Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы получения и индикации экзотоксина токсического шока и внутривидовое дифференцирование Staphylococcus aureus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Методы получения и индикации экзотоксина токсического шока и внутривидовое дифференцирование Staphylococcus aureus"

РГб Ой

и а 1

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ЗДЕРАШШ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА. ДРУЖЕН НАРОДОВ. щшвднскиВ.. дютшт

На правах рукозшса

ТЕКУТЪЕВ Сергей Ивановач

ШОЛН НШЧШВ й- ВНЕШНЕЙ ЭКЗОТОКСИНА ТОКСИЧЕСКОГО ШОКА II ЕНУТКПЩОВОЕ ДДОЕ-тШРОШШЕ ат&ртаососстз ' лткиз 0

03.00.07 - шкробаодогня

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация та соискание ученой степени кандидата кедзщшских наук

Ростов-на-Дону 1593

Работа вшелнена в Ростовском НИК шкроЗио догнв н иаразитодолш ШЮ "Биопрепарат"

ЕаучннЙ руководитель:

ВаучшШ консультант*

Офпцкальнш оппоненты:

доктор шдйцйнсюезс наук Карнвдкая Н.В.

доктор медицинских наук, профессор Шевелев А. П.

действительный член РАМН н PAS» доктор медицинских, доктор биологических наук» профессор Домарадский И. В.

доктор медицинских наук, додент Васильева Л. И.

Вздуаш сргйнкгдая: Ростовский ваучно-исследоватеяьскггй

ИрОТНВОЧуКШЛ ИНСТИТУТ

Завита состоится " т. в ^ "часов на

заседании СЕгцнализировашогосоввта Д 084.53.01. при Ростовском ордена Дружбы народов медицинской инетотуто (344700 г.Ростов-на-Дону, дер. Назизчевавсюй, 29).

С дассертодяей ыоано сзнакошться в библиотеке Ростовскою ордена Дружбы народов иедацицсюого инсйстута.

Автореферат разослан " (ФИГЛ^иЯ 1933

г.

Ученый секретарь сшциалнгцрованвого совета доцент

Н.Я.Корганов

- 2 -

ОВИЯ 2АРДШЕ1СТ2М РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В структуре возбудителей стафилококковых инфекций золотистей стафилококк (з.еигеиа ) остается лют-рущнм этиояогическтаа факторов. Спектр проявлений клинических фору, связанные со стафндокохковшж заболеваниями, широк и многообразен. Это обусловлено способностью s. aureus продуцировать во знешниэ среду большое количество эЕзонродужгсв - токсинов и ферментов, Еграяних вздущрз роль в патогенезе стафилококковых инфекций.

Сравнительно недавно установлено, что некоторые штакаы ^.auraus способнн продуцировать особое вещество белковой природы, обладавшее гоксотеснЕКн'свойствами ( a.s.Bergdoil at ai ., 1981; P.M.Schlie-vert et al' ■ 1981). Ьдло воказано, что данный белок отличается от ззвесшк токсинов л нграет главную роль в патогенезе спндрог^а токсического шока (M.s.Bergdoll , P.M.Schiie-vsrt , 1984), вследствие чего новк2 токсин получал название ~ зкзотоЕсда ¡токсического пота (ЭТИ).

Снцдром токсического шока (СИП), этнологически связанный со шгакаагщ золотистого стафилококка, 'впервые был зарегистрирован в США. в 1978 г. (J.K.Todd at al, 1978) как новое инфекционное заболевание, поражающее прекмуще стиещго молодых ненщин, детей и лвд с гослеояеращюншш ослознешизаги стафилококкового генеза. В настоящее время СШ встречается во многих странах (ti.s.Bergdoii , P.J.Chsisney , 1991).

Значительней интерес к этому заболевании обусловлен крайне тягелка течением, высокой частотой летальных неходов в сочетании с отсутствием вадезных методов лабораторной диагностики, профилактики и лечений.

Установлено, что ЭТИ цродуцарувдие штаьзгЫ s.aureus широко распространены и выявляются с частотой от 15,6 % да 52,2 % (M.S.Bergdoil , P.J.Chesnoy , 1991; П.Ф.Покар а др., 1989).

Для обнаружения штагков S.aureus , отзетстЕен;шх за развитие синдрома токсического пока, предложены различные кетсды тестирования ( игаунофермектннй анализ, радаогазлуникй анализ, реакция пассивной латекс агглзтннашга и др.). В нашей стране проводятся экспериментальные разработки диагностическая препаратов в ИЗМ гм.Ги:алеа (Л.К.Акатов и др., I96S; Ф.С.Флуер и др., 1989, 1990), но, :: созаленка, ли одня из 'юга пока Fie доведен до пренз-

всдстаенного выпуска и не доступен практическому здравоохранению. Ввиду этого в России евдцроы токсического вока не ввдгден в самостоятельную нозэологическув единицу и до настоящего времени не регистрируется. В то ге время спектр проявлений клинических форы при стафилококковых заболеваниях свидетельствует о тоы, что случаи (ЛИ имеют место, но проходят кз-за отсутствия диагностики под другими диагнозами. Ввиду этого вопросы разработки и производственного изготовления препаратов доз" яадикации ЭТИ продуцкрувдих штаммов S,aureus являются актуальными и открывают перспективы диагностики и профилактики СГИ.

В настоящее время при изучении закономерностей циркуляции внутрабольшгчных в вне больничных шташов s.aureus отмечается увеличение частоты нетшируешх культур Международный набором стафи-лофагов (от 33 до 65 %) (A.vmdel et el1987; С.Петровский, 1988). В связи с этш потребности клинической к эпидемиологической практики ставят задачи расширения возмокностей альтернативного внутривидового дифференцирования, штаммов s. aureus , повышающих уровень диагностики и профилактики стафилококковых инфекций.

Учитывая, что около 30 % штаммов s.aureus", продуцирующих ЭТШ не тишфуются йагами Международного набора, для эпидемиологических исследований возникает необходимость разработки новых методов дифференцирования культур - возбудителей СТШ.

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснованге и разработка методов индакацаи штаммов s.aureus продуцентов экзотоксина токсического шока и использование метода внутривидового дифференцирования культур на основании антигенной идентичности для идентификации нетипируемых 323П продуцирушщх штаммов.

В соответствии с поставленной целью исследования были определены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить оптимальные условия и разработать технологию культивирования штаммов s.aureus , продуцирунцих экзотоксин токсического шока.

2. Разработать методы выделения и очистки .ЭТШ из эталонного штамма s.eureue PRl - 1169 я получить специфическую антитоксическую ищущую сыворотку к ЕЛИ.

3. Отработать тест-систему для гадгкацгг штадаов s.aureus , продуцирухадих ЭТШ.

4. Определить частоту распространения ЭШ цродударуицих

штаммов s.aureus , выделенных от разных категорий больных'и бактерионосителей и охарактеризовать их биологические свойства. ■

5. Отработать ыетод внутривидового дифференцирования для идентификации ЗШ продударупцёх штаммов s.aureus не типируадпхся Международным набором стафояофагов, основанный на использовании принципа антигенной идентичности.

Научная новизна и теоретическая значилость работы.

В результате проведенных исследований разработана региональная технология культивирования штампов S.aureus , продуцирующих ЗИЛ :

- разработана тест^истема для выявления ЗШ продуцирующих итаимов s.aureus , выделенных от большее и носителей; . -

- впервые продемонстрирована возможность применения хемилши-несцентного метода исследования биологической активности ЭТШ, основанного на свойстве ингибйровагаш токсином уровня свечения био-лшинесцентных бактерий. Ибказана специфичность действия ЭТШ на биосенсоры путем нейтрализации специфической антитоксической сиво роткой влияния ЭТИ;

- Е&уЗена частота распространения ЭТШ продуцирущих штаммов s.aureus среди культур, изолированных от разных групп людей и показано их преимущественное выделение от детей с клиническими цро-явлениями синдрома токсического шока;

- обоснована возможность использования метода внутривидового дифференцирования ЗШ продупир'ушда штаммов s.aureus . не ткпнру-вдихся фагеми Ыевдународного набора, с целью выявлений источников СШ инфекции.

Практическая значимость работы.

По результатам выполненной работы были разработаны: I) науч-■ но-техническая документация ("Экспериментально-производственный регламент" и "Временная фармакопейная статья") ка сыворотку диагностическую к стафилококковому экзотоксину токсического шока, кроличью, жидкую для реакций преципитации в геле, которая с положительным результатом прошла лабораторные испытания в ШСКе им.Тарасовича; 2) методические рекомендации для практических врачей "Способ индикации штаммов золотистого стафилококка, продуцирующих экзотоксин токсического шока", одобренные и утвержденные Ученым Советом Ростовского НИИ микробиологии а паразитологии 28 января 1992 г., протокол й I; 3) со результатам исследований подана заявка на изобретение "Экспресс-способ определения активности

бактериальных экзотоксинов" ( в соавторстве с В.М.Поляковым, И.Т.Андрусенко, А.П.Шепелевьм, А.Ю.Антшавым; приоритетная справка * 5063179/14 ). Показаны основные преимущества применения хеми-лшинесцентного метода доя оценки активности бактериальных токсинов - простота в исполнении, необходимость значительно меньших затрат времени для получения ответа, а также дешевизна в сравнении с принятыми обычными методами; 4) на основании отработанных методов внутривидового дщфзрендарования стафилококков нетишруешх Ыевдународнш набором стафилофагов, разработаны, опубликованы и внедрена методические рекомендации "Ветод определения антигенной вдентячности стафилококков и его нспользоваяве в лабораторной практике и эпидемиологическом анализе", ИЗ РСФСР, Москва, 1989 г.

Основные положения. внносимне на защиту j

- для получения экзотоксина токсического шока в больших количествах рационально использовать культивирование шташа-продуцента

FRI - 1169 в модифицированной среде Касыана (А.К.Акатов и др., I98S) с последующей очисткой, включающей осаждение ЭТШ из культу-ралъной жидкости сульфатом аммония, катвонообменную хроматографии я гель-фяльтрацшэ;

- полученная специфическая иммунная сыворотка к очищенному препарату ЗШ идентична референс-снворотке (полученной от црофес-сора K.S.Bergdoll -Wisconsin, Hadiaon, USA - США) Ii является основой конструирования тест-систем для индикации ЭТШ продуцирующих штаммов S.aureus ;

- специфичность, чувствительность тест-системы на основе диагностической сыворотки к ЭШ позволяет использовать ее для диагностики L идентификации штаммов s. aureus , продуцирующих экзотоксин токсического шока;

- впервые показано, что хешлшинесцептный метод может быть применен для выявления биологической активности ЭТШ," который ин-гибярует свечение биолшинесцентша бактерий. Специфичность действия ЗПВ на биосенсоры доказана путем нейтрализащш спецкфичес-кой антитоксической сывороткой токсического действия ЭШ ;

- разработанный метод внутривидового дифференцирования штаммов s.aureus нетшшруемнх Международным набором стафилофагов, основанный на реакции ишунодиффузионной преципитации в агаре, может быть использован для выявления источников СШ янфевдии.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых "Эпидемиология, микробиология и иыму-

нобнология бактериальных и вирусных инфекций" в 1989 г., Ростов-на-Дону; на 2-й Всесоюзной научной конференции с Международным участием "Бактериальные токсины", Юрмала, 1989 г.; на Всесоюзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний", Москва, 1991 г.

Публикация материалов исследования. Основные положения диссертации отражены в 10 опубликованных научных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, ойлсания материалов я методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, вщшчащего 188 работ, из которых 17 отечественных и 171 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 рисунками, 19 таблицами а 7 фотографиями.

• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .

Для получения и очистки ЗШ был использован Международный эталонный шташ-продуценг ЭТШ s.aureus fri - 1169, выделенный от больною с синдромом токсического шока в США и моноспецифическая сыворотка к очищенному ЗИЛ ( anti-TSST-i-Technoiogy ) любезно предоставленные нам npogpeccopoM.H.S.Bergdoll ( Pood Research Inatitate University of '.7isconain, Madison, USA - С311А), а также аналогичный штамм-продуцент* ЭШ, полученный от профессора А.К.Акатова (ИЗJ та.Гамалеи АМН РФ).

При определении специфичности препаратов в качестве гетеро-логичных были взяты стафилококковый альфа-тпкеин, холерный экзотоксин, стафилококковые энтеротоксины типов А, В и С, а такае антиэнтеротоксическае сыворотки типов А, В и С.

При выполнении ишунохшнческих исследований использовала полученную нами поливалентную и моноспецяфичэскую сыворотки к ЭТШ; коммерческую протавостафилококковуи антитоксическую оыЕорот-ку и иммуноглобулин. Эксперименты выполнены на 250 серых кроликах породы шиншилла массой от 2,0 до 3,0 кг и 50 кроликах - сосунках 18 - 20 дневного возраста - всего 300 жгвоткых.

Для выявления ЗИ] продуцирущах штаммов были исследованы 702 штамма s.eureus , из которых 232 были изолированы из гнойного отделяемого ран и патологических очагов взрослых и детей с

разнши фориаш стафилококковой инфекции (вагинит, колышт, эндометрит, остеомиелит, бронхопневмония; гшодерая и энтероколиты, осложненные токсикозом); 470 штаммов выделены из верхних дкха -тельных путей бактерионосителей (медицинский персонал, родильницы 2 роженицы) и кохнкх покровов (новорожденные).

Шгамын стафилококков ввдьлеяы в разных городах Ростовской области - г.Ростов-на-Дону, г.Волгодонск, г.Таганрог, г.Шахты.

Видовою кдентзфикащт тташов з.аигаив , их фаготшкрованке и определение устойчивости к антибиотикам проводили общепринятыми методами (А.К. Акатов, В.С.Зуева, 1983).

Для определения продукции ШИ исследуемыми шташаш з.аигечв использовали полусинтетическую питательную среду Касмана в ыода-(ТЕкадии А.К.Акатова и др. (1986). Исследуемые культуры-выращивали в яадкой (при встряхивании на вюттедь-ашарате) и на агаризо-ванной среде Касыана, а также на агаре Хоггннгера,' покрытом целлофановым диском. После 18 - 24 часовой инкубации культур при 37°С в жидкой среде и на агаре Хоттингера микробные клетки отделяли центрифугированиш при 3000 об/гаш в течение 20 минут, а супернатантн исследовали на наличие ЗПВ шкрбметодом в реакции ишунодиффузиокной прецшштащи с антитоксической сывороткой к ЭГШ. При отработка реакции преципитации в геле в качестве основного применяли метод ОисЫег1опу (1962).

Определение продукции ЭТШ шташаки на атаризованной среде Касмана проводили по модифацированкой методике определения "антигенной идентичности" в утлекаслотно-воздушной атмосфере с 5 %

Со2.

Внутривидовое дифференцирование штаммов з.аигеив нетипиру-емых стафалофагаш осуществляли разработанным наш способом, ос~ новашгш на сравнении антигенной структура преципитатов токсических комплексов в реакции "антигенной идентичности" СН.В.Кар-ницкая, С.ИЛекутьев, 1389). Посевы испытуемых кул^ур делали в виде квадратов на среде Бернета, антитоксическую противостафило-кокковув сыворотку (30 - X МЕ на чашку) помещали в канавку по диаметру чашки Петра. Чаижя с посевами выдергивали в эксикаторе, заполненном углекислотно-воздушной сыесыо, в течение. 24 - 48 ч при 37°С, после чего производили учет результатов.

Для получения 31Ш в больших количествах культльирование Еташа-продуценга проводили в I литре жидкой питательной среды Касйана, в колбах Эрденмейера (емкостью 5 л) в течение 24 ч при

37°С и при непрерывном встряхивании на шюттёйь-алпарате (ПО качаний в минуту). Микробные клетки отделяли на центрифуге PG-6 при 5000 об/мин и температуре +5°С в течение 20 млн. Белки культураль-ной жидкости концентрировали осаздениеы сульфатом аммония при 80% насыщении в течение 16 - 18 ч при -t-4°C. Осадок отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин при +Ь°С. Гель-фильтрации проводили на сефадехсе g-75 ("Pharmacia " - Швеция), ионообменную хроматографгю на QAE - А50 сефадексе ("Pharmacia " -Швеция) и КМ-целлюлозе ("ßeanal " - Венгрия). Все операции по очистке 351 наполняли при температуре 4 - 6°С. Иммуноэлектрофорез проводили в I % агаре Дифко (ША) на мединаловом буфере pH 8,6 ^ионная сила 0,05). Электрофоретпческое разделение ЭТШ проводили методом диск-электрофореза' в 7,5 % полиакриламидном геле (ПАГ) по методике Davis ( B.J.Davis., 1964).

Молекулярнув кассу qnitíreиного препарата ЭТШ определяли методом гель-фильтрации и методом электрофореза в 12 % ПАГ в присутствии ДДС -Ыа по Методике Laenmii (1970) с применением набора белковых маркеров "Bio-Rad " (США).

Контроль чистоты полученного 3111 выполняли методом высокоэффективной яидкостной хроматографии (ВЕХ) на автоматизированной системе ни>с.

Получение диагностических анти-ЗПП сывороток осуществляли путем подкожной иммунизации кроликов породы шиншилла массой 2,5 -3,0 кг очвденнш препаратом ЭТШ.

Биологическую активность ЭТШ на кроликах оценивав пс летальному эффекту, определяя Ы>50 общепринятым методом (Й.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962). Токсическую активность препаратов ЭТШ также опредедали хешшшнесцентныи (ХЛ) методом по степени кнгибпрова-ния свечения биолшинесцентншс бактерий. В качестве потенциальных биосенсороз использовали лшянесцируяшие морские бактерии, входящие в набор "Зколш" (СП Биохиммак).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятым методом (Г.Ф.Лакин, 1990).

О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и опытной груш судили по величине t- критерия Стьидента- Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р с 0,05. Наличие корреляционной связи между признаками оценивали методом параметрической н непараметричейкой корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ y. ошгадаив -

Получение и очистка ЗШ, тжгоговлввие специфической антисыворотки к нему. Мы получали ОТ путем культивирования эталонного штамма-продуцента FRI - XIS9 в казешово-гидролизатной среде (Касмана) с I % дроххевнм экстрактом, приготовленной на основе отечественных ингредиентов в модификации А. К.Акатова и др. (1986). Нативный ЭШ шел титр в реакции юалуЕодайузии (ИД) от 1:2 до 1:8 и вызывал при годкозшом введении .кроликам массой 2,5 - 3,0 кг летальный эффект.

Ваннам эталон яехнологги получения ЗИП является его взделе-нге и очистка, так как сложность состава и обилие зкзоцродуктов, продуцируемых при культивировании: шташа в питательнуэ среду, затрудняют выделение любого конкретного белка.

На первом этапе очистки белки культуральной жидкости концентрировали осаздением сульфатом шконея до 80$ насвдения. Для получения очищенного препарата ЭШ было проведено сравнительное изучение двух способов очистки, отличавшихся по ряду параметров.

Первый способ очистки ЭШ вкяочал 2 зтапа: колоночнув гель-фильтрацию на сефедексе G-75 ж ионообменную хроматографию на колонке с qab - А50 сефадексом. Ери фракционировании Ж! на колонке с QAE - А50 сефадексоы оптимальная десорбция разделяемых белков отмечалась в цределах концентрации SaCi от 0,8 до 0,87 М. Профиль эдвцаи ЭЛЛ на колонке с шионообменникоы представлен на рисунке I.

Рис. I. Профиль элюции ЗИЛ (1-го пика с сефадекса G-75 ) па колонке с ф&-кЬ0 в C.OI U rpzc-HCi буфере, рН 7,2 с градиентом ЭьС1 0 - .1,0 Ы. Заштрихованная часть - пробы, содержащие ЭШ (по КЩ. с монослецифической рефереяс-сызороткой).

Использование градиента, увеличивающего ионную силу буферного раствора', • вызывало деформацию о (¡ценника в колонке и затрудняло протекание элюента. В таких.условиях получить полной десорбции токсических белков не оказалось возмоянш..

Для того, чтобы добиться максимального выхода ЗИП с целью препаративного фракционирования, мы использовали модифицированный, второй способ очистки. Способ вклкчал извлечение ЭТШ из концентрированного нативного-материала (осаяденные сульфатом аммония белки кульгуральной жидкости) с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой и поел едущую гель-фильтрацию на колонке с сефвдексоы G -75 -

Применение катноноодмеиной хроматографии на колонке с КМ-цел-лшозой позволило полностью, злшровагь ЭТШ.

Сорбированный ЗШ. элшр&вался третьим пиком после подачи градиента в пределах концентраций Had от 0,05 до 0,08 М. Характерный профиль элюции токсина- дряводится на рисунке 2.

Рис. 2. Фракционирование ЭТШ на колонке с КМ-целлюлозой (1,6 х 40 см) в 0,01 М ацетатном буфере с градиентом HaCi от 0 до 0,1 М и pH от 4,0 до 5,8. Объем фракций - 10 мл. Заштрихованная часть - фракции, содержащие ЭТШ (по РИД с ыо~ носпецифической референс-сывороткой).

При гель-фильтрации на колонке с сефадексом g-75 только злюаты 1-го пика были положительны в РИД с референо-еывороткой.

Характерный профиль алвдш ЗИП представлен на рисунке 3. С поливалентной сывороткой ЗШ с сефадекса о-75 образовывал одну полосу преципитации (рве. 4).

Рис. 3. Гель-фильтрация ЗШ (3-го пика с КИ-целдюлозы) на колонке с сефадексом с-75 (2,0 х 90,0 см) в О,СБ 1£ фосфатной буфере рН 7,2 с 0,15 И К&С1 . Объем фракций 2,0 мл. Скорость элюции 1,0 мл/мин. 'Заштрихованная часть - пробы, содержащие ЗТШ.

Рис. 4. БЩ в геле с поливалентной сывороткой к ЭТИ.

I, 2 - фракции 3-го шоса с сефадекса QAE - А50 (.первый способ счистки); 3,4— Фракции 1-го пика с сефадекса с-75 (втогой спосоо очистки); 5,' 8 - фракции 3-го пика с КМ-целлшозы; 6, ? - фракции 2-хх) пика' с сефадекса G-75 .

При сравнительном изучении двух способов очистки степень чистоты ЭПП была одинаковой, но выгод токсина предложенным вторым способом очистка в сравнении с первым был большим и составил 17 % против 5 %.

В дчск-электрофэрезе в 7,5 % ПАТ без использования ДДС - На очищенный препарат ЭТШ выявлялся в виде одного низкомолекуляркого компонента- Молекулярная масса ЭПП, определенная по Ьаешяи (1970)' оказалась равной 23500 ~ 24000 Д, что согласовывалось с данными Других исследователей (К.Р.ИеАвег et а1 1983) (рис. 5). При изучении ЗТШ иетодои электрофореза в 12 % НАГ в присутствии ДДС - 1?а кроме основного компонента с иол. кассой 23500 Д были выявлены принеси в йздэ шшорного компонента с мод. массой равкой 16000 Д.

(23,5 и». эш

(16,0 KD) примеси

¡333

М.н. (КД)

- 97,4

- 66,2

- 45,0

- 31,0 21,5

- 14,4

лвдируший краситель

Рис. 5. Определение молекулярной массы МШ методом электрофореза в 12 % ПАГ с исполь-. зованиегл ДЕС - ira .

При исследовании степени чистоты ЭТШ методом ЕНХ на îsk-ЗО геле были выделены 2 четко дифференцируемых пика: основной пик, составляющий 80 % и примчси, на долю которых- приходилось не более 20 % (рис. 6). С учет: имевдихся в литературе данных о гетерогенности полученного разнши способами ЭТШ (P.K.Hostpn et «а .., 1989) можно считать, что выделенный нами ЭТШ являемся достаточно очищенным, а предложенный способ пр:ше:пьм для препаративного вы-

- 13 -

деления и очистки экзотоксина токсического сока s.aureus.

Е2В0 хш

Рис. 6. Исследование чистоты препарата ЗГШ методой БЗХ. Показаны основной пик ЭТИ и малый пик пршесей.

В ИИ была выявлена серологическая нецдентичность полученного ЗГШ и стафилококковых энтеротоксинов типоз А, В и С, а такае стафилококкового альфа-токсина.

Подученные результаты исследования биологической активности ЗГШ показали, что очищенный препарат ЗГШ облапал полноценными биологическими свойствами и при подкозвом введении кроликам массой 2,5 - 3,0 кг вызывал гибель животных в дозе ЬД^ 140 - 150 мкг/кг.

Препарат ЭГШ обладал иммуногенньш свойствами: цри подкояном введении кроликам шссой 2,5 - 3,0 кг последовательно 40, 80, 160, 320, 700 шт/мл ЭШ с интервалов в одну неделю, была получена специфическая антитоксическая сыворотка к ЭШ с титром в РИД I : 16. Приготовленная нами ишунная антисыворотка к очищенному препарату ЗГШ в РЩ была идентична референс-сыворотке, полученной от профессора S.s.Bargdoll (США) и давала одну полосу преципитации (рис. .7). - J

bit.. • .Г.: Л . /

г'.фф! •• 'viPki^-HXrf'^ ' 'Ч' -V.-V^-f

"К- оЧ ^

Рас. 7. Исследование специфической сыворотки к ЭНП. методом ШД в геле.

1 - специфическая сыворотка к ЭТШ, полученная нами;

2 - референс-снворотка против ЗГШ ( Ц.Э.Ве^аоП , США);

3 - препарат ЗПП.

В ходе исследования впервые на модели биолшинссцентннх бактерий по^аз^на возможность определения активности ЭТШ по степени ингибирования хемилшинесценща бносенсоров. В пробирку, содержащую исследуемый прапарат ЭТШ в количестве 0,1 мл вносил}» смесь бактерий. Смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Контролем служили: ЭТШ, нейтрализованный специфической анти-ЭТШ кроличьей сывороткой, а также кроличья анти-ЗГШ сыворотка и физ. раствор, з которых разводили лшинзсгдарупцие бактерии. Содержимое пробирок переносили в кюветы и регистрировали интенсивность свечения на хе-милшинсметре.

Результаты определения свидетельствовали, что специфическая сыворотка полностью нейтрализовывада действие ЭЛЛ на биосенсоры (таблица I).

Таблица I.

Показатели нейтрализации ЗГШ Б.аихеио шх - ибэ антитоксической спецкфэтеской сывороткой. .

№ Ингредиенты Интенсивность ХЛ предлагаемым способом, та/с Активность (по величине bD^o на животных, ¡¡кг/кг

I. ЭШ - Ю+1 150,0

2. ЭШ + анти-ЭТШ сыворотка 27 + 4 -

3. Физ.раствор 31 + 5 -

4. Анти-ЭТШ сыворотка 30 + 5 -

. Аналогичным образом исследовали активность очищенного концентрированного препарата ЭШ в разведениях от 1:2 до 1:64. Контролем служите активность, определяемая обычным способом по LD50 на животных. Црлученнне данные свидетельствовали о фактически линейной зависимости уровня туаения II от концентрации ЭТШ и вполне позволяли адекватно оценить данный показатель.

Таким образом, предлагаемый метод вполне иогет быть использован для-эксгпесс-оцределзния активности ЭШ, что позволяет рекомендовать его применение в практике.

Метода индикации штаммов s.aureus, продуцирустшх ЭШ.

Всего изучено 702 штамма s.aureus, выделенных от больных и здоровых носителей на различных территориях Ростовской области. Результаты исследований- биологических свойств показали,'что все штаммы s.aureus в высокой степени обладали признаками патогеняос-ти, такими как наличие плазшкоагулазы (98,9 %), ледатовителлазы (94,2 %), ДНК - азвой активности (97,4 %), гемолиза (83,2 %), фос-фатазы (97,4 %), хзгапьеобразуадего фактора (99,8 %), пигаентообра-зования (68,9 %) и способности сбраживать ыаннит в анаэробных условиях (94 %). Из 7Ш культур 192 юш 27,3 % штатов являлись продуцентами ЭПП.

Определение продукции ЭШ штатами s. aureus проводили методом ишунодиффузионной преципитации в геле. Рабочие концентрации сывороток составляли 1:8 - 1:16. Проведено определение способности штаммов s.aureus продуцировать ЭШ с использованием различных методов культивирования. Полусинтетическая среда Касмана (жидкая и агаризованная) .в условиях культивирования при ншттелировании и при наличии Ъ% ОО2 явилась наиболее адекватной для обнаружения продукции ЭШ. Разработанные нами тест-системы для выявления ЭШ в микробных супернатантах культур и на плотной питательной среде в уг-лекислотно-воздушной атмосфере использовали для инди -даи ЭТШ Продуцирувдих шташов S.aureus.

Показано, что щташы продуценты ЭШ выявлены у больных и здоровых носителей во всех четырех городах с частотой от 19,6 до 33,9 %. В целом у шташов, выделенных в Ростовской области, уровень продукции ЭШ нике, чем в других регионах страны - 52,2 % (П.Ф.Пояар и др., 1989).

При сопоставлении результатов ыезду числом'продуцентов ЭШ, изолированных от больных к здоровых носителей существенной разни-

- 16 -

да не оказалось (таблица 2).

Таблица 2.

Частота продукции ЗТШ штаммами s.aureus , выделенными от разных груш болъних и носителей.

^ Источник выделения Кол-во исследуемых шташзов Кол-во штаммов,продуцентов ЗИП

Абс. % + м

I. Медицинский персонал родильных отделений 196 58 29,5 + 3,3

1 о « 2. Новорожденные 63 14 22,2 + 5,2

3. Беременные и родильницы Всего : 211 470 62 134 29.4 + 3,1 28.5 +2,0

1. Гинекологически©-Ульяне . 96 2. Больные травматологического отделения 70 19 13 19,8 + 4,1 18,5 + 4,6

ф а З.' Дёти с бронхолегочной патологией инфекцион- 44 ного отделения 10 22,7 + 6,3

4. Дети с токсквдаллергическим синдромом реаяи- 22 нацяонного отделения Всего : 232 16 58 .72,7+ 9,4 25,0 + 2,84

Между частотой продукции Э1Й у стафилококков, изолированных от гинекологических больных, больных травматологического отделения и детей в возрасте от 6 месяцев до 1,5 лег с бронхолзгочкой патологией существенной разницы не выявлено.

Наибольшая частота продукции ЗИП (72,7 %) была выявлена у штаммов s.aureus , изолированных от детей в возрасте от 6 месяцев до 1,5 лет с диагнозом токсикоаллергический синдром, имеодим сходную клиническую картину с синдромом токсического шока. Установлено, что частота продукции ЭТШ стафилококков в группе детей с тяжелой формой токсикоза была более чем в 3 раза выше, чем с диагнозом бронхопневмония.

Можно предположить, что у этой группы больных этиологически а клинически может быть поставлен диагноз - ссндрса токсического шока. Надо полагать, что многие септические к токсшсоаялергячес-

кае состояния при стафилококковых инфекциях являются проявлением истинного <7ПЕ, а выявление большого процента штаммов s.aureue продуцентов ЭТШ подтверждает это.

При сравнительно*: изучении биологических свойств ЭТШ позитивных и ЭТШ негативных пташов Снло показано, что цродуценты Ж! обладали всеми признаками патогеяноств s.tureuа(наличие плазыокоа-гулазы, лепитовителлазы, ДНК-азной активности, фосфатазы, хлопье-образупцегс фактора и способности сбраживать маннит в анаэробных условиях), но с достоверной разницей бшги менее гемолитичны {45, против 97,5/0, что согласуется с данными K.ciyne et al . (1988). Была обнаружена зависимость частоты продукции ЗШ и устойчивости к метициишну. Йолученкые результаты несколько отличаются от данных других исследователей (А.К.Акатов и др., 1989), показавших, что достоверной разницы мезду чувствительными и устойчивыми к антибиотикам шташаыи по частоте продукции ЭТИ не выявлено, хотя устойчивые к тетрациклину штамин продуцировали ЭНН чаще, чем чувствительные. Это обстоятельство, возможно, связано с неравномерной частотой применения антибиотиков в определенных регионах нашей страны и спектром циркулирующих Е-пдазмид.

При фаготкпированик изученных шташов s.aureus установлено, что нетшшрусмне фагами культуры значительно реке продуцирует ЭТШ (28,1 %), чек типируемые (71,8 %). При этом штаммы 1-ой и Ш-й фа-гогруппы чаще продуцировали ЭТШ (64 % н 60,7 % соответственно). Штаммы, лизируеыые фагами 52, 52 А и 29 (90 %) образовывали токсин чаще, чем другие. Это обстоятельство было отмечено и другими исследователями (W.A.Alteneier et el „, 1982; П.Ф.Покар и др.,' 1989).

Представленные результаты позволяют сформулировать положение о тоы, что шташы s.aureus , продуцирующие ЭТШ, обладают всеми признаками патогенности, свойственными виду aureus . Главным шр-кером шташов стафилококков, обусловливающих СТИ, является продукция экзотоксина токсического шока. Высокий процент ЗШ продуцирующих шташов (27,3 %) и широкое распространение их среди носителей и больных с. разлзгчншя формами стафилококковой инфекции свидетельствует о том. что ЭТШ является одним из факторов патогенности, действие которого проявляется при определенных условиях в форые СПИ.

Не менее вакши является выявление источников СПЕ инфекции при изучении закономерностей циркуляции ЭТШ продуцируадих стам-иов Siaureus.

Для ловшения уровня идентификации культур нетипируемых стафилофагаш нами разработан метод внутривидового дифференцирования. Это метод сравнения антигенной структуры преципитатов токсических комплексов изучаемых штаммов s.aureus , основанный на реакции икмунодиффузионной преципитации в агаре - так называемой реакции "антигенной идентичности". При изучении культур методом сравнительного кммунохишгческого анализа достоверно была'установлена взаимосвязь антигенной структуры токсических цреципитатов и фагогрушовой принадлежности иташов.

Этии методом изучено 54 штамма s.aureus , продуцирующих ЭТШ и не лизируемнх набором стафилофагов. При изучении различных сочетаний в опыте у 52 (96 %) штакмов была выявлена идентичность преципитационных комплексов при полном совпадении набора биологических признаков и резистентности к 5 антибиотикам. При этом были установлены и расшифрованы эпидемические связи: медицинский персонал - мать ~ ребенок полученные данные подтверждают факт носительства ЭТШ позитивных штакмов среди медицинского персонала к возможность инфицирования новорожденных детей и родильниц. Учитывая тякерть заболевания синдромом токсического шока и высокую смертность при этом, важность расшифровки таких случаев трудно переоценить. Использование полученных данных эпидемиологами для целей эпидемиологического анализа поможет в выявлении источников СП11 инфекции, а, следовательно, и в проведении целенаправленных противоэпидемических мероприятий.

В целом полученные результаты свидетельствуют, что разработанные нами методы индикации и внутривидового дифференцирования ЭТШ продуцирущих птаммов s.aureus могут быть с успехом использованы .в практическое здравоохранении и являются перспективными для диагностики и профилактики синдрома токсического шока.

ВЫВОДЫ

I. Предложена схема выделения и очистки экзотоксина токсического шока из штамма продуцента s.aureus FRI - 1169, включающая осаждение ЭТШ из культуралыюЗ кцдкости сульфатом аммония, проведете катионообменной хроматографии с последующей гель-фильтрацией, позволяющая получать очищенный, биологичзски активный препарат 31Ш с молекулярной массой 23500 ~ 24000 Д.

2. Разработан хемилжминесцентннй экспресс-мегод определения биологической активности ЗШ, основанный на ингибируотеы действии токсина на уровень свечения сапрофитных биолшинесцирувдкх бактерий.

3. На основе антитоксической специфической сыворотки, полученной путей иммунизации кроликов очищенным препаратом ЗШ, отработаны в приыепенн тест-системы для выявления ЗШ продуцирущих шташоз- S.aureus в мшсробных супернатантах г на плотной питатель-вой среде в реакции шгмунодаффузионной преципитации в геле. '

4. ЗШ является одним из факторов патогенностн S. aureus , действие которого проявляется при определенных условиях в форме синдрома токсического иова, что подтверждает высокий процент 31Ш-тфодудирувдих штаммов (27,3 %) и широкое распространение их среди здоровых носителей и больных с различными формами стафилококковой инфекции.

5. Выявлена наибольшая частота продукции ЗШ шташа&ш s.aureus (72,7 %), выделенными от больных детей с характерными для СТШ клиническими проявлениями в сравнении со штаммами s.aureus , изолированными из других источников - 27,3 %.'

6. Шташы s.aureus , прлнаддегащне к I и Ш фаговым группам, достоверно чаще (64,0 % и 60,7 %) продуцирует ЭТШ, а нетипируемые фагами Международного набора штаммы значительно реже являются продуцентами ЗШ (28,1 %).

7. Установлено, что ЗШ продуцирухщие пташы S.aureus с достоверной разницей являются менее гемолитичншн, чем штачмы не продуцирующие ЗШ. Достоверно чаще продуцируют ЗШ культуры, устойчивые к мзтициллину.

8. Разработанный метод внутривидового дифференцирования штаммов s.«ureua , основанный на реакции вьмулодиффузионной преципитации в агаре, дает возможность установить источники кетипируеыых ЭТШ продуцирущих иташов, что не позволяет применимый в настоящее время метод фаго титрования с использованием Международного набора стафилофагов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Методы внутривидового дифференцирования стафшгококков й возможности его применения в лабораторной практике и эпидемисло-гаческом анализе. - Москва, 1988. - 6 с. - Деп. во ВНИИШ,

Л Д - 14907. - ,

2. Методы внутривидового дифференцирования стафилококков в микробиологической диагностике гнойно-септических заболеваний (Н.В.Карницкая, И.В.Васильева и др.). - // Всес. конф. "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционкой клинике". Тез.докл. -.Москва, 1988, - С. 133 - 135.

3. Метод определения антигенной идентичности стафилококков и его использование в лабораторной практике и эпидемиологическом анализе: Методические рекомендации (Н.В.Карницкая). - Москва,

МЗ РСФСР, 1989, - 9 с.'

4. Получение экзотоксийа Staphylococcus aureus , обусловливавшего синдром токсического шока и сывороток к нему // Обл. конф. молодых ученых "Эпидемиология, микробиология и иммунобиология бактериальных и вирусных инфекций". Тез. докл. - Ростов-на-Дону, 1989. - С. 47;

5. Изучение экзотоксина токсического шока ЭТШ-I S.aureus (Н.В.Карницкая). - // 2-ая Всес. конф. с международным участием "Бактериальные токсины". Тез. докл. - Юрмала, 1989. - С. 130.

5. Счистка экзотоксина токсического шока, выделенного из штамма s,aureus ж - IIS9 (Н.В.Карницкая). - // Сб.тр. ш-та им.Пастера "Стафилококковые инфекции" - Санкт-Петербург, 1991. -С. 85 - 88.

7. Синдром токсического шока ассоциированный со s.aureus (Г.В.Хмелевская, Л.В.Девтероьа). - // Там же. - С, 78 - 34.

8. Применение метода внутривидового дифференцирования стафилококков не типирушихся фагами в лабораторной практике (Н.В.Карницкая, А.Х.Кукса, В.С.Малыпева и др.). - П Там же. -С. I6S - 169.

9. Получение диагностических сывороток для индикации штаммов S.aureus, продуцирующих СТШ-гоксин. - Москва, 1991. - 8 с. - Деп. во ШИШИ, Л А - 21474.

10. Некоторые аспекты патогенетического действия экзотоксина токсического шока s.aureus(А.Ю.Антилоп, А.П.Шепелев). -// Известия Северо-Кавказского Научного центра высшей школы. Естественные науки. - 1991. - 3. - С. 224-I3G.