Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранные белки-иммуногены и тубулиноподобный белок микоплазмы (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM)

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Мембранные белки-иммуногены и тубулиноподобный белок микоплазмы (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM)"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 579.89:579.887.111:576.311.348:576.524.

НИКОНОВ

Андрей Владимирович

МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ-ИММУНОГЕНЫ И ТУБУЛИНОПОДОБНЫЙ БЕЛОК МИКОПЛАЗМЫ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM)

03.00.25 —КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканне ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в лаборатории структурной организации генома Института цитологии Российской Академии Наук.

Научный руководитель — доктор биологических наук С. Н. БОРХСННИУС

Официальные оппоненты: д. б. п., профессор, член-корр. РАН Б. В. ГРОМОВ д. б. н., профессор В. И. ВОРОБЬЕВ

Ведущее учреждение: Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Защита состоится « » Ой 1992 г. в « ^^^"часов

на заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии Российской Академии Наук по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук Л. Н. ПИСАРЕВА

© — Институт цитологии РАН.

,'г "I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Микоплазмы - прокариотические организмы, широко распространенные в природе. Таксономически микоплазмы выделены в класс noincutes. В отличие от бактерий, клетки микоплазм окружены только цитоплазнатичэской мембраной, то есть лишены клеточной стенки и не способны синтезировать ее биохимические предшественники. Все микоплазмы являются симбионтами или паразитами человека, животных или растений.

Актуальность исследования. Б связи с относительной простотой организации, клетки микоплазм представляют собой объекты, чрезвычайно привлекательные дая молекулярной биологии. Интерес к микоплазмам определяется также практической необходимостью - представители семейств

Mycoplasmataceae и Acholeplasma.ta.ceae КЛЗССа Hollicutes

играют существенную роль в патологии человека, сельскохозяйственных животных, в том числе птиц, а представители семейства Spiropiasmataceae - в патологии растений и насекомых. Микоплазмы являются контаминантами клеточных культур, в частности культур-продуцентов биологически активных веществ на биотехнологических производствах. Микоплазмы часто сопутствуют вирусным и бактериальным инфекциям. У людей и животных микоплазмы поражают слизистые оболочки респираторного и урогенитального трактов, вызывая хронические воспалительные процессы и иммунодеФицигные состояния.

Ряд патогенных микоплазм (M. gallisepticum, И. pneumoniae, м. genttaiium. и другие) обладает скользящей подвижностью, механизм которой ДО СИХ пор не ясен. М. pneumoniae, возбудитель первичной атипичной пневмонии человека, вызывает по эпидемиологическим наблюдениям от 3 до 10% острых респираторных заболеваний, м. gain septicum. - распространенный возбудитель респираторного микоплазмоза домашних птиц. Эта микоплазма способна поражать дыхательные пути и яйцеводы кур и индеек, передаваясь потомству через яйца. Заболевания,

вызываемые м. gaiitsopttcwn, как правило не приводят к массовой гибели птщ, но резко снижают скорость их роста, увеличивают потребление кормов и снижают качаство продукции птицзфабрик, что выражается для крупных- хозяйств в больших экономических потерях. Отличительная черта этих патогенных микоплазм - наличие специализированных концевых клеточных структур.

Естественно предполагать, что в организации клеток. Форма которых отличается от сферической, и к тому же обладающих подвижностью, должны принимать участие внутренние цстгоскелетные структуры, подобно тону, как это известно для клеток эукариот.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы -изучение поверхностных иммуногенов M.gallisepticxim. и поиск белков, аналогичных белкам цитоскелета эукариот. Задачи работы состояли в следующем:

1. Ишунологический анализ белков M.gall isepticum. с помощью антител к тубулину эукариот.

2. Электронномикроскопическое исследование внутриклеточных структур микоплазмы.

3. Поиск возможной связи между выявленными тубулярными структурами и мембранными белками, экспонированными на поверхности клетки M.gallisepticvm.

4. Сравнение разных штаммов и. gaiiisepticum по электроФорети-ческим свойствам поверхностных иммуногенов и спектрам рестриктазных Фрагментов ДНК.

Научная новизна работы. Впервые показано, что в клеточных экстрактах Mycoplasma gallisepticvm (прОКарЮТИЧвСКОГО организма) присутствует 40 кДа белок, специфически связывающий антитела против тубулинов эукариот. Методом иммунной электронной микроскопии показано, что этот белок входит в состав цитоплазматаческих тубулярных структур.

Показано, что сильные иммуногены различаются у разных

штаммов M.gallisepticvm. ПО ЗЛеКТрОФОрвТИЧвСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ.

Этггопы этих белков локализованы на поверхности клеточной мембраны.

Получены результаты, позволяющие предполагать наличие связи (in situ) между сильным поверхностным иммуногеном и тубулиноподобным белкой. Сделана рекострукция

пространственного расположения тубулярных структур в микоплазменной клетке и предложена гипотетическая схема движения клетки M. gallisepticxun.

Научно-практическая ценность работы. Полученные результаты дополняют сведения об элементах цитоскелета микоплазм, мембранной организации поверхностных иммуногенов м. gain sept icxan. и позволяют развивать представления о механизмах скользящего движения прокариот.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на vin Конгрессе Международной Организации Микоплазмологов (Стамбул, 1990), на Всесоюзной конференции "Функциональная морфология клетки" (Санкт-Петербург, 1991) и на совместном семинаре лабораторий структурной организации генома, биохимических основ репродукции клетки и отдела клеточных культур Института цитологии Российской Академии Наук (Санкт-Петербург, 1992).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "материалы и методы", результатов, обсуждения и выводов. Иллюстративный материал содержит 17 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Организмы и условия культивирования. Acholeplasma la.id.lawH а, Mycoplasma hyorh.in.is bts7 и всв ПГГЗММЫ Н. gal 1 isept ic-um. cs6. а5969, us, fs9, r, mr33 ПОЛуЧвНЫ ОТ

Г.Лабера (g. laber), Исследовательский институт Фирмы sandoz,

Вена. Mycoplasma, fermentans, M.mycoides subsp. mycoides,

м. hominis нз4 были предоставлены И. В. Раковской, Институт

зпвдэмкологш и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи PAÍ.ffl, Москва. m.arßinini rie подучена от В. П. Еердника, Полтавская зональная научно-ветеринарная станция, Полтава, Украина.

H. salivarium PG20 И Н. orale CHI0299 - ОТ К. ЮрМЭНОВОС (К. Yигmanova), ИНСТИТУТ ВЭТЭрИНарНОЙ И8ДИЦИНЫ, БрНО, Чехословакия. Микоплазны выращивали при 37°С на средах, основу которых составлял препарат "Mycoplasma Broth Baso СМ403" или "Mycoplasma Agar Base CM401" фИрМЫ Oxoid,

Великобритания.

ГедьэлвктроФорез белков а присутствии sds. Разделение микоплазменных белков проводили с помощью одномерного электрофореза в полиакраламцдном геле (ПААГ) на трис-глициновом буфера (pH 8.6) В присутствии sds (Laemmli, 1970).

Поликлональные антитела к M^gaiusepticum получали -по метода поликлонального асцита (Kurpisz et al., 1988) и проверяли на видосшцифичность.

Получение моноклональных антител. Иммунизацию мьппэа микоплазмами проводили ПО кетоду Morrison-Plummer et al. (1936). Для слияния использовали миеломные клетки линии wso. Слияние проводили в присутствии полиэтиленгликоля pegiooo по методу Kennett (1979) В МОДИФИКЭЦИИ И. И. ФрИДЛЯНСКОЙ (1988). Скрининг гибридом, продуцирующих специфические антитела, проводили в иммунологических планшетах, приготовленных- по методу Buck et al. (1982).

Иммуноблотинг. Перенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозу

(Amersham, ВбЛИКОбрИТаНИЯ) ПрОВОДИЛИ В ТрИС-ГЛИЦИНОВОМ

буферном растворе с добавлением 20% метанола по стандартной методике (Anderson, Thope. 1980). БЛОТЫ ВЫМЭЧИВаЛИ 30 мин При 25°С в блокирующих буферных растворах: 0.05% Твин-20 на фосфэтном буфере (ФБ-Тв) или 0.05% Твин-20 на обезжиренном молоке (ОМ-Тв). Затем блоты инкубировали 1 ч при 25°С с моноклональными (маь) или поликлональными антителами (раь), разведенными в блокирующих буферных растворах 1:2000 или 1:300, соответственно. В качестве вторых антител использовали кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши или козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с

пероксидазой хрзна. Блоты отмывали в ФБ и при комнатной температуре вымачивали в буферном растворе, содэргхащэм 50 r.iM Трис-нс1 (рН 7.5), 0.05% Твин-20, 1 мг/мл диамшобонзидига и 0.00012 0 работе были использованы мдь ти-oi к

а-тубулину го крупного рогатого скота (КРС) подученные от В. Визсищкого (V. vikiitsky). Институт молекулярной генетшси, Прага, раь к тубудину из КРС были получены из лаборатории В.И. ГельФандга, Институт белка АН СССР, Москва. Кроме того, в работе были использованы коммерческие маь к а-тубулину цыпленка (Am^rsham, Великобритания) .

Реакция кммунопрвютштации. Для проведения реаими 12Л(унопрзц»!питации использовали стафилококковый реагент, содержащий бедок А (НИИЗМ ш. Пастера, Санкт-Петербург). Белки шкоплазмы метили l-г33s]Кетионином in vivo. Клетки вскрывали в присутствии 2 мм ФенидметилсульФонил Флюорида (pmsf) замораживанием в жидком азоте с последующим оттаиванием (7-10 циклов). Клеточный экстракт осветляли центрифугированием при 14000 об/ша, 10 мин па зппеидорФовской центрифуге. "Для избежания неспецифической сорбции микоплазменных белков, клеточный экстракт инкубировали 1 час при комнатндв . температуре со стафилококковым реагентом, приготовленным согласно инструкции изготовителя. Клеточный экстракт вторично центрифугировали при 1500 об/мин, 10 мин.

Для специфической сорбции белков, стафилококковый реагент инкубировали со специфическими антителам! при комнатной температуре 30 мин на качалке. Реагент отмывали ФБ-Тв и дополнительно инкубировали с неспециоическими антителами при комнатной температуре 30 мин на качалке. Реагент со специфически адсорбированными белками осаждали центрифугированием. ■ Преципитат тризды промывали ■ ФБ-Тв. и наносили на полиакриламидный гель.

Приготовление микоплазм для электронной микроскопии. Клетки, отмытые от среды, Фиксировали в 2,5% глютаральдегиде на ФБ. Постфиксацию осуществляли в 1% oso. на ФБ.

Фиксированные объекты дегидратировали этанолом возрастающей концентрации. Затем объект переносили в 100% ацетон и заливали аралдитом или смесью эпона с аралдитом. Контрастирование ультра!онких срезов осуществляли уранилацетатом и цитратом свинца.

Иммунная электронная микроскопия■ Мечение интактных микоплазмеиных клеток коллоидным золотом щюводшш ' по

следующей схеме: никелевые сеточки с Формваровой подложкой и угольным напылением помещали подложкой вниз на каплю раствора белка А (1 мг/мл ФБ), инкубировали при 20°С 30 мин. Сеточки ополаскивали ФБ-Тв, блокировали БСА на ФБ-Тв (БСА-фБ) при 2D°C 30 мин и переносили на 30 мин в раствор маь, разведенных 1:400 БСА-ФБ. Сеточки повторно ополаскивали ФБ-Тв и помещали на каплю микоплазменной культуры. Фиксирование микоплазм проводили в 0.1% глюггаральдегиде на ФБ. Сеточки промывали ФБ-Тв и инкубировали в ram, конъюгированным с 5 нм коллоидным золотом, (разведение БСА-ФБ 1:300). Сеточки промывали ФБ, дегидратацию материала проводили ацетонигршюм.

Мечение тонких * срезов коллоидным золотом. кл6тки

микоплазм Фиксировали в смеси 4% параформальдегида и 0,2% глкггаральдегида на ФБ. Затем клетки отмывали ФБ и переносили на ночь в 100 мМ глицин на ФБ при 4°0, промывали ФБ. Дегидратацию проводили в этаноле возрастающей концентрации при -20°С. Заливки в ловикрил К4М проводили согласно инструкции Фирмы-изготовителя. Для блокирования неспецифической сорбции антител, сеточки со срезами инкубировали в БСА-ФБ 30 мин при комнатной температуре, затем в течении 1 ч в растворе первых антител (раь или маь), разведенных БСА-ФБ 1:10 или 1:50, соответственно. Сеточки отмывали в ФБ-Тв, инкубировали с ram или gar, конъюгированвыми с 5 нм коллоидным золотом. Срезы на сеточках контрастировали раствором 1,856 уранилацетата и 0,2% метилцеллюлозы в воде (Roth et al. . 1990).

Гидролиз ДНК рестриктазами в агарозных блоках и проведение пульс-электрофореза. Клетки микоплазм суспензировали в ФБ до концентрации бхЮ^кл^мл и смешивали с равным объемом 1.1%

легкоплавкой агарозы (BioRad, США). Лизис, дэпротеннизацкю и обработку ДНК рестриктазейли проводил! по методу Р. Гвш.ила (Gerr.mil, 1937). В рЗбОТ© бЫЛИ ИСПОЛЬЗОВЭНЫ ФЗр'ЛвНТЫ Eco 02 I CXma III}, Ehe I ' СНаг 13, St.а I И ДНК ФЭГЭ ЛЯГДЦЭ

производства НПО "Форкент", Вильнюс. Пульс-злэктроФорэз в 1.3% агарсзног«. геле проводили в аппарате Фирмы "Диапульс" (Москва) с 9 мМ трис-бораткым буфером (pH 8.0), содержащем 0.2 мМ ЭДТА (Нанкатис и др. 1984) при 8°С в течении 20-24 ч. Время пульс-пзриода составляло 35 сек., напрятапность электрического поля - 10-12 В/см. Размеры Фрагментов ДНК определяли по их зле1строФорзтической подвижности относительно олигогдеров ДНК Фага лямбда.

Эксгерта'ентальв ое иноищфовавкэ шшгят микоплазмон. В работе использованы здоровые, свободные от микоплази, цыплята двухнедельного возраста, стандартизованные по весу. Цыплят дельта на три равныз группы (по пять в каждой группе) и инфицировали инъекцией нопосрздственно в воздушный мешок по 3 мл активно растущей микоплазмзнной культуры. Контрольной группе вводили тот ке объем стерильной среды. Через две недели цыплят уг'.ервшдяли дзкапитацией, вскрывали, исследовали визуально воздупшие мешки и делали микробиологический высев на агаризованяую среду. В течет® всего эксперимента контролировали изменение веса цыплят и потребление ими корма.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Электронномикроскопическко исследования ультратонких срезов M. qallisepticum ВЫПО.ЛНеНЫ На ДВУХ ШТаММаХ M. gallisepticum. (s6 И a59q9) И ОДНОМ штэкме A. laidlczwH (а). МорФОЛОГИЧвСКИХ

различий между штаммами м. gains&pticum. не обнаружено.. В связи с тем» что клетки н. gaiiisepticum имеют грушевидную Форму, большинство профилей на срезах выглядят округлыми или элипсоидными. На снимках видны электронплотные участки в районе специализированного терминального образования и

центральной области цитоплазмы, соответствующей местоположению нуклеоида в клетке. В примеыбранной области цитоплазмы выявляются полые тубулярные структуры. Отдельные тубулы расположены в центральной области цитоплазмы. Диаметр их поперечного сечения колеблется в пределах 28-36 нм, причем на профилях этого сечения выявляется 4-5 элвктронплотных глобул диаметром 7-8 нм, ассоциированных с тубулярными структурами. Оценка размеров сделана на срезах с помощью калиброванного золота. На продольных профилях тубулярных структур вйдйа их спиральная организация (с шагом спирали 16-20 нм). На основании анализа серийных срезов проведена реконструкция, пространственного расположения тубулярных структур в квзткА (Рис. 1). Тубулы имеют петлеобразную Форму. В зовё терминального образования ("ыеь") и прилагающем к нем£ районе ("1пГгаЫеь") эти тубулы не видны. Однако, концы тубул расположены в непосредственной близости от района инФраблеба.

Рис. 1. Объемная реконструкция системы тубул м.ватзер-асит., (схема). Терминальная структура "Ыеь" (1), "центр организации" тубул, или инФраблеб (2), петлеобразные тубулы (3), клеточная мембрана (4).

В клетках другой МИКОШИЗМЫ, А. la.idla.wH, не способной к активному клеточному движению и исследованной параллельно с применением тех же методов Фиксации и заливки материала, тубулярные, структуры необнаружены.

Фиксация микоплазменных клеток прямо в ростовой среде показала, что тонкая организация тубул и их расположен!© в клетке не является артефактом. Тубулы присутствуют в клетках микоплазмы на ранних стадиях развития культуры, то есть не являются результатом действия на' клетку неблагоприятных условий роста.

Следует отметить, что у рада скользящих бактерий описаны внутриклеточные тубулярные структуры описаны ранее (Kuhrt,

Pate. 1973; Margulis et al., 1978).

Тубулиноподобныд белок M.gan^apUcum^ Белок микоплазмы м. gaiiisepticwn. с электроФоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе 40 кДа, выявлен на иммуноблотах с моноклональными антителами ти-oi против а-тубулина КРС, поликлональными антителами против тубулинов из мозга КРС и коммерческими моноклональными антителами к а-тубулину цыплят. На рис. 2 приведены результаты исследования двух штаммов M. gain sep ticum. (S6 И A5969) И ТрвХ ДРУГИХ ВИДОВ МИКОПЛаЗМ (М. hominis, H. orale, M. sal ivariwn).

Результаты аналогичного исследования еще трех штаммов

И. gaIii septicum (MR3, U5, R) И ПЯТИ ДРУГИХ ВИДОВ МИКОПЛЭЗМ {A.laidlawii, M. fermant ans, H.hyorhinis, M. arginini, M.mycoides subsp. mycoides) ЗДбСЬ HQ ПрЭДСТЗВЛеНЫ. БвЛОК,

имеющий эгоггопы, общие с «-тубулином, обнаружен у всех пяти исследованных штаммов Н. gallisepticvm.. у восьми других исследованных нами видов микоплазм, не способных к скользящему движению, подобные белки не найдены.

Внутриклеточная локализация тубулшоподобного белка. Методом иммуной электронной микроскопии с антителами против тубулина показано специфическое связывание коллоидного золота

- IQ -

A Ç

1

j s? i j

1 î

J

TT"s vTI i л s v г6

Рис. 2. ТубуЛИНОПОДОбНЫЙ белок H. gallisepticum.. ПААГ-злектроФорез белков микоплазм и тубулина КРС (А). Гель окрашен ' Кунасси. Иммуноблот аналогичного материала с маь

tu-ol (Б). Н.hominis (1), ».orale (2), H. sal ixja.rixjm (3) МИфОТрубОЧКИ КРС (4), И. gai Ii sept icum. S6 И A5969 (5, 6,

соответственно).

с тубулами. На основании этого результата мы делаем вывод о том, что 40 кДа белок входит в состав тубулярных структур, и называем этот белок тубулиноподобным.

Однако, наибольшая концентрация метки в экспериментах с раь заметна в районе инФраблеба, где тубулярь о структуры морфологически не выражены. Специфическое связывание антител в этой части клетки можно объяснить тем, что тубулиноподобный белок находится в деполимеризованном состоянии, и число эпитопов этого белка, доступных для антител, вероятно, становится больше. На исключено, что в районе инФраблеба

происходит полимеризация и деполимеризация тубул, то есть процессы, подобные тредашиингу классических гасфотрубочек. В таком случае инФраблеб может выступать з роли своеобразного "центра организации" тубул.

Описанная ньгае тубулярная система, имеющая в своем составе тубулиноподобный белок, мог;:ет составлять структурную основу скользящего движения микошгаз!*ы. В этом случае тубулярные структуры должны быть связаны с мембранным белками, участвующими в процессах прикрепления и движения ммкоплазменной клетки. Подобная связь известна для и. pneumoniae, - белок-адгезин PI, экспонированный на поверхности микоплазш и являющийся сильным кммупогеном, связан с элементами цитоскэлета (Meng, pfister. isoo).

Выявление СИЛЬНОГО итдуногена М. qalllsoptlcum, При иглмуноблотинге с ПОЛИКЛОНЭЛЬНЫМИ антителами к м. gallisopticxim. в штаммах аз и Л5эеэ, такие как и в четырех других штаммах: (r, HR3, из и FS9), выявлено по одной интенсивно окрашенной полосе (Рис. ЗА). Белки, соответствующие этим полосам, названы наш сильными иммуногенами, так как явно обладают нат*большей "удельной шмуногеннностью". Молекулярные Ееса сильных иммуногенов штаммов sa, из, FS9 равны 64 кДа, штамма AS969 - 70 кДа, штаммов r и mr3 - 67 кДа. Соответствующие белки мы обозначаем далее как Р64, Р70 и т.д. Наибольшее различие в электроФоретической подвижности сильных иммуногенов наблюдается у штаммов ss и А59еэ.

При селекции гибридных клонов, полученных при слиянии активированных спленоцитов мышей, иммунизированных интактными клетками штамма ss, было отобрано всего 5 гибридом, стабильно продуцирующих антитела к Н. gallisepticwn. Проверка соответствующих маь на иммуноблотах показала, что все антитела реагируют с сильным иммуногеном м. gainsepticvm', причем узнается этот иммуноген только у двух штаммов

М. galliseptic-um. - S6 И S969, НО Не ДРУГИХ ЧеТЬфвХ (РИС. ЗБ).

Исходя из результатов, представленных на Рис. 3, мы

предполагаем, что сильные иммуногены (белки Р64, Р67, Р70), выявленные во всех исследованных штаммах м. вашгерисшь и обладающие различной электроФоретической подвижностью, являются аналогами. Скрининг гибридом проводили с использованием интактных клеток микоплазмы. Поэтому возможно предположение о том, что обнаруженные сильные иммуногены разных штаммов м. еатверис-ит являются поверхностными белками.

Пун;

I 2 1 Ч £ Ь 7

Рис. 3. Сильные иммуногены штаммов н. ваШверИсхап.. Иммуноблот с раъ к М. еаШэерИсит. а5969 В ОМ-ТВ (А). Иммуноблот с маъ к Р64 (Б). Белки штаммов и. еаньгерисит: аз (1), а5969 (2), из (3), мйз (4), I? (5), РБЭ (6). А. 1аьсИаъ>И А (7).

По результатам экспериментального инфицирования, штамм Бе является патогенным для цыплят, тогда как штамм дзэбэ, вероятно, утратил свои инфекционные свойства. Различия в патогенности этих штаммов могут быть обусловлены разными причинами, в' том числе - изменениями структуры сильных иммуногенов. Сравнительный анализ белковых спектров позволил дополнительно выявить межштаммовые различия в областях, соответствующих 20 белковым полосам с различной электроФоретической подвижностью. Значительные различия между

штаммами эз и А5еве подтверждаются результатами пульс-электроФорзза Фрагментов ДНК. Выявленные различия касаются не только сшктров рестриктазных Фрагментов, но и размера геномов, определяемого суммой размеров рестриктазных Фрагментов (Рис. 4). Для штамма 28 размер генома составил 1090 ТЫС.Н.П., ДЛЯ А5969 - ИЗО ТЫС.Н.П.

р,„'" " "" ..........- -■■

!

? ч,

I

HSV F ь

Рис. 4. ЭлектроФоратические спектры Фрагкентов ДНК патогенного, se (дорожи 1-3), и не патогенного, АБэеэ (4-6) шташов н. gaiiisspticxm.. Гель окрашен бромистым этидкем. Препараты ДНК, обработанные рестриктазаш: Eco 52 х (1, 4), Ehe I (2, 5), Sma I (3, в).

Локализация сздьных иммуногенов , на ПОМРИРСТИ микоплазм. Электронномикроскопические исследования интактных клеток и. ga.llisepticv.rn, квчвных коллоидным золотом (с

использованием маъ к Р64 и ram, конъюгированным с золотом), показали, что сильные иммуногены микоплазмы локализованы на поверхности клеток. Поверхностная локализация этих иммуногенов видна как на целых клетках, так и на тонких

срезах клеток, иипрегнированных ловикршюм. Кроме того, нг здвктронномикроскотмеских снимках, представленных в диссертации, видно, что частицы коллоидного золота расположены на поверхности микоплаз?.;енной клетки неравномерно, образуют кластеры. Эти результаты хорошо согласуются с данными других авторов по кластерному распределению холестерина в мембране и. gainsepticum (Rottem, Verkieij, 188?). Характер локализации исследуемых нами поверхностных иммуногенов может быть связан с распределением холестерина в мембране.

После культивирования микоплазм в течении 1-2 часов непосредственно на поверхности сеточек, покрытых подложкой с белком А и маь к Р64 (см. раздел материалы и метода), клетки Фиксировали и после инкубации с маь к Р64 катили коллоидным золотом. На прздставлонных в диссертации фотографиях видны целые микоплазгленные клетки с частицами коллоидного золота на их поверхности. Клетки имеют характерную грушевидную форму с выраженным "лидирующим ' концов", где, как известно, расположена струетура "ыоь". Утолщенная часть многих клеток переходит в хвостоподобное образование, также меченое золотом. Мы предполагаем, что эти образования возникли в результате движения клетки по подложке. Траекторию предполагаемого движения можно проследить по частицам цитоплазмы, утерянным микоплазмой в процессе движения. Подложка, покрытая маь к сильным иммуногенам М. galliseplicuru, в данном случае может быть выступает аналогом поверхности клеток трахеального эпителия цыплят и вызывает процесс активной адгезии и движения микоплазмы.

Тубулярные структуры И поверхностные белки М.qallisepti -cum. Если поверхностные- мембранные белки участвуют в процессе клеточного движения, то эти белки должны быть Функционально связаны с белками цитоскелета.' Одним из возможных подходов выявления подобной связи может служить метод перекрестной иммунопревдпитации клеточных экстрактов микоплазмы, меченных

35

in vivo l—[ siМетионином. Для реакции иммунопреципитации были использованы маь к Р64 М. galhsepticwn И раь к ТубуЛИНЭМ

КРС. В качестве контроля использовали преиммунную сыворотку кролика. Иммунопреципитаты исследовали электроФоретически (Рис. 5). Выявлено соосавдение 40 кДа тубулиноподобного белка и главного иммуногена м еаШяерисит А5969. Полученные -результаты по перекрестной иммунопрецигаггации не противоречат нашему предположению о Функциональной связи тубулярных структур с сильными иммуногенами никоплазш.

r I

'] -х

/ 2. 3 V

Рис. 5. Иммунопреципигация белков н. gallisept iсыт А5969, меченных l-c siМетионином in vivo. Радиоавтограф. Тотальный микоплазменный белок (1). Преципитаты с раъ к тубулину КРС (2), неспецифической кроличьей сывороткой (3),- маъ к Р64 (4). Сильный иммуноген (Р70) и 40 кДа " тубулиноподобный белок отмечены (*).

Известно, что у н. pn&wnon¿ae в организации поверхностных белков-адгезинов принимают участие цитоскелетоподобные

СТРУКТУРЫ (Stevens. Krause, 1991), а ПОВврХНОСТНЫе ЭНТИГвНЫ

по кранное г.:эро трэх гадов микоплазм: и. рпеитопсае,

Н. (уеп£ Ю.Ы-шл., М. саШверЧсчт, БариЯТНО, СПОСОбНЫ ГОренеЩаТЬ-СЯ ПО КЛЗТ0ЧЕ0Й г.эг.йранэ (КаЬапе, 1984).

На основании собственных и литературных данных ш предполагаем что поверхностные белки (иммуногены) могут направленно пзрошцаться по мембране м. ва.ь И5&рИс-и>л благодаря тоглу, что они связаны (заякорены) с тубулаш. Этого гложет быть достаточно для обеспечения движения клетки.

Тубулярньв структуры и клеточное движение м. оашзерц-сит, Описанные наш тубулярные структуры м. еаШБерИсит ш склонны отнести к элементам цьтгоскедэта по следующим причинам:

1. Из представленной схемы объешой реконструкции системы тубулярных структур (Рис. 1) следует, что тубуды располагаются главным образом по периферии клетки в виде плавно изогнутых петель. Такая система тубул может осуществлять опорную Функцию клетки.

2. В состав тубулярных структур входит 40 кДа белок, специфически связывающий антитела против тубулина эукариот.

3. По аналогии с микротрубочками эукариот, кы предполагаем, что в районе инФраблэба может происходить полимеризация и деполимеризация тубул. Тагам образом инфраблеб может выступать в роли своеобразного "центрз организации" тубул.

4. Результаты перекрестной иммунопреципитации не противоречат предположению о Функциональной связи тубулярных структур И СИЛЬНЫХ иммуногенов К. еаШз<?р1ъсит., зпитопы которых экспонированы на поверхности клеточной мембраны.

5. Субстрат, покрытый маь к сильным иммуногенам м. ea.iiisepiic-u.Ti, способствует процессу активной адгезии и движения кикоплазмы. Такой субстрат можно рассматривать в качестве аналога поверхности хозяйских клеток.

Результаты, полученные в данной работе позволяют развить представления об опорно-двигательных Функциях тубулярных

структур по аналогии с тшфотрубочкагт. '¿ы продяагаэм

ГНПОТОТИЧОСКУЮ СХОЩ ДВИНШШ МИКОШВЗКОННОЙ КЛеТХСН (Рис. 6).

Пршфоплзшэ шзкоплазмы к субстрату Ослетке-хозяину) иожэт Ериво.щггь к конФорглационным изменения:.! поверхностных антигенов. Подобные газ нения, в свою очередь вызывают заякоревашгэ адгезшов на тубулах. Процесс трэдталлзшга тубул обёсшчиваэт направленное -движение адгезшов по клзточной шмбране, что в свою очерэдь приводит к движению кяэткп по субстрату.

Рис. 6. Гипотетическая схема движения гаЕсошгазменной клетки. Концевая структура "ЫоЬ" (1), "цэнтр организации" тубул, "ХпГгаЫеЬ" (2), ПвТЛвОбраЗНЫв ТубуЛЫ (3), плазматическая мембрана (4), поверхностный антиген, не связанный (5) и связанный (6) с тубулярной системой. Область сборки и разборки тубул обозначена "+" и

ВЫВОДЫ

1. В клеточных экстрактах Н. еаШгерИсмт выявлвн 40 кДа белок, специфически реагирующий с антителами против тубулина эукариот.

2. В цршембранной Области цитоплазмы М. gall isept ic-wn обнаружены тубулярные структуры. По результатам анализа электронномикроскопических изображений эти структуры имеют спиральную организацию с шагом 16-20 нм. Диаметр поперечного сечения тубул составляет около 30 нм. Методом иммунной электронной микроскопии показано, что в состав тубулярных структур Н. gallisopticxjm. ВХОДИТ 40 КДа ТубуЛИНОПОДОбНЫЙ белок.

3. Электрофоретическиэ спектры белков М. gallisepticvm различны для разных штаммов и штаммосгоциФичны. Различия между штаммами подтверждены методами перекрестного иммуноблотинга со штаммоспециФичными политональными антителами. Межштаммовые различия выявлены также методом пульс-элвктроФореза рестриктазных Фрагментов ДНК..

4. Во всех шести исследованных штаммах м. gaiiisepticvm выявлены белки с наибольшей отное'гительной иммуногеннностью, называемые сильными иммуногенами. Эти иммуногены у разных штаммов отличаются по электроФоретической подвижности. Эпитопы этих белков экспонированы на поверхности клеточной мембраны.

6. На основании электронномикроскопичвских данных сделана реконструкция пространственного расположения тубулярных структур м. gaiiisepticvm. По результатам перекрестной иммунопреципитации сделано предположение о возможной связи in situ СИЛЬНЫХ иммуногенов м. gallisepticvm С 40 КДа тубулиногодобным белком. Предложена гипотетическая ' схема движения микоплазменнои'клетки.