Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Методы получения трансгенных растений картофеля с использованием штаммов Agrobacterium, несущих гены устойчивости к болезням и вредителям

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Методы получения трансгенных растений картофеля с использованием штаммов Agrobacterium, несущих гены устойчивости к болезням и вредителям"

На правах рукописи

Р Г 5 ОД

. 9 ИЮЛ Ш7

КОМАЛЕТДИНОВА Фарида Мансуровна

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММОВ АСНОВАСТЕМиМ, НЕСУЩИХ ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНЯМ И ВРЕДИТЕЛЯМ

Специальность: 06.01Л1 - зашита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Р. И. Высоцкая

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.М. Гаврилюк

кандидат биологических наук С. Л. Тютярев

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится "-3 "О?!997 года ь/З^йОШт. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу:

189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан " $ " 1997 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Картофель - одна из важнейших сельскохозяйственных культур. Болезни и вредители приводят к потере значительной части урожая, что наносит.большие убытки сельскому хозяйству. Введение в хозяйственную практику возделывания генетически однородных культур на больших площадях нарушает естественный баланс эволюции паразита и хозяина и приводит к возникновению массовых эпифитотий/ Вследствие этого весьма актуальной является проблема создания устойчивых к болезням и вредителям форм картофеля.

Генетическая инженерия - метод, осуществляющий перенос конкретных генов от одних организмов к другим. Он позволяет устранить репродуктивный барьер при переносе генсв между отдаленными видами. Преимущество генетической трансформации перед другими методами заключается в возможности вводить один или небольшую группу генов в растения, не нарушая других ценных признаков сорта. Процедуры генной инженерии включают в себя выявление и выделение полезного гена, клонирование выбор подходящего генетического вектора и встраивание в него этого гена, выбср оптимального метода трансформации, обусловленного как особенностями вектора, так и реципиента, выяснения эффективности экспрессии и влияние встроенного гена на растение и взаимодействующие с ним организмы.

Генетическая трансформация с помощью ssp. Agrobacterium -наиболее простой и эффективный способ введения чужеродной ДНК в клетки растения, не требующий сложного оборудования, так как в данном случае используются естественные природные векторы -бактерии рода Agrobacterium. Разработаны и разрабатываются новые методы трансгеноза. Конструируются самые разнообразные векторы для переноса полезных генов в растения, ведется поиск генов, кодирующих последовательности, вызывающие устойчивость к грибам, бактериям, л насекомым.

В настоящее время существуют векторные конструкции, несущие гены, обеспечивающие устойчивость растений к болезням и вредителям. Это конструкции с геном гамма-эндотоксина из Bacillus thurlnglensls, обеспечивающие устойчивость растений чешуекрылым, бетта-эндотоксина, обеспечивающие устойчивость к жесткокрылым вредителям, в том числе и к колорадскому жуку. Недавно были открыты небольшие (30-50 аминокислотных остатков) пептиды широкого фунгицидного и антибактериального действия. Выделенные из семян различных культурных растений. Эти белки

ингибируют рост грибов гораздо эффективнее, чем антигрибные хитин-байндирующие белки и при этом не токсичны для клеток млекопитающих (Broekaert et al., 1992). Методом ПЦР синтезированы гены предшественника фунгицидного пептида амаранта и зрелого пептида, определена их нуклеотидная последовательность (Лунин и др., 1996).

Одновременно исследователями ведутся поиски новых векторов для трансформации растений. Так , например, Шаденкозым и соавторами была создана новая оригинальная конструкция arpoбактериального вектора 3850 LGV ph22 кпео; в котором правая граница Т-ДНК BR и белок virD2, отвечающий за перенос Т-ДНК, заменены на oriT и белок гаоЬА плазмиды широкого круга хозяев RSF1010. В эту конструкцию был встроен ген устойчивости к биотическим стрессам kell под контролем 35s промотора (Шаденков и др. 1996).

Для создания форм и сортов картофеля, устойчивых к вредителям и болезням методами генетической инженерии, представляется исключительно важным изучение и отработка эффективных и быстрых методов трансформации картофеля. Поиск новых эффективных векторов, в частности изучение эффективности трансформации различных видов и форм растений в том числе и картофеля. Изучение возможности и эффективности трансформации картофеля штаммами , несущими бинарный вектор рН22Кпео, содержащий oriT-mob-систему плазмиды широкого круга хозяев RSF1010, 3850LGVpH22kneo в рамках поиска новых эффективных векторов для трансформации. Получение и изучение трансгенных растений картофеля, несущих гены устойчивости к болезням и вредителям, в том числе дельта-эндотоксинов и генов устойчивости к биотическим стрессам, обеспечивающими устойчивость к широкому кругу фитопатогенных грибов и бактерий.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось изучение и отработка методов быстрого и эффективного получения трансгенных растений картофеля, несущих бинарный вектор рН22Кпео, и гены Ас77 устойчивости к биотическим стрессам.

В задачи работы входило:

1.Сравнительная характеристика регенерационной способности сортов и линий картофеля, поиск сортов и линий с высоким регенерационным потенциалом.

2. Отработка оптимальных методов трансформации эксплантов

используемых сортов и линий картофеля.

3. Оценка эффективности трансформации сортов и линий картофеля штаммами Agrobacterlum гишеГас1епз и AgroЬacteriuш гМио£епез, несущими различные векторные конструкции.

4. Подтверждение трансгенной природы полученных регенерантов.

5. Опенка полученных трансгенных растений на устойчивость к фитофторозу.

Научная новизна и значимость работы. В работе исследованы и оптимизированы различные методы трансформации для сортов картофеля северо-западной зоны Изора и Лорх, сорта Адретта и дигаплоидной линии 59 (из коллекции института генетики устойчивости Германии): кокультивирования сегментов стебля, листовых дисков и сегментов микрсклубней с агробактериями, трансформации меристематической ткани пазушных почек и прединкубации эксплантов в растворах стимуляторов роста. Для используемых в работе сортов и линий выделены и модифицированы наиболее быстрые и эффективные методы: трансформация меристематической ткани пазушных почек и прединкубации в растворах стимуляторов роста.

Исследованы штаммы АвгоЬас1ег1ш, несущие бинарный вектор рН22Кпео, содержащий опТ-тоЬ-систему плазмиды широкого круга хозяев ¡^1010, 3850ЬСУрН22кпео и 3850ЬСУрН22Ас77. Полученные трансформанты эксплантов картофеля дигаплоидной линии 59 и сорта Изора показали, что эта векторная конструкция способна успешно встраиваться в геном картофеля.

Практическая ценность работы. В результате проведенных экспериментов отработаны и модифицированы методики прединкубации и трансформации меристематической ткани пазушных почек картофеля, позволяющие значительно ускорить получение трансгенных растений: трансгенные побеги получали уже через 1 месяц после трансформации, которые через 2 месяца укоренялись и могли развиваться самостоятельно.

Получены и поддерживаются трансгенные линии картофеля, которые можно использовать для дальнейших исследований.

Апробация работы. Результаты работы были.представлены на Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995); на научной конференции, посвященной актуальным проблемам биотехнологии в растениеводстве, ■ животноводстве и ветеринарии (Москва, октябрь 1996); на отчетной сессии ученого

совета ВИЗР (Санкт-Петербург, март 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 12Е страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована схемами, 21 таблицами и И фотографиями. Список литературы включает 110 наименований, из них 13 на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В нашей работе для трансформации картофеля былс использовано несколько штаммов Agrobacterlum tumefaciens v. Agrobacterium rhlzogenes, несущих маркерные и полезные гены. Все штаммы сконструированы в ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ( Москва ) и любезно предоставлены нам для проведения совместных исследований.

Это штаммы:

1. Agrobacterium tumefaciens 3850/pGV941, несущие маркерные гены устойчивости к антибиотикам

2. Agrobacterium rhizogenes, несущие ген дельта эндотоксине из В. thurlngiensls

3. Agrobacterium tumefaciens 3850LGVpH22kneo, несущий бинарный вектор рН22Кпео, содержащий orlT-mob-систему плазмидь широкого круга хозяев RSF1010

4. Agrobacterium tumefaciens 3850 LGVpH22 Ас77 г A.rhlzogenes A4 LGV рН22 Ас77 , несущие ген устойчивости к биотическим стрессам из амаранта.

Формы картофеля (S.tuberosum) представлены дигаплоидными линиями из генетической коллекции д-ра Г.Вентцеля из института генетики устойчивости в Германии; и сортми Северо-западной зоны: Лорх, Адретта и Изора. Растения поддерживали в условиях In vitro на среде MS (Murashlge and Skoog 1962) с добавлением 30 г/л сахарозы, при температуре 20-22 С и освещении 3000 люкс, размножали черенкованием и переносили на свежую среду каждые три-четыре недели.

Для трансформации зксплантов картофеля применяли кокультивирование агробактерий с эксплантами сегментов стеблей и микроклубней картофеля, трансформацию меристематической ткани пазушных почек и прединкубацию эксплантов в растворах

стимуляморов роста. Кокультивирование сегментов стеблей, листовых дисков и сегментов микроклубней с агробактериями проводили по модифицированной методике Дрейпера и соавторов (1991). Трансформацию меристематической ткани пазушных почек картофеля проводили по методике С.А.Дмитриевой (1991). а предварительную инкубацию эксплантов в растворах стимуляторов роста - на основе методик Hovenkamp-Hermellnk. (цит. по Visser et al., 1989) и Wenzler G.(1989).

В основу выделения и анализа растительной геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции, проведенную во ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Шаденковым А.А., положены методики выделения, описанные в руководстве Дрейпера и Скотта (1991).

Определение неомицинфосфотрансферазной активности In situ в ПААГ проводили на основе метода, изложенного в руководстве Скотт и др., 1991.

Для тестирования пробирочных растений картофеля на устойчивость к фитофторе проводили их заражение смесью сложных рас Phytophthora Infestans К-19; К-6; К-100. Свежевыращенный мицелий использовали для приготовления суспензии зооспор и инокуляции растений in vitro. Учет проводили через 5 и 7 дней после инокуляции. Фитофтороустойчивость растений оценивали по пятибальной шкале на основании эффективности спороношения гриба и некрозов листьев по методике, описанной Асеевой Е.А.(1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Сравнительная характеристика регеяерашонной способности сортов и линий картофеля и выяснение оптимального состава питательных сред для эффективного каллусогенеза и регенерации эксплантов используемых сортов и линий картофеля.

Оценка регенерационной способности сортов и линий картофеля проводилась на стандартной среде для регенерации RGM по проценту побегообразующих эксплантов. На основании данных, полученных в результате оценки интенсивности регенерации эксплантов картофеля дигаплоидных линий 50; 51; 52; 53; 54; 55; 57; 58; 59 , была выделена дигаплоидная линия 59, как обладающая наибольшей интенсивностью регенерации, поэтому она представляется наиболее перспективной для получения трансгенных растений. Интенсивность регенерации сортов Лорх, Изора и

Адретта была оценена как средняя. Таким образом, в дальнейшем мы вели работу с тремя сортами картофеля: Лорх, Изора и Адретта, и дигаплоидной линией 59.

Таблица 1.

Интенсивность регенерации междоузлий картофеля на среде ИйМ.

Сорта. Количество Количество %

линии эксплантов регенерантов регенерации

50 75 24 32i.011.50

51 75 16 21.3+2.88

52 75 7 9.3±1.08

53 75 16 16.0+ 0

54 75 9 12.,0+1.49

55 75 И 14.6+2.17

57 75 24 32.0+1.50

58 75 23 34.0+2.21 .

59 75 66 88, 0+1.50

Лорх 75 26 34.6+1.96

Адретта 75 27 36.6+1.96

Изора 75 25 33.3+2.87

Таблица 2.

Интенсивность каллусогенеза сегментов стеблей сортов и линий картофеля на средах 1.1, ST-1 и Cul.

Среды 1.1 ST-1 CU1

Сорта, линии % калусо-генеза % каллусогенеза % каллусогенеза

N 59 Лорх Адретта Изора 96.0+3.2 97.3+1.08 100.0+0 98.6+1.00 98.611.08 98.611.08 96.0+3.20 100.010.08 100.0±0 100.0+0 '98.6+1.08. 98.611. 08 •

Проведена оценка сред по влиянию на способность эксплантов картофеля к каллусообразованию на средах для каллусогенеза 1.1, ST-1 и Cul. Экспланты листовых дисков и междоузлий успешно образуют каллусы на всех исследованных средах, при этом процент каллусогенеза эксплантов.междоузлий выше, чем листовых-дисков у всех исследованных сортов. На среде Cul образуются каллусы зеленого цвета, в весенний период переходящие к спонтанной регенерации побегов, поэтому среда Cul выделена нами как наиболее благоприятная для каллусогенеза и последующей

регенерации используемых сортов и линий картофеля.

В результате проведенных экспериментов по оценке влияния сред БТ-2 и ЛСМ выяснили, что на среде БТ-2 морфогенез сегментов стеблей всех исследованых нами сортов и линий картофеля идет более интенсивно чем на среде НОМ. Экспланты листовых дисков всех исследованных сортов и линий на средах ЙБИ и БТ-2 оказались неспособными к регенерации.

Таблица 3.

Интенсивность регенерации сегментов стеблей сортов и линий картофеля на средах БТ-2 и ИСМ.

Среды БГ-2 ¡^М

Сорта, линии % регенерации % регенерации

N 59 Лорх Адретта Изора 93.3il.08 38.6+1.08 41.3+1.08 40.6±1.40 88.0+1.50 34.6+2.88 36.6±2.88 33.3+2.87

3.Оценка эффективности методов трансформации и отработка оптимальных методов для эксплантов используемых сортов и линий картофеля.

В ходе работы мы применяли различные методы трансформации и различные экспланты растений картофеля - метод кокультивирования сегментов стебля, листовых дисков и сегментов микроклубней с агробактериями, трансформации пазушных почек и прединкубации эксплантов в растворах стимуляторов роста. Каждый из методов имеет определенные преимущества и недостатки. Используемые штаммы агробактерий в качестве селективного маркера несут ген неомицинфосфотрансферазы-П, обеспечивающий устойчивость к канамицину. Оценка эффективности методов лроводилась по показателю средний процент эксплантов, эбразущих канамицин-устойчивые побеги на селективной среде.

Кокультивированием эксплантов сегментов стеблей и шфоклубней картофеля с агробактериями были трансформированы зорт Лорх и дигаплоидная линия 59. В результате проведенных ^следований выяснено. что оптимальные сроки ' инкубации и «культивирования сегментов стеблей картофеля с агробактериями эавны 15 минутам инкубирования эксплантов в жидкой среде МБ с зуспензией ночной культуры агробактерии и два дня

кокультивирования эксплантов на агаризоранной среде MS' без антибиотиков. При этом, для успешной трансформации желательно использовать наиболее "щадящий" для эксплантов метод трансформации с минимальным количеством травмирующих процедур. Отработана методика кокультивирования эксплантов с агробактериями через каллусогенез и прямую регенерацию эксплантов. Метод прямой регенерации эксплантов сорта Лорх позволяет получать регенеранты на месяц быстрее, чем через каллусогенез. Получено три трансгенных побега сорта Лорх, трансформированных через каллусогенез штаммом 3850 pGV941, устойчивых к канамицину. Методом прямой регенерации получено 2 трансгенных побега сорта Лорх, трансформированных' штаммом 3850pGV941tt и 1 - трансформированный штаммом 3850 pGV94l. Используя сегменты микроклубней, мы получили два регенеранта сорта Лорх, устойчивых к канамицину через 10 месяцев после трансформации при эффективности - - регенерации 5% трансформированные штаммами 3850 pGV941tt и A28lpGV941tt.

Полученные трансгенные растения свидетельствуют о том, что кокультивирование эксплантов с агробактериями является достаточно эффективным методическим приемом. Однако, у этого метода есть существенные недостатки: это длительность получения регенерантов и, вследствие этого, индукция нежелательных морфологических изменений (Welsing et al., 1988), а также достаточно низкая эффективность трансформации, что требует поиска других методов трансформации растений.

Один из способов повышения эффективности и скорости трансформации и регенерации - инокуляция меристематических тканей пазушных почек. Метод включает введение чужеродного генетического материала в меристематические клетки пазушных почек и получение трансформированных побегов, минуя стадию каллусогенеза. Меристематические клетки обладают огромным морфогенетическим потенциалом, поэтому метод обеспечивает возможность трансформации даже для тех растений, которые не могут быть регенерированы из протопластов или тканей листьев, стеблей," клубней; он значительно снижает время получения трансгенных растений и позволяет избежать хромосомных перестроек, анеуплоидии и полиплоидизации, часто происходящих в дедифференцированных тканях в культуре in vitro (Дмитриева и др.. 1992).

Меристемы пазушных почек на побегах картофеля дигаплоидной линии 59 инокулировали суспензией агробактерий штамма 3850 рН22кпео. Побеги регенерировали в период от 2 до 4 недель после инокуляции. Было получено 5 " регенерантов устойчивых к канамицину. ТраНсгенная природа одного из них (11Ь) доказана методом полимеразной цепной реакции.

Таблица 4.

Эффективность трансформации меристематической ткани дигапоидной линии N 59 штаммом А.ШтеГас1епз 3850 рН22 Кпео.

N опыта Количество эксплантов Кол-во канамицин-устойчивых регенерантов % иегене-рации

1 12 8 66.0

2 9 3 33.3

3 8 3 37.5

Всего 29 14 37.9

Другой способ повышения эффективности трансформации и регенерации - предварительная инкубация эксплантатов в растворах стимуляторов роста: 1 по (Visser et al., 1989) и 2 по (Wenzler et al.,1989). Для трансформации использовали штамамы агробактерий 3850рН22 hell' и A4 рН22 kell, несущие маркерный ген неомицинфосфотрансферазы и гены устойчивости к биотическим стрессам в составе бинарных векторов на основе природной плазмиды RSF 1010 .

Экспланты сегментов стебля картофеля сортов Адретта, Изора и дигаплоидной линии 59 инкубировали в растворе 1 и 2 в течение одних и четырех суток. Использованный метод существенно влиял на регенерационные процессы, которые охарактеризуем более подробно. Через 4 дня после инокуляции агробактериями наблюдали каллусообразование на раневых поверхностях эксплантов, инкубировавшихся • в растворе 2. У эксплантов, которые инкубировались в течение четырех дней, наблюдали образование более крупных каллусов, чем после суточной инкубации. У эксплантов, инкубировавшихся в растворе 1, видимо, в результате плазмолиза каллусообразование не наблюдалось. В контроле при кокультивировании без прединкубации на раневой поверхности эксплантов каллусы образовывались через 3-4 недели после трансформации. Первые регенерирующие побеги появлялись через 14

дней после трансформации у эксплантов, инкубировавшихся в течение 4 дней как при обработке раствором 1, так и при обработке раствором 2. Наблюдались отличия в скорости и интенсивности регенерации как среди сортов и линий картофеля, так и в зависимости от времени предобработки. У дигаплоидной линии 59 максимальная интенсивность регенерации наблюдалась раньше, чем у сорта Изора при всех вариантах инкубации (Графики 1 и 2). Процент регенерации через 8 недель после трансформации при всех типах обработки у линии 59 был выше, чем у сорта Изора. Экспланты дигаплоидной линии 59 проявляли максимальную интенсивность регенерации в период с 3 по 5 неделю после трансформации, а экспланты сорта Изора с 4 по 6, при предварительной обработке в течение 4 дней (График 3). При обработке в течение суток максимальную интенсивность регенерации наблюдали с 6 по 8 неделю у линии 59 и сорта Изора. При трансформации методом кокультивирования максимум регенерации наблюдался в период с 4 по 5 недели у линии 59 и сорта Изора.

То есть, при длительной обработке в растворах стимуляторов роста дигаплоидная линия 59 регенерировала быстрее и интенсивнее, чем сорт Изора. При других же процедурах трансформации таких отличий не наблюдали. Возможно, такой результат связан с повышенной отзывчивостью этой линии на воздействие стимуляторов роста, а также чувствительностью к воздействию канамицина.

Процент регенерирующих эксплантов через 8 недель после трансформации у дигаплоидной линии 59 после 4 дней предварительной инкубации состовлял 93.5%. после суток - 42% и 14.1% после трансформации методом кокультивирования (Таблица 5). Для сорта Изора процент регенерации через 8 недель после трансформации составлял 83.7%, 42.4% и 10.7% после четырехдневной, суточной и без прединкубации, соответственно (Таблица 6). Таким образом, при предварительной инкубации в течение четырех дней эффективность регенерации у обеих линий значительно выше, чем при суточной обработке.

Полученные результаты дали нам возможность судить о динамике регенерации эксплантов сорта Изора и линии 59 при различных типах обработки, выбрать наиболее благоприятный период инкубации в растворах стимуляторов роста, оценить воздействие растворов 1 и 2 на экспланты картофеля, и выбрать

оптимальный состав раствора для прединкубации эксплантов для дальнейших опытов.

Предварительная обработка в течение четырех дней эксплантов в растворах стимуляторов роста более эффективна по сравнению с суточной. При обработке раствором 2 на одном

Таблица 5.

Интенсивность регенерации канамицин-устойчивых побегов на эксплантах картофеля дигаплоидной линии N 59, трансформированной штаммом А. ШпеГасХепБ 3850 ЮУ рН22Кпео Ас77, методом прединкубации в течение 4 дней, 1 суток и кокультивированием.

Способ Предиккуб. Прединкуб. Кокультиви-

трансф. 4 дня 1 сутки рование

Время Средний % Средний % Средний %

в регене- регене- регене-

неделях рации рации рации

2 2.5±1.08 0 +0 0 Ю

3 16.6±1.08 3. 2011.44 0.9811.00

4 48.7±1.96 6.48±1.08 3.9211.08

5 75.6+1.40 10.40+1.08 9.80+1.08

6 93.5+0 11.30+1.00 10.78Ю

7 93.5+1.08 27.00+1.08 12.7411.08

8 93.5±1.08 42.0011.50 14.70+0.96

Таблица 6.

Интенсивность регенерации канамицин-устойчивых побегов на эксплатах картофеля сорта Изора, трансформированных штаммом А.tumefaclens 3850 рН22 Ас77, методом прединкубации в течение 4 дней, 1 суток и кокультивированием.

Способ трансф. Прединкуб. 4 дня Прединкуб. 1 суток Кокультиви-рование

Время Средний % Средний % Средний %

в регене- регене- регене-

неделях рации рации рации

2 3 4 5 6 7 8 1.2511.00 6.25+1.08 13.00+1.08 31.2011.50 57.50+1.08 72.50+1.49 83.70+1.08 0 Ю 3.211. 08 6.4+0. 94 8.0+1.08 11.2+0.45 27.2+1.08 42.411.08 0 +0 0. 8911. 00 1. 8712. 04 6.3011.08 8. 90+1.50 9.8011.08 10.7011.08

экспланте образовывалось несколько регенерирующих побегов, при обработке раствором 1 на эксплантах образовывалось по одному регенеранту. Исходя из этих данных, мы считаем более целесообразным проводить предварительную инкубацию эксплантов в растворе 2. Различия в эффективности методов прединкубации и кокультивирования наглядно показаны на графиках 1 и 2.

Экспланты дигаплоидной линии 59, инкубировавшиеся в растворах стимуляторов роста в течение 4 дней, образовывали многочисленные побеги-регенеранты, которые ' однако белели и погибали на среде с канамицином в концентрации 100 мг/л в течение месяца. Такой результат может быть связан с более высокой скоростью регенерации дигаплоидной линии 59, чем у сортов Лорх, Изора и Адретта, поэтому клетки раневой поверхности успевали регенерировать. Известно, что оптимальный период для инокуляции агробактерией 1.5-3 день после поранения растения (Дрейпер и др.,1991), видимо в связи с - высоким морфогенетическим потенциалом у эксплантов этой линии оптимальный период инокуляции несколько короче, а к четвертому дню после поранения эффективность трансформации становится минимальной. При предварительной инкубации в растворах стимуляторов роста в течение суток период регенерации побегов увеличивался и регенерация шла гораздо менее интенсивно по сравнению с предобработкой в течение 4 дней. Таким образом, увеличение срока предобработки увеличивает скорость и эффективность регенерации, но снижает эффективность трансформации. Поэтому мы решили выбрать промежуточный вариант и сократили период инкубации эксплантов в растворах стимуляторов роста до 3 дней.

3. Оценка эффективности трансформации картофеля штаммами Agrobacterlum tumefaclens и Agrobacterlum rhlzogenes. несущими различные векторные конструкции.

При оценке эффективности трансформации штаммами 3850 рН22 Ас77, A4 рН22 Ас77 и стандартным вектором 3850 pGV941tt. Трансформацию проводили методом предварительной инкубации в растворе 2 в течение 3 дней. Эффективность трансформации штаммом 3850 рН22 Ас77 и 3850 pGV941tt дигаплоидной линии 59 одинакова, это говорит о том, что при трансформации картофеля система переноса, где последовательности Т1-плазмиды BR и функции гена Vir D2 заменяют области mob и oriT плазмиды

Таблица 7.

Эффективность регенерации сегментов стеблей картофеля сорта Изора, трансформированных штаммами А.tumefaclens 3850 рН22 Ас77 и А.rhizogenes A4 рН22 Ас77 метдом прединкубации.

Штамм N Количество Количество % регене-

опыта эксплантов регенерантов рации

3850 1 60 50 83.4

Агп77 - 2 22 19 86. 1

всего 82 69 84.7

A4 1 49 41 84.2

Аш77 2 23 20 87.1

всего 12 61 84. 1

Таблица 8.

Эффективность регенерации сегментов стеблей картофеля соота Изора, трансформированных штаммами А. 1итеГас1епз 38Й0 рН22 Ас77 и А. гШгоеепез А4 рН22 Ас77 метдом прединкубации.

Штамм Количество эксплантов Количество регенерантов % регенерации

A4 рН22 Аш77 75 52 68.7

3850 рН22 Аш77 75 69 92.2

3850 pGV941tt 75 54 72.3

широкого круга хозяев RSF1010 работает не менее эффективно, чем стандартный вектор. При сравнении эффективности трансформации штаммов А. rhizogenes A4 рН22 Ас77 и А. tumefasiens 3850 рН22 Ас 77 получены неоднозначные результаты. В предварительных опытах трансформации методом прединкубации ^сорта Изора процент регенерантов, устойчивых к канамицину, почти одинаков, при трансформации штаммами А.rhizogenes A4 рН22 Ас77 и А. tumrfaciens 3850 LGV рН22 Ас77. При трансформации дигаплоидной линии 59 были выявлены различия в эффективности трансформации штаммов А.rhizogenes A4 LGV рН22 Ас77 и А.tumefaclens 3850 LGV рН22 kell. В этом случае одинаковые векторные системы встроены

в разные виды рода Agrobakterium - A.tumefaciens и A. rhizogenes. Следовательно, возможно два варианта трактовки полученных результатов. Первая: возможно эффективность трансформации зависит от генотипа экспланта. Вторая: в A.rhizogenes плазмида рН22 Ас77 функционирует менее эффективно , чем в A.tumefaciens или штамм A4 заражает экспланты картофеля менее эффективно, чем штамм A.tumefaciens 3850. Для выяснения причин различия эффективности трансформации штаммами A.rhizogenes A4 pH22kneo Ас77, A.tumefaciens 3850 pH22kneo Ас77 и 3850 pGV941tt необходимы дополнительные исследования.

4. Подтверждение трансгенной природы канамипин-устойчивых регенерантов картофеля.

Методом полимеразной цепной реакции подтверждена трансгенная природа линии Hb, полученной методом трансформации меристематической ткани пазушных почек картофеля дигаплоидной линии 59 агробактерией штаммом 3850 рН22Кпео и линии 86 , полученной трансформацией сорта Изора штаммом 3850 pH22kneo kell.

5. Оценка полученных траксгенных растений на устойчивость к фитофторозу.

Полученные канамицин-устойчивые регенеранты были оценены на устойчивость к фитофторозу в условиях in vitro. Оценка проводилась по 5 бальной шкале на эффективнось спороношения и некрозы. По исследованным параметрам различий чувствиельности к фитофторозу у трансформированных и контрольных растений не наблюдалось.

Таким образом, нами отработана и оптимизирована методика трансформации с предварительной инкубацией эксплантов в растворах стимуляторов роста. Был выяснен оптимальный состав раствора стимуляторов роста для используемых нами сортов и линий картофеля. Определили оптимальное время инкубации эксплантов - 3 дня. Этот период прединкубации оказался вполне достаточным для насыщения эксплантов стимуляторами роста, с другой стороны раневая поверхность эксплантов за это время не успевает регенерировать и остается компетентной к заражению arpoбактериями.

Трансформанты, полученные от трансформации эксплантов картофеля дигаплоидной линии 59 штаммом 3850 pH22kneo показали, что векторная конструкция способна успешно встраиваться в геном картофеля.

График 1.

егенерация адвентивных побегов на сегментах стебля картофеля сорта зора, трансформированных методами кокультивирования и прединкубации течение 4 дней и 1 суток.

4 дня

1 сутки

кокультивирование

о 12345678 в время культивирования (в неделях)

График 2.

згенерация адвентивных побегов на эксплантах междоузлий картофеля ^гаплоидной линии 59, трансформированных методами кокультивирования прединкубации в течение 4 дней и 1 суток.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

4 дня

1 сутки

кокультивирование

1 2 3 4 5 6 7 время культивирования

(в неделях)

График 3.

[тенсивность регенерации эксплантов картофеля сорта Изора и ¡гаплоидной линии 59, трансформированных штаммом А.ШтеГас1епз !УрН22Кпео Ас77, методом прединкубации в течение 4 дней.

% 100 р 90 е 80 70 60

н 50

40 30 20

н 10 т о в

линия 59 Изора

1 2 3 4 5 6 7 8 время культивирования (в неделях)