Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Методы диагностики активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков и устойчивости растений яровой пшеницы к заболеванию

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Методы диагностики активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков и устойчивости растений яровой пшеницы к заболеванию"

РГБ ОД

1 ? ОЕВ 1996

На правах рукописи

Березина Виолетта Юрьевна

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ОБЫКНОВЕННОЙ КО Р НЕ В О И Г И ИЛ1 \ 3Л А К ОВ И УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К ЗАБОЛЕВАНИЮ

06.01.11 —зашита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Новосибирск

!

УДК 632.25.07:633. II

Работа выполнена в Сибирском физико-техническом институте аграрных проблем СО РАСХН.

Научный руководитель кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Беребсрдин H.A.

Официальные оппоненты доктор сельскохозяйственных наук, профессор ЧулкинаВ. А.

кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Христов Ю. А.

Ведущая организация — Сибирский научно-исследовательский институт земледелия и химизации.

Защита состоится "_"_1995 г. в_часов на заседании специализированного совета Д. 120.32.01 при Новосибирском ордена Трудового Красного Знамени Государственном аграрном университете.

Адрес: 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160, зал заседаний.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского Государственного аграрного университета.

Автореферат разослан "_"_1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В. В. Токарев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важным резервом в повышении производства зерна является снижение потерь урожая от болезней. Обыкновенная корневая гниль относится к широко распространенным и вредоносным заболеваниям зерновых культур, вызывающим в Западной Сибири ежегодный недобор зерна от 10 до 20 % (Чулкина, 1985). Одним из наиболее эффективных методов борьбы с заболеванием является выведение устойчивых сортов.

В решении этой задачи большое значение имеет объективная оценка исходного материала и отбор устойчивых форм на ранних этапах селекции. Однако традиционные методы характеризуются большой трудоемкостью, продолжительностью и, как правило, не позволяют провести оценку с достаточной оперативностью, поэтому необходима разработка современных методов исследования и диагностической аппаратуры для экспрессной оценки активности фитопатогенов и устойчивости к ним растений.

Исследования зарубежных и отечественных ученых свидетельствуют о перспективности применения для этой цели биофизических методов, в частности, метода регистрации биохемилюминесценции клеток, тканей, жидкостей, величина которой является интегральным показателем энергетических процессов растительного организма в норме к при различных патологиях (Тарусов, Веселовский, 1978; Моргун и др., 1987).

Подобных исследований применительно к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков ранее не проводилось.

Цель исследований — разработка экспресс-методов оценки активности патогенных грибов и устойчивости растений яровой пшеницы к обыкновенной корневой гнили на основе регистрации уровня биохемилюминесценции.

Задача исследований:

1) изучить популяцию и выделить изоляты возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых культур;

2) определить патогенность и фитотоксичность изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых культур фитопатологи-ческими методами;

3) исследовать физико-химические свойства, уровень собственного свечения и индуцированной люминесценции культуральных фильтратов изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили, различающихся по патогенности;

4) изучить влияние токсинов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых культур на фотосинтетический аппарат растений;

5) исследовать уровень замедленной флуоресценции листьев сортов яровой пшеницы, различающихся по устойчивости к обыкновенном корневой гнили.

Основные результаты исследований и научная новизна. Выделены моноспоровые изоляты, представляющие популяцию возбудителя обыкновенной корневой гнили на территории полигона СибФТИ, определены их патогенность, фитотоксичность и физико-химические свойства культуральных фильтратов биофизическими методами.

Впервые исследован уровень собственной и хемииндуцированной люминесценции культуральных фильтратов изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили, различающихся по патогенное™. Выявлена обратная зависимость между величиной индуцированного свечения фильтратов и патогенностью изолятов.

Показано, что по относительному изменению уровня замедленной флуоресценции листьев яровой пшеницы после воздействия токсинов можно судить о степени устойчивости сорта к патогену.

Практическая ценность и реализация результатов. Выделены моноспоровые изоляты возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков с различной степенью патогенности для оценки сортообразцов на устойчивость к болезни.

Созданы новые экспресс-методы оценки сравнительной патогенности изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков, времени их максимальной фитотоксичности и относительной устойчивости к ним растений (а. с. №№ 1137755, 1367494, 1488976).

Разработаны методические рекомендации по проведению оценки биологической активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков биофизическими методами (Новосибирск, 1994).

Апробация. Результаты исследований обсуждались: на региональной конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1986); Всесоюзной школе-семинаре по биотермохе-милюминесценции (Суздаль, 1990); Всесоюзной научной конференции по экологическим проблемам защиты растений (Ленинград, 1990); научно-технической конференции (Паланга, 1991); конференции молодых ученых и аспирантов Сибири (Новосибирск, 1994).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в трех авторских свидетельствах, двух методических рекомендациях и 12 статьях, опубликованных в сборниках научных трудов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах, включая приложения. Состоит из введения, 5 глав, выводов и практических рекомендаций, содержит 38 таблиц, 6 рисунков, 20 приложений, список литературы из 198 наименований, в том числе 50 иностранных.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в Сибирском физико-техническом институте аграрных проблем в 1983-1993 гг. Объектами исследований являлись почвенные образцы, чистые культуры и культуральные фильтраты моноспоровых изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых культур, семена, проростки и растения сортов яровой пшеницы.

Почвенные и растительные образцы для микологического анализа отбирались на опытных делянках биополигона СибФТИ перед посевом и в фазы полных всходов, кущения, восковой спелости. Анализ микофлоры проводили на яровой пшенице сорта Новосибирская 67, посеянной по пару при норме посева 6 млн/га всхожих зерен по схеме: контроль (без удобрений); азотное удобрение (Ибо); полное минеральное удобрение (ЫбоР9оК45). Повторность опытов четырехкратная, учетная площадь делянки 100 м2.

Выделение почвенных грибов проводили методом Ваксмана (Билай, 1982), конидий В1ро1апз хогокЫапа — методом флотации (Ьешг^Ьат, Стпп, 1955), видовую идентификацию грибов — прямым микроскопированием. Учет количества грибных зародышей осуществляли по методике В. Н. Билай (1982).

Возбудителя обыкновенной корневой гнили из пораженных органов растений пшеницы выделяли на агаризованную среду Чапека. Выделение моноспоровых изолятов проводили по микробиологическим методикам (Хохряков, 1979; Билай, 1982). Всего было проанализировано 296 растительных образцов, 48 почвенных проб и 24 образца зерен различных сортов яровой пшеницы (Новосибирская 67, Зарница, Омская 9, Целинная 21, Саратовская 29, Скала). Выделено 11 моноспоровых изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков, 11 изолятов было получено из Красноярского научно-исследовательского института сельского хозяйства и 6 изолятов — из Сибирского научно-исследовательского института земледелия и химизации.

Изоляты культивировали на жидкой питательной среде Чапека с разными источниками азота (азотнокислый натрий, валин, глутами-новая и аспарагиновая кислоты) в течение 10-14 суток при температуре (22±0,5) °С. Биомассу гриба определяли весовым методом.

Фитотоксичность культуральных фильтратов определяли по степени ингибирования начального роста проростков на 6-е сутки,

критерием которого служил показатель корнеобеспечениости ростков (Оценка сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням в Сибири, 1981). Патогенность изолятов исследовали по методу В. Ла-чицовой в модификации Э. И. Лангольф (1981). Развитие болезни определяли по балловой шкале (Коршунова и др., 1976).

Активную кислотность и окислительно-восстановительный потенциал культуральных фильтратов измеряли по универсальном рН-метре типа № 5122, активность каталазы — титрометрическим методом (Билай, 1982).

Проростки яровой пшеницы различных сортов выращивали методом коррексов на водопроводной воде в течении 10-14 дней при освещенности 5000 лк.

Регистрацию собственного (ССС) и хемииндуцированного (ХИЛ) свечения культуральных фильтратов изолятов В. sorokiniana и замедленной флуоресценции (ЗФ) листовой ткани проростков производили на регистраторе сверхслабого свечения "ФОТОН", разработанном и изготовленном в СибФТИ СО РАСХН.

Для измерения ССС и ХИЛ 1 мл культурального фильтрата наливали в кювету из увеолевого стекла и помещали в регистрационную камеру, определяли фоновое и собственное свечение, а после добавления 1 мл свежеприготовленного 1 %-ного раствора перекиси водорода — хемииндуциро-ванное свечение (светосумму). Повторность опытов — четырехкратная.

Регистрацию ЗФ (светосумму) высечек из первых листьев проростков проводили после темновой адаптации в течение 15 минут. Длительность засветки образцов составляла 5 с, освещенность — 5000 лк.

Относительную устойчивость сортов яровой пшеницы к токсинам В. sorokiniana оценивали по сигналу ЗФ. Для этого из первого листа 10-14-дневных проростков делали высечки длиной 2 см. Контрольные образцы помещали в раствор Кнопа, а опытные — в культуральный фильтрат в разведении 1:1 и 1:3 раствором Кнопа.

Реакцию сорта на токсин определяли по относительному изменению (К) замедленной флуоресценции контрольных и опытных образцов (Березина и др., 1989):

K=\Jk-Jo\IJk, (1)

где Jk — суммарное свечение за 5 с контрольных образцов;

Jo— суммарное свечение за 5 с опытных образцов.

Статистическую обработку результатов проводили на ЭВМ типа IBM по пакету программ "Кинетический анализ замедленной флуоресценции".

АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНИ В ПОЧВЕ И ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНАХ РАСТЕНИЯ — ХОЗЯИНА

Почва. Наблюдения за динамикой численности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков в почве под первой пшеницей после пара позволили установить, что исходный потенциал возбудителя составлял менее 10, а в течение всей вегетации не более 18-22 конидии в 1 г воздушно-сухой почвы, что ниже порога вредоносности и характерно для парового предшественника. В те же сроки исследовали динамику общей численности почвенных грибов. Наименьшее их количество (2618 шт/г абсолютно сухой почвы) было перед посевом. В период полных всходов общая их численность увеличилась в 1,5-2,4 раза и особенно значительно (до 6385 шт/г) в контроле (без удобрений), а к моменту кущения достигла 9089 шт/г, что превосходило варианты с азотным и полным минеральным удобрением в 2,1 и 3,5 раза, соответственно. В фазу восковой спелости количество грибных зародышей изменялось от 4342 до 5872 шт/г абсолютно сухой почвы.

Вегетативные органы. Микологический анализ растений пшеницы с явными признаками болезни в фазе кущения (153 образца) и в восковую спелость (143 образца) показал, что преимущественно микофлора была представлена В. sorokiniana. При этом на фоне азотного удобрения поражение возрастало на 11-45% в сравнении с другими вариантами, что связано с большей восприимчивостью растений к обыкновенной корневой гнили при избытке нитратов. К концу вегетации уровень инфицирования растений В. sorokiniana увеличивался.

Анализ степени инфицирования органов растений пшеницы показал, что в фазе кущения междоузлия не поражались, а в восковую спелость их поражение в контроле и на фоне азотного удобрения составило 23-54 %. К этому времени возбудитель выделялся и из колосковых чешуй (5-31 %).

На фоне NPK поражение основания стебля повышалось на 15-30 %, а эпикотиля — снижалось на 19%. Внесение азотного и особенно полного минерального удобрения повышало на 15-26 % поражение колосковых чешуй. В меньшей степени по вариантам опыта изменялось инфицирование корня, которое в восковой спелости было несколько выше на контрольном варианте.

Внутренняя инфекция зерна пшеницы сорта Новосибирская 67 перед посевом была представлена, в основном, грибами рода Alternaría и Pénicillium (30-68 %), и в меньшей степени (3-4 %) Fusarium sp. и

В. sorokiniana. В микофлоре послеуборочного зерна во всех вариантах опыта наибольшая доля (66-82%) приходилась на грибы рода Alternaría. Плесневые грибы (Pénicillium sp.) составляли 1,3%, а возбудители корневой гнили (Fitsarium sp., В. sorokiniana) — от 8 до 23 %. Плотность популяции В. sorokiniana на зерне увеличивалась к концу вегетации и была наибольшей в варианте с азотными удобрениями (17 %), что связано с негативным влиянием нитратов на восприимчивость растений зерновых культур к обыкновенной корневой гнили.

Уровень развития болезни в течение вегетации по всем вариантам опыта возрастал с 1-2% во время полных всходов, до 15-20 % в фазу кущения и до 25-27 % в восковую спелость, что превышало порог вредоносности болезни в 3-5 раз.

Значительный уровень развития болезни к концу вегетации при низком содержании патогена в почве и семенной инфекции ниже порога вредоносности подтверждает экономическую значимость данного возбудителя для зоны и необходимость корректировки имеющихся и разработки новых методов исследования его паразитической активности и методов диагностики устойчивости растений к болезни, особенно на ранних этапах онтогенеза.

ИНФОРМАТИВНОСТЬ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИЗОЛЯТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ОБЫКНОВЕННОЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ ЗЛАКОВ

Окислительно-восстановительный потенциал и активная кислотность культуральных фильтратов. Почвенный аэроб В. sorokiniana развивается при достаточно высоких значениях окисп.чтсльно-вос-становительного потенциала. В замкнутой культуре в фазу неравномерного роста величина этого показателя составила 200-260 мВ, после чего происходило его неравномерное падение с выходом на некоторый стационарный уровень (изоляты № 421 и № 830), либо с последующим возрастанием (изоляты № 260 и № 420, табл. 1).

Наиболее интенсивное изменение редокспотенциала, обусловленное синтезом изолятами экзогенных метаболитов частично восстановленной природы, совпадало с логарифмической фазой роста гриба. Значение редокспотенциала к концу вегетации зависело от используемого источника азота. Так на среде Чапека с азотнокислым натрием оно составляло 256 мВ, на среде с валином — 186 мВ, а на средах с аспара-гиновой и глутаминовой кислотами — 50 и 3 мВ соответственно.

Таблица 1

Динамика окислительно-восстановительного потенциала (мВ) культуральных фильтратов В. sorokiniana, 1986 г.

№ изолянта Возраст культуры, сут.

3 5 7 10 12

233 228 ±2 239 ± 1 231 ±2 173 ± 1 121 ± 1

260 193 ±3 111 ± 1 111 ± 2 71 ± 1 91 ± 1

420 258 + 3 213 + 2 168+1 121 ± 1 131 ± 1

421 241 ±1 12В ±3 128+1 105 ± 1 97 ± 1

648 248 ±6 232 ± I I45± 1 150 ± I 147 ± I

830 238 ± 14 204 ±3 154± 1 85 ± 1 74 ± 1

Рост гриба на средах с азотнокислым натрием, глутаминовой и аспа-рагиновой кислотами сопровождался подщелачиванием фильтратов, а на валине — подкислением. За весь период инкубации рН среды изменялся на 1,5-2 единицы.

Изоляты В. sorokiniana достоверно различались по уровню редокс-потенииала, активной кислотности, каталазной активности, различия по приросту сухой и сырой биомассы были не существенны. Корреляция между этими параметрами и патогенностью изолятов слабая. Максимум токсинообразования, оцениваемый по корнеобеспечен-ности, у разных изолятов наступал не одновременно: у изолята № 233 на пятые сутки, у изолятов № 421, № 648, № 830 — на десятые. При этом максимум каталазной активности может опережать по времени максимум фитотоксичности (изолят № 420) или наступать позднее (изоляты № 233, № 421, № 830).

Биохемилюминесценция культуральных фильтратов. Нами установлено, чта культуральные фильтраты изолятов В. sorokiniana обладают собственным (ССС) и хемииндуцированным (ХИЛ) свечением (хемилюминесценцией). Оказалость, что динамика корнеобеспечен-ности проростков и собственного свечения культуральных фильтратов совпадают, их уровень определяется возрастом культуры и генотипом изолята (см. рисунок).

Зависимость данных показателей от времени описывается уравнением второго порядка с коэффициентом корреляции 0,75...0,85. Связи между значением собственного свечения культуральных фильтратов и патогенностью изолятов не обнаружено.

Установлено, что уровень хемииндуцированного свечения значительно выше собственного свечения и превышает фон в 10...100 раз. Для каждого изолята существует возрастная динамика ХИЛ, при этом

I I: Ш М '/IТ .\ЧГ>1

Инолмт № !:">()

200100

£ 90 2 НО 70 60 50

40

сх

5 30

1 /

/

2

У 1

{

\

\ У 2

У

2 4 С 8 10 12 14 2 4 Возраст культуры, сут.

Фитотоксичность (I) и собственное сверхслабое свечение (2) культуральных фильтратов изолятов В. югокШапа

6 8 10

ее максимум достигается не одновременно: у медленно растущих изолятов (№№ 64, 65, 214) он смещался к 9-12-м суткам, а быстрорастущие (№ 935) достигали его на 7-е сутки (табл. 2). Зависимость ХИЛ культуральных фильтратов изолятов от времени описывается следующими уравнениями: для изолята № 53:

У = 841 ехр (0,55х — 0,02x2), (6)

для изолята № 830:

Г = 1370 — 5212 1ях + 6056 ¡ё2х, (7)

где У— интенсивность ХИЛ культуральных фильтратов, % от контроля; х — время культивирования изолята, сут. Коэффициент корреляции этой связи составил 0,75...0,85. Нами также выявлено, что сильнопатогенные изоляты обладают более низким уровнем свечения, чем среднепатогенные. Максимальные различия между этими группами на 5 %-ном уровне значимости наблюдаются у 4-10-суточных культур.

Г а 6 л и ц а 2

Динамика хсминндуимровашюто свсчсиии (имп/100 с) культуральиых фильтратов MoiiocnopoHi.tx изолятов В. sorokiniana, 1990 г.

№ Возраст культуры, сут.

изолянта 2 5 7 9 12 14

Среда Чапека 890 940 962 864 976 923

64 5501 6432 7639 11594 6558 5300

65 5030 5291 7331 11148 8595 3469

214 3369 4350 6133 9735 10629 3334

935 1896 3697 9000 6457 5456 4522

Взаимосвязь физико-химических параметров культуральиых фильтратов. В результате исследований установлено, что между окислительно-восстановительным потенциалом, активной кислотностью, активностью каталазы, корнеобеспеченностью и биомассой гриба существует сильная взаимосвязь, особенно в логарифмическую фазу его роста. Корреляционные отношения парных комбинаций этих параметров составили 0,90...0,95. Редокспотенциал, активная кислотность и активность каталазы наиболее тесно связаны с сухой биомассой, тогда как корнеобеспеченность проростков зависит от параметров примерно в одинаковой степени (г = 0,7...0,75). При этом кривые накопления сухой биомассы являлись зеркальным отображением кривых редокспотенциала. На основании полученных данных и выявленных связей была построена и проанализирована следующая эмпирическая функция, которую можно использовать для определения периода максимальной метаболической активности изолятов В. sorokiniana:

f(EM,p) = Eh\np, (8)

где Eh — редокспотенциал, мВ;

р — сухая или сырая биомасса.

Выявлено, что в логарифмической фазе известноедля культуры бактерий условие выполняется также и для изолятов В. sorokiniana:

Eh\x\p = const. (9)

Определяя по экспериментальным значениям редоксопотенциала и сырой или сухой биомассы момент нарушения условия (9), можно оперативно и с определенной точностью оценивать время максимальной активности изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили (табл. 3).

Таблица 3

Время максимальной метаболической активности изолятов В. хогокЫапа, определяемое по фитотоксичности, редокспотенциалу и биомассе, сут.

Показатель № изолянта

233 420 421 648 830

/(Е/„ сухая биомасса) — 7-8 11-12 — 7-8

/(Е/,, сырая биомасса) 7-8 7 5-6 5-7 6-7

Фитотоксичность 7 8-9 6-7 5 7

Проведенные нами исследования выявили сильную корреляционную связь (0,90...0,99) между физико-химическими и биофизическими (собственным-ССС и индуцированным ХИЛ свечением) культураль-ных фильтратов В. зогокШапа.

Обнаруженная зависимость указывает на возможность эффективного использования хемилюминесцентного метода для оценки метаболической активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков, что является принципиально новым подходом в исследовании его патогенных свойств.

ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ПАТОГЕННОСТИ И ВРЕМЕНИ МАКСИМАЛЬНОЙ ФИТОТОКСИЧНОСТИ ИЗОЛЯТОВ В. ЭОИОЮИША

В основе экспрессного метода определения сравнительной патоген-ности изолятов В. ьогоктапа лежит экспериментально установленная нами зависимость уровня индуцированного раствором перекиси водорода свечения культуральных фильтратов от патогенности изолятов и времени их культивирования. При этом анализ необходимо проводить у одновозрастных культур на 6-10-е сутки от начала инкубирования, когда наблюдаются достоверные различия в интенсивности индуцированного свечения фильтратов.

Патогенность исследуемых изолятов оценивается по уровню ХИЛ их культуральных фильтратов относительно эталона-изолята, патогенность которого принимается за 100% (табл. 4). По уменьшению или увеличению показателя патогенности (К) судят соответственно и о патогенности других изолятов:

АГ=(У,/Уи)-100%, (10)

где JJ— интенсивность ХИЛ фильтрата изолята-эталона; Ju — интенсивность ХИЛ фильтрата исследуемого изолята.

Таблица 4

Определение сравнительно» патогашости изолятов В. \orokiniana по уровню ХИЛ, 1991 г.

Сильнопатогенные изоляты Слабопатогенные изоляты

№ 53 № 23 №451 №233 №211 № 150

Хемииндуцированное свечение, имп/мин

81800 86140 96500 112000 164300 180500

Показетель патогенности, %

100 95 85 73 50 45

Сильнопатогенные изоляты обладают более низким уровнем ХИЛ культуральных фильтратов. Оценка может проводиться и относительно изолятов с неизвестными патогенными свойствами. В этом случае за эталон берут наименьшее из значений (а. с. № 1367494).

1Сах отмечалось выше, функции собственного свечения культуральных'фильтратов и корнеобеспеченности описываются уравнениями второго порядка:

У = ах2 + Ьх + с, (11)

где У — интенсивность собственного сверхслабого свечения культуральных фильтратов или корнеобеспеченность; а, Ь, с — постоянные для изолята коэффициенты; х — время культивирования изолята, сутки.

Значения постоянных коэффициентов находят по результатам первых трех измерений уровня собственного свечения и, используя условие У' = 0, определяют ожидаемое время максимальной фитотоксичности каждого изолята (а. с. № 1137755).

Рассчитанное таким образом время опережает истинный экстремум не более, чем на 0,6-1,5 суток. При сокращении интервала между отдельными регистрациями свечения до 10-12 часов точность определения времени максимальной фитотоксичности изолятов повышается до 0,5 суток.

Разработанные методы рекомендуется использовать в исследованиях патогенных свойств возбудителей болезней растений в лабораторных условиях, что позволит повысить эффективность отбора соответствующих штаммов патогена и оценку устойчивости исходного материала к заболеваниям.

ОЦЕНКА ОТНОСИТЕЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ЯРОВОЙ ПЩЕНИЦЫ К ОБЫКНОВЕННОЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ ПО ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ЛИСТОВОЙ ТКАНИ

Замедленная флуоресценция листовой ткани (ЗФ) тесно связана с фотосинтетическим аппаратом растения, поэтому любые неблагоприятные биотические и абиотические воздействия могут приводить к изменению величины и кинетики сигнала ЗФ (Тарусов, Веселовский, 1978).

Токсины возбудителя обыкновенной корневой гнили подавляют транспорт электронов и окислительное фосфорилирование в митохондриях, в результате чего уровень ЗФ, в зависимости от степени повреждения фотосинтетического аппарата, либо возрастает, либо снижается.

Наши исследования показали, что статически достоверное изменение уровня свечения происходит в период максимальной токсичности возбудителя.

Экспресс-метод определения относительной устойчивости сортов яровой пшеницы к токсинам В. вогоктапа на основе регистрации ЗФ позволяет значительно сократить затраты труда и времени и увеличить производительность труда в 2-2,5 раза при оценке селекционного материала. Трудоемкость проведения одного анализа предлагаемым способом составляет 14 часов вместо 61 часа по стандартному методу (а. с. № 1488976). Реакция сортообразца на токсин определяется по относительному измерению замедленной флуоресценции контрольных (обработанных раствором Кнопа) и опытных (обработанных токсинами) листовых высечек по формуле (1). Чем меньше данное отношение, тем устойчивее к токсинам возбудителя корневой гнили злаков исследуемый сорт пшеницы или ячменя.

В таблице 5 представлены результаты определения относительной устойчивости сортов пшеницы к токсинам возбудителя традиционным и разработанным экспресс-методом.

Таблица 5

Оценка относительной устойчивости сортов яровой пшеницы к токсинам В. IогокШапа по сигналу замедленной флуоресценции, 1993 г.

Сорт Интенсивность свечения, имп/15 с (|Л — Л|/Л)-Ю0% Снижение урожайности, %

Контроль Опыт

Зарница 86 ООО 190 ООО 120,9 44,2

Мана 188 ООО 250 000 33,0 Не достоверно

Иртышанка 10 240 ООО 160 000 33,3 Не достоверно

Аниверсарио 150 ООО 260 000 73,3 20,4

По замедленной флуоресценции проведена оценка 18 сортов яровой пшеницы на устойчивость к обыкновенной корневой гнили, получено совпадение оценок фитопатологическими и люминесцентным методами.

ВЫВОДЫ

1. Численность конидий В. sorokiniana в почве под пшеницей после пара в течение вегетации растений составляет 18-22 конидий в 1 г воздушно-сухой почвы. Внесение минеральных удобрений повышает в микофлоре послеуборочного зерна с 18 до 32% долю грибов, вызывающих корневые гнили (Fusarium sp., В. sorokiniana). Азотное удобрение увеличивает содержание В. sorokiniana в общей микофлоре зерна на 6-7 %.

2. Заражение растений яровой пшеницы грибом В. sorokiniana достигает максимума (54-74 %) в фазу восковой спелости. Внесение полного минерального удобрения снижает поражение эпикотиля и повышает зараженность основания стебля и колосковых чешуй.

3. Развитие обыкновенной корневой гнили в популяции растений яровой пшеницы по паровому предшественнику при внесении минеральных удобрений возрастает с 1-2 % во время всходов, до 15-20 % в фазу кущения и до 25-27 % в восковую спелость, что в несколько раз превышает порог вредоносности болезни.

4. Обнаружено собственное и индуцированное раствором перекиси водорода свечение культуральных фильтратов изолятов возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков, уровень которого зависит от времени культивирования гриба и патогенности изолятов.

5. Окислительно-восстановительный потенциал, активная кислотность и концентрация каталазы в культуральных фильтратах изолятов В. sorokiniana изменяются в процессе культивирования. Зависимости этих параметров от патогенности изолятов не обнаружено.

6. Между собственным свечением, ХИЛ, окислительно-восстановительным потенциалом, кислотностью и активностью каталазы культуральных фильтратов, а также биомассой гриба и корнеобеспе-ченностью проростков выявлена сильная корреляционная связь. Наибольшая зависимость (г = 0,7...0,9) наблюдается в логарифмическую фазу роста гриба.

7. Обработка листьев проростков пшеницы токсинами возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков изменяет интенсивность замедленной флуоресценции и наиболее значительно при максимальной токсичности культуральных фильтратов патогена.

8. Реакция сортов яровой пшеницы на токсины В. хогокШапа оценивается по относительному изменению замедленной флуоресценции контрольных и опытных образцов высечек листьев 10-14-дневных проростков. Чем выше данный показатель, тем менее устойчив сорт к токсинам возбудителя.

9. Разработаны новые экспрессные методы определения сравнительной патогенности и времени максимальной фитотоксичности изо-лятов В. зогокшапа по собственному и хемииндуцированному свечению культуральных фильтратов, а также определения относительной устойчивости к патогену сортов зерновых культур по замедленной флуоресценции листьев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Время максимальной фитотоксичности изолятов В. зогокШапа определять по собственному свечению их культуральных фильтратов.

2. Сравнительную патогенность изолятов В. зогокШапа определять по индуцированному 1 %-ным раствором перекиси водорода свечению на 6-10-е сутки культивирования.

3. Относительную устойчивость сортов яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили оценивать по фотоиндуциро-ванному свечению листьев 10-14-дневных проростков.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

I Применение регистраторов сперхслабого свечения в диагностике растений и фито-патогепов (и соавторстве). // Измерительные п управляющие приборы и комплексы в сельскохозяйственном производстве: Сб иауч тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1984. С. 38-47.

2. Исследование фитотоксических свойств культуральных жидкостей моноспоровых изолятов Шра1иг1у хогокшапа в зависимости от условий хранения и обработки. // Современные экспресс-методы в исследовании растений и животных: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние.—Новосибирск, 1985 —С. 27-40.

3. Информативность физико-химических параметров для диагностики метаболической активности изолятов Шрокгя зогок1тапа (в соавторстве). // Современные экспресс-методы в исследовании растений и животных: Сб. науч. тр. // ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1985. — С. 16-26.

4. Развитие корневых гнилей яровой пшеницы на территории биополигона СОПКТБ СО ВАСХНИЛ (в соавторстве). // Технические средства и методы обеспечения биологических экспериментов в сельскохозяйственной науке: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1986. —С. 46-52.

5. Использование показателя хемииндуцированной люминесценции в изучении пато-генности изолятов гриба Шро1ат ¡огокМапа (в соавторстве). // Технические средства и методы обеспечения биологических экспериментов в сельскохозяйственной науке: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1986. — С. 53-58.

6. Использование флуоресцентного метода при оценке сортов зерновых культур на устойчивость к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков Шро1аги югоктшпа (в соавторстве). // VI Региональная конференция молодых ученых Сибири и Дальне! и Востока: Тезисы докл. -- Новосибирск, 1986. — С. 57.

7. Окислительно-восстановительный потенциал в диагностик мс!аииличсский а к 1 ив-ности изолятов В\ро1аг1я хогоктшпа (в соавторстве). // Методы и аппаратура для измерения параметров состояния растений и животных. Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1987. —С. 39-46.

8. А. с. № 1137755 СССР, МКИ А01 Н1/04, А01 07/00. Способ определения времени максимальной фитотоксичности культуральной жидкости грибов (в соавторстве). — № 3566540. — Заявлено 8.02.83; Зарег. 1.10.84.

9. А. с. № 1367494 СССР, МКИ А01 Н1/04, А 01 07/00. Способ определения патоген-ности моноспоровых изолятов возбудителя корневой гнили злаков (в соавторстве). — № 3697412. — Заявлено 21.11.83; Зарег. 15.09.87.

10. А. с. № 1488976 СССР, МКИ А01 07/00, А01 Н1/04. Способ определения относительной устойчивости сортов ячменя и пшеницы к токсинам возбудителя корневой гнили злаков (в соавторстве). № 4106479. — Заявлено 22.05.86; Зарег. 22.02.89.

11. Разработка биофизических методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. / Отчет о научно-исследовательской работе. № гос. регистрации 891113. — Краснообск, 1989. - 89 с.

12. Перспективы использования люминесцентного метода для оценки устойчивости растений к болезням (в соавторстве). // Экологические проблемы защиты растений: Сб. науч. тр. — Ленинград, 1990. — С. 23.

13. Использование хемилюминесцентного метода для оценки активности патогенов и устойчивости к ним растений (в соавторстве). // Методические указания Всесоюзной школы-семинара Биотермохемилюминесценция. — Суздаль 19-29 ноября 1990 г. — М„ 1990, —С. 81.

14. Оптико-электронные методы исследования биологических объектов (в соавторстве). // Средства и система автоматизации управления процессом сельскохозяйственного

производства: Тез докл. I научно-технической конференции. — Паланга, 1-5 октября 1991 г. М., 1991. — С. 91-92.

15. Применение люминесцентных методов в биологии и сельском хозяйстве (в соавторстве) // Методы и принципы действия приборов и научного оборудования для сельскохозяйственного производства: Сб. науч. тр. / РАСХН. Сиб. отд-ние. ФТИ. — Новосибирск, 1992. — С. 39-50.

16. Оценка биологической активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков (коллектив авторов): Методические рекомендации СО РАСХН. Новосибирск, 1994. — 24 с.

17. Оценка активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков люминесцентными методами. // Анализ современных аграрных проблем: Сб. науч. тр. молодых ученых и аспирантов. / Новосиб. гос. аграр. ун-т. — Новосибирск, 1994. — С. 106-111.