Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы транспорта ионов через нанометровые поры в модельных мембранах

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы транспорта ионов через нанометровые поры в модельных мембранах"

;

\ . .■) На правах рукопяся

/ '

ЧО

и

ВЕЙНБЕРГ Ирина Олеговна

МЕХАНИЗМЫ ТРАНСПОРТА ИОНОВ ЧЕРЕЗ НАНОМЕТРОВЫЕ ПОРЫ В МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАНАХ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

и О — <э & - 0

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Адольф Аронович ЛЕВ,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Офяцхллышв оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Зоя Иринарховна КРУТЕЦКАЯ

Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

доктор биологических наук Юрий Алексеевич НЕГУЛЯЕВ,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая органхаяцжя: Институт физиологии РАН им.

И.П. Павлова, Санкт-Петербург

Защита состоится 30 июня 2006 года в 12 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан « » мая 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транспорт ионов через каналы клеточных мембран играет существенную роль для обеспечения ионного го-меостаза клетки и процессов передачи сигнала, а также для реализации специализированных функций, включая проведение импульса по нервному волокну, мышечное сокращение, преобразование энергии рецепцию и т. д. Важное значение имеют такие свойства ионных каналов, как избирательная проницаемость и способность к открыванию и закрыванию при смещении трансмембранного потенциала или при взаимодействии с гормонами и агонистами внеклеточной среды. Изучение физико-химических основ работы каналов клеточных мембран необходимо для понимания функционирования клетки, а также для решения практических задач биотехнологии, медицины, фармакологии и т.д.

Последние годы отмечены интенсивным развитием фундаментальных исследований принципов организации ионных каналов, в том числе и с использованием различных модельных систем (Korchev et al.,1995; Siwy et al., 2002). Как известно, наиболее распространенными моделями клеточных мембран являются бислойные липидные мембраны (BJIM) . Возможность шире варьировать экспериментальные условия, чем на чувствительных клеточных мембранах является большим преимуществом BJIM для изучения физико - химических основ транспорта ионов. Как всякая модель, БЛМ имеют и свои достоинства, и недостатки: при относительной близости к нативным мембранам по химическому составу данные модели в условиях эксперимента могут быть весьма нестабильны и неспособны выдерживать сильные колебания различных физико-химических воздействий (рН, давление, величина подаваемого на мембрану напряжения). Поэтому выяснение механизмов ионного транспорта с использованием новых модельных систем - нанометровых пор из полиэтилентерефталата (ПЭТФ) представляет особый интерес (Pasternak et al.,1995). Исследования особенностей проводимости пор ПЭТФ мембран позволяют получить информацию о биологических структурах и процессах, происходящих в нанопространствах на молекулярном уровне. Как показывает анализ литературных данных, изучение свойств сверхузких пор представляет практический интерес для разработки новых способов тестирования биопрепаратов с использованием нанотехнологий.

Результаты проведенных исследований (Lev et al., 1993; Kor-chev et al.,1997) позволяют полагать, что в экспериментах с применением модельных нанометровых пор могут быть изучены важнейшие особенности ионных каналов клеточных мембран, включая такие свойства как дискретность ионных токов, ионная селективность, нелинейность вольт-амперных характеристик, чувствительность к фармакологическим агентам. Повышенный интерес вызывает исследование механизмов блокирования и феномена аномального выпрямления, характерных для катион-селективных каналов клеточных мембран, в частности для каналов TRP (transient receptor potential) семейства. Важное значение для практической фармакологии и медицины имеет понимание фундаментальных механизмов ингибирующего действия известных физиологически значимых агентов: диуретиков, характеристических Олокаторов эпителиальных натриевых каналов; местных анестетиков, известных как модификаторы ионных каналов возбудимых мембран нервных и мышечных образований.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является изучение проводящих свойств и механизмов блокирования биологических ионных каналов с использованием нанометровых пор в модельных мембранах.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Характеристика проводящих свойств одиночной поры мембраны из полиэтилентерефталата. Выяснение возможностей применения нанометровых пор для моделирования и изучения свойств ионных каналов клеточных мембран.

2. Выяснение особенностей вольт-амперных характеристик нано-метровой конической поры и анализ эффектов многозарядного катиона рутениевого красного для понимания феномена аномального выпрямления ионных токов.

3. Исследование действия амилорида на проводимость

а) конических и цилиндрических нанометровых пор ПЭТФ мембран;

б) каналов, образованных антибиотиком грамицидином в билипидных мембранах.

4. Изучение механизма действия местных анестетиков, различающихся по степени липофильности и кислотно-основным характеристикам, на проводимость нанометровых пор.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Одиночная нанометровая пора мембраны из полиэтилентереф-талата - адекватная модель для изучения проводящих свойств ионных каналов клеточных мембран. Основное свойство одиночных нано-метровых пор и ион-транспортирующих мембранных белков - дискретность, т.е. ступенчатый характер протекающих по ним ионных токов.

2. Физико-химическая основа дискретности токов нанометровых пор есть следствие специфического вида ионной проводимости -поверхностной проводимости, которая возникает в нанометровой поре и связана с зарядом стенок поры.

3. При изучении проводящих свойств конической одиночной поры ПЭТФ мембраны обнаружена выраженная нелинейность вольт-амперной характеристики - так называемое свойство аномального выпрямления Механизмы данного явления могут быть выявлены при изучении действия многозарядного катиона рутениевого красного на проводимость нанометровых пор.

4. Обнаруженное подавление проводимости нанометровых пор ПЭТФ мембран при действии амилорида и ряда анестетиков с различной степенью липофильности (ультракаин, лидокаин, новокаин) можно отнести за счет взаимодействия органических катионов с отрицательно заряженными стенками пор и тем самым уменьшения поверхностной проводимости.

Научная новизна полученных результатов. Для изучения физико-химических основ функционирования ионных каналов клеточных мембран предложена удобная модель - одиночная коническая нанометровая пора мембраны из полиэтилентерефталата. Впервые показано действие на проводимость нанометровых пор фармакологических препаратов двух групп - диуретиков и местных анестетиков, а также известного блокатора катион-проводящих каналов клеточных мембран комплексного катиона рутениевого красного. Предложено новое понимание механизма блокирования на основе действия на проводимость, возникающую в узких нанометровых пространствах, стенки которых имеют поверхностный заряд. Выявлена возможная взаимосвязь нелинейности вольт-амперных характеристик с геометрией поры и существованием поверхностной проводимости.

Теоретическое и практическое значение работы. Выявление механизмов проводимости нанометровых пор ПЭТФ мембран важно для

понимания принципов функционирования каналов и пор в плазматической мембране и внутриклеточных структурах. Известная простота модельной системы позволяет получить информацию о протекающих физико-химических процессах, происходящих в нанометровой поре на молекулярном уровне. Принципиальное значение для клеточной биологии имеют выводы о том, что селективность каналов и дискретность регистрируемых токов обусловлены существованием так называемой поверхностной проводимости, возникающей в нанометровых пространствах со стенками, несущими заряды. Разработанная модельная система с изученными физико-химическими свойствами может быть использована для тестирования свойств фармакологических препаратов, а также для электрического детектирования биопрепаратов .

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Основные положения были представлены и обсуждены на научных семинарах Группы физической химии клеточных мембран Института цитологии РАН, на 3 Всероссийском Биофизическом съезде (Воронеж, 2004), на 7 Всероссийской конференции молодых ученых "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ... страницах машинописного текста и содержит ... рисунков и ... таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение пор мембранах из полиэтилентерефталата. Эксперименты проводились на одно и многопоровых мембранах из полиэтилентерефталата толщиной 10-12 мкм. Образцы многопоровых трековых ПЭТФ мембран были получены из лаборатории ядерных реакций им. Г.Н. Флерова ОИЯИ (Объединенный институт ядерных исследований), Дубна. Многопоровые мембраны, использующиеся в работе, имели количество пор 106 на см2 при диаметре 15 нм. Конусность пор выражена слабо (Апель и др., 1985).

Фильтры с одиночными треками были получены из института СБ1 (Общество исследования тяжелых ионов), Дармтдштадт, Германия. При использовании несимметричных условий химической обработки (травления) одиночных трековых пор ПЭТФ мембран получали образцы, имеющие коническую форму. По предварительным оценкам диаметра

узкой и широкой части одиночной конической поры размеры были соответственно 2 и 500 нм (Siwy et al., 2002).

Получение грамицидиновых каналов в БЛМ. Еислойные липидные мембраны формировали по методу Монтала и Мюллера (Montai, Mueller, 1972) путем сведения конденсированных монослоев на отверстии диаметром 20-50 мкм в перегородке толщиной 10 мкм тефло-новой камеры с двумя отделениями. Для получения бислойных липид-ных мембран использовалась смесь общих липидов соевых бобов -азолектин. Грамицидин добавляли в камеру симметрично в концентрации 10~7М.

Исследования электрохимических характеристик модельных систем. Для регистрации проходящих через пору токов достаточно малой величины (доли и единицы пА) использовался метод фиксации потенциала на мембране, часто применяющийся для изучения свойств клеточных и модельных мембран, в том числе бислойных ли-пидных мембран и пор мембран из полиэтилентерефталата (рис.1).

Напряжение на мембрану подавали с использованием хлорсереб-ряных электродов с выхода 12-разрядного цифро-аналогового преобразователя (фирма L-card, Москва), выходной сигнал поступал на преобразователь ток-напряжение с высокоомной обратной связью и далее записывался на жесткий диск компьютера.

Исследования элекрохимических характеристик полученных ПЭТФ мембран с одиночной порой и билипидных мембран, модифицированных грамицидином, проводили при температуре 22 "С в растворах 0.1 М KCl марки "о.с.ч.".Для поддержания pH 6-8 использовали 0.005 М HEPES(Sigma).

Вольт-амперные характеристики одиночной поры мембраны из полиэтилентерефталата снимали при подаче на мембрану ступенчато

\["1ленка из полиэтилентерефталата

Рис. 1. Упрощенная схема установки для определения проводимости методом фиксации потенциала на мембране.

Пора /

разности потенциалов от -500 до 500 мВ с шагом 100 мВ (время 1 ступени - 60 с), в ряде случаев диапазоне увеличивали до ± 1000 мВ. Для фиксации возникающих флуктуации одиночной поры проводили наблюдения за величинами токов при выбранном постоянном значении подаваемой разности потенциалов на мембране (время наблюдений до 5 мин, разность потенциалов -200,-300 мВ).

Измерения селективности ПЭТФ мембраны проводили на многопо-ровых мембранах (количество пор 10 6 на см 2 и диаметр пор 15 нм) с помощью электрометра VA-J-51 методом потенциала нулевого тока при создании с обеих сторон мембраны градиента концентрации электролита. Для подтверждения катионной селективности определяли числа переноса при градиенте концентраций: 0.1 М / 0.01 М; при pH используемых растворов в диапазоне 6-8. Числа переноса вычисляли по формуле:

1 (_ (р'конц | J I

Т*= 2 — J ^ щ где а2 - активности электролитов,

находящихся по разным сторонам мембраны; R, F - имеют обычные значения, Т - температура в градусах Кельвина; z - валентность

катиона; ™ - концентрационная разность потенциалов (Oda,

Yawataya,1956).

Условия проведения экспериментов. Эксперименты с проводились в ионных условиях, близких к физиологическим (концентрация базового электролита 0.1 М, pH в диапазоне 6-8, HEPES 0.005 М). Бло-каторы в камеру добавляли симметрично в цис и транс отделения камеры. Концентрации каждого из них подбирали исходя из данных, найденных для блокирующего действия на каналы биологических мембран. Использовали амилорид (Sigma), рутениевый красный (Sigma) , анестетики лидокаин и новокаин (ФГУП "Мосхимфармпрепа-раты ") , ультракаин (Hoechst) .

Обработка результатов экспериментов. Записи токов фиксировали в электронном формате с использованием изготовленного в лаборатории аналога программного продукта Pclamp 6.02. Затем проводили обработку с помощью разложения гистограмм амплитудного распределения токов по Гауссу (применялась программа Origin 6) . Для построения вольт-амперных характеристик использовали средние во времени значения токов для каждого значения разности потенциалов на мембране.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика модельных систем — манометровых пор ПЭТФ мембран. С использованием методики фиксации потенциала на мембране и потенциометрического . метода были проведены исследования ионной проводимости и электрохимических характеристик наномет-ровых пор с различными геометрическими параметрами в одно- и много-поровых мембранах из полиэтилентерефталата. На рис. 2 представлен пример регистрации ионных токов одиночной поры модельной мембраны. Результаты экспериментов показали, что дискретные колебания токов на одиночной поре конической формы обнаруживались при ионных условиях, близких к физиологическим, т.е. при концентрации электролита, омывающего мембрану, порядка 0.05 - 0.1 М, pH 6-8, HEPES 0.005. В симметричных электролитных условиях (0.1 М KCl по обеим сторонам мембраны) проводимость пор составляла около 15 - 30 пСм в области потенциалов -100, -300 мВ. Разность потенциалов на мембрану подавали с ориентацией

отрицательных значений на широкую часть поры (рис. 2).

Рис. 2. Дискретные коле-

ТОКИ. ПА

оалия токов манометровой конической порч ПЭТ* мем-брани, регистрируемые при поддерживаемом потенциале -300 мВ с ориентацией на

п широкую часть поры; 0.1 М

время 60 с

KCl.

Вольт-амперная характеристика полученной одиночной конической поры характеризуется выраженной нелинейностью (рис. 3).

Рис. 3. Вольт-амперная характеристика одиночной конической поры мембраны из полиэтилентерефталата в симметричных электролитных условиях <0.1 М KCl). На вставках показаны знаки приложенной разности потенциалов относительно узкой и широкой части конической поры.

10

M<\fVi.

Присутствует эффект так называемого аномального выпрямления, достаточно характерный для ряда ионселективных каналов биологических мембран. Более высокая проводимость наблюдается при подаче отрицательных значений потенциала на широкую часть поры, т.е. в той же области, где возникновение дискретных токов наиболее вероятно. Таким образом, нанометровые поры мембраны из полиэти-лентерефталата обладают одним из кардинальных свойств каналов клеточных мембран, а именно, дискретностью протекающих по ним ионных токов. Наблюдаемая дискретность, т.е. ступенчатый характер токов, представляет свойство так называемой поверхностной проводимости, возникающей в сверхузких пространствах, несущих поверхностный заряд (Духин, Дерягин, 1976).

При исследовании зависимости проводимости одиночной конической поры от величины рН был обнаружен минимум значений при рН 3.86 (табл. 1), что согласуется с данными об изоэлектрической точке для трековых ПЭТФ мембран в зоне рН 3.7 - 3.8; в данной зоне карбоксильные группы полиэтилентерефталата теряют свой отрицательный заряд в водном растворе.

Таблица 1. Исследование зависимости проводимости одиночной кони-

рН.

При дальнейшем понижении рН, по-видимому, происходит "^перезарядка" мембраны (Ермакова и др., 1998). Компенсация отрицательного заряда карбоксильных групп при снижении рН приводит к уменьшению пристеночной концентрации моновалентных катионов, что уменьшает поверхностную проводимость. Эффекты перезарядки мембраны приводят к изменению селективности и появлению анионного тока за счет переноса ионов хлора. Сходные эффекты были обнаружены при исследовании проводимости многопоровых ПЭТФ мембран при варьировании рН.

По ходу экспериментов выяснилось, что снижение рН от 6 до 3 приводит к уменьшению проводимости в 2-3 раза, при дальнейшем же снижении рН (от 3 до 1) проводимость возрастает до значений, близких к таковым при рН 6 (табл. 2).

ческой поры от величины

рН Проводимость, пСм

6.0 9.0

3.86 6.7

3.2 10.2

2.7 15.4

Таблица 2. Изменение проводимости многопоровых мембран при из-

Возрастание проводимости (табл.2) при повышении рН (от рН6 до рН8) связано с увеличением заряда карбоксильных групп стенок нанометровых пор. Эти данные сходны с результатами расчета (табл.3) поверхностной плотности заряда ( & ) стенок нанометровых пор мембран из по-лиэтилентерефталата, а также с результатами измерений катионной селективности, полученными потенциометрическим методом. Теоретически показано, что плотность поверхностного заряда ( а ) в порах ПЭТФ мембран при изменении рН от 6 до 8 увеличивается. Этот эффект связан с увеличением заряда поверхности пор за счет диссоциации карбоксильных групп протравленного полиэтилентерефталата. Таблица 3. Расчет поверхностной плотности заряда стенок пор мембраны из полиэтилентерефталата: толщина 10 мкм, плотность пор 106*см~2, диаметр поры 15нм.

Базовый Электролит 0.1 М КС1 Поверхностная плотность заряда, сгмккул*см~2

рН 6 5,3 ± 0,8

рН 8 13,4 ± 1,9

Для оценки селективности многопоровых ПЭТФ мембран определяли числа переноса потенциометрическим методом. Высокие значения чисел переноса (Т+ = 0.94±0.05) были найдены для мембран с следующими характеристиками: количество пор 10б на см2, диаметр пор 15 нм. Это свидетельствует о высокой катион - анионной избирательности нанометровых пор, обусловленной наличием отрицательного поверхностного заряда стенок пор мембран из полиэтилентерефталата (Березкин и др., 1991) . В работах по исследованию физико-химических особенностей нанометровых пор ПЭТФ мембран было отмечено, что поверхностные эффекты становятся значимыми при размерах пор не больше 15-20 нм (Апель и др.,1985).

Таким образом, на модельных системах - нанометровых порах ПЭТФ мембран - зафиксированы изменения проводимости, связанные с изменениями поверхностного заряда отрицательно заряженных карбоксильных групп стенок пор. Измерения чисел переноса показывают

менении рН.

рН Проводимость, (10"7)См

8.0 11.0

6.0 4.4

5.0 3.7

4.0 2.9

3.5 2.4

3.0 2.4

2.0 3.0

высокую катионную селективность нанометровых пор ПЭТФ мембран в области нейтральных и щелочных рН. Ионные токи, возникающие в нанометровых порах, обладают свойством дискретности, которая является следствием феномена поверхностной проводимости. Одно из возможных объяснений возникновения поверхностной проводимости включает предположения о кооперативности гидрофобно-

гидрофильных взаимодействий (Korchev et al., 1997).

Влияние органических катионов на проводящие свойства нанометровых пор ПЭТ* мембран. Изучение механизмов блокирования ионных каналов наряду с фундаментальным интересом имеет также и практическое значение в фармакологии и терапии, в частности, для выбора веществ, используемых для местной и общей анестезии. На приводимом ниже экспериментальном материале, полученном на модельной системе нанометровых пор, показана возможность блокирования поверхностной проводимости известными фармакологическими агентами, являющимися ингибиторами катионных каналов клеточных мембран. Эксперименты проводили как на однопоровых ПЭТФ мембранах, так и на многопоровых образцах. Для моделирования действия диуретика амилорида использовали также бислойные липидные мембраны, модифицированные каналоформером грамицидином. 1. Исследование действия шестизарядного комплексного катиона рутениевого красного. Рутениевый красный - неорганический краситель, химическая формула ( [ (NH3) 5Ru-0-Ru (NH3) 4-O-Ru (NH3) 5] Cl6) . В водном растворе представляет собой шестизарядный катион. Для исследования электрохимических характеристик одиночных пор конической формы ПЭТФ мембран при действии рутениевого красного (Ru6+) регистрировали трансмембранные токи при постоянном значении подаваемой разности потенциалов на мембране. Анализировали вольт-амперные характеристики, наблюдали дискретные токи в отсутствие и в присутствии разных концентраций рутениевого красного (рис. 4, рис. 5) . Данные, приведенные на рис. 5, показывают, что Ru6+ уменьшает вероятность появления флуктуаций токов относительно высоких значений. При максимальной концентрации Ru6+ (10~5М) происходит полное подавление дискретности токов. На рис. 4 показаны вольт-амперные характеристики для ПЭТФ мембраны с одиночной конической порой, полученные в симметричных электролитных условиях (0.1 М КС1) для различных концентраций рутениевого красного (10-6 - 10~4 М) . При сопоставлении вольт-амперных

кривых, полученных в контроле и при добавлении рутениевого красного обнаруживается эффект уменьшения суммарной проводимости, т.е. блокирующее действие Ru6+(Вейнберг и др.,2005).

Рис.4.Яолът-ампернае характеристик* одиночной конической пори в отсутствие (1) и m присутствия Ra 6 + а базовом электролите 0.1 М KCl: 2 - 10'6, 3 - I0"5, 4 -10'4 М Ra б +.

Основным результатом действия Ru (10~5 -10"4 М) является ин-гибирование токов при высоких отрицательных потенциалах, вольт-амперная характеристика становится близка к линейной, т.е. снимается эффект аномального выпрямления. Это значит, что возникновение больших токов в области отрицательных значений потенциала связано с присутствием большого поверхностного и объемного зарядов в широкой части конической поры. Обнаруженные эффекты находят свое объяснение в рамках гипотезы концентрационной поляризации (Woermann, 2002), суть которой заключается в избыточном накоплении носителей тока в области большого объемного заряда поры.

Таким образом, выявлена связь эффекта аномального выпрямления ионных токов с геометрией нанометровых пор. При измерении селективности потенциометрическим методом при действии Ru6+ (Ю-5 М) значение Т+ становилось равным 0.5, т.е. происходило полное уничтожение катионной селективности многопоровой ПЭТФ мембраны (табл. 4). При дальнейшем увеличении концентрации бло-катора Т+ составляло 0.3, т.е. стенки мембраны приобретали положительный заряд и мембрана становилась анион-селективной. Наблюдался так называемый эффект перезарядки мембраны.

Токи пА

N 40

40

пА 20

пА 20

м 0АВ

1 ч^м Км*'

УЙЬк

Ряс 5. Действие рутениевого красного ( Ки 6+) на дискретные токи одиночной конической пора. Показаны фрагменты за -писей токов в отсутствие (а) и в присутствии рутениевого красного в разных концентра-

циях: (б)

10~ М;

(в) - 10'5М Яи6+.

ТОКИ. пА

время записи, 30

Соответствующие амплитудные гистограммы построены по значениям токов, измеренным для интервалов 5 мс. 1 — соответствует минимальному и 2 - максимальному значению токов на данном временном интервале. Подаваемая разность потенциалов -800 мВ. Таблица 4. Изменение показателя селективности мембраны Т+ при добавлении рутениевого красного (Яи6+).

Таким образом, при изучении проводящих свойств конической одиночной поры мембраны из по-лиэтилентерефталата обнаружено свойство аномального выпрямления ионных токов, связанное, по-видимому, с существованием отрицательного поверхностного заряда и геометрическими параметрами поры. Существенные изменения вольт-амперной характеристики при действии шестизарядного катиона рутениевого красного обусловлены нейтрализацией заряда стенок поры (\/е1пЬегд е! а1.,2005).

2. Исследование действия амилорида на проводимость пор ПЭТФ мембран и билипядных мембран, модифицированных грамицидином.

По своей структуре амилорид является пиразиноилгуанидином, содержащим аминогруппы в 3 и 5-м положениях и радикал СХ в 6-й позиции пиразинового кольца (химическая формула СбНвС1Ы70) , рК

Концентрация Г1и6+(М) Т+

0(контроль) 0.89± 0.03

Ю"6 0.79± 0.1

ю-* 0.55+0.05

10"' 0.33+ 0.3

аминогруппы амилорида в воде составляет 8.8 . При физиологических значениях рН амилорид несет положительный заряд, т.е. должен связываться с анионными группами различных типов каналов. При увеличении рН раствора протонированная фракция амилорида уменьшается. Известно, что в депротонированом состоянии амилорид обладает липофильными свойствами (К1еушап а1.,1988). Сродство амилорида к стенкам поры в гидрофобном материале (полиэтиленте-рефталат) может определяться также гидрофобными взаимодействиями Для исследования электрохимических характеристик одиночной конической поры регистрировали трансмембранные токи при постоянном значении подаваемой разности потенциалов. Было показано, что при добавлении амилорида в концентрации 10~7 М (рис.6 а, б) уменьшается вероятность появления дискретных токов (флуктуа-

ций) . Эффект уменьшения проводимости одиночной поры можно отнести за счет взаимодействия положительно заряженной части амилорида со стенками поры, что в свою очередь уменьшает количество избыточных носителей тока. При увеличении концентрации амилорида в растворе базового электролита (0.1 М ЫаС1) до 10-4 М было обнаружено увеличение проводимости одиночной конической поры (рис. 6, в) . Этот эффект сходен с так называемым парадоксальным действием амилорида в отношении эпителиальных натриевых каналов (Носырева и др.,1988).

Анализируя вольт-амперные характеристики на участке от -500 до + 500 мВ в присутствии амилорида в концентрациях от 10"7 М до 10~5 М также следует отметить наряду с уменьшением суммарной проводимости поры при концентрации 10 "7 М увеличение проводимости при 10~5 М амилорида (рис. 7).

Таким образом, обнаружен эффект подавления проводимости одиночных пор конической формы при малых концентрациях амилорида и стимулирующий проводимость пор эффект при больших концентрациях амилорида(Лев,Вейнберг,2004).

Ряс.6. Действие диуретика амилорида на дискретные токи одиночной конической поры. Показаны фрагменты записей токов в отсутствие (А) и в присутствии амилорида в концентрациях 10~7М (Б) и 10~5М (В) . Соответствующие амплитудные гистограммы построены по значениям токов, измеренным для интервалов 5 мс. 1 - соответствует минимальному уровню тока и 2,3 - уровни флуктуации токов. Подаваемая разность потенциалов -500 мВ.

Рис.7. Вольт-амперные характеристики одиночной конической поры ПЭТ* мембраны в отсутствие (1) и в присутствии амилорида в концентрациях 10~7 (2) и 10~5 (3) М. Базовый электролит 0.1 М KCl.

При действии амилорида на одиночные цилиндрические поры ПЭТФ мембран диаметром 15 нм было обнаружено ингибирование токов и проводимости. Эффекта стимуляции проводимости, отмеченного для конических пор, показано не было (табл. 5).

Таблица 5. Действие амилорида среднюю проводимость одиночной цилиндрической поры диаметром 15 нм.

Концентрации амилорида Средняя проводимость(С) , пСм

0(контроль) 38

10"" М 38

10"" М 35

10"" М 17

По-видимому, возрастание проводимости одиночной конической поры ПЭТФ мембраны при действии амилорида связано с эффектом разрыхления пристеночного геля, в результате чего повышается поверхностный заряд стенок и, соответственно, увеличивается проводимость поры. Подобное объяснение согласуется с результатами работ по изучению физико-химических свойств ПЭТФ Мембран (Березкин и др.,2003; Сергеев и др.,2003), а также с данными по изменению катионной селективности многопоровой ПЭТФ мембраны, представленными ниже.

При определении ионной селективности многопоровой мембраны было обнаружено уменьшение чисел переноса Т+ с 0.91±0.01 (в отсутствии амилорида) до 0.78± 0.02 при концентрации амилорида 10" 6-10"5 М. Изменения селективности мембраны на анионную обнаружено не было.

Изучалось влияния амилорида на грамицидиновые каналы в БЛМ из аэолектина. Увеличение концентрации амилорида 10~6 М до 10"4 М в омывающем мембрану растворе практически не влияло на амплитуды одиночных открываний грамицидиновых каналов. Уменьшалась частота возникновения каналов (табл. 6).

Таблица 6. Действие амилорида на каналы, образованные грамицидином А в бислойных мембранах из азолектина.

Контроль(0) Амилорид 10~ь М 10"ь М 10'" М

Проводимость канала (О, пСм 18 18 18 17

С/Б0 1 1 1 0.9

Частота возникновения каналов 20 23 9 0.1

Опираясь на модель липидной регуляции функционирования ион-транспортирующих систем этот факт свидетельствует о возможном

влиянии амилорида на равновесие ассоциации - диссоциации олиго-мерных структур молекул грамицидина.

3. Действие местных анестетиков на проводимость и селективность нанометровых пор ПЭТФ мембран. Основные эксперименты были проведены с использованием двух групп местных анестетиков, различающихся по степени липофильности и рК заряженной группы. Известно, что фармакологическая эффективность препарата зависит от его структуры и физико-химических свойств (Харкевич, 1993). При прочих равных условиях эффективность анестетика пропорциональна концентрации ионизированной формы, что зависит от рКа препарата и локального рН в месте введения. Ультракаин имеет относительно низкую рКа (7.8) и быстро действует сравнительно с новокаином (рКа =9.1) и лидокаином (рКа - 7.9). Кроме того, ультракаин наименее липофильный анестетик. В физиологических и близких к ним рН локальные анестетики представляют собой органические катионы, способные понижать поверхностный заряд стенок пор ПЭТФ мембран и, таким образом, оказывать влияние на поверхностную проводимость данных модельных систем. Действительно, в наших экспериментах на мембранах из полиэтилентерефталата при действии ультракаина наблюдается уменьшение как амплитуды, так

и частоты возникновения

16, ток'па Н n 3 дискретных токов (рис. 8) .

Рис. 8. Действие ультракаина на дискретные токи одиночной поры. Показаны фрагменты записей токов одиночной конической поры в отсутствие (а) и в присутствии ультракаина в разных концентрациях: (б) - 10~4 М; (в) -10'3 М ультракаина. 1 соответствует минимальному и 2 максимальному значению токов на данном временном интервале. Значения токов для амплитудной гистограммы получали для интервалов 5 мс. Разность потенциалов -300 мВ.

12

8 У

а

1в, 12 8 4

13 12 8 4

ЛГ\А

■Л.

Бремя записи, 60 с

Это свидетельствует о подавлении поверхностной проводимости конической поры и сопоставимо с данными о действии амилорида и комплексного катиона рутениевого красного, а также согласуется с результатами влияние катионов металлов на проводимости пор ПЭТФ мембран (Lev et al., 1993).

На рис. 9 представлены вольт-амперные характеристики одиночной конической поры ПЭТФ мембран при действии 10 "3М и 10 ~4М ультракаина, новокаина и лидокаина. Сопоставление графиков показывает, что существенные изменения проводимости в области отрицательных потенциалов (от -300 до -1000 мв) имеют место при действии ультракаина (рис. 9) .

действие новокаина

действие ультракаина

Ряс. 9. Вольт-янпернив характеристик* одкночной коняческож пори ПЭТФ ытыбрани а отсутствие (1) ж в присутствии Анестетиков в

концентрациях 10~4 (2) и 10'3 (3) М. Базовый электролит 0.1 М КС1.

Необходимо отметить, что описанные эффекты подавления проводимости были зарегистрированы на однопоровых мембранах ПЭТФ только при рН 6-7, при рН 8 уменьшения проводимости не наблюдалось. Это объясняется отсутствием положительного заряда у анестетиков при рН> 8 (рКа ультракаина =7.8 , рКа новокаина = 9.1, рКа лидокаина = 7.9). Таким образом, эффект действия локальных анестетиков на проводимость конической поры ПЭТФ мембраны связан

действие лидокаинл

с экранированием отрицательного заряда стенок пор, при котором уменьшается локальная концентрация носителей тока и, соответственно, проводимость поры.

С помощью потенциометрического метода определены числа переноса и, таким образом, оценены изменения селективности много-поровых ПЭТФ при действии анестетиков (табл. 7).

Таблица 7.Изменение чисел переноса многопоровой мембраны при действии местных анестетиков.

новокаин лидокаин ультракаин

Т+ ПЭТФ-мембраны 0.944 0. 917 0.917

Т+ ПЭТФ-мембраны; анестетик 10-3 М 0 .843 0.86 0.6

Согласно полученным данным (табл. 7) наиболее существенное изменение катионной селективности вызывает ультракаин: - при действии ультракаина имеет место снижение величины Т+ (от 0.917 до 0.6) большее, нежели в случае новокаина и лидокаина. Все представленные локальные анестетики являются однозарядными органическими катионами. Изменение катионной селективности мембран можно объяснить уменьшением отрицательного заряда

поверхности пор ПЭТФ мембран за счет взаимодействия анестетиков с карбоксильными группами полиэтилентерефталата.

Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что ионные токи через нанометровые поры ПЭТФ мембран обладают рядом особенностей, свойственных каналам клеточных мембран, в том числе катионной селективностью, флуктуациями между высоко- и низко-проводящими уровнями, ингибированием токов протонами и органическими катионами. Наши выводы согласуются с результатами исследований последних лет, проведенных на модельных нанометро-вых порах мембран из полиэтилентерефталата (Lev et al., 1993; Korchev et al.,1995; Korchev et al.,1997). В настоящей работе моделируется действие различных органических катионов, в том числе, известных фармакологических агентов на проводимость и селективность нанометровых пор ПЭТФ мембран. Используется новая модель одиночной поры ПЭТФ мембран конической формы. Отмечены эффекты блокирования при действии органических катионов, сходные с тем, что происходит на ионных каналах клеточных мембран.

ВЫВОДЫ.

1. Ион-транспортирующие нанометровые поры в модельной по-лиэтилентерефталатной мембране обладают важнейшими особенностями ионных каналов клеточных мембран: дискретностью ионных токов, ионной селективностью, нелинейностью вольт-амперных характеристик, чувствительностью к фармакологическим агентам.

2. Предложено новое физико-химическое объяснение дискретности токов как одного из свойств поверхностной проводимости, возникающей в нанометровых порах с выраженной ионной селективностью .

3. Вольт-амперная характеристика одиночной конической поры обнаруживает свойство аномального выпрямления ионных токов, связанное с существованием отрицательного поверхностного заряда и геометрическими параметрами поры.

4. Существенные изменения ионных токов и вольт-амперной характеристики нанометровой поры при действии шестизарядного катиона рутениевого красного обусловлены нейтрализацией заряда стенок поры.

5. Диуретик амилорид (10"7 М) и местные анестетики различной липофильности (ультракаин, лидокаин, новокаин) ингибируют проводимость нанометровой поры, что обусловлено и* взаимодействием с карбоксильными группами узкой части конической поры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Лев A.A., Вейнберг* И.О. Моделирование действия амилорида с помощью исследования проводимости нанометровых каналов синтетических трековых мембран. ДАН. 2004,399(3): 415-417.

2. Veinberg I.O., Gotlib V.A., Apel P.Yu., and Lev A.A. The use of synthetic nanometer pores for modeling the conduction block of cation-selective channels of cell membranes by ruthenium red. Docl. Biochem. Biophys. 2005, 405 (6) :454-457.

3. Вейнберг И.О., Готлиб В.А., Апель П.Ю., Лев A.A. Моделирование блока проводимости катионизбирательных каналов клеточных мембран рутениевым красным на синтетических нанометровых порах. ДАН. 2005, 405(6): 822-825.

4. Вейнберг И.О. Возможности использования лавсановых пленок для моделирования действия фармацевтических препаратов. 7 Всероссий-

екая медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье". Санкт-Петербург,2004,52 . 5. Вейнберг И.О., Лев А. А. Выяснение механизма блокирующего действия амилорида на ионные каналы. 3 Съезд биофизиков России. Воронеж, 2004, 191-192. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Veinberg et al.,2005. Biochem. Biophys. 405 (6) : 454-457 2. Korchev Y.E. et al.,1997. FASEB J. 11:600-608. 3. Korchev Y.E. et al.,1995. J. Membr, Biol. 147: 233-239. 4. Lev A.A. 1969. In: Glass microelectrodes. N. Y. 76-94. 5. Lev A.A. et al., 1993. Proc. R. Soc.187-192. 6. Oda Y. and Yawataya T., 1956. Bull. Chem. Soc. Japan.29: 673-679. 7. Pasternak C.A. et al.,1995. NIMB В 105: 332-334. 8. Pasternak C.A. et al.,1993, Colloids and Surface A: physiochemical and Engineering Aspects. 77:119-124. 9. Rostovtseva Т.К.et al.,1998. Biophys. J.75: 1783-1792. 10. Siwy

2. et al., 2002. Physical review letters. 89 (19) : 198103. 11. Siwy Z.l et al.,2002.Europhys. Lett.60 (3): 349-355.12. Woermann

D., 2002. Nuclear Instr. And Methods in Physics Research.194, 4:458-462.13. Апель П.Ю. и др., 1985. Коллоидный журнал.47(1):3-8 . 14. Березкин В.В. и др.,2003. 65(1) :129-131.15. Березкин В.В. и др.,2003. Коллоидный журнал.65(3) : 311-315.16. Березкин В.В. и др.,1991. Коллоидный журнал. 53 (3) : 339-342. 17.Вейнберг и др. ДАН. 2005, 405 (6): 822-825.18. Духин С.С. Дерягин Б.В. 1976, с. 322. 19. Ермакова Л.Е. и др.,1998.Коллоидный журнал.60(6): 763770. 20.Лев, Вейнберг, 2004.ДАН. 399(3): 415-417 21. Носырева

E.Д. и др.,1988.Нейрофизиология. 21:131 -134. 22. Саббатовский К.Г. 2003.Коллоидный журнал. 65(2): 263-269. 23. Сергеев А.В. и др-, 2003.Коллоидный журнал.65. (1) : 93-97.24. Сидорова М.П. и др., 1990. Коллоидный журнал, 52(5): 895-900.25. Харкевич Д.А., 1993. Фармакология.544 с.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 26.05.2006. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 57Ib.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14

Тел./факс: 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вейнберг, Ирина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1. Изучение механизмов проводимости биологических ионных каналов.

1.1.1. Многообразие каналов клеточных мембран: характеристика, классификация.

1.1.2. Методы изучения ионных каналов с помощью регистрации трансмембранных токов.

1.1.3. Свойства катион-проводящих каналов клеточных мембран.

1.1.4. Современные представления о механизмах проводимости ионных каналов.

1.2. Моделирование ионных каналов клеточных мембран.

1.2.1.Транспорт ионов в бислойных липидных мембранах.

1.2.2. Нанометровые поры ПЭТФ мембран как модели биологических ионных каналов.

1.2.3. Моделирование блока проводимости на нанометро-вых порах полиэтилентерефталатных мембран.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Получение пор в лолиэтилентерефталатных (ПЭТФ) мембранах.

2.2. Получение грамицидиновых каналов в бислойных лихшдных мембранах и исследование их характеристик.

2.3. Исследования электрохимических характеристик на-нометровых пор ПЭТ* мембран.

2.4. Измерение селективности ПЭТФ мембраны.

2.5. Условия проведения экспериментов.

2.6. Обработка результатов экспериментов.

ГЛАВА 3. Результаты исследований.

3.1. Характеристика модельных систем — нанометровых пор ПЭТФ мембран.

3.2. Действие органических катионов на модельные системы - нанометровые поры ПЭТФ мембран.

3.2.1. Исследование действия шестизарядного комплекс ного катиона рутениевого красного.

3.2.2. Исследование действия амилорида на проводимость пор ПЭТФ мембран и билипидных мембран, модифицированных грамицидином.

3.2.3.Действие местных анестетиков на проводимость и селективность нанометровых пор ПЭТФ мембран.

ГЛАВА 4 . Обсуждение.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы транспорта ионов через нанометровые поры в модельных мембранах"

Актуальность проблемы. Транспорт ионов через каналы клеточных мембран играет существенную роль для обеспечения ионного гомеостаза клетки и процессов передачи сигнала, а также для реализации специализированных функций, включая проведение импульса по нервному волокну, мышечное сокращение, преобразование энергии, рецепцию и т. д. Важное значение имеют такие свойства ионных каналов, как избирательная проницаемость и способность к открыванию и закрыванию при смещении трансмембранного потенциала или при взаимодействии с гормонами и агонистами внеклеточной среды. Изучение физико-химических основ работы каналов клеточных мембран необходимо для понимания функционирования клетки, а также для решения практических задач биотехнологии, медицины, фармакологии и т.д.

Последние годы отмечены интенсивным развитием фундаментальных исследований принципов организации ионных каналов, в том числе и с использованием различных модельных систем (Korchev et а1., 1995; Бхыу et а1., 2002). Как известно, наиболее распространенными моделями клеточных мембран являются бислойные липидные мембраны (БЛМ). Возможность шире варьировать экспериментальные условия, чем на чувствительных клеточных мембранах является большим преимуществом БЛМ для изучения физико-химических основ транспорта ионов. Как всякая модель, БЛМ имеют и свои достоинства, и недостатки: при относительной близости к нативным мембранам по химическому составу данные модели в условиях эксперимента могут быть весьма нестабильны и неспособны выдерживать сильные колебания различных физико-химических воздействий (рН, давление, величина подаваемого на мембрану напряжения). Поэтому выяснение механизмов ионного транспорта с использованием новых модельных систем - нанометровых пор из полиэтилентерефталата (ПЭТФ) представляет особый интерес (Pasternak et al.,1995 Pasternak et al.,1993). Исследования особенностей проводимости пор ПЭТФ мембран позволяют получить информацию о биологических структурах и процессах, происходящих в на-нопространствах на молекулярном уровне. Как показывает анализ литературных данных, изучение свойств сверхузких пор представляет практический интерес для разработки новых способов тестирования биопрепаратов с использованием нанотехнологий.

Результаты проведенных исследований (Lev et al., 1993 Korchev et al.,1997) позволяют полагать, что в экспериментах с применением модельных нанометровых пор могут быть изучены важнейшие особенности ионных каналов клеточных мембран, включая такие свойства как дискретность ионных токов, ионная селективность, нелинейность вольт-амперных характеристик, чувствительность к фармакологическим агентам. Повышенный интерес вызывает исследование механизмов блокирования и феномена аномального выпрямления, характерных для катион-селективных каналов клеточных мембран, в частности для каналов TRP (transient receptor potential) семейства. Важное значение для практической фармакологии и медицины имеет понимание фундаментальных механизмов ингибирующего действия известных физиологически значимых агентов: диуретиков, характеристических блокаторов эпителиальных натриевых каналов; местных анестетиков, известных как модификаторы ионных каналов возбудимых мембран нервных и мышечных образований.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение проводящих свойств и механизмов блокирования биологических ионных каналов с использованием нанометровых пор в модельных мембранах.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Характеристика проводящих свойств одиночной поры мембраны из полиэтилентерефталата. Выяснение возможностей применения нанометровых пор для моделирования и изучения свойств ионных каналов клеточных мембран.

2. Выяснение особенностей вольт-амперных характеристик нанометровой конической поры и анализ эффектов многозарядного катиона рутениевого красного для понимания феномена аномального выпрямления ионных токов.

3. Исследование действия амилорида на проводимость а) конических и цилиндрических нанометровых пор ПЭТФ мембран; б) каналов, образованных антибиотиком грамицидином в билипидных мембранах.

4. Изучение механизма действия местных анестетиков, различающихся по степени липофильности и кислотно-основным характеристикам, на проводимость нанометровых пор.

Научная новизна полученных результатов. Для изучения физико-химических основ функционирования ионных каналов клеточных мембран предложена удобная модель - одиночная коническая нанометровая пора мембраны из полиэтиленте-рефталата. Впервые показано действие на проводимость на-нометровых пор фармакологических препаратов двух групп -диуретиков и местных анестетиков, а также известного бло-катора катион-проводящих каналов клеточных мембран комплексного катиона рутениевого красного. Предложено новое понимание механизма блокирования на основе действия на проводимость, возникающую в узких нанометровых пространствах, стенки которых имеют поверхностный заряд. Выявлена возможная взаимосвязь нелинейности вольт-амперных характеристик с геометрией поры и существованием поверхностной проводимости.

Теоретическое и практическое значение работы. Выявление механизмов проводимости нанометровых пор ПЭТФ мембран важно для понимания принципов функционирования каналов и пор в плазматической мембране и внутриклеточных структурах. Известная простота модельной системы позволяет получить информацию о протекающих физико-химических процессах, происходящих в нанометровой поре на молекулярном уровне. Принципиальное значение для клеточной биологии имеют выводы о том, что селективность каналов и дискретность регистрируемых токов обусловлены существованием так называемой поверхностной проводимости, возникающей в нанометровых пространствах со стенками, несущими заряды. Разработанная модельная система^ с изученными физико-химическими свойствами может быть использована для тестирования свойств фармакологических препаратов, а также для электрического детектирования биопрепаратов.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Основные положения были представлены и обсуждены на научных семинарах Группы физической химии клеточных мембран Института цитологии РАН, на 3 Всероссийском Биофизическом съезде (Воронеж, 2004), на 7 Всероссийской конференции молодых ученых "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит 19 рисунков и 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Вейнберг, Ирина Олеговна

выводы.

1. Ион-транспортирукхцие нанометровые поры в модельной полиэтилентерефталатной мембране обладают важнейшими особенностями ионных каналов клеточных мембран: дискретностью ионных токов, ионной селективностью, нелинейностью вольт-амперных характеристик, чувствительностью к фармакологическим агентам.

2. Предложено новое физико-химическое объяснение дискретности токов как одного из свойств поверхностной проводимости, возникающей в нанометровых порах с выраженной ионной селективностью.

3. Вольт-амперная характеристика одиночной конической поры обнаруживает свойство аномального выпрямления ионных токов, связанное с существованием отрицательного поверхностного заряда и геометрическими параметрами поры.

4. Существенные изменения ионных токов и вольт-амперной характеристики нанометровой поры при действии шестизарядного катиона рутениевого красного обусловлены нейтрализацией заряда стенок поры.

5. Диуретик амилорид (1СГ7 М) и местные анестетики различной липофильности (ультракаин, лидокаин, новокаин) ингибируют проводимость нанометровой поры, что обусловлено их взаимодействием с карбоксильными группами узкой части конической поры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вейнберг, Ирина Олеговна, Санкт-Петербург

1. Adams С. М., Shyder P.M., Shyder М., Welsh M.J. 1999. Paradoxical Stimulation of a DEG/ENaC Channel by Amiloride J. Biological chemistry, 274,22: 15500-15504.

2. Adelsberger-Mangan D.M., Colombini M.1987.Elimination and restoration of voltage dependence in the mitochondrial channel, VDAC, by graded modification with succinic anhydride. J. Membr. BioL. 98 (2) : 157-68.

3. Alvares de la Rosa D., Canessa С. M., Fyfe G. K., Zhand P. 2000. Structure and regulation of amiloride-sensitive sodium channels. Annual review of Phisiology, 62, 573-594.

4. Apell P., Korchev Y. E., Siwy Z., Spohr R., and Yoshida M. 2001. Diode-like single-ion track membrane prepared by electro-stopping. Nucl. Instrum. Methods B, 184:337 .

5. Apell P.J., Bamberg E., Alpes H., Lauger P.J. 1977. Formation of ion channels by a negatively charged analog of gramicidin A. J. Membrane Biol. 31: 171-189.

6. Arias Hugo Ruben, 1999. Role of local anestetics on both cholinergic and serotonargic ionotropic receptors. Neuroscience and Biochavioral Reviews 23:817-843.

7. Bashford C., Lindsay, Alder Glenn M. And Pasternak Charles A. 2002. Fluctuation of Surface Charge in membrane Pores. Biophysical J.82:2032-2040.

8. Baumann G, Mueller P. 1974. A molecular model of membrane excitability. J. Supramol. Struct. 2 (5-6): 53857 .

9. Baux G., Simonneau M., Tauc L.1979. Transmitter release: ruthenium red used to demonstrate a possible role of sialic acid containing substrates .J. Physiol. 291:161-178.

10. Bechinger B. 1997. Structure and functions of channes-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin.J. Membr. biol. 156(3): 197-211.

11. Bell J.E., Miller C. 1984. Effects of phospholipid surface charge on ion consonduction in the K+ channel of sarcoplasmic reticulum. Biophys. J., 1984, 45(1): 279-87.

12. Benos D.J., Awayda M.S; Ismailov I.L, Johnson J.P.1995. Structure and function of amiloride-sensitive Na+ channels. J. Membr. Biol., 143: 1-18.

13. Ben-Tabou S., Keller E., Nussinovitch I. 1994. Mechanosensivity of voltage-gated calcium currents in rat anterior pituitary cells. J. Physiol. 476: 29-39.

14. Biagi B.A., Enyeart J.J. 1990. Gadolinium blocks low and high threshold calcium currents in pituitary cells. Am. J. Physiol. 264: 1037-1044.

15. Brunen M., Engelhardt H. 1993. Asymmetry of orientation and voltage gating of the Acidovorax delafieldii por-in Omp34 in lipid bilayers. Eur. J. Biochem. 212 (1): 129-135 .

16. Bullock J.O., Kolen E.R. 1995. Ion selectivity of colicin El Anion permeability. J. Membr. Biol., 1995, 144 (2): 131-145.

17. Cahalan M.D., Ahners W. 1979.Block of sodium conductance and gating current in squid giant axons poisoned with quaternary strychnine. Biophys. J.Jul; 27(1):57-73. (a)

18. Cahalan M.D., Aimers W. Interactions between quaternary lidocaine, the sodium channel gates, and tetro-dotoxin. Biophys. J. 1979 Jul; 27(l):39-55. (b)

19. Chandy K.G.1991. Simplified gene nomenclature. Nature (Lond.) 352:26.

20. Cole K. S. 1949. Dynamic electrical characteristics of the squaid axon membrane. Arch.Sci.Physiol., 3: 253 -258.

21. Colombini M. 1980. Pore size and properties of channels from mitohondria isolated from neurospora crassa. J. Memebr. Biol., 53:79-84

22. Colombini M. 1987. Regulation of the mitochondrial outer membrane channel, VDAC. J. Bioenerg. Biomembr. 19 (4): 309-20.

23. Colombini M. 1989. Voltage gating in the mitochondrial channel, VDAC. J. Membr. Biol. Ill (2): 103-11.

24. Courtney K.R. 1975. Mechanism of frequency-dependent inhibition of sodium currents in frog myelinated nerve by the lidocaine derivative GEA. J. Phannacol. ExpTher. Nov;195(2):225-36.

25. Doyle D.A., Morais Cabral R.A. Puetzner A., Kuo J.M., Gulbis S.L., Cohen S.L., Chait and R. MacKinnon. 1998. The structure of potassium channel: Molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280:69-77.

26. Finkelstein A., Andersen O.S.1981. The gramicidin A channel: a review of its permeability characteristics with special reference to the single-file aspects of transport. J. Membr. Biol. 59 (3): 155-171.

27. Forte M., Blachly-Dyson E., Colombini M. 1996. Structure and function of the yeast outer mitochondrial membrane channel, VDAC. Soc. Gen. Physiol. Ser. 51: 145154. Review.

28. Frazier D.T., Narahashi T., Yamada M. 1970.The site of action and active form of local anesthetics. II. Experiments with quaternary compounds. J. Phannacol. Exp.Ther. Jan; 171(1): 45-51.

29. Fröhlich 0., 1979. Asymmetry of the gramicidin channel in bilayers of asymmetric lipid composition:

30. Voltage dependence of dimerization. J. Membr. Biol. 48 (4) : 385-401 .

31. Gartzke J. and Lange K. 2002.Cellulal target of weak magnetic fields:ionic conduction along actin filaments ot microvilli Am J. Physiol. Cell Physiol., 283: C1333-C134 6.

32. Grigoriev S.M., Conception M., Laurent M. Dejean, M.L. Campo, Martines-Caballero S., Kinnally K.W.2004. Electrophysiological Approaches to the Study of protein translocation in mitochondria. Internatonal Review of Cytology, 238:227-274.

33. Hamill O.P., McBride Jr., D. W.1996. The pharmacology of mechanogated membrane ion channels . Pharmacol . Rev. 48 : 231-252.

34. Henry J.P., Chich J.C., Goldschmidt D. and Thief-fry M. 1989. Ionic Mitochondrial channels. Characteristics and possible role in protein translocation. Biochimie 71:963-968.

35. H-ladky S.B.and Haydon D. A. 1972. Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. Biochim. Biophys. 274: 294-312.

36. Hille B. 2001. Ion channels of excitable membranes . University of Washington, Sinauer Associates, Inc. USA, 607 p.

37. Hodge T., Colombini M. 1987. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. J. Membr. Biol.157 (3): 271-279.

38. Kaulin Yu.A., Schagina L.V., Bezrukov S.M., Malev V.V., Feigin A.M., Takemoto J.Y., Teeter J.H., Brand J.G. 1998. Cluster organization of ion channels formed by the antibiotic syringomycin E in lipid membranes. Biophys. J. 74: 2918-2925.

39. Kirber M. T., Ordway R.W., Clapp L.H., Walsh Jr., J.V., Singne J.J. 1992. Both membrane stretch and fatty acids directly activate large conductance Ca2+ -activated K+ channels in vascular smooth muscle cells. FEBS Lett. 297: 24-28.

40. Kleyman T.R., Cragoe E.J. 1988. Amiloride and its analogs as tools in the study ion transport. J. Membr. Biol. 105: 1-21.

41. Korchev Y.E., Bashford C.L., Alder G.M., Apel P.Y., Edmonds D.T., Lev A.A., Nandi K., Zina A.V., and Pasternak C.A.1997. A novel explanation for fluctuations of ion current through narrow pores. FASEB j. 11:600-608

42. Korchev Y.E., Bashford C.L., Alder G.M., Kasianowic^: J.J. Pasternak C.A. 1995. Low conductance states of a single ion channel are not "closed". J. Membr, Biol. 147: 233-239.

43. Kosower E.M.1984. Revised assignments for the beta-, gamma- and delta-subunits of the acetylcholine receptor structural model. FEBS Lett. 172(1): 1-5.

44. Krasilnikov O.V.and Sabirov R.Z. 1989. Ion transport through channels formed in lipid bilayers by Staphylococcus aureus a toxin induced ionic channels.Gen. Physiol. Biophys. 8:213-222.

45. Lane J. W., McBride Jr.D. W., Hamill O.P. 1991. Amiloride block of the mechanosensitive cation channel Xenopus oocytes.J. Physiol. 441: 347-366.

46. Lange K. 2002.Role of microvillar cell surfaces in the regulation of glucose uptake and organization of energy metabolism Am J. Physiol Cell Physiol.,282:1-26.

47. Lange K. and Gartzke J. 2001. Microvillar cell surface as a natural defense system against xenobiotics: a new interpretation of multidrug resistance. Am. J. Physiol Cell Physiol., 281: C369-C385.

48. Lev A. A. 1969. Electrochemical properties of "incompletely sealed'' cation sensitive microelectrodes. In: Glass microelectrodes. N.Y. 76-94.

49. Lev A.A., Korchev y.E. Rostovtseva T.K. Bashford C.L. Edmonds D.T. and Pasternak C.A. 1993.Rapid switching of ion current in narrow pores : implications for biological ion channels, Proc. R. Soc., p. 187-192.

50. Lu Z., Klem A.M. , Ramu Y.2001. Ion conduction pore is conserved among potassium channels. Nature. 413: 809-811.

51. Mannella C.A, Colombini M, Frank J. 1983. Structural and functional evidence for multiple channel complexes in the outer membrane of Neurospora crassa mitochondria. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 80: 2243-2247.

52. Mannella C.A, Colbmbini M, Frank J. 1998. conformational changes in the mitochondrial channel protein, •VDAC, and their functional implications.J. Struct. Biol. 121 (2):207-218.

53. Marmont, G. 1949. Studies on the axon membrane. A new method. J. Cell. Comp. Physiol.34;351-382.

54. Menestrina G. 1986. Ionic channels formed by Staphylococcus aureus alpha-toxin: voltage-dependent inhibition by divalent and trivalent cations.J. Membr. Biol. 90(2); 177-190.

55. Merrill A.R, Cramer W.A. 1990. Identification of a voltage-responsive segment of the potential-gated colicin El ion channel. Biochemistry. 29(37): 8529-8534.

56. Miller Ch. 2000. An overview of the potassium channel family, Genome Biology. 1(4) reviews 0004.1 0004.5.

57. Montal M., and Mueller P. 1972. Formation of bi-molecular membranes from lipid monolayers and study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 69, 3561-3566.

58. Oda Y. and Yawataya T.1956. On transport number for ion- exchange resin membranes.Bull. Chem. Soc. 1956. 29:673-679.

59. Paoletti P., Ascher P. 1994. Mechanosensitivity of NMDA receptors in cultured mouse central neurons. Neuron. 13: 645-655.

60. Pasternak C.A., Alder G.M., Apel P.Y. Bashford C.L. Lev A.A. Rostovtseva T.K., Zhitariuk N.I. 1995.Model pores for biological membranes: the properties of track-etched membranes. NIMB B 105: 332-334

61. Pasternak C.A., Bashford D.T, Korchev Y. E, Rostovtseva T.K and Lev. A.A. 1993. Modulation of surface flow by divalent cations and protons. Colloids and Surface A: physiochemical and Engineering Aspects. 77: 119124

62. Raymond L., Slatin S.L., Finkelstein A. 1985. Channels formed by colicin El in planar lipid bilayers are large and exhibit pH-dependention selectivity. J. Membr. Biol. 84(2): 173-181.

63. Rostovtseva T.K., Aguilella V.M., Vodyanoy I., Bezrukov S.M., Parsegian V.A 1998. Membrane Surface-Charge Titration Probed by Gramicidin A Channel Conductance . Biophys. J.75: 1783-1792.

64. Roux B. and R. MacKinnon. 1999. The cavity and pore helices in the KcsA K+ channel: Electrostatic stabilization of monovalent cations. Science. 285: 100-192.

65. Sansom M.S.1993. Structure and function of channel-forming peptaibols. Rev. Biophys. 26(4): 365-421, (a).

66. S-ansom M.S. 1993. Alamethicin and related peptai-bols-model ion channels. Eur. Biophys. J. 22(2): 105-124,(b).

67. Schwarz G, Stankowski S, Rizzo V. 1986. Thermodynamic analysis of incorporation and aggregation in a membrane: application to the pore-forming peptide alamethicin. Biochim. Biophys. -Acta. 861(1): 141-151.

68. Schein S.J., Colombini M., Finkelstein A. 1976. Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltagedependent anion-selective channel obtained from Paramecium mitochondria. J. Membr. Biol. 30(2); 99-120.

69. Shimizu S., Ide T., Yanagida T., Tsujimoto Y.2000. Electrophysiological study of a novel large pore formed by Bax and the voltage-dependent anion channel that is permeable to cytochrome c. J. Biol. Chem. 275(16): 1232112325.

70. Siwy Z. and Fulinski A. 2002. Fabrication of a Synthetic Nanopore Ion Pump.Physical review letters. 2002. 89 (19) -.198103.

71. Siwy Z.l,Gu Y., Spohr H.A., Baur D., Wolf-reber A., Spohr R., Apel P., and Korchev Y.E.2002. Rectification and voltage gating of ion currents in nanofabricated pore.Europhys. Lett., 60(3):349-355

72. Starushenko A., Negulyaev Yu., Vedernicova E.2000. Stretch-activated ion channels in human leukemia cells. Neurophysiology.32: 180-181.

73. Starushenko A., Vedernicova E.2000. Mechanosensi-tive cation channels in human leukemia eels: calcium permeation and blocking effect. J. Physiol. 541: 81-90.

74. Stimers J.R. and Byeerly L.1982. Slowing of Sodium Current Inactivation by Ruthenium Red in Snail Neurons J. of General Physiology. 80(4):485-497.

75. Vandorpe D. H., Morris C.E. 1992. Stretch-activation of the Aplysia S-channel. J. Membr. Biol. 127:205-214.

76. Veinberg I.O., Gotlib V.A., Apel P.Yu., and Lev A.A. 2005. The use of synthetic nanometer pores for modeling the conduction block of cation-selective channels of cell membranes by ruthenium red. Docl. Biochem. Bio-phys. 405(6) : 4 5 4-4 5 7 .

77. Wilmsen H.U., Pugsley A.P., Pattus F. 1990. Colicin N forms voltage- and pH-dependent channels in planar lipid bilayer membranes. Eur. Biophys. J.18 (3) : 149-158.

78. Woermann D. 2002. Nucl. Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 194(4): 458-462.

79. Zhou Y., Morais-Cabral J.H., Kaufman A., MacKinnon R. 2001. Chemistry of ion coordination and hydration revealed by а К channel-Fab complex at 2.0 A resolution. Nature. 414:43-48.

80. Апель П.Ю., Кузнецов В.И., Житарюк Н.И., Орело-вич O.JI.1985. Ядерные ультрафильтры. Коллоидный журнал. 47 (1):3-8.

81. Белоусов Ю.В., Моисеев B.C. Лепахин В.К.1993. .Клиническая фармакология и фармакотерапия. Москва. Изд-во "Универсум", с.366-373

82. Березкин В.В., Волков В.И., Киселева O.A., Митрофанова Н.В., Соболев В.Д. 2003. Заряд пор трековых мембран из полиэтилентерефталата. Коллоидный журнал. 65(1): 129-131.

83. Березкин В.В., Нечаев А.Н., Митрофанова Н.В.2003. Влияние адсорбции поливалентных металлов на электроповерхностные и ион-селективные свойства трековых нано-фильтров. Коллоидный журнал, 65 (3) -.311-315.

84. Березкин В.В., Нечаев А.Н., Фомичев C.B. Мчедли-швили Б.В., Житарюк Н.И.1991. Ядерные фильтры с ионосе-лективными свойствами. Коллоидный журнал, 53 (3): 339-342 .

85. Березкин В.В.и др, Киселева O.A., Нечаев А.Н., Соболев В.Д., Чураев Н.В. 1994. Электропроводность растворов KCl в порах ядерных фильтров и их электроповерхностные свойства. Коллоидный журнал. 56(3) : 319-325

86. Вейнберг И.О. 2004. Возможности использования лавсановых пленок для моделирования действия фармацевтических препаратов. 7 Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье". Санкт-Петербург, с.52 .

87. Вейнберг И.О., Готлиб В.А., Апель П.Ю./ Лев A.A. 2005. Моделирование блока проводимости катионизбирательных каналов клеточных мембран рутениевым красным на синтетических нанометровых порах. ДАН. 405(6): 822-825.

88. Вейнберг И.О., Лев А.А.2004. Выяснение механизма блокирующего действия амилорида на ионные каналы. 3 Съезд биофизиков России. Воронеж, 191-192 с.

89. Волькенштейн М.В. Биофизика. Изд-во "Наука",М. 1981,575 с.

90. Духин С.С. Дерягин Б.В. Электрофорез. М., "Наука", 1976, 322 с.

91. Ермакова Л.Е., Сидорова М.П., Безрукова М.Е.1998. Фильтрационные и электрокинетические характеристики трековых мембран. Коллоидный журнал.60(6):763-770

92. Каулин Ю. А., Щагина Л.В. 1999. Влияние электролитного состава водных растворов на потенциал-чувствительность ионных каналов, образованных сирингоми-цином Е в липидных бислоях. Цитология.41:610-614.

93. Корчев Ю. Е. Влияние липидного состава бимолекулярных мембран на свойства ионного грамицидинового канала. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Ленинград. 1989.

94. Лев' A.A., Вейнберг И.О. 2004.Моделирование действия амилорида с помощью исследования проводимости нано-метровых каналов синтетических трековых мембран. ДАН. 2004,399(3): 415-417.

95. Максимов А. В. Натрий-проводящие каналы клеток миелоидной лейкемии человека: биофизические характеристики и функциональная связь с микрофиламентами. Диссертация на соискание ученой степени кандидата билогических наук. Санкт-Петербург. 1998.

96. Можаева Г.Н., Наумов А.П. 1971. Влияние поверхностного заряда мембраны на проницаемость клетки для ионов калия. Укр. Биохим. Журнал. 2: 159-165.

97. Можаева Г.Н., Наумов А.П. 1972. Влияние поверхностного заряда мембраны на стационарную калиевую проводимость мембраны перехвата Ранвье. Биофизика. 17: 412-421.

98. Носырева Е.Д., Грищенко И.И., Негуляев Ю.А.1988. Влияние рутениевого красного на инактивацию натриевых каналов клеток нейробластомы. Нейрофизиология.20 (1):131 134 .

99. Ростовцева Т.К., Осипов В.В., Лев A.A. 1987. Зависимость проводимости грамицидиновых ' каналов от потенциала, задаваемого адсорбцией анионов 1- анилинонафталин-8-сульфоната на липидных мембранах. Биол. Мембраны. 4: 955-964.

100. Саббатовский К.Г.2003. Влияние адсорбции многозарядных катионов на селективность нанофильтрационной мембраны. Коллоидный журнал.65(2):263-2 69.

101. Сидорова М.П., Ермакова Л. Э., Савина И.А., Мчедлишвили Б. В. 1990. Электрокинетические свойства исходных и модифицированных ядерных фильтров в растворах NaCl. Коллоидный журнал. 52 (5):895-900.

102. Фридрихсберг. 1984. Курс коллоидной химии. Ленинград: Химия. 368 с.

103. Харкевич Д.А. Фармакология: Москва.: Медицина, 1993. 544 с.

104. Щагина Л.В., Каулин Ю.А., Фейгин A.M., Такемото Д., Бранд Д., Малев В.В. 1998. Зависимость свойств ионных каналов, образованных антибиотиком сирингомицином Е в ли-пидных бислоях от концентрации электролита в водной фазе. Биол. Мембраны. 15: 433-446.