Выделенные микроорганизмы способны расти на минимально-солевой питательной среде, использовали ПХБ как единственный источник углерода и имели уровень устойчивости к ПХБ, равный 200 мг/л питательной среды

Создан музей микроорганизмов-деструкторов ПХБ, содержащий 18 штаммов микроорганизмов

Безвредность для теплокровных животных и человека. Для проведения дальнейших работ с выделенными из почвы наиболее активными штаммами микроорганизмов-деструкторов ПХБ необходимо было установить их безвредность для теплокровных животных и человека.

Работы по определению средневирулентной дозы (LD50), токсичности, токсигенности и определению диссеминации штаммов во внутренних органах экспериментальных животных проводили в соответствии с методическими рекомендациями на белых мышах и крысах.

Проведенными токсикологическими исследованиями экспериментальных штаммов было установлено отсутствие патогенных свойств штаммов Hcmsenula AT и Alcaligenes ТХД-13 по показателям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах, что позволило использовать названные штаммы для дальнейших работ, при условии соответствия их необходимым микробиологическим характеристикам.

На основании диффиринцируюших характеристик видов штамм бактерий Alcaligenes ТХД-13 был отнесен к виду latus, а штамм дрожжей Hcmsenula AT отнесен к виду califomica. Штамм бактерий .Alcaligenes latus ТХД-13 антибиотикорезистентен к группам пенициллиновых и цефалоспориновых антибиотиков, штамм дрожжей Hansenula califomica AT способен к росту на средах содержащих молочную кислоту в концентрации 0,3%.

Культивирование микроорганизмов-деструкторов осуществляли для получения микробной биомассы, с последующим внесением ее в почву, загрязненную ПХБ. Разработаны лабораторные регламенты культивирования микроорганизмов-деструкторов ПХБ.

Определение оптимальной концентрации микробной суспензии для разложения ПХБ в почве микроорганизмами- деструкторами. Эксперимент проведен с цель выяснения- влияния концентрации микробной суспензии, при .обработке загрязненной- ПХБ почвы, на степень деструкции ПХБ и для последующего определения оптимальной концентрации микробной суспензии. Данные, полученные в результате эксперимента, представлены в таблице 1.

Таблица I

Деструкция ТТХБ при внесении различных количеств микроорганизмов__деструкторов ПХБ_

Штамм Исходная концентрация кл/см1 Время экспозиции, месяцы Концентрация ПХБ в почве мг/кг

Alcahgenes latus ТХД-13 контроль 0 49,0±18,2

10' 05 13 1±3,1

1 6 3±2,3

2 5 2±1,б

3 12 9±3,5

10" 05 13 9±3,2

1 6 2±1,9

2 17 2±3,6

3 17 6±3,6

107 05 12 3±3,4

1 10 4±3,5

2 16 3±3 6

3 6 7±1,8

Hansenula californica AT контроль 0 49,0±18.6

107 05 20 8±4,3

1 14 1±4,2

2 20 9±4,1

3 17 2±3,6

106 05 24 1±5,2

1 8 8±2,1

2 17 9±3,б

3 17 7±3,5

ю5 05 19 1±3,2

1 13 5±3,8

2 16 6±3,4

3 12,5±3,7

Из результатов экспериментов следует, что оптимальной концентрацией для суспензии, вносимой в почву, являлась - 107 клеток/см1 для бактерий Alcahgenes latus, а для дрожжей Hansenula californica - 105 клеток/см3. Норма расхода составила 1литр суспензии на 1м2 почвы Данные концентрации

б

являются наиболее. ' экономически выгодными, так как позволяют при сравнительно небольших объемах культивирования обрабатывать значительные площади загрязненных почв.

Определение_оптимальной температуры окружающей среды для

разложения ПХБ в почве микроорганизмами - деструкторами. Эксперимент проведен с целью выяснения влияния температуры окружающей среды на степень деструкции ПХБ в почве микроорганизмами и определения оптимального температурного интервала применения микроорганизмов-деструкторов. Результаты эксперимента, представлены в таблице 2.

* ' - . . Таблица 2

Штамм Температура0 Экспозиции», Концентрация ПХБ в

■ С месяцы почве, мг/кг

А1саИвепев 1аш ТХД-13 КОНТРОЛЬ • 0 49,0±18,2

■ 12 0.5 27.7±5,5

1 26.6±6,1

2 28.2±4,2

3 29.8±6,3

20 0.5 12.1 ±3,5

г 16.3±1,7

2 12.4±7,3

3 15.8±4,6

30 0.5 18.6±3,5

1 10.4±2,1

2 1б.3±3,9

3 11.3±3,3

' Наюепи1а саИ/оШса АТ контроль 0 49,0±18,2

12 0.5 18.4±3,6

I 14.4±3,6

3 22.0±6,4

20 0.5 21.4±4,0

I 5.5±1,2

2 14.2±4,1

3 15Л±4,7

- 30 0.5 34.1 ±10,4

1 9.9±2,б

2 7.8±2,0

3 10.2±3,5

Результаты экспериментов показали, что максимальная степень разложения ПХБ наблюдалась в температурном интервале 20 - 30°С, при влажности почвы 60 - 80%, что соответствует теплому периоду года в средней полосе России с середины мая по середины августа

Изучение характеристик комплекса почвенных микроорганизмов Для изучения свойств и биологического состояния дерново-подзолистой почвы, загрязненной пол «хлорированными бифенилами, с целью дальнейшего определения взаимоотношений между интродуцировалными культурами микроорганизмов-деструкторов и аборигенной микрофлорой, проводили изучение характеристик комплекса почвенных микроорганизмов

Объектами исследования служили почвы различной степени загрязненности

При сравнительном изучении характеристик микробного сообщества дерново-подзолистой почвы, загрязненной ПХБ в концешрациях от 15 до 210 мг/кг, установлено снижение численности и биомассы бактерий, грибов, акгиномицетов и водорослей, уменьшение интенсивности разрушения целлюлозы.

В целом, структурные и количественные характеристики микробного сообщества дерново-подзолистой почвы, показатели общей биологической активности позволили судить об изменении биологического состояния почвы под действием ПХБ

Нами было изучено изменение концентрации микроорганизмов-деструкторов в течение всего срокд биоремедиации. а также их влияние на аборигенную микрофлору почвы В течение 3-х месяцев (с интервалом в 7 дней) после внесения микроорганизмов-деструкторов определяли концентрацию естественной микрофлоры в почве Повторность опытов пятикратная Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Концентрация микрофлоры (кл/г-103) в почве после интродукции ' микроорганизмов-деструкторов

Время,; неделя контроль Почва+шт. Alcaligenes 1аш ТХД-13 Почва+шт. Нап$епи1а. саИ/огпка АТ

0 (1120±160)104 (1120*160)104 (1120*160)104

1 (1650±140) 104 (1680±120)104 (1730*150)Ю4

2 (2640±190) 104 (2450*220) 106 (2660±160)104

3 (2460±170) Ю6 (2340±260) 10е (2410± 120)' 10й

4 (2120*320)104 (2060*130)104 (2330*140)104

5 (1840±210)106 (1940±160) 104 (1920*290) 106

6 (1630±320) 104 (1530±160) 104 (1470±110)104

7 (15201160) 10б (1480±50) 104 (1400±100)Ю6

8 (1270±120) 106 (1300±110) 104 (1840*70) Ю6

9 11210*110) 104 (1140±90) 104 (1810*90) 104

10 (1120±040)104 (1120±100) 104 (1830±270)104

11 (1160*120) 104 (1130±90)104 (1700*290)104

12 (1110*190) 104 (1120±80) 106 (1730±110)104

Как видно из приведенных результатов, количество почвенных микроорганизмов в течение всего эксперимента оставалось примерно на таком же уровне, как и в почвах, .обработанных микроорганизмами-деструкторами ПХБ.

Это свидетельствует об отсутствии, сколько-нибудь существенного влияния, шпродуцированных микроорганизмов на аборигенную микрофлору почвы.

Содержание микроорганизмов-деструкторов в почве определяли в течение 3-х месяцев после их внесения (с интервалом в 7 дней), методом прямого высева почвенной суспензии на селективные среды. Повторность экспериментов - 5-ти кратная. Полученные данные представлены в таблице 4.

»

Таблица 4

Динамика концентрации микроорганизмов-деструкторов (кл/г 103) в почве

Время, неделя Загрязненная почва, контроль Почва+шт Alcahgenes latus ТХД-13 Почва+шт Hansenula cahfomica AT

0 0 (3500 ±630) 10* (3200±420) 101

5 0 (3200±550)101 (1800±100) 10

б 0 (1200 ±450) 10* (1100 ±220) 10

7 0 (5900 ±950) 10 8400 ±1800

8 0 (1500±40)102 (5500±200)10

9 0 (1500±40) 101 (1810±90) 106

10 0 (1500±200) 10' 5200±200

11 0 (1600±300)102 2200±200

12 0 (1300±200) 102 1500±500

14 0 (9590±3150) 10 -

16 0 (9900±3200) 10 -

18 0 (2-100±260) 10 -

Полученные данные свидетельствуют о том, что концентрация микроорганизмов-деструкторов за время наблюдения неуклонно понижалась до своего минимального уровня, причем количество дрожжей Hansenula caltfomica достигало минимального значения к 12-й неделе эксперимента, а бактерий Alcahgenes ¡alus лишь к 18-й неделе

Полевые испытания Эксперименты проводили с целью проверки способности штаммов микроорганизмов-деструкторов разлагать ПХБ в полевых условиях, а также оценить (ранее выбранные в лабораторных экспериментах) условия деградации ПХБ

Для проведения полевых испытаний выбраны два участка, находящиеся рядом с индивидуальными огородами, возле Серпуховского завода "Конденсатор", по улице Стрелковая Эти два участка характеризуются различными уровнями ПХБ, содержащегося в почве Количество микробной суспензии для обработки почвы брали из расчета 1л/1мг почвы Концентрацией микробной суспензии составляла 107кл/мл для Alcahgenes latus и 105 ют/мл доя Hansenula cahfomica Микробную суспензию вносили на поверхность каждого из участков с помощью ранцевого аэрозольного опрыскивателя После внесения микроорганизмов участок повторно рыхлили с помощью мотокультиватора Эксперимент проводили в течение трех месяцев - с июня по август 1998 г Пробы для химического и микробиологического анализа отбирали один раз в месяц Результаты двух полевых испытаний представлены в таблице 5

ю

Таблица 5

Деструкция ПХБ на полевых участках № 1 и №2 _

ВАРИАНТ СРОК ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ, МЕСЯЦЫ Деструкция ПХБ,%

0 ПХБ, мг/кг 1 ПХБ, мг/кг 2 ПХБ, мг/кг 3 ПХБ, мг/кг

Загрязненная ПХБ почва, контроль 49,0±10,1 И 196±20,4 49,6±10,9 и 200±31,1 47,0±11,3 и 198±32,7 45,0±10,8 и 195±24,1 6,5 и-

Почва+Alcaltg enes latus шт ТХД-13 - 43,7±9,7 и 103±20,4 22,4±3,1 и 98±11,7 10,8±2,2 и 94±10,5 76,4 и 52

Почва+Hanse nula cahfomica шт AT - 21,8±4,5 и 145±19,6 16,1 ±3,5 И 111±10,4 5,1±0,8 и 85±8,7 88,9 и 57

Проведенные деляночные испытания показали, что выбранные нами штаммы микроорганизмов in situ активно разлагают ПХБ в полевых условиях Как на участке с уровнем ПХБ 49 мг/кг, так н на участке 196 мг/кг уровень разложения ПХБ сопоставим Это свидетельствует о возможности отобранных штаммов микроорганизмов-деструкторов разлагать ПХБ в почве в довольно широких пределах концентрации ксенобиотика

Биотестирование на интегральную токсичность было проведено для оценки степени обшей токсичности почвы до, и после проведения эксперимента по деградации ПХБ микроорганизмами-деструкторами, так как зачастую продукты распада ксенобиотиков бывают токсичнее исходного соединения Разработка критериев и норм загрязненности почвы ПХБ. Для изучения критериев загрязненности земель ПХБ на животных-биотестах проводили эксперименты с использованием почв, искусственно загрязненных ПХБ в концентрациях от 1 до 12 мг/кг почвы Концентрация ПХБ в почве, вызывающая гибель 50 % дафний (LDso) составляла 2,7 мг/кг Следовательно, причконцентрации ПХБ в почве >2,7 мг/кг почва считается токсичной, тк вызывает гибель более 50 % тест-животных Биотестирование на аквариумных рыбах и дождевых червях показывало, что они в 2-3 раза устойчивее к наличию в почве хлорорганических соединений, чем дафнии Таким образом, был сделан вывод, что наиболее удобным и чувствительным биообъектом для оценки загрязненности почвы ПХБ являются дафнии

и

Определение острой токсичности почвы. Для определения наличия острого токсического действия в водной вьгтяжке, полученной из почвы, загрязненной ПХБ, ее тестировали без разбавления. Исследования показали, что почва в данном районе сильно загрязнена ПХБ и оказывает выраженное токсическое действие на животных. Особенно'загрязнен участок вдоль р. Боровлянка.

Определение острой токсичности почвы после воздействия микроорганизмов-деструкторов ПХБ. Результаты биотестирования проб почв, обработанных микроорганизмами-деструкторами, представлены в таблице 6.

Таблица 6

Интегральная токсичность почвенных проб для Dafnia maffia (%погибших) с ,

участков № 1 и №2

Проба Исходи ый уровень 1 месяц 2 месяц 3 месяца

S4/S9 Загрязненная ПХБ почва, контроль 100 и 100 100 и 100 100/100 100/100

35/60 Почва +■ Alcaligenes latus шт. ТХД-13 100 и 100 75±1,6 и 79±3,8 73±2,1 И 67±3,6 70±1,4 И 69±1,4

56/61 Почва + Hansenula califomica шт. AT 100 и 100 76±2,7 И 76±6,6 75±1,6 и 68±5,7 77±4,9 И 70*1,9

Как видно из полученных данных, при сравнении процентов гибели дафний в почвах, до и после обработки микробными деструкторами ПХБ, наблюдалось • понижение токсичности почвы после обработки микроорганизмами. Данные эксперимента свидетельствуют об уменьшении общего количества ПХБ в почве в результате рекультивации ' и низкой токсичности продуктов их разложения.

Токсичность почв для теплокровных животных, до и после обработки их Микроорганизмами-деструкторами. определяли методом длительного выпаивания водного экстракта загрязненной почвы теплокровным лабораторным животным - белым крысам. Эти биообъекты наиболее чувствительны к ПХБ. По окончании эксперимента у животных брали пробы крови для проведения морфологического и биохимического анализа, а также кусочки внутренних органов для патоморфологического анализа.

Критериями загрязненности почв ПХБ являлась специфическая патологоанатомическая картина,- наблюдаемая в органах теплокровных животных. У крыс, подвергшихся действию сублетальных доз ПХБ, картина его токсического действия на самцов и самок одинакова: основными органами-

мишенями являются печень и почки, в паренхиме которых возникали дистрофические изменения и гемодинамические нарушения

Оценка токсичности почвы с опытного участка до рекультивации. Обобщая результаты исследования хронической токсичности почвы для теплокровных животных перед внесением микроорганизмов-деструкторов, следует отметить, что общими моментами проявления токсического действия ПХБ является снижение общей резистентности организма в связи с уменьшением количества лейкоцитов в крови и влияние на ферментативную активность печени Однако, наибольшее значение имеет гонадотоксическнй эффект, поскольку его последствия сказываются на развитии потомства в эмбриональном и постэмбриональном периодах жизни и, возможно, на последующих поколениях В этом и заключается наибольшая опасность токсического действия ПХБ для человека

Результаты эксперимента по действию водного экстракта почвы с загрязненных ПХБ участков земли Серпуховского завода "Конденсатор" на основании изменения отдельных показателей, позволяют заключить, что выявленное токсическое влияние на печень непосредственно связано с действием ПХБ

По окончании эксперимента у животных были взяты пробы крови и аликвоты внутренних органов Исследование периферической крови выявило статистически достоверное уменьшение общего количества лейкоцитов (лейкопению), увеличение содержания эозинофилов и палочкоядерных лейкоцитов у крыс, получавших экстракт почвы в разведении 1 1 У всех подопытных групп животных отмечалось статистически достоверное повышение активности аланинаминотрансферазы и, кроме того, у группы, получавшей экстракт почвы в разведении 1 1 - повышение активности аспартатаминотрансферазы Это свидетельствует о наличии токсического влияния ПХБ, содержащихся в экстракте почвы, на гепатоциты, увеличение селезенки у данной группы крыс согласуется с изменением морфологического состава крови и является результатом интоксикации

При проведении паггоморфологического анализа изучались микроскопические препараты легких, сердца, печени, селезенки, почек, надпочечников, тонкого кишечника, мочевого пузыря и семенников Из всех исследованных органов патологические изменения были выявлены только в семенниках При этом характер этих нарушений имел четко выраженную дозовую зависимость У животных, получавших экстракт почвы в разведении 1 5, наблюдали увеличение просвета семенных канальцев за счет атрофии слоя сперматошггов 2-го порядка при явлениях дистрофии сперматоцитов 1-го порядка и сперматогоний У животных, получавших экстракт почвы в разведении 1 1, частично сохранены лишь сперматогонии В целом.

описываемая картина является следствием процесса атрофии, вызванной действием ксенобиотиков, содержащихся в экстракте почвы. При этом в обоих случаях процесс сперматогенеза, естественно, сокращен. У животных, получавших экстракт почвы в разведении 1:25 гонадотоксический эффект не был обнаружен. ■ ■■..'.*

Результаты исследования; хронической токсичности ПХБ для теплокровных животных при их поступлении в организм с питьевой водой, следует отметить наличие влияния ПХБ на морфологический состав периферической крови, ферментативную активность1 печени. Однако наибольшее диагностическое значение имеет гонадотоксический эффект, наблюдавшийся у животных, получавших экстракт почвы в разведениях 1:1 и 1:5. -.* - ' ""' :/,< : - -

Исследование хронической токсичности санированной почвы. Для установления уровня токсичности почвы, после обработки - ее микроорганизмами-деструкторами были проведены исследования проб поЧЬы с полигона после окончания цикла биоремедиации.

Условия проведения эксперимента аналогичны предыдущему. В результате проведенных исследований не установлено изменений в морфологическом составе' и биохимических показателях крови. При патологоанатомическом исследовании микроскопическая структура органов соответствовала нормальной. Проведенными исследс^ЗЬтями установлено снижение токсического действия водного экстракта санированной почвы на экспериментальных животных: , * . . 1 , '

Это может служить свидетельством уменьшения общего количества ПХБ и продуктов их распада в почве до'нетоксических концентраций. ВЫВОДЫ И ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА САНАЦИИ На основании проведенных исследований нами сделано заключение, что для санации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами, in situ, с высокой эффективностью , может быть - использовано внесение микроорганизмов-деструкторов.' ; ' ,/

Составлено методическое руководство по их. использованию для детоксикации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами. v

Разработана принципиальная схема микробиологической.санации почв, загрязненных ПХБ, (рисунок 1). , . , . '

. ' ■ .. \ '' :■' У " •

Рис 1 Принципиальная схема биоремедиации почв загрязненных ПХБ при помощи микроорганизмов-деструкторов

выводы

1. Проведен поиск на загрязненных территориях микроорганизмов, способных разлагать в почве ПХБ. Выделены из почв и охарактеризованы 18 штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ.

2. Наиболее эффективными оказались штаммы деструкторов ПХБ бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT. Они депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В - 7505, Y- 2284. На них получены две международные патентные заявки по системе РСТ и оформляются два патента Российской Федерации. В полевых опытах установлено, что степень дЙструкции ПХБ микроорганизмами в почве in situ составила для Alealigenus latus ТХД-13 от 52 % до 78 %, для Hansenula californica AT от 60 % до 90 %.

3. Токсикологические испытания бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT показана их безопасность для теплокровных животных по показателям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах белых мышей. Эти микроорганизмы пригодны для использования при биоремедиации почв in situ.

4. Интродукция штаммов бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT в почву не оказывает существенного влияния на численность почвенной микрофлоры. В течение трех месяцев их численность неуклонно снижается с 10& до 104 КОЕ/г почвы для Alealigenus latus ТХД-13 и для Hansenula californica AT с I05 до 10' КОЕ/г почвы, достигая минимального уровня к концу 3 месяца.

' 5. Оптимальная концентрация суспензии микроорганизмов, вносимых в почву, загрязненную полихлорированными бифенилами, составляет: для Alealigenus latus ТХД-13 - 107 кл./мл, для Hansenula californica AT - 106 кл./мл. Норма расхода микробной суспензии составила 1 л/м2 почвы. При температуре воздуха 20-30°С и влажности почвы 60-80% достигается максимальная степень деструкции ПХБ в почве. V

6. Оценена интегральная токсичность почвы, до и после проведения полевого эксперимента, методом биотестирования и показано снижение интегральной токсичности почвы в процессе биоремедиации. Для почв, обработанных Alealigenus latus ТХД-13, интегральная токсичность снизилась в течение трех месяцев со 100 до 69 %, для Hansenula californica AT со 100 до70%.

7. Токсикологическая оценка рекультивированной почвы, проведенная на белых крысах, показала отсутствие выраженных патологических изменений в органах и крови лабораторных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Жариков Г А., Боровик Р В , Капранов В В Интегрированная система рекультивации земель, загрязненных полихлорбифенилами // Тез дохл I Всерос конф токсикологов "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии", С -Петербург, 1995 г - с 18

2 Жариков Г А, Капранов В В , Боровик Р В , Дядищев Н Р Разработка биотехнологии интенсивной санации земель, загрязненных полихлорбифенилами //Тез докл научно-техл семинара "Защита окружающей среды от загрязнений промышленного и сельскохозяйственного производства", Афины, Греция, 1997 г - М 1997 - с 48-49

3 Марченко А.И, Жариков Г А., Капранов В В , Воробьев А В , Дядищев Н Р, Боровик Р В Влияние полихлориро ванных бифенилов (ПХБ) на биологическое состояние дерново-подзолистой почвы - - Афины, Греция, 1997 г -М. 1997 -с 50-51

4 Капранов В В , Жариков Г А, Успенская С Н, Дядищев Н Р Использование микроорганизмов-деструкторов для санации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами // Тез докл междунар научно-практической конференции, 1997 -Пенза, 1997 -с 170-173

5 Жариков Г А, Марченко А И, Рыбалкин С П , Капранов В В , Дядищев Н Р, Боровик Р В Изучение токсического действия полифенилов на биологическую активность дерново - подзолистых почв - Токсикологический вестник, 1997, №4, с 7-10

6 Zhankov G А, Borovick R V, Dyadischev N R , Kapranov V V, Kjselyova NI, Dyadischeva V P, Aldobaev V N, Development of Biotechnology for Detoxification of Soils Polluted with Polyphenyls // Symposium "Dioxin - 97", USA, Indianapolis, August 25-29,1997)- Organohalogen Compounds, 1997, Vol 31, p 316-319

7 Жариков Г А., Капранов В В, Рыбалкин С П, Боровик Р В , Дядищев Н Р Использование микроорганизмов-деструкторов для санации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами — Лозанна, Швейцария, 1998 г - Москва, 1998 - с 26-27

8 Дядищев Н Р, Рыбалкин С П, Онацкий Н М, Марченко А И, Жариков Г А, Капранов В В Токсикологическая оценка эффективности биологического метода рекультивации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами (ПХБ) - Лозанна, Швейцария, 1998 г - Москва, 1998 - с 29

9 Боровик Р В , Дядищев Н Р , Киселева Н И, Капранов В В , Дядищева В Жариков ГА Опыт использования биологических методов для санации земель, загрязненных токсичными химическими веществами и радионуклидами// Труды научи -практ конф .посвященной 50-летию

Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве РФ,-М:, 1998, с. 206-207

10. Боровик Р.В., Дядищев Н.Р., Жариков Г.А., Киселева Н.И., Капранов

B.В.,Рыбалкин С.П.,Вареник В.И.ДСовалев В.П. Ecologically safe Technology for Bioremediation of Soils polluted by toxic chemical substances// Abs. Workshop "Environmental Aspects Converting CW Facilites to Peaceful Purpose and Derevative Technologies in Modeling, Medicine and Monitoring". - Spiz, Switzerland, 1999.

11. Жариков Г.А., Боровик P.B., Дядищев H.P., Капранов В.В., Киселева Н.И, Ковалев В.П., Дядищева В.П., Рыбалкин CXL. Алдобаев В.Н., Марченко А.И. Экологически безопасные биотехнологии переработки промышленных органических отходов и биоремедиации почв, загрязненных токсичными химическими веществами и радионуклидами // Стендовое сообщение на . Германо-российской рабочей встрече ' биотехнологов и конференции "DECHEMA", Висбаден, Германия, 1999.

12. Международная заявка на патент РСТ - RU/98/00036

13. Международная заявка на патент РСТ - RU/98/00037

14. Жариков Г.А., Капранов В.В., Рыбалкин С.П. Биоремедиация почв загрязненных полихлорированными бифенилами// Проблемы, медицинской и экологической биотехнологии. - Оболенск, 1999г. - с. 175.

15. Жариков Г.А., Капранов В.В., Михина Л.В., Гольцсв И.А., Мельников

C.В., Рыбалкин С.П. Оценка - безвредности для тепло1фовных животных штаммов микроорганизмов деструкторов полихлорированных бифенилов// Проблемы медицинской и экологической» биотехнологии. - Оболенск, 1999г. -с. 176. ' v

Объем 1 25 п л

Заказ 76

Тираж ЮЭ

Типография Издательства МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул, д 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Капранов, Владимир Владимирович

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Химико-токсикологическая характеристика ПХБ.

1.2 Метаболизм ПХБ микроорганизмами-деструкторами

1.3 Детоксикация почв, загрязненных ПХБ, с помощью физико-химических 13 методов.

1.4 Микробная деградация ПХБ в почве.

1.4.1 Активизации естественной микрофлоры почвы.

1.4.2 Интродукции штаммов микроорганизмов-деструкторов

ПХБ в почву. ' •!*- '.

1.4.3 Выделение микроорганизмов-деструкторов ПХБ из почв.л.:.'.:. К.

1.4.4 Изучение безопасности микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных.

1.4.5 Технологии биоремедиации почв, загрязненных ПХБ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микроорганизмы деструкторы полихлорированных бифенилов"

Поколение людей, живущих на Земле сегодня, не должно удовлетворять свои нужды за счет лишения будущих поколений возможности жить на чистой планете. Люди в своей хозяйственной деятельности все больше и больше используют различные вещества, искусственно созданные ими - ксенобиотики, которые вследствие деятельности человека непрерывно поступают в окружающую среду, загрязняя ее.

Одними из самых опасных веществ искусственного происхождения являются стойкие хлорорганические соединения. В природных условиях они практически не подвергаются распаду из-за своей высокой устойчивости к химическому, биологическому и фотолитическому разложению. Распространяясь по планете благодаря их широкому использованию в промышленности, сельском хозяйстве и вследствие своих физико - химических свойств эти стойкие органические соединения наносят ущерб здоровью людей даже там, где они не применялись. Контроль над распространением этих загрязнителей, их запрет, и уничтожение являются одной из приоритетных задач мирового сообщества.

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относятся к токсичным хлорорганическим соединениям, диоксиноподобным веществам первой группы опасности /7,54/. Они входят, по списку 1ЖЕР, в "черную дюжину" наиболее стойких и опасных органических загрязнителей, угрожающих окружающей среде планеты.

ПХБ производились с 30-х годов и нашли свое применение, в основном, в электротехнической промышленности. Естественного образования их в окружающей среде не установлено /36/. ПХБ, вследствие своей токсичности и сспособности к биоаккумуляции, с 1978 года запрещены к широкому применению в промышленности, за исключением эксплуатации уже выпущенных трансформаторов и конденсаторов.

ПХБ - политропные яды, поражающие практически все органы и системы организма, данные ВОЗ свидетельствуют, что наиболее чувствительным к ним является человек. Поэтому с начала 80-х годов производство этих опасных соединений свернуто. Сейчас ведутся работы по их планомерному уничтожению, но проблема ПХБ, попавших в окружающую среду, так и остается нерешенной ввиду их очень высокой химической и биологической инертности /36, 54/.

В настоящее время очистка почв, загрязненных ПХБ, ведется физико-химическими методами, что приводит к неблагоприятному изменению свойств почв и к возникновению их вторичных загрязнений /36,54/. Альтернативным способом является метод микробной деградации ПХБ, который позволяет не только понизить концентрацию ПХБ в почве, но и свести к минимуму ущерб для окружающей среды.

Целью исследования является разработка метода микробной деструкции полихлорбифенилов в загрязненных почвах in situ.

Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделить из загрязненных почв и идентифицировать штаммы микроорганизмов, разлагающие полихлорбифенилы.

2. Провести токсикологические испытания выделенных штаммов микроорганизмов на безопасность для теплокровных животных.

3. Найти оптимальный температурный интервал и определить наиболее эффективную концентрацию вносимой микробной суспензии при проведения микробиологической деструкции ПХБ в почве.

4. Изучить динамику содержания микроорганизмов- деструкторов ПХБ в почве и их взаимоотношение с естественной почвенной микрофлорой.

5. Провести полевые испытания разработанного метода биоремедиации на участках почвы, подвергшихся длительному и массированному загрязнению ПХБ.

6. Сравнить токсичность почвы, загрязненной ПХБ, до и после проведения биоремиднации, для теплокровных животных и дафний.

На защиту выносится: Система мероприятий по экологически безопасной санации in situ загрязненной полихлорированными бифенилами почвы с помощью микроорганизмов-деструкторов.

Научная новизна:

1. Разработан метод санации почвы in situ с помощью микроорганизмов-деструкторов ПХБ Alcaligenes latus TXD-13 и Hansenulla californica AT.

2. Впервые показано, что доя деструкции ПХБ могут быть использованы дрожжи Hansenulla californica, способные активно разлагать эти ксенобиотики.

3. В полевых условиях изучено взаимоотношение микроорганизмов-деструкторов ПХБ и аборигенной почвенной микрофлоры.

4. Предложена методика определения токсичности почв в процессе микробиологической санации с помощью животных-биотестов.

Практическая ценность: 1. Организован музей микроорганизмов-деструкторов ПХБ. Штаммы Alcaligenes latus TXD-13 и Hansenulla californica AT Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В 75-05 и Y

2284. На них получены две международные патентные заявки PCT/RU 98/00036 и PCT/RU 98/00037 соответственно и оформляются два патента Российской Федерации.

2. На основании исследований в лабораторных и полевых условиях разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для детоксикации почв, загрязненных ПХБ.

Работа проводилась по контракту с Японской корпорацией Toyta Motors, а также в рамках научных исследований по проекту № 228 Международного Научно-технического Центра, совместно с фирмами Heuro. GR - Германия, Osis Project - США, Biotec Engineering LTD -Великобритания.

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на конгрессах, научных и научно-практических конференциях в России, США, Германии, Швейцарии, опубликованы в итоговом сборнике "Труды научно-практической конференции, посвященной 50-летию Федерального Управления Медбиоэкстрема", журнале "Токсикологический вестник", оформлены в виде международных патентных заявок РСТ, патентов Российской Федерации, 2 лабораторных регламентов, отчетов к проекту № 228, методик. Всего по теме диссертации опубликовано 16 работ.

Автор сердечно благодарит академика РАСХН, профессора, доктора биологических наук М.С. Соколова, профессора, доктора ветеринарных наук Р.В. Боровика за помощь в разработке направлений исследований и обсуждении концепции диссертации. Автор благодарит кандидата биологических наук С.П. Рыбалкина с сотрудниками, кандидата биологических наук А.И. Марченко, научных сотрудников В.А. Блохина, В.Н. Алдобаева, сотрудников НИЦТБП, оказавших методическую помощь в выполнении отдельных этапов исследований.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Капранов, Владимир Владимирович

ВЫВОДЫ:

1. Проведен поиск на загрязненных территориях микроорганизмов, способных разлагать в почве ПХБ. Выделены из почв и охарактеризованы 18 штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ.

2. Наиболее эффективными оказались штаммы деструкторов ПХБ бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansemila californica. AT. Они депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В - 7505, Y- 2284. На них получены две международные патентные заявки по системе РСТ и оформляются два патента Российской Федерации. В полевых опытах установлено, что степень деструкции ПХБ микроорганизмами в почве in situ составила для Alealigenus latus ТХД-13 от 52 % до 78 %, для Hansenula californica AT от 60 % до 90 %.

3. Токсикологические испытания бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT показана их безопасность для теплокровных животных по показателям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах белых мышей. Эти микроорганизмы пригодны для использования при биоремедиации почв in situ.

4. Интродукция штаммов бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT в почву не оказывает существенного влияния на численность почвенной микрофлоры. В течение трех месяцев их численность неуклонно снижается с 106 до 104 КОЕ/г почвы для Alealigenus latus ТХД-13 и для Hansenula californica AT с 105 до 103 КОЕ/г почвы, достигая минимального уровня к концу 3 месяца.

5. Оптимальная концентрация суспензии микроорганизмов,вносимых в почву, загрязненную полихлорированными бифенилами, роставляет: для

Alcaligenus latus ТХД-13 - 107 кл./мл, для Hansenula californica AT - 106 кл./мл. Норма расхода микробной суспензии составила 1 л/м2 почвы. При температуре воздуха 20-30°С и влажности почвы 60-80% достигается максимальная степень деструкции ПХБ в почве.

6. Оценена интегральная токсичность почвы, до и после проведения полевого эксперимента методом биотестирования и показано снижение интегральной токсичности почвы в процессе биоремедиации. Для почв, обработанных Alcaligenus latus ТХД-13, интегральная токсичность снизилась в течение трех месяцев со 100 до 69 %, для Hansenula californica AT со 100 до70%.

7. Токсикологическая оценка рекультивированной почвы, проведенная на белых крысах, показала отсутствие выраженных патологических изменений в органах и крови лабораторных животных.

Заключение

В результате наших лабораторных и полевых экспериментов из загрязненных почв, находящихся в районе Серпуховского завода "Конденсатор", выделены природные штаммы микроорганизмов, способные разлагать ПХБ. Проведена их идентификация, организован банк штаммов выделенных микроорганизмов-деструкторов полихлорбифенилов.

Проведены токсикологические исследования и выбраны штаммы микроорганизмов-деструкторов, безопасные для человека и теплокровных животных, при этом учитывались следующие показатели: уровень средних летальных доз микроорганизмов при различных путях введения лабораторным животным (LD50); токсичность (наличие эндотоксинов, гибельных для лабораторных животных при определенных уровнях доз); токсигенность (наличие экзотоксинов, выделяемых в окружающую среду); диссеминация (способность микроорганизмов распространяться в организме теплокровных животных и персистировать в течение длительного времени.)

Жесткие критерии отбора, регламентированные общегосударственными методическими требованиями, из общего числа исследованных штаммов позволили охарактеризовать в качестве безвредных всего лишь два микроорганизма-деструктора ПХБ, являющиеся дрожжами Hansenula californica AT и бактериями Alcaligenes latus ТХД-13. Штаммы не вирулентны - LD50 для мышей и крыс

7 Q превышает 10 кл. при внутрибрюшинном введении и 10 при внутрижелудочном. На основании результатов проведенных исследований указанные штаммы могут быть отнесены к IV классу опасности микроорганизмов (малоопасные). Это позволяет использовать их без ограничений в окружающей природной среде в качестве биодеструкторов ПХБ.

Выбранные и охарактеризованные нами штаммы (Hansenula californica AT и Alcaligenes latus ТХД-13) депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (приложение 6,7) и на них оформлены 2 международные заявки РСТ (приложение 4,5).

Определен уровень разложения ПХБ в почве микроорганизмами-деструкторами, условия влияющие на этот процесс. Максимальный уровень разложения ПХБ наблюдается при температуре 20 - 30° С, влажности почвы 60 - 80 % и посевной дозе микроорганизмов 1 литр на 1 м 2 при концентрации микробной суспензии 107 клеток/см3 для бактерий Alcaligenes latus, а для дрожжей Hansenula californica — 105 клеток/см3.

Проведенные полевые испытания показали, что выбранные штаммы микроорганизмов активно разлагают ПХБ, находящиеся в почве в различных концентрациях.

После рекультивационных мероприятий с внесением в почву микроорганизмов-биодеструкторов, было проведено изучение токсичности водного экстракта почвы на лабораторных животных. Результаты исследований показали значительное снижение токсического действия экстракта почвы на теплокровных животных. Морфологические и биохимические показатели крови крыс соответствовали физиологической норме и не отличались от таковых у животных контрольной группы, гонадотоксический эффект отсутствовал.

Таким образом, предлагаемый биологический метод рекультивации почв с использованием микроорганизмов-биодеструкторов может быть признан потенциально безопасным. В пользу этого свидетельствует ряд фактов:

1. культура микроорганизмов вносится в почву в концентрациях (10 -10 кл/мл), значительно уступающих испытанным на животных (109 кл/мл);

2. почва является естественной средой обитания данных микроорганизмов, на основании чего можно сделать заключение о невозможности изменения их свойств (патогенности) в процессе рекультивационных мероприятий;

3. в процессе санации происходит снижение численности интродуцированных микроорганизмов в почве до исходного уровня вследствие установления межвидового равновесия;

4. при внесении микроорганизмов-биодеструкторов происходит снижение уровня ПХБ в почве до относительно низких концентраций, не оказывающих общетоксического действия на организм теплокровных животных;

5. в результате жизнедеятельности микроорганизмов не происходит образования и накопления в почве токсических продуктов распада исследуемых ксенобиотиков.

На основании проведенных исследований нами сделано заключение, что для санации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами, in situ, с высокой эффективностью может быть использовано внесение в почву микроорганизмов-деструкторов. Составлено с учетом полученных экспериментальных данных методическое руководство по использованию микроорганизмов-деструкторов для детоксикации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами (приложение 3).

Разработана принципиальная схема микробиологической санации почв, загрязненных ПХБ, (рисунок 13)

МОНИТОРИНГ ЗЕМЕЛЬ НА ИНТЕГРАЛЬНУЮ ТОКСИЧНОСТЬ

ШТАММ МИРООРГАНИЗМА- 4,

ДЕСТРУКТОРА ИЗ МУЗЕЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

УРОВНЯ И ГРАНИЦ

ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПХБ

НАРАБОТКА БИОМАССЫ

МИРООРГАНИЗМА-ДЕСТРУКТОРА

ПХБ

1 ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ

ОБРАБОТКА УЧАСТКА

4,

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕЙ ВНЕСЕНИЕ

СУСПЕНЗИИ МИРООРГАНИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ

ДЕСТРУКТОРОВ ПХБ

ПРОВЕДЕНИЕ

КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ <— БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ

БИОРЕМЕДИАЦИИ

ОФОРМЛЕНИЕ ПАСПОРТА НА САНИРОВАННЫЙ УЧАСТОК

Рис 13. Принципиальная схема биоремадйации почв загрязненных ПХБ при помощи микроорганизмов-деструкторов

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Капранов, Владимир Владимирович, Серпухов

1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - 180с.

2. Безвредная и эффективная очистка почвы // Земледелие. 1991.-№9.-77 с.

3. Бобовникова Ц.И. и др. // Гигиена и санитария. 1988. -№7.- С.4-8.

4. Всемирная организация здравоохранения. Бюллетень. -Женева .: 1981.Т. 59. № 6.- С. 20-27.

5. Всемирная организация здравоохранения. Полихлорированные бифенилы и терфенилы. Доклад. Женева .: 1980.-83 с.

6. Всесоюзная научная конференция. "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущино, 20-24 января 1992 г. Пущино, 1992.-С. 14-15.

7. Вредные химические вещества Л.: Химия, 1993. Т 6. С. 56-61.

8. Герхардт. Ф. и др., Методы общей бактериологии М.:-Мир 1983. 405с.

9. Добровольская Т. Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В., Методы выделения и идентификации почвенных бактерий.-Московский Университет.-1989. 35с.

10. Ю.Звягинцев Д.Г., Методы почвенной микробиологии и биохимии М.: Московский Университет.-1991. 304 с.

11. П.Звягинцев Д.Г., Почва и микроорганизмы- М.: Московский Университет 1987. 256с.

12. Карасевич Ю.Н., Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения- М.: -Наука.-1982. 144с.

13. Материалы зональной конференции молодых ученых-биологов. Актуальные проблемы современной биологии-Казань, 1989. С.64-70

14. Н.Методические указания. Минздрав СССР. №-№ 4263-87, 2620-82. 63с.

15. Методическое руководство по биотестированию почвы / Мособлкомприрода, вх. № 621 от 08.08.95. Серпухов, Архив НИЦТБП, 1994-13 с.

16. Методические указания по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и растений и болезней на основе неспоровых микроорганизмов №2620-82-Киев. 1982 23с.

17. Набока М.В. Об использовании биотестирования в гигиенической оценке качества воды // Гигиена и санитария. -1993.-№6.-С. 75-76.

18. Новые способы очистки почвы // Земледелие. 1992. - № 4.- 18с.19.0ксенгендлер Г.И., Яды и организм. Проблема химической опасности Санкт-Петербург. Наука, 1991. - 319 с.

19. Очистка почвы на территории промышленных предприятий. Usine nouv., 1990, № 2294, с. 86-87.

20. Патент № 52259 Япония, В 461004516. Способ получения оптически активного альфа-фенилэтилового спирта путем культивирования микроорганизмов рода Pseudomonas на питательной среде, содержащей ПХБ.- 10.02.86.

21. Патент №162766, Япония, А 23030682 Метод получения метана из соединений бифенила.-08.02.91.

22. Патент № 453895, США, А 4981793. Биологический и химический способ гидроксилирования 4-замещенных ПХБ и продукты, полученные этим способом. 12. 20. 1989 31

23. Патент №53822, Япония, В 456017919. 5 -бензоилфталовая кислота, ее производные фи-формы и способ их получения. 24.04 81.

24. Патент №162765, Япония, А 30306773. Новый ген bph а, b,c,d, имеющий функции метаболизма ПХБ и новая бактерия несущая этот ген. -08.02.91.

25. Патент №4,843,007,США, Alcaligenes eutropis for biodégradation PSB. Jun.27,1989.

26. Почвы. Общие требования к отбору проб // ГОСТ 17.4.3.01 -83 (CT СЭВ 3847 82).- М., 1984. - 4 с.

27. Практикум по микробиологии. -Московский Университет.-1976. 307 с. 40.

28. Рацион кормления .-Приказ Минздрав СССР № 755 от 12.08.1977 г. 85с.

29. Прядко А.Л., Оконский А.И., ВеличкоВ.А., Черников В. А. Эколого-гигиеническая оценка промышленных отходов -химических мелиорантов почв // Известия Тимирязевской Сельскохозяйственной Академии. 1996. - Выпуск 4. - С. 107— 115.

30. Соколов М.С., Монастырский O.A., Пикушова Э.А. Экологизация защиты растений. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1994 г.-462 с.

31. Сурнина Н.Н, В.В. Тарасов. Некоторые аспекты загрязнения внешней среды полихлорированными бифенилами и терфенилами // Журнал экологической химии. -1991. С. 5-20.

32. Справочник. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания , кормах и окружающей среде. -М.: -Агропромиздат Т. 2. 1992. 416 с.

33. Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).- Минздрав СССР.- 06.07.1973 г. 65с.

34. Тарасов В.В. Загрязнение окружающей среды полихлорированными бифенилами и пути минимизации их воздействия. // Сборник научных трудов РХТУ LXXV лет/ Основные достижения в науке. М.: 1996. - С. 24-41.

35. Токсичность полихлорбифенилов и проблема их промышленного использования. Гражданская оборона ,- 1986. 284с.

36. Харченко А.Т. и др .Российский химический журнал. 1993. T.XXXVII. №3. С.40-43.

37. Abramowicz D.A. Aerobic and anaerobic biodégradation of PSBs: a review / CRC Critical Reviews in Biotechnology, 1990, vlO, p 241-250.

38. Ahmed M- and D.D. Focht. Degradation of polychlorinated biphenils by two species of Achromobacter / Can. J. Microbial., 1973, vl9,p 47-52.

39. Bedard D.L., Wagner R. E., Brennan M.J., Haberl M.L., Brown J. F. Extensive degradation of Aroclors and environmentally transformed polychlorinated biphenyls by Alcaligenes eutrophus Н850/ Appl. Environ. Microbiol., 1987, v 53 p 11031112.

40. Bedard D.L., Wagner R. E., Brennan M.J, Haberl M.L., Brown J. F. Extensive degradation of Arochlors and environmentally transformed polychlorinated biphenyl by Alcaligenes eutrophus U1850/ Appl. Environ. Microbiol., 1987, v 54 pi094-1102.

41. Bedard D.L., Untcrman., Bopp L.H., Brennan M.J. Extensive degradation of polychlorinated biphenyl Afoclois and environmentally transformed polychlorinated biphenyl by Alcaligenes eutrophus FV50/ Appl. Environ. Microbiol, 1986, v51: p761-768.

42. BergeyAs manual determinative bacteriology. T.S. Williams, Gibbons N. E. (Eds.). Baltimore, 1994. Vol. 4.

43. Bridges O., Bridges J., Losing V., Hope M. The environment and health in Russia. Alddershot Brookfield/ Hong Kong. - Singapore Sydney. - 1996. - 266 p.

44. Deckwer W.-D. Weppen P. Обзор технологий по санации загрязненной почвы и заброшенных территорий, загрязненных вредными отходами. Chemie-Ingenieur-Technik., 1987, Vol. 59, p. 457-464.

45. Evans В.S., Dudley C.A., Klasson KT. Sequential Anaerobic- Aerobic Biodegradation of PSB in Soil Slurry Microcosms/ Applied Biochemistry and Biotechnology, 1996, v 57-8, Iss SPR, p 885-894.

46. Harkeness M.R., and all. In situ stimulation of aerobic PCB biodégradation in Hudson River sediments / Science, 1993, v. 259, #22, p. 503-507.

47. Haddoc J.D., Horton J.R., Gibson D.T. Dihydroxylation and dechlorination of chlorination biphenilus by purifield biphenil 2,3 dioxygenases from Pseudomonas sp. LB 400 / J. Bacteriologi, 1995, # 177, p. 20-26.

48. Kreger-van Rij N. J. W. (ed.) The yeasts. A taxonomic stady. 3d. Elsevier, 1984.

49. Pfieger-Bruss S., Hanf V., Behnisch P., Hagenmaier H., Rune G. M. Effect of PSBs on spermatogenesis/ Lancet, N8981, p. 1040-1041.

50. Schöndorf T., Münz K.H. Удаление полихлорированных бифенилов из загрязненной почвы. Chem. Rosch. (Schweiz.), 1988, v. 41, №45, s. 18.

51. UNEP. Субрегиональное совещание по выявлению и оценке выбросов стойких органических загрязнителей. Санкт-Петербург.: 1997. - 288 с.

52. UNEP. Inventory of wold-wide РСВ destruction capacity. First Issue. 1998, s 85.