Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методические аспекты определения среднемолекулярных пептидов крови и их изменение при сахарном диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Методические аспекты определения среднемолекулярных пептидов крови и их изменение при сахарном диабете"

На правах рукописи

Василенко Дмитрий Викторович

Уэ-

МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СРЕДНЕМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ КРОВИ И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Рязань-2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Алабовский Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубинина Инесса Ивановна

кандидат медицинских наук Приступа Александр Сергеевич

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится декабря 2004 г. в 12 часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.084.01 при ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова Минздрава России» по адресу: 390026, Рязань, ул. Высоковольтная, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова Минздрава России» по адресу: 390026, Рязань, ул. Шевченко, 34

Автореферат разослан: ноября 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета к.б.н., доцент

Е. А. Рязанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. При многих патологических состояниях в тканях и биологических жидкостях накапливаются эндогенные токсические субстанции, являющиеся продуктами нормального или нарушенного обмена веществ. Развивается синдром эндогенной интоксикации. Для выбора оптимальной лечебной тактики необходимо установить не только сам факт интоксикации, который в острых и подострых случаях обычно очевиден, но и оценить его выраженность (А.И.Карлищенко, 2001).

Токсическими субстратами, ответственными за возникновение стадии аутоагрессии эндотоксикоза, могут быть продукты неполного распада белков крови и тканей, представленные в основном среднемолекулярными пептидами (СМП) с молекулярной массой от 500 до 5000 Дальтон (Да) (П К.Дьяченко, 1987; М.Я.Малахова, 1995; АХ.БаЪЪ, 1973, К.УапЪэЫег, 2003; 1.Р."МпсИе$1ег, 2004). В результате образуются пептиды с выраженной биохимической активностью вследствие их высокой агрегационной способности (З.А.Тупикова, 1983; А.К1ет, 1978).

В этой связи имеет большое научное и практическое значение выделение и количественное определение различных фракций белков и пептидов крови. В настоящее время хорошо освоены методы разделения отдельных фракций высокомолекулярных белков с помощью гель-хроматографии (Р.Скоупс, 1985). Однако методические аспекты выделения среднемолекулярных пептидов остаются недостаточно разработанными. Остаются пока неясными вопросы о выборе объекта исследования -плазму или сыворотку крови лучше всего исследовать для оценки фракционного состава среднемолекулярных пептидов.

Учитывая разную способность денатурирующих агентов осаждать белки, необходимо также разработать метод, позволяющий провести наиболее полное осаждение белков без потери фракций

I РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ*] I БИБЛИОТЕКА I

среднемолекулярных пептидов. Недостаточно данных о влиянии времени и температуры хранения образцов на результаты определения среднемолекулярных пептидов. В процессе хранения образцов вследствие протеолиза (К.Н.Веремеенко, 1988) может происходить накопление продуктов деградации белков, имеющих ту же молекулярную массу, что и среднемолекулярные пептиды.

В литературе нет данных о влиянии антикоагулянтов, времени и способах хранения образцов перед началом определения среднемолекулярных пептидов.

Представляло также большой интерес изучение возможности использования метода фракционирования среднемолекулярных пептидов в клинической практике, при заболеваниях, сопровождающихся эндотоксикозом, например, при сахарном диабете (СД). Научных исследований в данном направлении пока крайне недостаточно (В.И.Сидельникова, 1998), а полученные результаты часто противоречат друг другу.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилась разработка новых методических приемов измерения концентрации среднемолекулярных пептидов и исследование особенности распределения фракций среднемолекулярных пептидов у больных сахарным диабетом.

Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные способы осаждения крупномолекулярных белков крови для последующего определения фракционного состава среднемолекулярных пептидов методом гель-фильтрации.

2. Сравнить плазму и сыворотку крови в отношении информативности данных о содержании среднемолекулярных пептидов.

3. Изучить in vitro влияние различных антикоагулянтов на уровень среднемолекулярных пептидов в плазме крови.

4. Исследовать содержание среднемолекулярных пептидов и их фракционный состав в плазме у больных при неосложненном течении сахарного диабета 1-го и 2-го типов, используя новые оптимальные методические приемы измерения концентрации пептидов в крови.

5. Сопоставить результаты исследования среднемолекулярных пептидов у больных сахарным диабетом с показателями уровня пептидов у больных с осложнением сахарного диабета нефропатией.

Научная новизна. Установлено, что при использовании в качестве осадителя белков растворов трихлоруксусной кислоты (ТХУ) значительная часть пептидов оказывается осажденной и не выявляется в супернатанте. Также отмечено, что трихлоруксусная кислота выходит из хроматографической колонки с сефадексом G-25 вместе с пептидами, имеющими молекулярную массу около 1000 Да, существенно завышая значения их концентрации.

Показано, что использование для осаждения белков этилового спирта приводит к частичному осаждению наиболее значительной фракции среднемолекулярных пептидов, имеющих молекулярную массу более 1000 Да. При этом наблюдаются случаи недоосаждения альбумина и завышаются результаты определения концентрации среднемолекулярных пептидов.

Проведенными исследованиями установлено, что для получения очищенных фракций среднемолекулярных пептидов лучше всего удалять крупномолекулярные белки с помощью сульфата аммония. При этом в супернатанте преимущественно остаются пептиды и белки с молекулярной массой не более 15-20 кДа, что позволяет проводить дальнейшее фракционирование среднемолекулярных пептидов в колонках меньших объемов. В результате существенно ускоряется время анализа,

уменьшается расходование реактивов, что делает методику более доступной для применения в обычных биохимических лабораториях.

Впервые показано, что концентрация СМП в сыворотке меньше, чем в плазме. Степень снижения пептидов чаще всего пропорциональна тяжести эндотоксикоза. В результате у больных с эндогенной интоксикацией, сопровождающейся увеличением уровня среднемолекулярных пептидов в плазме, можно не обнаружить повышения концентрации пептидов в сыворотке, что приводит к ошибкам в определении степени тяжести эндотоксикоза и несвоевременному назначению дезинтоксикационной терапии.

Установлено, что применение различных антикоагулянтов (цитрат натрия, оксалат натрия, трилон Б, гепарин) in vitro не влияет на концентрацию СМП в плазме крови.

.Выяснено, что при хранении плазмы при низких температурах или замораживании происходит значительное снижение концентрации среднемолекулярных пептидов. Хранение проб при температуре +20°С вызывает значительное увеличение концентрации СМП через 1 час после взятия крови.

Показано, что при сахарном диабете в стадии субкомпенсации, не определяемой клинически, отмечается увеличение уровня среднемолекулярных пептидов плазмы. Осложнение течения СД нефропатией приводит к значительному снижению уровня пептидов в плазме, что коррелирует с уменьшением потребности в инсулине.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили упростить метод гель-фильтрационного определения среднемолекулярных пептидов, что дает возможность применять его в обычных биохимических лабораториях. Это позволит более точно оценить степень эндогенной интоксикации у конкретного больного и своевременно назначить адекватную терапию. • Более

экономный расход реактивов удешевляет исследование и уменьшает затраты рабочего времени.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Пироговской конференции молодых ученых и студентов (Москва, 2001, 2003 гг.), Всероссийской конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Воронеж, 2000 г.), межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых (Воронеж, 2004 г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Суммарную концентрацию среднемолекулярных пептидов и их фракционный состав можно определять в плазме крови больных с помощью гель-фильтрации после осаждения крупномолекулярных белков сульфатом аммония. При этом следует учитывать условия получения и хранения крови.

2. Сахарный диабет в стадии субкомпенсации сопровождается значительным увеличением уровня среднемолекулярных пептидов плазмы по сравнению с показателями здоровых людей. Эти изменения достаточно хорошо коррелируют с тяжестью клинических проявлений интоксикации.

3. Сахарный диабет, осложненный диабетической нефропатией, отличается значительным снижением уровня пептидов в плазме крови. Данные явления объясняют причину меньшей потребности в инсулине.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 215 наименования, из которых 97 на русском языке и 118 на иностранных языках.

Материалы и методы исследования

В работе использовано 13 образцов крови контрольной группы, 18 образцов крови больных с различными заболеваниями, сопровождающимися эндотоксикозом для определения концентрации СМП в плазме и сыворотке крови, изучении времени хранения образцов, а также влияния на концентрацию пептидов в плазме антикоагулянтов. В качестве антикоагулянтов использовали 3.8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении антикоагулянт : кровь 1 : 9; 1.8%-ный раствор оксалата натрия в соотношении 1 : 9; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б) в концентрации 2 мг/мл крови и гепарин 100 ед/мл крови (В.С.Камышников, 2000).

Для изучения концентрации СМП у больных СД использовалось 60 образцов крови больных. Из них 33 больных СД 1-го типа, 17 больных СД 2-го типа и 10 больных обоими типами СД в стадии субкомпенсации с сопутствующим пиелонефритом. Стадии нефропатии определялись по В.Р.Клячко (1974) и C.E.Mogensen (1983).

Для выделения СМП плазмы крови использовались колонки с сефадексом G-50 superfine. Определение концентрации пептидов проводилось спектрофотометрически при длине волны 220 нм (Р.Скоупс, 1985). При гель-фильтрации нативной плазмы использовались колонки размером 12X400 мм, объем колонки составлял 45 мл. Плазму либо ее супернатант после осаждения белков в количестве 0.1 мл вносили в колонку и элюировали 0.9% раствором хлорида натрия. Собирали 20 фракций по 3 мл. Молекулярную массу пептидов выражали в Дальтонах (Да). Для определения молекулярной массы пептидов колонку калибровали растворами голубого декстрана (молекулярная масса 2.000.000 Да), цитохрома С (молекулярная масса 12300 Да) и витамина (молекулярная масса 1360 Да) и рассчитывали объем выхода фракции Ve к общему объему геля в колонке Vo.

Для осаждения крупномолекулярных белков органическими кислотами использовалась методика Н.И.Габриэлян и соавт. (1981).

Осаждение крупномолекулярных белков с помощью органических растворителей проводилось по методу Т.И.Грековой в модификации В.И.Сидельниковой (1992).

Для осаждения крупномолекулярных белков насыщенным раствором сульфата аммония (СА) к плазме добавляли порошок СА до прекращения растворения, перемешивали стеклянной палочкой в течение 5 минут. Через 10 минут центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. 0.1 мл полученного прозрачного бесцветного супернатанта вносили в колонку и элюировали 0.9% раствором хлорида натрия.

В работе использовался Sephadex G-50 superfine фирмы Pharmacia Fine Chemicals AB Uppsala, Sweden. Соли и другие реактивы - фирмы «Диаэм», Россия.

Статистическая обработка результатов экспериментов была проведена на персональном компьютере Intel Pentium III с использованием программы статистического анализа Analysis ToolPak - VBA, входящего с состав лицензионной программы Microsoft Excel пакета Microsoft Office ХР АЕ (серийный номер 54521-701-3227086-17606). Оценку нормальности распределений проводили с использованием коэффициентов асимметрии и эксцесса.

Оценка достоверности результатов исследования проводилась с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Силу влияния изучаемого фактора определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (И.В.Поляков, 1975; С.Гланц, 1999).

Результаты и их обсуждение Оценка качества отделения пептидов от белков плазмы крови с помощью трихлоруксусной кислоты

При хроматографировании супернатанта плазмы после добавления ТХУ в конечной концентрации 5% получены очень высокие значения экстинкции в зоне выхода пептидов массой 800-1300 Да. Пересчет в единицы массы по калибровочным растворам альбумина и дипептида глицил-глицина дали результаты около 15 г/л, тогда как при хроматографировании нативной плазмы получены значения около 2 г/л. Для выяснения расхождений сняты спектры 5%-ного раствора ТХУ против элюирующего 0.9%-ного раствора хлорида натрия и проведено хроматографическое исследование этого же раствора ТХУ на колонке с сефадексом. Спектр ТХУ представлен на рисунке 1.

Рис. 1. Спектрограмма контрольного раствора трихлоруксусной кислоты против воды.

Из спектрограммы видно, что раствор ТХУ с концентрацией кислоты, соответствующей контрольной пробе имеет высокие значения

экстинкции, превышающие максимальную границу шкалы спектрофотометра. Поэтому невозможно определить экстинкцию проб на длинах волн, соответствующих максимуму поглощения пептидной связи. Реально измерение экстинкции возможно только с длин волн более 250 нм, на которых экстинкция пептидной связи минимальна.

При анализе хроматограммы ТХУ обнаружено, что её максимальный выход отмечается в объеме выхода 1-1.2 от общего объема колонки, что соответствует максимальному выходу пептидов группы средних молекул При совмещении хроматограммы супернатанта плазмы, обработанного раствором ТХУ с хроматограммой чистого контрольного раствора кислоты было обнаружено, что до 50% высоты хроматографического пика составляет экстинкция самой кислоты. Совмещения хроматограмм с вычислением доли пептидов представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Совмещение хроматограмм контрольного раствора трихлоруксусной кислоты, супернатанта плазмы после осаждения белков трихлоруксусной кислотой и разность между этими хроматограммами.

Вероятно, что линейная зависимость объема элюции вещества от молекулярной массы сохраняется для соединений, имеющих глобулярную структуру и может отсутствовать для молекул, не имеющих округлой формы, таких как трихлоруксусная кислота.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о некорректности использования ТХУ в качестве осадителя крупномолекулярных белков при исследовании СМП методом гель-фильтрации.

Оценка методики исследования средних молекул после осаждения крупномолекулярных белков этиловым спиртом

Для определения пептидного состава супернатанта, обработанного спиртом, проведена его гель-хроматография. Параллельно исследован пептидный состав нативной плазмы. Хроматограмма супернатанта нативной плазмы и обработанной этиловым спиртом представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Гель-хроматограмма нативной плазмы и после осаждения белков этанолом.

и

При сравнении результатов гель-фильтрации нативной плазмы и супернатанта после осаждения белков этиловым спиртом в конечной концентрации 87° обнаружено, что в спиртовом супернатанте присутствует небольшой пик в зоне 0.4-0.5 Уе/Уо, что по данным калибровки соответствует выходу белков массой 30.000-60.000 Да. Данная молекулярная масса характерна для таких белков, как альбумин. В зоне 0.8-1.0 Уе/Уо в спиртовом супернатанте по сравнению с нативной плазмой значительно снижен наиболее выраженный хроматографический пик СМП.

Таким образом, при использовании метода осаждения белков этиловым спиртом в супернатанте определяются пептиды с молекулярной массой менее 2000 Да. При изучении гель-хроматограмм спиртовых супернатантов обнаружено, что высота пика веществ массой более 30000 Да составляет 0.1 Ед экстинкции, а высота пика СМП - 0.2 Ед экстинкции. Следовательно, суммарная экстинкция спиртового супернатанта на 1/3 обусловлена крупными белками, не относящимися к СМП.

Наличие незначительного пика в зоне 0.4-0.5 Уе/Уо может свидетельствовать о присутствии растворенного альбумина (Г.В.Троицкий, 1991), что снижает диагностическую ценность данного исследования.

Оценка методики исследования средних молекул после осаждения крупномолекулярных белков сульфатом аммония

Использование сульфата аммония в качестве осадителя белков приводило к исчезновению хроматографических пиков в зоне выхода альбуминов. Хроматографирование насыщенного раствора сульфата аммония не сопровождается появлением хроматографических пиков в зоне выхода СМП. Хроматографические пики средних молекул нативной плазмы и после осаждения белков сульфатом аммония идентичны, что свидетельствует о том, что в данных растворах не происходит осаждения

СМП. Хроматограммы нативной плазмы и после осаждения белков сульфатом аммония представлены на рисунке 4.

Рис. 4. Гель-хроматограмма нативной плазмы и после осаждения белков сульфатом аммония в 100% насыщении.

Таким образом, оптимальным осадителем крупномолекулярных белков при исследовании СМП плазмы является насыщенный раствор сульфата аммония.

Влияние антикоагулянтов на результаты определения концентраций среднемолекулярнык пептидов плазмы

Исследовалась плазма больных с эндотоксикозом в стадии компенсации и клинически выраженным эндотоксикозом 2-3 стадии. Показано отсутствие различий при использовании различных антикоагулянтов (р=0,997) у больных в стадии компенсации эндотоксикоза. При изучении влияния антикоагулянтов на уровень СМП плазмы больных с клинически выраженным эндотоксикозом установлено,

что суммарное содержание пептидов также не различается. (р=0,996). Различий в содержании пептидов по фракциям в зависимости от вида антикоагулянта не обнаружено как у больных с эндотоксикозом в стадии компенсации, так и у больных с эндотоксикозом 2-3 стадии. Концентрации СМП у больных с эндотоксикозом в стадии компенсации и клинически выраженном эндотоксикозе 2-3 стадии представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Концентрация фракций СМП плазмы при использовании различных

антикоагулянтов у больных с эндотоксикозом в фазе компенсации

Антикоагулянт Фракции СМП г/л плазмы Суммарное содержание СМП

3-5 кДа 1-3 к Да 500-1000 Да

Цитрат натрия 0,383±0,06 0,764±0,13 0,332±0,03 1,48±0,13

Оксалат натрия 0,347±0,07 0,786±0,16 0,352±0,07 1,487±0,14

Трилон Б 0,384±0,06 0,789±0,15 0,317±0,03 1,472±0,13

Гепарин 0,374±0,05 0,777±0,14 0,332±0,03 1,485±0,13

Критерий Р 0,393 0,032 0,507 0,013

Уровень значимости р 0,759 0,991 0,681 0,997

Таблица 2

Концентрация фракций СМП плазмы при использовании различных антикоагулянтов у больных с эндотоксикозом 2-3 стадии

Антикоагулянт Фракции СМП г/л плазмы Суммарное содержание СМП

. 3-5 кДа 1-3 кДа 500-1000 Да

Цитрат натрия 1,156±0,72 1,052±0,24 0,341±0,18 2,55±0,65

Оксалат натрия 1,201±0,78 1,039±0,25 0,346±0,20 2,587±0,71

Трилон Б 1,145±0,72 1,064±0,26 0,334±0,18 2,544±0,68

Гепарин 1,077±0,62 1,093±0,23 0,338±0,18 2,501±0,60

Критерий Г 0,03 0,05 0,0039 0,0167

Уровень значимости р 0,992 1 0,984 0,999 0,996

Таким образом, вид антикоагулянта, добавляемого в кровь при получении плазмы, не влияет на показатели СМП у больных как при компенсированном эндотоксикозе, так и при клинически выраженном.

Сравнение уровней СМП в плазме и сыворотке крови у больных с эндотоксикозом различной этиологии

В группе больных с эндотоксикозом в стадии компенсации суммарное содержание СМП в плазме такое же, как сыворотке. При изучении фракционного состава пептидов отмечается уменьшение концентрации их в сыворотке во фракции 1-3 кДа (р=0,037). Изменений СМП во фракциях 3-5 кДа и 500-1000 Да в сыворотке по сравнению с плазмой не отмечено. В группе больных с клинически выраженным эндотоксикозом 2-3 стадии суммарное содержание СМП в сыворотке в 1.5 раза ниже, чем в плазме (р=0,0016). Изменения концентрации пептидов в плазме и сыворотке крови при эндотоксикозе в стадии компенсации и при клинически выраженном эндотоксикозе 2-3 стадии представлены на рисунках 5 и 6.

Рис. 5. Фракции среднемолекулярных пептидов плазмы и сыворотки при эндотоксикозе в фазе компенсации.

Анализ фракционного состава пептидов в данной группе больных показал, что наиболее выраженное снижение СМП в 2.4 раза отмечается во фракции 500-1000 Да (р=0,0079).

3-5 кДа 1-3 кДа 500-1000 Да Сумма СМП фракции СМП

Рис. 6. Фракции среднемолекулярных пептидов плазмы и сыворотки при эндотоксикозе 2-3 стадии.

В наиболее значительной фракции СМП массой 1-3 кДа снижение пептидов в сыворотке составило 30,25% от уровня в плазме (р=0,0077). Снижения пептидов фракции 3-5 кДа не обнаружено

Таким образом, в сыворотке отмечается более низкий уровень СМП ло сравнению с плазмой.

Влияние времени хранения и температуры на концентрацию среднемолекулярных пептидов плазмы

Обнаружено, что хранение плазмы при + 20°С в течение одного часа не приводило к изменению суммарной концентрации пептидов (р=0,704).

Изучение фракционного состава пептидов также не показало различий при хранении плазмы в течение одного часа. Через 2 часа после взятия крови отмечается достоверный рост уровня СМП в плазме в 1.26 раза. (р=0,03 17). Следовательно, хранение плазмы допустимо только в течение одного часа после взятия крови. При последующем хранении образцов отмечается значительное повышение концентрации пептидов плазмы в 1.73 раза с максимумом через 3 часа после взятия. В дальнейшем отмечается снижение концентрации СМП. Хранение пробы в холодильнике в течение 4 часов при + 4°С приводило к снижению уровня пептидов в плазме на 30,16% ниже уровня СМП в момент взятия крови. Замораживание плазмы с последующим однократным оттаиванием приводило к существенному (в 2.02 раза) уменьшению концентрации СМП. Динамика изменения суммарной концентрации СМП при хранении плазмы представлена на рисунке 7.

Рис. 7. Изменение суммарной концентрации СМП в процессе хранения образцов при + 20°С.

По данным дисперсионного анализа, влияние времени хранения плазмы на суммарный уровень среднемолекулярных пептидов существенно и составляет 88,85%, тогда как на долю других неучтенных в данном исследовании факторов, таких как температура хранения, влияние контактной активации системы свертывания, различных видов патологии приходится лишь 11,15%.

Влияние протеолиза при длительном хранении плазмы, полученной у больных с деструктивными формами панкреатитов на

показатели среднемолекулярных пептидов крови

В процессе хранения плазмы больных острыми панкреатитами (ОП) при температуре + 20°С в течение одного часа выявлено увеличение суммарной концентрации пептидов на 68% (р=0,018). Наибольшие изменения отмечены во фракциях пептидов массой 3-5 кДа (р=0,017) и 1-3 кДа (р=0,022). Уровень пептидов фракции 500-1000 Да остался без существенных изменений (р=0,916). Динамика изменения концентрации СМП при хранении плазмы больных с ОП в течение 1 часа представлена на рисунке 8.

Следовательно, при заболеваниях, сопровождающихся усилением протеолитической активности крови исследование концен грации СМП необходимо проводить сразу же после забора биологического материала.

3-5 кДа 1-3 кДа 500-1000 Сумма Да СМП

Фракции пептидов

Рис. 8. Изменение концентрации пептидов различных фракций у больных острым панкреатитом при хранении плазмы в течение 1 часа при + 20°С.

Распределение фракций среднемолекулярных пептидов плазмы крови у больных сахарным диабетом

При обследовании больных сахарным диабетом в стадии компенсации обнаружено, что суммарное содержание СМП у больных СД 1-го типа в 1.4 раза меньше, чем при СД 2-го типа (р=0,0103). У больных в стадии субкомпенсации суммарный уровень СМП при СД 1-го типа и СД 2-го типа не различается (р=0,069). У больных СД 1-го типа в состоянии декомпенсации суммарный уровень СМП такой же, как и при субкомпенсации. При проведении анализа фракционного состава СМП у больных СД 1-го типа и СД 2-го типа без поражения почек установлено, что содержание пептидов массой 3-5 кДа в стадиях компенсации, субкомпенсации и декомпенсации не различается (р=0,27).

При изучении концентрации СМП массой 1-3 кДа установлены достоверные различия между их уровнем при ухудшении течения СД и

переходу процесса из стадии компенсации в субкомпенсацию и декомпенсацию как у больных СД 1-го типа, так и в группах больных СД 2-го типа. Содержание пептидов в крови у больных СД без поражения почек представлены в табл. 3.

Таблица 3

Содержание пептидов в плазме крови при СД без поражения почек

Тип диабета Степень компенсации Пептиды г/л плазмы

3-5 кДа 1-3 кДа 700-1000 Да Сумма СМП

СД 1-го типа компенсированный 0,53±0,0 4 0,6±0,09 0,17±0,09 1,31±0,11

Субкомпенсирован-ный 0,47±0,2 2 р=0,6 0,97±0,2 1 р=0,04 0,23±0,08 р=0,32 1,69±0,43 р=0,073

Декомпенсирован-ный 0,36±0,2 р,=0,4 0,88±0,0 8 Р.=0,37 0,19±0,07 Р|=0,5 1,44±0,28 Р.=0,31

СД 2-го типа компенсированный 0,63±0,1 8 р2=0,23 0,95±0,2 3 р2=0,011 0,25±0,03 Р2=0,Н 1,84±0,37 р2=0,01

Субкомпенсирован-ный 0,64±0,2 5 Рз=0,94 1,2±0,12 рз=0,045 0,32±0,21 р3=0,55 2,17±0,37 Рз=0,19

Обозначения: р - достоверность ошибки различий уровня СМП между

субкомпенсированным и компенсированным СД 1-го типа; р> - достоверность ошибки различий уровня СМП между декомпенсированным и субкомпексированныч СД 1-го типа; рг - достоверность ошибки различий уровня СМП между СД 2-го типа и СД 1-го типа в стадии компенсации; рз - достоверность ошибки различий уровня СМП субкомпенсированным и компенсированным СД 2-го типа

Таким образом, у больных СД без признаков заболевания почек имеются отличия по суммарному содержанию СМП. Уровень пептидов выше при СД 2-го типа. При ухудшении течения СД и переходе процесса в состояние субкомпенсации, отмечается увеличение уровня СМП как при СД 1-го типа, так и при СД 2-го типа. Увеличение уровня СМП более

значительно при СД 1-го типа. Суммарный уровень пептидов повысился при СД 1-го типа на 22.4% и при СД 2-го типа на 15.2%. При изучении фракционного состава СМП изменения отмечены только в уровне пептидов массой 1-3 кДа. Вероятными механизмами увеличения концентрации пептидов в плазме при диабете является усиление распада собственных белков для использования их в энергетическом обмене при дефиците глюкозы' в клетках. Повышение концентрации СМП при переходе диабета в стадию субкомпенсации, вероятно, связано с усилением протеолиза белков в целях использования аминокислот в процессе глюконеогенеза. Уменьшение пептидов при декомпенсации сахарного диабета может быть объяснено развитием кетоацидоза с угнетением активности внеклеточных протеиназ.

Изменение концентрации СМП у больных СД в стадии субкомпенсации при осложнении его течения нефропатией и пиелонефритом

Содержание СМП в плазме крови существенно отличалось у больных СД 1-го и 2-го типов в стадии субкомпенсации и больных таких же типов СД с сопутствующим пиелонефритом. При пиелонефрите их концентрация в среднем в 1,4 раза выше, чем при СД без поражения почек (р=0.016).

Однако специфическим патогенетическим осложнением СД является диабетическая нефропатия (НХСтаркова, 1991). Поражение почек при сахарном диабете (Л.Р1шошаг, 1999; C.E.Mogensen, 2000; Т.1пика1, 2000; МА.8а1ет, 2002) может приводить к усилению интоксикации организма среднемолекулярными пептидами.

В дальнейших исследованиях изучался уровень пептидов и низкомолекулярных белков у больных СД с нефропагией без сопутствующего пиелонефрита.

При сравнении суммарного содержания СМП установлено значительное снижение в их содержании во всех группах обследованных (р=0,0000005). При переходе нефропатии в протеинурическую стадию у больных СД 1-го типа наблюдается рост суммарного уровня СМП в плазме крови в 1.67 раза. Однако их уровень остается меньше, чем в группе больных без нефропатии. Переход в уремическую стадию, сопровождающуюся развитием ХПН 1 стадии, не приводит к значимому изменению уровня СМП в плазме. Факт снижения концентрации СМП у больных диабетической нефропатией не описан в литературе и требует дальнейшего изучения. Содержание пептидов различных фракций при осложнении течения диабета нефропатией представлены в табл. 4.

Таблица 4

Содержание СМП в плазме крови у больных СД в стадии

субкомпенсации при осложнении диабетической нефропатией

Тип Наличие Пептиды г/л плазмы

диабета нефропатии 3-5 кДа 1-3 кДа 700-1000 Да Сумма СМП

СД 1-го Нет 0,47±0,22 0,97±0,21 0,23±0,08 1,69±0,43

типа Начальная 0,42±0,19 0,36±0,П 0,08±0,06 0,87±0,08

р=0,67 р=0,00016 р=0,011 р=0,0014

Протеин-урическая 0,45±0,16 Р!=0,73 0,78±0,23 р,=0,0016 0,22±0,1 р,=0,013 1,46±0,25 Р1=0,00015

Уремичес- 0,66±0,17 0,53±0,03 0,14±0,11 1,34±0,02

кая Р2=0,097 р2=0,104 Рз=0,31 Р2=0,43

СД 2-го Нет 0,64±0,25 1,2±0,12 0,32±0,21 2,17±0,37

типа Начальная 0,32±0,05 0,55±0,11 0,21±0,13 1,095±0,13

Рз=0,012 р3=0,000001 4 рз=0,28 рз=0,00003 7

Обозначения: р- достоверность ошибки различий уровня СМП СД 1-го типа при

начальной нефропатии по отношению к СД 1-го типа без нефропатии; р| достоверность ошибки различий уровня СМП при протеинурической нефропатии по отношению к начальной; - достоверность ошибки различий уровня СМП при уремической нефропатии по отношению к протеинурической; рз - достоверность.

ошибки различий уровня СМП СД 2-го типа при начальной нефропатии по отношению к СД 2-го типа без нефропатии.

Следовательно, при осложнении течения СД диабетической нефропатией в начальной стадии как при СД 1-го типа, так и при СД 2-го типа происходит снижение уровня СМП в плазме, вероятно за счет усиления почечной фильтрации. При ухудшении течения нефропатии и переходе ее в протеинурическую и далее в нефросклеротическую (уремическую) стадии происходит накопление низкомолекулярных белков и крупных пептидов, вероятно за счет снижения скорости клубочковой фильтрации.

Параллельно со снижением концентрации пептидов в крови больных диабетом, осложнившимся диабетической нефропатией отмечается снижение потребности в инсулине. Предполагается, что увеличение эффективности действия инсулина обусловлено уменьшением активности инсулиназы в почках (Н.Т.Старкова, 1991). Учитывая полученные нами данные, а также высокую адгезивную способность среднемолекулярных пептидов (ЖЬих, 1975), можно предположить возможность второго механизма снижения потребности в инсулине - уменьшении его инактивации адгезивными пептидами.

Таким образом, проведенные исследования позволяют повысить возможности диагностики эндогенной интоксикации и своевременно корригировать лечебные мероприятия.

Выводы.

1. Широко применяемые в лабораторной диагностике методы осаждения белков трихлоруксусной кислотой и этанолом не могут быть использованы для определения фракционного состава среднемолекулярных пептидов. В качестве осадителя

крупномолекулярных белков из плазмы крови с последующим фракционированием пептидов рекомендуется использовать сульфат аммония в 100% насыщении.

2. Среднемолекулярные пептиды следует выявлять в плазме, а не в сыворотке крови. При этом необходимо учитывать влияние температуры и длительности хранения образцов на результаты измерения фракционного состава пептидов крови.

3. Применение различных антикоагулянтов (цитрат натрия, оксалат натрия, динатриевая соль этилендиаминтетраацетата, гепарин) для получения плазмы не оказывает заметного влияния на результаты измерения концентрации среднемолекулярных пептидов.

4. При сахарном диабете 1-ю и 2-го типов в плазме крови больных наблюдается значительное увеличение уровня среднемолекулярных пептидов, главным образом за счет фракции массой 1-3 кДа. Ухудшение течения сахарного диабета с переходом в стадию субкомпенсации сопровождается еще более выраженным повышением уровня среднемолекулярных пептидов у больных обоими типами сахарного диабета.

5. Развитие начальной стадии диабетической нефропатки вызывает понижение всех фракций среднемолекулярных пептидов по сравнению с аналогичными показателями у больных сахарным диабетом, протекающим без осложнения нефропатией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Диагностика эндогенной интоксикации: Обзор литературы // Новое в диагностике и лечении заболеваний: Сб. науч. тр. студентов, посвящ. 80-летию Воронежской гос. мед. акад. им. Н.Н.Бурденко. -Воронеж, 1998. - С. 3-7. - (Соавт.: М.В.Пашков, ИА.Тюркин).

2. Влияние условий хранения образцов крови на уровень среднемолекулярных пептидов // Современные проблемы

экспериментальной и клинической медицины : Труды Всерос. конфер. -Воронеж, 2000. - С. 124. - (Соавт.: Д.А.Ермолов, Д.Н.Погорелов, Р.Р.Карамышев).

3. Достоинства и недостатки метода определения пептидов средней молекулярной массы, экстрагированных спиртом // Вестн. Рос. гос. мед. ун-та. - 2001.- Т. 17, № 2. - С. 122. - (Совм. с: А.Л.Антипко, М.В.Пашков, Д.Н.Погорелов).

4. Среднемолекулярные пептиды плазмы и мочи при сахарном диабете, осложненном нефропатией // Вестн. Рос. гос. мед. ун-та. - 2001. -Т. 17, № 2.-С. 125.

5. Концентрация среднемолекулярных пептидов плазмы крови при использовании различных антикоагулянтов // Вестн. Рос. гос. мед. ун-та. -2003. - Т.28, № 2. - С.151. - (Соавт.: М.В.Пашков, А.И.Маслов, В.О.Лукашев, А.П.Остроушко).

6. Зависимость концентрации среднемолекулярных пептидов «в плазме крови от температуры и времени хранения // Новые технологии в биологии и медицине: Сб. материалов межрегион. науч-практ. конф. молодых ученых. - Воронеж, 2004. - С. 216-219. - (Соавт.: В.ВАлабовский).

7. Среднемолекулярные пептиды плазмы крови при диабетической нефропатии // Журн. теоретической и практической медицины. - 2004. -Т.2, № 3. - С. 203-205. - (Соавт.: В.В.Алабовский, А.И.Маслов, А.П.Остроушко).

ЛР ИД №00437 от 10 11 99 Заказ №818 Тираж 100 Формат 60x84 '/ Объем 1,5 п

Отпечатано в типографии ВГУ 394000, г Воронеж, ул Пушкинская, 3

«24515

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Василенко, Дмитрий Викторович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Понятие об эндогенной интоксикации.

1.2 Маркеры эндогенной интоксикации.

1.3 Химическая структура молекул средней массы.

1.4 Биологические свойства молекул средней массы.

1.5 Методы выделения среднемолекулярных пептидов из биологических жидкостей.

1.6 Патогенез и некоторые клинико-диагностические аспекты сахарного диабета.

1.7 Особенности метаболизма у больных сахарным диабетом.

1.8 Поражение почек при сахарном диабете.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Результаты исследования.

Глава 3. Усовершенствование способа обработки проб плазмы крови перед проведением хроматографических исследований.

3.1 Оценка качества отделения пептидов от белков плазмы крови с помощью трихлоруксусной кислоты.

3.2 Оценка методики исследования средних молекул после осаждения крупномолекулярных белков этиловым спиртом.

3.3 Оценка методики исследования средних молекул после осаждения крупномолекулярных белков сульфатом аммония.

Глава 4. Методические аспекты определения среднемолекулярных пептидов в доаналитической стадии исследования.

4.1 Влияние антикоагулянтов на результаты определения концентраций среднемолекулярных пептидов плазмы.

4.2 Сравнение уровней СМП в плазме и сыворотке крови у больных с эндотоксикозом различной этиологии.

4.3 Влияние времени хранения и температуры на концентрацию среднемолекулярных пептидов плазмы.

4.4 Влияние протеолиза при длительном хранении плазмы, полученной у больных с деструктивными формами панкреатитов на показатели среднемолекулярных пептидов крови.

Глава 5. Распределение фракций среднемолекулярных пептидов плазмы крови у больных сахарным диабетом.

5.1 Изменение уровня СМП у больных сахарным диабетом 1-го и

2-го типов в зависимости от степени компенсации.

5.2 Изменение концентрации СМП у больных СД при осложнении его течения нефропатией и пиелонефритом.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методические аспекты определения среднемолекулярных пептидов крови и их изменение при сахарном диабете"

Актуальность темы. При многих патологических состояниях в тканях и биологических жидкостях накапливаются эндогенные токсические субстанции (ЭТС), являющиеся продуктами нормального или нарушенного обмена веществ, накапливающихся в избытке [48, 49, 52, 54, 80, 107, 160, 168, 173, 178, 188]. Развивается синдром эндогенной интоксикации (ЭИ) [54]. Для выбора оптимальной лечебной тактики необходимо установить не только сам факт интоксикации, который в острых и подострых случаях обычно очевиден, но и оценить его выраженность [11, 27, 32, 57, 76, 87, 91].

Для диагностики ЭИ традиционно используют два подхода - клинический и лабораторный, которые дополняют друг друга [52, 57, 58]. Клиническая оценка эндотоксикоза не лишена субъективности, сопряжена с опытом и знаниями врача. Это затрудняет раннюю диагностику эндогенной интоксикации, что может приводить к несвоевременному началу соответствующей терапии. Поэтому большое значение для диагностики эндотоксикоза, особенно его хронических форм, придается лабораторным исследованиям [39, 58, 63, 76].

Различают специфическую и неспецифическую лабораторную диагностику эндогенной интоксикации. С помощью специфических тестов можно выявить действие токсичных агентов, вызывающих синдром интоксикации. Однако данные исследования возможны лишь для ограниченного числа заболеваний. Используемые методы часто либо сложны для повседневного применения, либо дорогостоящи [54, 58]. Поэтому в лабораторной диагностике применяются в основном неспецифические методы, являющиеся интегральными показателями токсичности той или иной среды организма без учета этиологических и нозологических особенностей заболевания [58].

В настоящее время считается [10, 12, 14, 18, 23, 26, 43, 45, 54, 57, 58, 89, 119, 125, 130, 151, 165, 169], что основным токсическим субстратом, ответственным за возникновение стадии аутоагрессии эндотоксикоза могут быть продукты неполного распада белков крови и тканей, представленные в основном среднемолекулярными пептидами (СМП) с молекулярной массой от 500 до 5000 Дальтон (Да) [126, 187, 214]. Основным источником образования среднемолекулярных пептидов считается усиление протеолиза белков крови и тканей. В результате образуются пептиды с мощной функциональной активностью вследствие их высокой агрегационной способности [79, 167, 172].

В этой связи большое научное и практическое значение имеет выделение и количественное определение различных фракций белков и пептидов крови. В настоящее время хорошо освоены методы разделения отдельных фракций высокомолекулярных белков с помощью гель-хроматографии [77,146, 171, 195, 203, 208]. Однако методические аспекты выделения среднемолекулярных пептидов остаются пока недостаточно разработанными. Остается пока неясным вопрос о выборе объекта исследования - плазму или сыворотку крови лучше всего исследовать для оценки фракционного состава среднемолекулярных пептидов.

Учитывая разную способность денатурирующих агентов осаждать белки, необходима также разработка метода, позволяющего наиболее полно осаждать белки без потери фракций среднемолекулярных пептидов.

В доступной нам литературе мы не нашли достаточно полных данных о влиянии антикоагулянтов, времени и способах хранения образцов перед началом определения среднемолекулярных пептидов.

Представляло также большой научный и практический интерес изучение возможности использования метода фракционирования среднемолекулярных пептидов в клинической практике, при заболеваниях, сопровождающихся эндотоксикозом, например, при сахарном диабете. Научных исследований в данном направлении пока крайне недостаточно, а полученные результаты часто противоречат друг другу [76].

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилась разработка новых методических приемов измерения концентрации среднемолекулярных пептидов и исследование особенности распределения фракций среднемолекулярных пептидов у больных сахарным диабетом.

Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные способы осаждения крупномолекулярных белков крови для последующего определения фракционного состава среднемолекулярных пептидов методом гель-фильтрации.

2. Сравнить плазму и сыворотку крови в отношении информативности данных о содержании среднемолекулярных пептидов.

3. Изучить in vitro влияние различных антикоагулянтов на уровень среднемолекулярных пептидов в плазме крови.

4. Исследовать содержание среднемолекулярных пептидов и их фракционный состав в плазме у больных при неосложненном течении сахарного диабета 1-го и 2-го типов, используя новые оптимальные методические приемы измерения концентрации пептидов в крови.

5. Сопоставить результаты исследования среднемолекулярных пептидов у больных сахарным диабетом с показателями уровня пептидов у больных с осложнением сахарного диабета нефропатией.

Научная новизна. Установлено, что при использовании в качестве осадителя белков растворов трихлоруксусной кислоты (ТХУ) значительная часть пептидов оказывается осажденной и не выявляется в супернатанте. Также отмечено, что трихлоруксусная кислота выходит из хроматографической колонки с сефадексом в-25 вместе с пептидами, имеющими молекулярную массу около 1000 Да, существенно завышая результаты измерения их концентрации.

Показано, что использование в качестве осадителя белков этилового спирта приводит к частичному осаждению наиболее значительной фракции среднемолекулярных пептидов, имеющих молекулярную массу более 1000 Да. При этом наблюдаются случаи недоосаждения альбумина, в результате чего завышаются результаты определения концентрации среднемолекулярных пептидов.

Проведенными исследованиями установлено, что для получения очищенных фракций среднемолекулярных пептидов лучше всего , удалять крупномолекулярные белки с помощью сульфата аммония. При этом в супернатанте преимущественно остаются вещества с молекулярной массой не более 15-20 кДа, что позволяет проводить дальнейшее фракционирование пептидов в колонках меньших объемов. В результате существенно ускоряется время анализа, уменьшается расходование реактивов, что делает методику более доступной для применения в обычных биохимических лабораториях.

Впервые показано, что концентрация среднемолекулярных пептидов в сыворотке меньше, чем в плазме. При этом степень снижения пептидов чаще всего пропорциональна тяжести эндотоксикоза. Различная тяжесть эндогенной интоксикации сопровождается изменением концентрации среднемолекулярных пептидов в плазме и сыворотке.

Установлено, что различные антикоагулянты in vitro не влияют на концентрацию среднемолекулярных пептидов в плазме крови.

Выяснено, что при хранении плазмы при низких температурах или замораживании происходит значительное снижение концентрации среднемолекулярных пептидов. Хранить пробы при комнатной температуре можно не более 30 минут после взятия крови. Исследование может быть отсрочено на сутки после осаждения белков сульфатом аммония, последующего центрифугирования и отделения безбелкового супернатанта.

Показано, что при сахарном диабете в стадии субкомпенсации, не определяемой клинически, отмечается увеличение уровня среднемолекулярных пептидов плазмы. Осложнение течения сахарного диабета нефропатией приводит к значительному снижению уровня пептидов в плазме, что коррелирует с уменьшением потребности в инсулине.

Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований позволяют модифицировать метод гель-фильтрационного определения среднемолекулярных пептидов, что дает возможность применять его в обычных биохимических лабораториях. Это позволит более точно оценить степень эндогенной интоксикации у конкретного больного и своевременно назначить адекватную терапию. Более экономный расход реактивов удешевляет исследование и уменьшает затраты рабочего времени.

Изучение динамики изменений фракций среднемолекулярных пептидов при сахарном диабете позволяет оценить тяжесть интоксикации и своевременно назначить корригирующую терапию.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Пироговской конференции молодых ученых и студентов (Москва, 2001, 2003 гг.), Всероссийской конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Воронеж, 2000 г.), межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых (Воронеж, 2004 г.).

Работа выполнена без соавторства. Из научных результатов, опубликованных в соавторстве, в диссертацию включены данные, выполненные лично автором.

Положения, выносимые на защиту.

1. Суммарную концентрацию среднемолекулярных пептидов и их фракционный состав можно определять в плазме крови больных с помощью гель-фильтрации после осаждения крупномолекулярных белков сульфатом аммония. При этом следует учитывать условия получения и хранения крови.

2. Сахарный диабет в стадии субкомпенсации сопровождается значительным увеличением уровня среднемолекулярных пептидов плазмы по сравнению с показателями здоровых людей. Эти изменения достаточно хорошо коррелируют с тяжестью клинических проявлений интоксикации.

3. Сахарный диабет, осложненный диабетической нефропатией, отличается значительным снижением уровня пептидов в плазме крови. Данные явления объясняют причину меньшей потребности в инсулине.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Василенко, Дмитрий Викторович

Выводы.

1. Широко применяемые в лабораторной диагностике методы осаждения белков трихлоруксусной кислотой и этанолом не могут быть использованы для определения фракционного состава среднемолекулярных пептидов. В качестве осадителя крупномолекулярных белков из плазмы крови с последующим фракционированием пептидов рекомендуется использовать сульфат аммония в 100% насыщении.

2. Среднемолекулярные пептиды следует выявлять в плазме, а не в сыворотке крови. При этом необходимо учитывать влияние температуры и длительности хранения образцов на результаты измерения фракционного состава пептидов крови.

3. Применение различных антикоагулянтов (цитрат натрия, оксалат натрия, динатриевая соль этилендиаминтетраацетата, гепарин) для получения плазмы не оказывает заметного влияния на результаты измерения концентрации среднемолекулярных пептидов.

4. При сахарном диабете 1-го и 2-го типов в плазме крови больных наблюдается значительное увеличение уровня среднемолекулярных пептидов, главным образом за счет фракции массой 1-3 кДа. Ухудшение течения сахарного диабета с переходом в стадию субкомпенсации сопровождается еще более выраженным повышением уровня среднемолекулярных пептидов у больных обоими типами сахарного диабета.

5. Развитие начальной стадии диабетической нефропатии вызывает понижение всех фракций среднемолекулярных пептидов по сравнению с аналогичными показателями у больных сахарным диабетом, протекающим без осложнения нефропатией.

Практические рекомендации.

1. Для определения уровня среднемолекулярных пептидов необходимо использовать плазму, а не сыворотку крови.

2. Для осаждения крупномолекулярных белков при фракционировании среднемолекулярных пептидов плазмы на колонках с сефадексом необходимо использовать сульфат аммония в 100% насыщении.

3. Исследование концентрации среднемолекулярных пептидов в образцах крови должно быть проведено сразу же после ее получения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Василенко, Дмитрий Викторович, Рязань

1. А. с. 1520445 СССР, МКИ 4 G01 N33/50. Способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях / В.М.Моин,

2. B.В.Николайчик, В.В.Кирковский и др.; Минский госуд. мед. ин-т. -4323421/28-14; заявл. 02.11.87; опубл. 07.11.89; Бюл. № 1.

3. A.c. 1503015 СССР, МКИ 4 G01 N33/49. Способ диагностики эндогенной интоксикации / А.А.Тогайбаев, А.В.Кургузкин, И.В.Рикун; Алма-Атинский госуд. мед. ин-т. 4093639/28-14; заявл. 26.05.86; опубл. 23.08.89; Бюл. № 31.

4. Авакян З.А. Определение среднемолекулярных пептидов в плазме крови и амниотической жидкости при нефропатии беременности / З.А.Авакян, Р.Г.Каргаманиан // Лабораторное дело. 1988. - № 11. - С. 46-48.

5. Анальгетические и антистрессорные эффекты среднемолекулярных пептидов в норме и при термических ожогах / И.А.Волчегорский и др. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1991. - № 3.1. C. 44-47.

6. Балаболкин М.И. Новая классификация, критерии диагностики и показатели компенсации сахарного диабета / М.И.Балаболкин, Е.М.Клебанова, В.М.Креминская //Терапевтический архив. 2000. - № 10. - С. 5-10.

7. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы / З.С.Баркаган. -М. : Медицина, 1988. 528 с.

8. Бильченко Л.В. Особенности клиники и лечения больных бронхиальной астмой в сочетании с сахарным диабетом: дис. . канд. мед. наук / Л.В.Бильченко; Воронежская гос. мед. академия. Воронеж, 2000. -150 с.

9. Большая медицинская энциклопедия : в 29 т. / под ред. Б.В.Петровского. -М. : Советская энциклопедия, 1978. Т. 9. -483 с.

10. Бондарь Т.П. Морфометрический и биохимический анализ эритроцитов у больных с поздними сосудистыми осложнениями сахарного диабета на фоне курения / Т.П.Бондарь, Д.А.Шмаров, Г.И.Козинец // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - № 8. - С. 37-40.

11. Ю.Веремеенко К.Н. Протеолиз в норме и при патологии / К.Н.Веремеенко, О.П.Голобородько, А.И.Кизим. Киев: Наука, 1988. - 198 с.

12. Верификация эндотоксикоза у больных с разлитым перитонитом / Н.А.Беляков и др. // Эфферентная терапия. 1995. -Т.1, № 2. - С. 14-19.

13. Габриэлян Н.И. Опыт использования показателя средних молекул в крови для диагностики нефрологических заболеваний у детей / Н.И.Габриэлян,

14. B.И.Липатова // Лабораторное дело. 1983. - № 3. - С. 138-140.

15. Герасимов A.M. Молекулы средней массы у больных наружным генитальным эндометриозом / А.М.Герасимов, Л.В.Посисеева, М.А.Гришанкова // Клиническая лабораторная диагностика. -2003. № 12.1. C. 16-19.

16. Гипотеза средних молекул в практике клинической нефрологии /Н.И.Габриэлян, Э.Р. и др. //Тер. Архив. 1983. - № 6. - С. 76-78.

17. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер.с англ. / С.Гланц. М.: Практика, 1999.-459 с.

18. Грекова Т.И. Эффективность медикаментозной терапии и состояние совокупности олигопептидов сыворотки крови при острой коронарной недостаточности: Дис. . докт. мед. наук /Т.И.Грекова; Воронежск. мед. ин-т. Воронеж, 1993,- 301 с.

19. Грызунов Ю.А. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Ю.А.Грызунов, Г.Е. Добрецова. М.ИРИУС, 1994. - 226 с.

20. Гудим В.И. Средние молекулы как уремические токсины (состояние вопроса) / В.И.Гудим, Н.И.Габриэлян // Лабораторное дело. 1985. - № 3. -С. 145-150.

21. Дедов И.И. Сахарный диабет. Руководство для врачей / И.И,Дедов, М.В.Шестакова. М. : Универсум Паблишинг, 2003. -455 с.

22. Диагностическая ценность определения средних молекул в плазме крови при нефрологических заболеваниях / Н.И.Габриэлян и др. // Клиническая медицина. -1981. -Т.59, № 10. С. 38-42.

23. Диагностическая ценность оценки проницаемости мембран эритроцитов в качестве критерия интоксикационного синдрома / Э.А.Петросян и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - № 8. - С. 5-8.

24. Диагностическое значение определения молекул средней массы при инфекционном эндокардите / В.Т.Комаров и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - № 8. - С. 19-21.

25. Диагностическое значение уровня молекул средней массы в крови при оценке тяжести эндотоксемии / A.C.Владыка и др. // Вестник хирургии им. Грекова. -1986. -Т.137, № 8. С. 126-129.

26. Динамика среднемолекулярных пептидов сыворотки крови в прогнозировании течения острого панкреатита / П.А.Иванов и др. // Вестник хирургии им. Грекова. -1999. № 6. - С. 32-35.

27. Дубикайтис А.Ю. Хронический эндотоксикоз при атеросклеротичесокм поражении сосудов / А.Ю.Дубикайтис, С.Г.Конюхова, М.В.Белоцерковский // Эфферентная терапия. 1995. - Т. 1, № 1. - С. 31-35.

28. Дьяченко П.К. Эндотоксикоз в хирургии / П.К.Дьяченко, Н.М.Желваков // Вестник хирургии. 1987. - № 7. - С. 129-135.

29. Закутский A.B. Дискретный лечебный плазмаферез с экстракорпоральным отмыванием эритроцитов при интенсивной терапии эндогенной интоксикации : дис. . канд. мед. наук / А.В.Закутский ; Воронежская гос. мед. академия. Воронеж, 1999. - 172 с.

30. Захарова Н.Б. Методы изучения деформируемости эритроцитов (обзор литературы) / Н.Б.Захарова, Н.И.Целик, М.Л.Кпячкин // Лабораторное дело. 1983.-№ 9.-С. 3-6.

31. Значение определения средних молекул в моче при нормальной и осложненной беременности и у новорожденных с гипоксией / С.О.Бурмистров и др. //Клиническая лабораторная диагностика. 2001. -№6.-С. 10-12.

32. Значение среднемолекулярных пептидов сыворотки крови при острых формах ишемической болезни сердца / Т.В.Копылова и др. // Лабораторное дело. 1991. - № 10. - С. 18-21.

33. Значение средних молекул в оценке уровня эндогенной интоксикации /А.А.Кишкун и др. // Военно-медицинский журнал. 1990. - № 2. - С. 41-44.

34. Иванова B.C. Среднемолекулярные токсины в угнетении эритропоэза /

35. B.С.Иванова, В.И.Гудим // Гематология и трансфузиология. 1986. - № 4.1. C. 9-12.

36. Изучение уровня средних молекул у пациентов с патологией органов гепатобилиарной системы / Ф.Н.Ромашов и др. // Вестник хирургии. 1988. - № 9.-С. 60-61.

37. Использование жидкостной эксклюзионной хроматографии для оценки методов лечения урологических заболеваний / Т.А.Конькова и др. // Лаборторное дело. 1990. - № 12. - С. 19-22.

38. Использование метода определения проницаемости эритроцитарной мембраны для мочевины с целью выявления токсического действия циклогексилнитрата / Л.В.Дубовская и др. // Гигиена и санитария. 1990. -№ 7. - С. 83-85.

39. Карабанов Г.Н. Использование лейкоцитарной формулы крови для оценки тяжести интоксикации / Г.Н.Карабанов // Вестник хирургии. 1989. - № 4. - С. 146-149.

40. Кинетика олигопептидов средней молекулярной массы при интермиттирующей гемофильтрации у больных с острой почечнойнедостаточностью / В.С.Тимохов и др. // Урология и нефрология. 1991. -№ 2. - С.13-16.

41. Кислоторастворимая фракция плазмы крови здоровых лиц и больных деструктивным панкреатитом и разлитым гнойным перитонитом / Г.А.Рябов и др. //Анестезиология и реаниматология. -1985. № 5. - С. 9-12.

42. Клиническая эндокринология: Руководство / под ред. Н.Т.Старковой. М.: Медицина, 1991. - 512 с.

43. Ковалишин Я.Ф. Среднемолекулярные пептиды в плазме крови больных с уремией / Я.Ф.Ковалишин, Е.Я.Баран, И.А.Дударь // Лабораторное дело. -1987. № 12.-С. 895-899.

44. Конькова Т.А. Оценка эффективности эфферентной терапии больных с острой и хронической почечной недостаточностью по спектру среднемолекулярных фракций крови / Т.А.Конькова, М.В.Чудновская, С.А.Голованов // Урология и нефрология. -1994. № 4. - С. 35-37.

45. Коротько Г.Г. Маркеры эндогенной интоксикации по данным капиллярного электрофореза ТХУ-супернатанта / Г.Г.Коротько, И.В.Решетова, В.Н.Бровко // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - № 8. - С. 14-17.

46. Критерии оценки эндогенной интоксикации при ожоговой травме / С.Б.Матвеев и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - № 10.-С. 3-6.

47. Лабораторная диагностика нарушений обмена углеводов, сахарный диабет / В.В.Долгов и др. Тверь: Триада, 2002. -112 с.

48. Левин Ю.М. Лечение, оздоровление, профилактика в условиях кризиса экологии организма / Ю.М.Левин. М. : МГОУ, 1998. -231 с.

49. Левин Ю.М. Проблемы эндоэкологии / Ю.М.Левин // Врач. 1994. - № 5. -С. 51-53.

50. Лужников Е.А. Эндотоксикоз при острых отравлениях химической этиологии / Е.А.Лужников, Ю.С.Гольдфарб, А.М.Марупов // Анестезиология и реаниматология. 2002. - № 2. - С. 9-14.

51. Лурье Б.Л. Влияние плазмафереза на содержание пептидов среднемолекулярной массы при тяжелых гнойно-септических осложнениях / Б.Л.Лурье, А.И.Лобаков, И.М.Калиман // Лабораторное дело. 1986. - № 2. -С. 95-98.

52. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации. Сообщение первое / М.Я.Малахова // Эфферентная терапия.- 1995.-Т.1, № 1. С. 61-64.

53. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации. Сообщение второе / М.Я.Малахова // Эфферентная терапия.- 1995.-Т.1, №2. -С. 61-64.

54. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) /под ред. А.И.Карпищенко. Спб. : Интермедика, 2001. - 544 с.

55. Микунис Р.И. Содержание в крови среднемолекулярных пептидов при сердечно-сосудистых заболеваниях / Р.И.Микунис, М.И,Векслер // Клиническая медицина. 1990. -Т.68, № 5. - С. 124-126.

56. Нагоев Б.С. Значение определения средних молекул в плазме крови при инфекционных заболеваниях вирусной и бактериальной этиологии / Б.С.Нагоев, М.И.Габрилович // Клиническая лабораторная диагностика. -2000.-№1,-С. 9-11.

57. Оболенский C.B. Диагностика стадий эндогенной интоксикации и дифференцированное применение методов эфферентной терапии / С.В.Оболенский, М.Я.Малахова, А.Л.Ершов // Вестник хирургии. 1991. - № 3. С. 95-100.

58. Оболенский C.B. лабораторная диагностика интоксикаций в практике интенсивной терапии / С.В.Оболенский, М.Я.Малахова. Спб: Издание института усовершенствования врачей, 1991. - 16 с.

59. Определение содержания молекул средней массы в сыворотке крови осаждением белков ТХУ и ультрафильтрацией / М.Я.Малахова и др. // Лабораторное дело. 1987. - № 3. - С. 224-227.

60. Определение содержания среднемолекулярных пептидов в крови больных острым инфарктом миокарда / И.М.Корочкин и др. // Лабораторное дело. -1988. -№ 9. С. 15-17.

61. Осипович В.К. Сравнительная оценка экспресс-методов определения средних молекул / В.К.Осипович, З.А.Тупикова, И.М.Маркелов // Лабораторное дело. 1987. - № 3. - С. 221-224.

62. Оценка кариесвосприимчивости зубов у жителей Севера России с использованием метода регистрации среднемолекулярных веществ и олигопептидов / В.П.Зеновский и др. // Стоматология. 2001. - Т.80, № 2. -С. 11-14.

63. Паньков В.Н. Церулоплазмин и среднемолекулярные пептиды как критерии течения острого миелобластного лейкоза / В.Н.Паньков, Н.Н.Перевалова // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - № 5. - С. 52-54.

64. Пат. 2110799 Российская Федерация, МПК 6 С1, G01 N33/50. Способ диагностики перинатальных нефропатии на стадии предболезни /

65. Л.Д.Панова, Р.Р.Фархутдинов; Компания "Медиком". 92005930/14; заявл. 12.11.92; опубл. 10.05.98; Бюл. № 13.

66. Пат. 2173461 1411, МПК 7 в 01 N 33/48. Способ оценки деформируемости эритроцитов / А.В.Закутский, В.Л.Радушкевич, Л.Ю.Пастухова, В.А.Белошевский; Воронежская госуд. мед. академия. 2000117531/14; заявл. 03.07.2000; опубл. 10.09.2001; Бюл. № 25

67. Перегудов С.И. Индекс Манхаймера как критерий тяжести состояния больных с разлитым перитонитом / С.И.перегудов, С.В.Смирении // Вестник хирургии им. Грекова. 2003. - № 6. - С. 75-78.

68. Показатели общей токсичности крови при распространенном перитоните / Б.К.Шуркалин и др. // Вестник хирургии. 1987. - № 8. - С. 136-140.

69. Поляков И.В. Практическое пособие по медицинской статистике / И.В.Поляков, Н.С.Соколова. Л.: Медицина, 1975. -152 с.

70. Проницаемость эритроцитарных мембран и сорбционная способность эритроцитов оптимальные критерии тяжести эндогенной интоксикации /

71. B.А.Михайлович и др. //Анестезиология и реаниматология. 1993. - № 5.1. C. 66-69.

72. Роль среднемолекулярных пептидов в патогенезе травматической болезни / Н.С.Немченко и др. // Вестник хирургии им. Грекова. 1994. - № 7-12. - С. 65-69.

73. Роль среднемолекулярных пептидов крови в развитии кардиодепрессии при термических ожогах / Р.И.Лифшиц и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1986. № 3. - С. 280-282.

74. Саломатин В.В. Экскреция токсических пептидов с мочой у больных с термическими ожогами / В.В.Саломатин, Р.И.Лифщиц // Вопросы медицинской химии. -1984. № 3. - С. 120-124.

75. Сандуляк Л.И. Эритроциты как депо и система транспорта инсулина / Л.И.Сандуляк // Доклады Академии наук СССР. 1974. - Т.219, № 4. - С. 1020-1021.

76. Сахарный диабет / под ред. В.Р.Клячко. М.: Медицина, 1974. -191 с.

77. Сидельникова В.И. Эндогенная интоксикация как одна из причин фармакорезистентности. Новые подходы лабораторной диагностики / В.И.Сидельникова, В.М.Лифшиц // Клиническая лабораторная диагностика. -1998. -№ 8. -С. 37.

78. Скоупс Р. Методы очистки белков : пер. с англ. / Р.Скоупс. М.: Мир, 1985. - 358 с.

79. Способ определения "средних молекул" / В.В.Николайчик и др. // Лабораторное дело. 1991. - № 10. - С. 13-18.

80. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. /

81. B.С.Камышников. Минск: Беларусь, 2000. - Т.1. - 495 с.

82. Среднемолекулярные олигопептиды у онкологических больных перед хирургическим вмешательством и в раннем послеоперационном периоде /

83. C.П.Свиридова и др. // Анестезиология и реаниматология. 1987. - № 5. -С. 42-45.

84. Средние молекулы и проблема эндогенной интоксикации при критических состояниях различной этиологии / A.C.Владыка и др. // Анестезиология и реаниматология. 1987. - № 2. - С. 37-42.

85. B.В.Николайчик и др. // Лабораторное дело. 1989. - № 3. - С. 31-33.

86. Средние молекулы мочи в оценке состояния почек у новорожденных /

87. C.Л.Нестеров и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - № 10.-С. 12-14.

88. Тительман K.M. Использование определения уровня средних молекул сывороки крови как скрининга азотемии / К.М.Тительман, Т.М.Мустафаева, И.К.Яновская //Лабораторное дело. 1986. - № 3. - С. 143-145.

89. Троицкий Г.В. Дефектные белки: постсинтетическая модификация / Г.В.Троицкий. Киев : Наукова думка, 1991. -232 с.

90. Туликова З.А. Среднемолекулярные уремические токсины (обзор литературы) / З.А.Тупикова // Вопросы медицинской химии. 1983. - № 1. -С. 2-10.

91. Характеристика стадий эндогенной интоксикации / В.Е.Марусанов и др. // Эфферентная терапия. 1995. -Т.1, № 2. - С. 26-30.

92. Чаленко В.В. Эндогенная интоксикация в хирургии / В.В.Чаленко, Ф.Х.Кутушев // Вестник хирургии. -1990. Т.144, № 4. - С. 3-8.

93. Чиркин А.А. Диагностический справочник терапевта / А.А.Чиркин, А.Н.Окороков, И.И.Гончарик. Мн. : Беларусь, 1992. - 688 с.

94. Шепилова Ж.И. Диагностическое значение определения средних молекул при некоторых деструктивных патологических процессах / Ж.И.Шепилова, С.О.Балякин // Лабораторное дело. 1984. - № 9. - С. 546-548.

95. Шутов A.M. Оценка детоксикационной функции почек по клиренсу средних молекул / А.М.Шутов, П.А.Прокаева, С.В.Железнякова // Клиническая лабораторная диагностика. 1996. - № 6. - С. 28-30.

96. Энциклопедия клинических лабораторных тестов : пер. с англ. / под ред. Н.Тица. М.: Лабинформ, 1997. - 960 с.

97. Abiko Т. Characterization of an acidic tripeptide in neurotoxic dialysate / T. Abiko, I.Onodera, H.Sekino // Chem. Pharm. Bull. 1980. - Vol. 28, № 5. - P. 1629-1633.

98. Abiko T. Isolation, structure and biological activity of the Trp-containing pentapeptide from uremic fluid / T. Abiko, I.Onodera, H.Sekino // Biochem Biophys Res Commun. 1979. - Vol. 89, № 3. - P. 813-821.

99. A compound from uremic plasma and from normal urine isolated by liquid chromatography and identified by nuclear magnetic resonance / P.Gallice et al. // Clin Chem. 1985. - Vol.31, №1. - P. 30-34.

100. A potent inhibitor of cell proliferation in "middle molecules" isolated from the urine of uremic patients / J.Navarro et al. // Biomedicine. 1979. - Vol.31, № 9-10. - P. 261-264.

101. Acanthocytes in the urine. Useful tool to differentiate diabetic nephropathy from glomerulonephritis? / G.H.Heine et al. // Diabetes care. 2004. - Vol.27, № 1.-P. 190-194.

102. Action of middle molecules from chronic renal insufficiency treated by hemodialysis on mitochondrial respiration / J.B.Rinaudo et al. // Biomedicine. -1979.-Vol.30, №4. P. 215-218.

103. Action on mitochondrial calcium metabolism of an ionophorous compound isolated from uremic plasma or normal urine / N.Fournier et al. // Artif Organs. -1985. -№1. P. 22-27.

104. Acute effect of hemodialysis with polyacrylonitrile membrane on nerve conduction velocities / N.R.Robles et al. // Ren. Fail. 2001. - Vol.23, №2. - P. 251-257.

105. Analysis of middle molecules in the cerebrospinal fluid of uremic patients / H.Sperschneider et al. // Z. Gesamte Inn. Med. 1981. - Vol.36, №1. - P. 926930.

106. Antioxidant status, lipid peroxidation and nitric oxide end products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy / S.Bhatia et al. // Clin. Biochem. 2003. - Vol.36, № 7. - P. 557-562.

107. Bergstrom J. Mechanisms of uremic suppression of appetite / J.Bergstrom // J. Ren.Nutr. 1999,- Vol.9, № 3. - P. 129-132.

108. Bernard P. A study of the cardiotoxicity of uremic middle molecules on embryonic chick hearts / P.Bernard M.Crest, J.B.Rinaudo // Nephron. 1982. -Vol.31, № 2.-P. 135-140.

109. Beta-2-microglobulin and other low molecular weight proteins in haemodiafiltrates and in haemofiltrates / U.Montali et al. // Int. J. Tissue React. -1984. Vol.6, № 1,- P. 71-74.

110. Bi-directional permeability of the human peritoneum to middle molecules / A.L.Babb et al. // Proc. Eur. Dial Transplant. Assoc. 1973. - № 10. - P. 247262.

111. Blood level of middle molecular substances during uraemia and haemodialysis / R.Dzurik et al. // Proc. Eur. Dial. Transplant. Assoc. 1973. -Vol. 10.-P. 263-270.

112. Boure T. Biochemical and clinical evidence for uremic toxicity / T.Boure, R.Vanholder // Artif. Organs. 2004. - Vol.28, №3. - P. 248-253.

113. Brenner. Middle molecule hypothesis / Brenner & Rector // The Kidney. -New-York, 2000. P. 2068-2069.

114. Chapman G.V. Separation and quantification of the "middle molecules" in uremia / G.V.Chapman, R.A.Ward, P.C.Farrell // Kidney Int. 1980. - Vol.17, № 1. - P. 82-88.

115. Chapman G.V. Uremic middle molecules: separation and quantitation / G.V.Chapman, P.C.Farrell //Artif. Organs. -1981. № 4. - P. 160-165.

116. Characterization of middle molecule compounds / L.Zimmerman et al. // Artif .Organs. -1981. № 4. P. 33-36.

117. Characterization of sub-peak b4.2, middle molecule / G.Cueille et al. // Artif. Organs. -1981. № 4. - P. 28-32.

118. Chemical analytic approaches to the definition of uremic toxins / P.Furst et al. // Ateneo Parmense Acta Biomed. -1975. Vol. 46, № 5. - P. 307-316.

119. Chen K. Clinical study on treatment of nasopharyngeal carcinoma by radio- and chemotherapy with supplementary moxibustion on Shenque point / K.Chen, Y.Jiang, H.Wen // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2000. - Vol.20, № 10. - P. 733-735.

120. Clark W.R. Middle molecules and small-molecular-weight proteins in ESRD: properties and strategies for their removal / W.R.Clark, J.F.Winchester // Adv. Ren .Replace Ther. 2003. - № 10. - P. 270-278.

121. Clinical evaluation of internal hemodiafiltration (iHDF): a diffusive-convective technique performed with internal filtration enhanced high-flux dialyzers / L.Lucchi et al. // Int. J. Artif. Organs. 2004. - Vol.27, № 5. - P. 414419.

122. Cloix J.F. Inhibition of bovine renal adenylate cyclase by urinary products / J.F.Cloix, G.Cueille, J.L.Funck-Brentano // Biomedicine. 1976. - Vol.25, № 6. -P. 215-218.

123. Considerations of the middle molecule hypothesis / C.M.Kjellstrand et al. // Proc. Clin. Dial Transplant. Forum. 1972. - № 2. - P. 127-132.

124. Continuous removal of middle molecules by hemofiltration in patients with acute liver failure / S.Matsubara et al. // Crit. Care Med. 1990. - Vol.18, № 12. - P. 1331-1338.

125. Cueille G. Determination of "middle molecules" presenting vitamin B12 molecular size in normal and uremic body fluids / G.Cueille // J. Chromatogr. -1978. Vol.146, № 1. - P. 55-65.

126. Diagnosis and classification of diabetes mellitus /American Diabetes Association // Diabetes Care. 2004. - Vol.27, № 1. - P. S5-S10.

127. Dialysis membrane-dependent removal of middle molecules during hemodiafiltration: the beta2-microglobulin/albumin relationship / P.G.Ahrenholz et al. // Clin. Nephrol. 2004. - Vol.62, № 1. - P. 21-28.

128. Diffusive clearance of small and middle-sized molecules in combined dialyzer flow configurations / S.EIoot et al. // Int. J. Artif. Organs. 2004. -Vol.27, № 3.-P. 205-213.

129. Djukanovic L.J. The effects of hemodialysis with different membranes on middle molecules and uremic neuropathy / L.J.Djukanovic, J.I.Mimic-Oka, J.B.Potic // Int. J. Artif. Organs. 1989. - Vol.12, № 1. - P. 11-19.

130. DNA damage of lymphocytes in experimental chronic renal failure: beneficial effects of losartan / Z.Krivosikova et al. // Kidney Int. Suppl. 2001. -Vol.78. - P. 212-215.

131. Dzurik R. Metabolic changes in renal insufficiency / R.Dzurik, P.Cernacek, U.Burchardt//Z. Gesamte Inn. Med. 1978. - № 1. - P. 340-344.

132. Eating behavior disorders in uremia: a question of balance in appetite regulation /A.Aguilera et al. //Semin. Dial. 2004. - Vol.17, № 1. - P. 44-52.

133. Effect of a novel adsorbent on cytokine responsiveness to uremic plasma / M.D.Morena et al. // Kidney Int. 2003. - Vol.63, № 3. - P. 1150-1154.

134. Effect of dialysis membranes and middle molecule removal on chronic hemodialysis patient survival /J.K.Leypoldt et al. // Am. J. Kidney Dis. 1999. -Vol.33, № 2. - P. 349-355.

135. Effect of middle molecules on immunological functions / J.Navarro et al. // Artif. Organs. 1981. - № 4. - P. 76-81.

136. Effect of oral adsorbent on blood metabolites in hepatic failure dogs / M.Hiraishi et al. // Int. J. Artif. Organs. -1989. Vol.12, № 2. - P. 114-120.

137. Effect of uremic middle molecules removed during hemofiltration on the enzyme activity in rat liver cytosol / K.Konobu et al. // Nippon Jinzo Gakkai Shi. -1991. Vol.33, № 11. -P. 1105-1110.

138. Effect of urine metabolites from healthy and uremic subjects on gluconeogenesis in slices of rat kidney cortex and liver / B.Lamberts et al. // Clin. Nephrol. 1976. - № 5. - P. 465-472.

139. Effect on leukocyte locomotion and superoxide production by uremic toxins and polyamines / A.Farinelli et al. // Int. J. Artif. Organs. 1987. - Vol.10, № 1. - P. 37-40.

140. Elevated levels of interleukin-18 and tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with type 2 diabetes mellitus: relationship with diabetic nephropathy / Y.Moriwaki et al. // Metabolism. 2003. - Vol.52, № 5. - P. 605-608.

141. Encephalopathy in acute hepatic atrophy. Effect of the purification of middle molecules. Preliminary results / P.Opolon et al. // Nouv. Presse Med. -1975. Vol.42, № 6. - P. 2987-2991.

142. Erythrocyte transport of middle molecular substances / M.Gajdos et al. // Proc. Eur. Dial Transplant. Assoc. -1981. Vol.18. - P. 183-187.

143. Evidence of splanchnic-brain signaling in inhibition of ingestive behavior by middle molecules / A.H.Mamoun et al. // J. Am. Soc. Nephrol. Vol.10, № 2. - P. 309-314.

144. Fractions of middle molecular weight responsible for immunodeficiency in malnourished and burnt patients / G.Gay et al. // Artif. Organs. -1981. № 4. -P. 71-75.

145. Furst P. Determination of endogenous middle molecules in normal and uremic body fluids / P.Furst, L.Zimmerman, J.Bergstrom // Clin. Nephrol. -1976. -№ 3.-P. 178-188.

146. Gafni A. Structural modifications of proteins during aging / A.Gafni // Journal of the American Geriatrics Society . -1997. Vol.45, № 7. - P. 871-880.

147. Grof J. Molecular weight distribution, diffusibility and comparability of middle molecular fractions prepared from normal and uremic sera by different fractionation procedures / J.Grof, J.Menyhart // Nephron. 1982. - Vol.30, № 1. -P. 60-67.

148. Heme synthesis in anemia of the uremic state / W.Linkesch et al. // Isr. J. Med Sci. 1978. - № 14. - P. 1173-1176.

149. Hemodialyzer evaluation by examination of solute molecular spectra / Babb A.L. et al. // Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 1972. - Vol. 18. - P. 98-105.

150. Horl W.H. Genesis of the uraemic syndrome: role of uraemic toxins / W.H.Horl //Wien Klin. Wochenschr. -1998. Vol.110, № 15. - P. 511-520.

151. Identification of an ascorbic acid metabolite among "uremic middle molecules" / P.M.Gallice et al. // Clin. Chem. 1990. - Vol. 36, № 7. - P. 13691372.

152. Identification and synthesis of a heptapeptide in uremic fluid / T. Abiko et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. - Vol. 84, № 1. - P. 184-194.

153. Immunomodulating properties of the uremic pentapeptide H-Asp-Leu-Trp-Glu-Lys-OH in vitro / D.Niese et al. // Klin. Wochenschr. 1986. - Vol.64, № 15. - P. 642-647.

154. Influence of dialysis membranes on the convective transport of middle molecules / A.L.De Francisco et al. // Int. J. Artif. Organs. 1986. - № 9. - P. 421-426.

155. Influence of middle molecules on the anemia of uremic patients / H.W.Leber et al. //Artif. Organs. 1978. - № 2. - P. 378-381.

156. Influence of middle-molecular-weight solutes from dialysate on the migration rate of leukocytes / T.Cichocki et al. // Kidney Int. 1980. - Vol.17, № 2. - P. 231-236.

157. Influence of uremic middle molecules on blood cells / K.Ota et al. // Artif. Organs. 1980. - № 4. - P. 113-115.

158. Inhibition in vitro of the polymerization of tubulin by uremic middle molecules: corrective effect of isaxonine / D.Braguer et al. //Clin. Nephrol. -1983. Vol.20, № 3. - P. 149-154.

159. Inhibitory effect of peak 2-4 of uremic middle molecules on platelet aggregation / J.L.Pales et al. // Eur. J. Haematol. 1987. - Vol.39, № 3. - P. 197-202.

160. Inhibitory factors of serum opsonic activity in serum from patients with chronic renal failure / T.Kikuchi et al. // Ren. Fail. 1997. - Vol.19, № 1. - P. 137-144.

161. Isolation, structure elucidation and synthesis of a hexapeptide from the hemodialysate of uremic patients / G.Bovermann et al. // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1982. - Vol.363, № 10. - P. 1187-1202.

162. Kaplan B. Amino acid containing compounds in uremic serum search for middle molecules by high performance liquid chromatography / B.Kaplan, M.Gotfried, M.Ravid // Clin. Nephrol. - 1986. - Vol.26, № 2. - P. 66-71.

163. Kausler E. Fragments from albumin and beta 2-microglobulin -constituents of the middle molecule fraction in hemofiltration / E.Kausler, G.Spiteller// Biol. Chem. Hoppe Seyler. -1991. Vol.372, № 9. - P. 849-855.

164. Klein A. / Middle-sized ninhydrin-positive molecules in uraemic patients treated by repeated haemodialysis. II. Chief peptide constituents of the faction /

165. A.Klein, M.Samecka-Keller, Z. Hanicki // Clin. Chim. Acta. 1978. - Vol. 90, № 1. -P. 7-11.

166. Laux C. Middle molecules in peritoneal equilibration test as a marker of peritoneal stress in children on continuous peritoneal dialysis / C.Laux, B.Weiss, K.E.Bonzel //Adv. Perit. Dial. 1999. - № 15. - P. 283-286.

167. Leypoldt J.K. Small-solute and middle-molecule clearances during continuous flow peritoneal dialysis / J.K.Leypoldt, J.M.Burkart // Adv. Perit Dial. -2002.-№ 18.-P. 26-31.

168. Liver support in fulminant liver failure after hemorrhagic shock / P.Faybik et al. // Wien Klin. Wochenschr. 2003. - Vol. 115, № 15-16. - P. 595-598.

169. Lutz W. Oligopeptides in blood plasma of healthy humans and of patients with nephrotic syndrome / W.Lutz, R.Markiewicz, L.KIyszejko-Stefanowicz // Clin. Chim. Acta. 1972. - Vol. 39, № 2. P. 319-326.

170. Lutz W. Studies on formation of complexes of insulin with basic peptides isolated from the plasma of uremic patients / W.Lutz // Acta. Med. Pol. 1975. -Vol. 16, № 3.-P. 159-170.

171. Methodology for identification of serum middle molecules / C.Buzio et al. //Artif. Organs. 1981. - № 4. - P. 22-27.

172. Middle molecules in patients with pre-dialysis chronic renal failure: a comparative clearance study / K.Schindhelm et al. // Clin. Nephrol. 1982. -Vol.17, № 4. - P. 200-205.

173. Middle molecules separation from uraemic serum / P.Dall'aglio et al. // Ateneo Parmense Acta Biomed. 1975. - Vol.46, № 5. - P. 331-344.

174. Middle-sized molecule fractions isolated from uremic ultrafiltrate and normal urine inhibit ingestive behavior in the rat / B.Anderstam et al. // J. Am. Soc. Nephrol. 1996. - № 11. - P. 2453-2460.

175. Migone L. Middle molecules in uremic serum, urine and dialysis fluid / L.Migone, P.Dall'taglio, C.Buzio // Clin. Nephrol. -1975. № 3. - P. 82-93.

176. Mogensen C.E. Diabetic nephropathy: evidence for renoprotection and practice / C.E. Mogensen // Heart. 2000. - Vol.84. - P. 26-28.

177. Mogensen C.E. The stages in diabetic renal disease. With emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy / C.E.Mogensen, C.K.Christensen, E.Vittinghus // Diabetes. 1983. - Vol.32, № 2. - P. 64-78.

178. Mojiminiyi O.A. Evaluation of serum cystatin C and chromogranin A as markers of nephropathy in patients with type 2 diabetes mellitus / O.A.Mojiminiyi, N.Abdella, S.George // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000. - Vol.60, № 6. - P. 483-489.

179. On the inhibitory effect of the serum of uraemic children on erythropoiesis / P.Scigalla et al. //Acta Haematol. -1980. Vol.64, № 5. - P. 256-264.

180. Opatrny K.Jr. Hemodialysis in the treatment of chronic kidney failure. Present status / K.Jr.Opatrny, S.Opatrna // Vnitr. Lek. 2003. - Vol.49, № 5. - P. 424-429.

181. Pedrini L.A. On-line mixed hemodiafiltration with a feedback for ultrafiltration control: effect on middle-molecule removal / L.A.Pedrini, V.De Cristofaro // Kidney Int. 2003. - Vol.64, № 4. - P. 1505-1513.

182. Plasma cystatin C concentration in non-insulin-dependent diabetes mellitus: relation with nephropathy / A.Piwowar et al. // Arch. Immunol. Ther. Exp (Warsz). -1999. Vol.47, № 5. - P. 327-331.

183. Poplawski A. Chromatographic analysis of middle molecules in plasma ultrafiUrates of uraemic patients / A.Poplawski, M.Mysliwiec // Nephrol. Dial Transplant. -1993. № 2. - P. 188.

184. Preparative isolation of middle molecular weight fractions from the hemofiltrate of patients with chronic uremia / H.Brunner et al. // Artif. Organs. -1978.-№2.-P. 375-377.

185. Removal of middle molecules and protein-bound solutes by peritoneal dialysis and relation with uremic symptoms / B.Bammens et al. // Kidney Int. -2003. Vol.64, № 6. - P. 2238-2243.

186. Removal of the protein-bound solute p-cresol by convective transport: a randomized crossover study / B.Bammens et al. // Am. J. Kidney Dis. 2004. -Vol.44, № 2. - P. 278-285.

187. Renal handling of middle molecules in uremic patients and in the isolated rat kidney / N.Lustenberger et al. //Artif. Organs. -1981. №4. - P. 110-114.

188. Renal handling of uremic middle molecules, a study with the isolated perfused rat kidney / K.Schindhelm et al. // Nephron. 1982. - Vol.30, № 2. - P. 166-172.

189. Report of the expert committee on the diagnosis and classification of diabetes mellitus / Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus // Diabetes Care. 2003. - Vol.26, № 1. - P. S5-S20.

190. Respective roles of ammonia, amino acids, and medium-sized molecules in the pathogenesis of experimentally induced acute hepatic encephalopathy / J.Denis et al.//J. Neurochem. -1983. Vol.40, № 1. - P. 10-19.

191. Scribner B.H. Evidence for toxins of "middle" molecular weight / B.H.Scribner, A.L.Babb // Kidney Int. Suppl. -1975. № 3. - P. 349-351.

192. Search for peptidic "middle molecules" in uremic sera: isolation and chemical identification of fibrinogen fragments / B.Kaplan et al. // J Chromatogr B Analyt Technol. Biomed. Life Sci. 2003. - Vol.25, № 1. - P. 141-153.

193. Separation of an inhibitor of erythropoiesis in "middle molecules" from hemodialysate from patients with chronic renal failure / A.Saito et al. //Clin. Chem. 1986. - Vol.32, № 10. - P. 1938-1941.

194. Severini G. Effects of uremic middle molecules on the activity of erythrocyte lactate dehydrogenase / G.Severini, L.Malaguti-Aliberti // Ann. 1st Super Sanita. -1985. Vol.21, № 3. - P. 357-361.

195. Shu C.D. Middle molecules in the serum, brain, liver and urine of galactosamine-induced fulminant hepatic failure rats / C.D.Shu, T.M.Chang // Int. J. Artif. Organs. 1983. - № 6. - P. 273-277.

196. Some aspects of middle molecules toxicity / J.B.Rinaudo et al. // Artif. Organs. 1981. - №4. - P. 90-93.

197. Sorbents in acute renal failure and end-stage renal disease: middle molecule and cytokine removal / J.F.Winchester et al. // Blood Purif. 2004. -Vol.22, № 1. - P. 73-77.

198. Survival of hemodialysis patients and uremic toxin removal / R.Vanholder et al. //Artif. Organs. 2003. - Vol.27, № 3. - P. 218-223.

199. Technical aspects on middle molecules: separation, isolation, and identification / G.Cueille et al. // Artif. Organs. -1981. № 4. - P. 8-12.

200. The effect of renal transplantation on middle molecules in plasma and urine / H.Asaba et al. // Clin. Nephrol. -1977. № 8. - P. 329-334.

201. The genesis of the square meter-hour hypothesis / Babb A.L. et al. // Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 1971. - Vol. 17. - P. 81-91.

202. The removal of uremic toxins / A.Dhondt et al. // Kidney Int. 2000. -Vol.58, № 76. - P.47-59.

203. Uremic middle molecules in non-dialyzed azotemic patients: relation to symptoms and clinical biochemistries / H.Asaba et al. // Clin. Nephrol.- 1982. -Vol.17, №2.-P. 90-95.

204. Uremic middle molecules: analytical study of middle molecular weight fractions subpeak b4-2 / G.Le Moel et al. //Artif. Organs. 1981. - № 4. - P. 1721.

205. Uremic neuropathy: evidence of middle molecule toxicity / J.Milutinovic et al. //Artif. Organs. -1978. № 2. - P. 45-51.

206. Uremic neuropathy: evidence of middle molecule toxicity / J.Milutinovic et al. //Artif. Organs. -1978. № 2. - P. 45-51.

207. Uremic neurotoxin in the middle molecular weight range / N.K.Man et al. //Artif. Organs. 1980. - № 44. - P. 116-120.

208. Urinary excretion of n-acetyl-beta-D-glucosaminidase and retinol binding protein as alternative indicators of nephropathy in patients with type 1 diabetes mellitus / M.A.Salem et al. // Pediatr. Diabetes. 2002. - № 3. - P. 37-41.

209. Vanholder R. Problems and solutions for artificial kidney / R.Vanholder // Technol. Health Care. 2000. - № 6. - P. 373-379.

210. Vanholder R. Uremic toxins / R.Vanholder // Nephrologie. 2003. - Vol.24, № 7. - P. 373-376.

211. Wardle E.N. Free phenols in chronic renal failure / E.N. Wardle, K.Wilkinson // Clin. Nephrol. -1976. № 2. - P. 361-364.