Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы сверхбыстрого сокращения мышц плавательного пузыря рыбы-жабы Opsanus Tau

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы сверхбыстрого сокращения мышц плавательного пузыря рыбы-жабы Opsanus Tau"

На правахрукописи

КЛИМОВ

АНДРЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

МЕХАНИЗМЫ СВЕРХБЫСТРОГО СОКРАЩЕНИЯ МЫШЦ ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ РЫБЫ-ЖАБЫ Ормнш Таи.

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в лаборатории биофизики мышечного сокращения Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино и в Лаборатории Физиологии Мышечного Сокращения департамента Биологии Пенсильванского университета, Филадельфия, США

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

З.А. Подлубная

доктор медицинских наук, профессор А. К. Цатурян

Ведущая организация: Институт Биофизики Клетки РАН

Защита состоится " 7 " июля 2004 г. в 13 час 30 мин.

на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН 142290, г. Пущино Московской обл.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат диссертации разослан " 7 " июня 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема механизма сверхбыстрого сокращения мышц (СБСМ) позвоночных животных - сравнительно новый раздел современных мышечных исследований. Основными объектами, в которых могут наблюдаться высокочастотные сокращения, являются глазные мышцы и мышцы, предназначенные для генерации некоторых звуков. Несмотря на определенный прогресс в понимании механизмов этого явления [1], до сих пор не удалось объяснить способность некоторых сверхскоростных мышц, например, "погремушки" гремучей змеи (Crotalus atrox) сокращаться с частотой 90 Гц при 35°С. Изучение механизмов, обеспечивающих СБСМ, поможет лучше понять разнообразные процессы, лежащие в основе управления работой различных органов животных.

Значительной трудностью в изучении механизма сверхбыстрых сокращений являлось отсутствие удобной модели: соответствующие мышцы были либо слишком малы (глазные мышцы), либо принадлежали редким охраняемым животным (гремучей змее).

Благодаря исследованиям Ларри Рома в Пенсильванском Университете, была найдена удобная для исследований модель - мышцы плавательного пузыря рыбы-жабы (Opsanus tau), способные сокращаться и почти полностью расслабляться с частотой около 200 Гц при 25°С или около 100 Гц при 15°С. Эти мышцы можно легко выделить из доступного объекта с большим объемом мышечной массы для экспериментов на интактных волокнах и тонких пучках волокон с перфорированной мембраной. Через ее поры можно обеспечить легкий проход достаточно крупных молекул (ферментов, красителей, солей) из окружающего раствора внутрь волокна и выход продуктов реакций из волокон в наружный раствор.

Особенности морфологии, а именно то, что в мышце плавательного пузыря рыбы-жабы более 30% объема занято пузырьками саркоплазматического ретикулума (СПР), мембраны которых пронизаны тесно упакованными каналами кальциевых насосов ,

открывают уникальную возможность проводить исследования работы на интактном СПР без его выделения из мышцы и сопутствующего выделению повреждения СПР.

Автор был приглашен в лабораторию д-ра Л. С. Рома в Пенсильванском университете для усовершенствования имеющегося оборудования, разработки новых методов исследования и проведения экспериментов.

Цель исследования. Провести in vivo и in vitro изучение особенностей структурно-фунуциональных и энергетических параметров

мышцы плавательного

сверхбыстрого сокращения этой мышцы. Задачи исследования:

1. На основе имеющегося в лаборатории Л. С. Рома оборудования разработать и сконструировать новые установки для достижения поставленной цели;

2. Разработать методические подходы для выделения, крепления волокон и для проведения разнообразных измерений в кювете с минимальными объемами волокон и растворов. Разработать методы длительного перемешивания вязких (с большой концентрацией ферментов) растворов в кюветах с объемом 5 и 12,8 цл при сохранении объема растворов неизменным в течение экспериментов длительностью до 20-30 минут;

3. Методом флуоресцентной микроскопии по изменению концентрации НАДН раздельно измерить скорости работы АТФаз актомиозиновых мостиков и НСПР-Са++;

4. Разработать метод и аппаратуру для флуоресцентной микроскопии с использованием FURA-2 в качестве Са-буфера и Са-индикатора, и провести изучение скорости перекачки кальция насосами СПР;

5. Провести измерения скоростных параметров мышечного сокращения при стимуляции электрическим током;

6. Разработать программу компьютеризованного управления всеми используемыми в эксперименте устройствами с регистрацией получаемых результатов, позволяющую их дальнейшую обработку с использованием стандартных программ.

Научная новизна. Разработан новый методический подход для in vitro измерения скорости гидролиза АТФ одиночными тонкими мышечными волокнами, в которых расстояние диффузии молекул из центра до поверхности (и обратно) так мало (20-40 ), что обмен молекул происходит за время менее 1 сек. Измерена скорость АТФазы волокна (т. е. сумма АТФаз миозиновых мостиков и АТФазы НСПР-Са++). Подобраны токсические препараты (TBQ - 20 цМ, CPA - 20 цМ), которые избирательно отключают , позволяя измерить

неизмененную АТФазу миозиновых мостиков. Поставлена серия опытов с различными комбинациями измерения АТФазы «отравленных» и «неотравленных» волокон мышц плавательного пузыря при рСа=4,4 (максимальная активация сокращения) и рСа=5,75 (волокно не развивает силу, и миозиновые мостики не циклируют), что позволило определить доли энергии, потребляемые миозиновами мостиками (63%) и НСПР-Са++ (37%) во время изометрического сокращения. Оказалось, что эти доли примерно такие же, как и в других мышцах позвоночных животных, сокращающихся намного медленнее.

Разработан, метод и создана аппаратура для прямых измерений

потоков кальция из окружающего мышцу раствора внутрь интактных пузырьков саркоплазматического ретикулума и обратно без их выделения из волокон. Измерена скорость поглощения кальция в СПР и вычислена скорость работы одиночного канала насоса СПР. Оценена емкость поглощения кальция в СПР (до 30 мМ/литр объема СПР).

Произведен расчет констант скоростей замыкания и размыкания для мышц разных типов. Показано, что в мышце плавательного пузыря константа скорости замыкания акто-миозиновых мостиков не отличается от мышц других типов, сокращающихся намного медленнее, а константа скорости размыкания на порядок выше.

Предложен механизм сверхбыстрого сокращения мышц.

Научная и практическая ценность. Полученные результаты расширяют представления о роли саркоплазматического ретикулума и парвальбумина в процессе регуляции скорости сокращения и расслабления. Кроме того, разработанные устройства, программы и методы могут быть использованы в разнообразных биофизических исследованиях и являются основой для создания новых устройств, позволяющих проводить эксперименты при минимальных объемах изучаемых объектов и используемых растворов. Переход к работе с минимальными объемами объектов исследования позволит ускорить обменные процессы между внутренними частями объекта и окружающим раствором, а уменьшение объема растворов, окружающих объект, позволит увеличить концентрацию продуктов реакции в растворе и повысить чувствительность методов измерения продуктов реакции в кювете. Это удешевляет эксперименты и улучшает быстродействие методов измерения.

Апробация работы. Материалы и основные положения работы были доложены и обсуждены на Ежегодном Митинге Биофизического Сообщества 13-17 Февраля, 1999, в Балтиморе, США, МБ; Биофизическом Митинге, в Вудс Холе, МА, США, 1999; международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 2004); заседании секции Ученого совета ИТЭБ РАН "Биологическая подвижность" от 18 мая 2004.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 100 стр., содержит 20 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 110 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследования: Мышцы плавательного пузыря, а также белые и красные мышцы рыбы-жабы [toadfish (англ.), Opsanus tau, (лат.)] (около 100 рыб, более 300 мышечных препаратов)

Растворы: 1) «Рннгера для рыб» (мМ): NaCl 132; KCl 2,6; Имидазол 10; СаС12 2,7; MgCl2 1,0; Na-пирувзт 10, pH 7,7 при 15°С. 2)

Таблица 1. Растворы для выделения волокон и измерения скорости гидролиза АТФ. рН 7,1 при 15°С подводится с использованием только КОН_

Вещество Деполяризу ющий мМ Релаксиру-ющий мМ Предактиви-руюший мМ Активирующий мМ

ТЭС 58,2 58,2 69,3 69,3

mgch 7,8 7,8 6,4 6,4

КН2Р04 1 1 1 1

Na2ATP 6,17 6,17 6,17 6,17

КзЭГТА 50 50 0,21 0,21

К2НДТА 0 0 49,79 0

Са2ЭГТА 0 0 0 49,79

Na-эзид 0 1,0 1,0 1,0

а2р5 0 0,22 0,22 0,22

Фосфоэнол пируват 0 4,85 4,85 4,85

Leupeptin 0 0,056 0,056 0,056

Олигомицин В 0 0,01 0,01 0,01

L-LDH 0 200 Ед/мл 200 Ед/мл 200 Ед/мл

Пируват киназа 0 1000 Ед/мл 1000 Ед/мл 1000 Ед/мл

НАДН 0 0,5-0,75 0,5-0,75 0,5-0,75

CPA 0 20 цМ 20 цМ 20 цМ

TBQ 0 20 рМ 20 цМ 20 цМ

Na2АТФ 0 6,17 6,17 6,17

Таблица 2. Растворы для измерения скорости кальциевых токов.

Вещество Основ- Загрузоч- Кофеино- Тритоно- Релаксиру-

ной мМ ный мМ вый мМ вый мМ ющий мМ

ТЭС 70 70 70 70 70

MgCh 8,4 8,4 8,4 8,4 8,4

Креатин фосфат 10 10 10 10 10

Na2ATP 8 8 8 8 8

K2FURA-2 0,05 0,009 0,05 0,05 0,05

К2НДТА 50 50 50 50 50

Ca2FURA-2 0 0,041 0 0 0

Креатин 30 30 30 Ед/мл 30 Ед/мл 30 Ед/мл

фосфокиназа Ед/мл Ед/мл

К2ЭГТА 0 0 1 0 1

Кофеин 0 0 40 0 0

Тритон XI00 0 0 0 3% объема 0

рН 7,1 при 15°С подводится с использованием только КОН

2) «Скинирующий с сапонином» = «деполяризующий раствор» + Saponin (50 цг/мл).

3) «Скинирующий с Тритоном» = «деполяризующий раствор» +

Тритон Х-100 (3% объема раствора).

Для выделения волокон использовали чашки Петри с полимеризованным на дне слоем прозрачного упругого Sylgard, в который можно втыкать иглы для закрепления частей мышц.

Выделенные в растворе Рингера интактные мышечные пучки диаметром 0,5 мм с сухожилиями на концах переносили в деполяризующий раствор на 5-10 минут. После удаления Са из межклеточного пространства можно было выделять пучки, состоящие из 1-3 волокон и отрезать их концы, не опасаясь необратимых контрактур. Кусочки мышечных пучков длиной 7-10 мм помещали на 15 минут в «скинирующий раствор с сапонином», если требовалось проделать поры во внешней мембране волокон и сохранить интактными мембраны СПР. Концы пучков прикалывали к Sylgard иголками длиной 5-8 мм и диаметром 0,2-0,4 мм. Для некоторых экспериментов волокна помещали в «скинирующий раствор с тритоном», перфорировавшим все мембраны. После скинирования пучки снова переносили в деполяризующий раствор, где концы волокон закрепляли в нижнюю часть клипс, сделанных из алюминиевой фольги размером 1,5*1,5*0,1 (мм) в форме "сапожка", у которого низ в сечении похож на перевернутую букву «П». Конец волокна прижимали боковыми стенками низа "сапожка"

Съемную часть установки, содержавшую кювету с рабочим объемом 5 или 12,8 датчик силы и сервомотор, закрепленные на трехмерных микроскопических приводах, переносили с микроскопа Leica-DM-IRB на столик, где все работы с волокнами проводились под бинокулярной лупой. Волокно вместе с клипсами переносили из чашки Петри в деполяризующий раствор, залитый в широкую часть кюветы для экспериментов, где "голенище сапожка" (сквозную трубочку клипсы) надевали на вертикально расположенные загнутые концы титановых проволочек, соединявших волокно с датчиком силы и с сервомотором. Пинцетом обжимали "голенище" на крючках так, чтобы избежать свободных движений клипс во время экспериментов и вдвигали крючки с волокном в узкую часть кюветы. Съемную часть возвращали на микроскоп и подсоединяли к ней систему водяного охлаждения кюветы, систему перемешивания раствора в щели кюветы с помощью потока воздуха с регулируемой влажностью и температурой, направленного над поверхностью раствора, систему автоматической подачи раствора с одной стороны щели кюветы и отсоса избытка раствора с другой стороны щели. Датчик силы и сервомотор присоединяли к электронным блокам,

выходное напряжение от которых подавалось на входы аналого-цифровых преобразователей платы, встроенной в компьютер, что позволяло записать в цифровом виде измеренную силу и смещение рычага сервомотора, (измеренное с помощью встроенного в сервомотор емкостного датчика). Компьютер, согласно заданной программе, вырабатывал аналоговое напряжение, подававшееся на вход электронного блока сервомотора и управлявшее смещением рычага с временным разрешением менее 0,5 мсек и стабильностью положения конца рычага 1-3 ЦМ. Камера состояла из анодированного алюминиевого блока со щелью, вмещающей 5 или 12,8 цл раствора. Прорези, проделанные по концам щели, позволяют ввести через них внутрь щели крючки преобразователя силы и системы микроподачи, позволяющие менять длину волокна, подсоединенного к крючкам с помощью легких алюминиевых клипсов.

Чтобы избежать запотевания дна кюветы, когда температура в ней (15°С) была много ниже комнатной, снизу встроена трубочка, подававшая под стекло осушенный с помощью Dririte воздух. Через трубки воздушного миксера к поверхности раствора в щели кюветы подавали воздух с регулируемой скоростью, влажностью и температурой, чем обеспечивалось длительное перемешивание раствора во всем объеме щели без изменения объема раствора. Растворы подаются через стальную трубочку, встроенную близко к одному концу щели, проходят через

щель, и избыток раствора отсасывается вакуумным насосом через трубочку, закрепленную над другим концом щели. Перед подачей в кювету растворы содержатся в термостатированном корпусе шприца и выталкиваются в кювету под давлением через контролируемые компьютером краны.

Волокно можно наблюдать через окуляры, с помощью видеокамеры выводить его изображение на экран монитора и в оцифрованном виде записывать в файл компьютера. С помощью специально написанной программы можно быстро измерять длину и диаметр волокон, а также длину саркомеров, применяя Фурье-преобразование к изображению поперечно-полосатой мышцы, записанному в файл компьютера. Нижнее освещение в микроскопе производили или от ксеноновой лампы 75 Вт для экспериментов с использованием НАДН, или от галогенной лампы накаливания 100 Вт в экспериментах с использованием FURA-2, FURA-4, FURA-6. Флуоресценцию раствора в кювете вне волокна возбуждали через объектив 40х, и с его же помощью собирали флуоресцентный свет для регистрации.

В микроскопе во вращающейся платформе были встроены различные светоделительные кубики с наборами светофильтров, позволявшими послать на объект свет с длиной волны 330-350 нм (для возбуждения НАДН) или с длиной волны 400-420 нм (для экспериментов с использованием FURA-2, FURA-4, FURA-6). Другие светофильтры в этих кубиках пропускали только свет флуоресценции на светодиод. Фототок от светодиода поступал на вход усилителя, и напряжение после усилителя подавалось на вход цифрового осциллографа Nicolet и вход аналого-цифрового преобразователя в компьютере. Там с помощью написанных автором программ, получаемые результаты (сила, развиваемая волокнами, интенсивность флуоресценции растворов, номер подаваемого в кювету раствора и время его подачи, положение рычага серводвигателя) воспроизводились на экране и записывались в файлы для дальнейшей обработки в программах Excel или QuadroPro.

После эксперимента съемную часть установки опять переносили на стол под бинокулярную лупу, снимали волокно с крючков вместе с клипсами и переносили в каплю деполяризующего раствора, налитого в перевернутую крышечку от пузырька, в которой заранее была полимеризована капля Sylgard. Клипсы волокна закрепляли двумя микроиголками на высоте 2-3 мм над уровнем Sylgard, волокно выпрямляли, отгибая иголки, и раствор удаляли из крышки и с поверхности волокна фильтровальной бумагой. В пузырек помещали несколько гранул Sylgard и закрывали его крышкой с закрепленным волокном. Через час сухое волокно доставали из крышки и переносили

для взвешивания на весы Cahn C35, имеющие цифровой выход, подсоединяемый через серийный порт к компьютеру. Взвешивание повторяли 3 раза, каждый раз усредняя около 200 показаний с помощью написанной автором программы, чем понижали до 0,1 цг присущую весам ошибку одиночного измерения 1,5 цг, что было необходимо, так как собственный вес сухих волокон составлял 1,5-4 цг.

Измерение скорости гидролиза АТФ. Скинированные волокна мышцы помещались в растворы с различными концентрациями , и затем методом регенерации АТФ с помощью реакций гликолиз-подобного каскада, в котором используется преимущество флуоресцентного субстрата НАДН, измерялась скорость использования АТФ. В этом методе каждая произведенная АТФазой молекула АДФ повторно фосфорилировалась с помощью переноса фосфата с фосфоэнолпирувата (PEP), катализируемого пировинограднокислой киназой (РК). Образовавшаяся пировиноградная кислота переходит в лактат в реакции, катализируемой дегидразой молочной кислоты (LDH), соединенной с окислением НАДН (флуоресцентного), превращающим его в (не флуоресцентный). В таком случае при работе АТФазы

сохраняются неизменными высокая концентрация АТФ и очень низкая концентрация АДФ, а расходуются фосфоэнолпируват (PEP) и НАДН:

пируват + НАДН (флуоресцентный)«-»•лактат + НАД* (2)

НАД+ слабо поглощает свет в области выше 300 нм, а НАДН имеет сильную полосу поглощения при 338 нм с коэффициентом экстинкции 6220 см2/ммоль.

Из-за взаимнооднозначного стехиометрического соотношения между производством АТФ из АДФ и окислением НАДН использование АТФ мышцей (производство АДФ) было измерено по уменьшению флуоресценции НАДН в растворе, окружающем волокна мышцы. Система была калибрована по измерению флуоресценции как функции концентрации [НАДН] и прямым впрыскиванием известных количеств АДФ [как в Stienen и другие 1995].

В ходе эксперимента, в различные моменты НСПР-Са++ были «отравлены» комбинацией растворов 20 цМ TBQ и 20 цМ СРА. Экспериментально было доказано, что после «отравления» волокон почти вся измеряемая АТФаза связана с циклированием исключительно актомиозиновых мостиков. По разности скоростей работы АТФаз в неотравленном и отравленном волокнах мы вычисляли скорость работы АТФаз НСПР-Са^.

Измерение скорости кальциевых токов СПР одиночного мышечного волокна. Скинированные сапонином мышечные волокна переносили в деполяризующий раствор в кювете. Затем деполяризующий раствор несколько раз заменяли на "основной" раствор, в котором не было ЭГТА, но присутствовала FURA-2 (как кальциевый буфер и как кальций - чувствительный индикатор). Используя серию растворов с FURA-2 и разными концентрациями [Са"], мы измеряли количество кальция, связанного с Р11РА-2 в растворе, окружающем волокно, по изменению флуоресценции FURA-2 при возбуждении светом с X ~ 400420 нм. Фиолетовый свет от галогенной лампы фокусируется с помощью объектива 40х внутри раствора (а не волокна) в кювете с образцом, что приводит к флуоресценции свободной от кальция Р11РА-2. Излучаемый флуоресцентный свет с Л. ~ 430-480 собирается тем же объективом и идет навстречу возбуждающему свету до дихроичного зеркала, которое пропускает флуоресцентный свет далее к отражателю, светофильтру и твердотельному фотодетектору. Используя FURA-2 как основной Са++ буфер (в дополнение к ее использованию как Са++ индикатор), мы достигаем максимальных абсолютных изменений флуоресценции в ответ на заданное изменение, концентрации Са4*. Исключив использование дополнительных буферов (например, ЭГТА) при низких. [Са++], мы достигли почти стехиометрического изменения флуоресценции в. одну молекулу FURA-2 на каждый перемещенный в СПР и обратно ион кальция. Согласно калибровочным кривым флуоресценция

пропорциональна концентрации свободной FURA-2.

Измерение скоростных характеристик мышц - рыбы-жабы. Стимуляцию интактных мышечных волокон осуществляли с помощью широких платиновых электродов, расположенных параллельно волокну. Жесткость активных волокон была измерена в полностью активированных скинированных мышечных волокнах, приложением серии малых шагов удлинения и расслабления волокна (2-4 нанометра/половину саркомера) с помощью сервомотора при одновременной регистрации длины саркомеров и силы. Жесткость была принята как наклон графика зависимости изменения силы от изменения длины саркомеров. Мы сравнивали долю присоединенных миозиновых мостиков в течение активного сокращения с долей мостиков, присоединенных в ригоре, и вычисляли эту долю, предполагая, что: (а) каждая головка миозина вносит одинаковую часть в активном сокращении и в ригоре; (б) миозиновые мостики отвечают за 50% податливости в ригорном волокне, а за остальные 50% отвечают миозиновые и актиновые нити [ЩдоЫ и др.(1995) Biophys. J.69].

Чтобы проверить возможность развития низкой силы за счет низкой активации, мы активировали скицированные мышечные волокна растворами с высокой и стабильной концентрацией Са** (чем избежали нормального, неконтролируемого нами освобождения и откачивания в живых волокнах). При условии максимальной активации мы нашли, что устойчивая сила на единицу площади поперечного сечения миофибрилл все еще очень низкая, 56 кН/м2 или 0,25 относительно таковой для других типов волокон (Табл. 3). Сила не увеличивается существенно по

Тип мышцы Модуль Юнга в ригоре МН/м2 Жесткость активного/ жесткость роторного Доля присоединенных миозиновых мостиков, % Сила на мио-фибриллярное поперечное сечение,кН/м2 Сила на присоединенный миозиновый мостик, пН

Красная 34,8 (±2,8) 0,82 (±0,05) 70 214(±20) 3,04

Белая 25,6 (±3,9) 0,76 (±0,03) 61 228(±19) 3,71

Плавательный пузырь 42,4 (±4,5) 0,19 (±0,02) 10,5 56(±9) 6,41

Таблица 3. Модуль Юнга (прирост силы/прирост длины) в ригоре и отношение жесткостей активной и ригорной мышцы. Отношение количества присоединенных мостиков при активном сокращении и в ригоре вычисляли как описано в [Rome, Klimov и др., (1999), PNAS 96]. Сила, рассчитанная для одиночного присоединенного мостика, равна отношению силы, вычисленной на поперечное сечение миофибрилл, к числу присоединенных мостиков на половину саркомера. Замечу, что если не все миозиновые головки участвуют в развитии жесткости в ригоре, то число присоединенных мостиков должно быть уменьшено, а сила на присоединенный мостик должна быть увеличена. Все величины являются средними для 5-8 измерений и среднеквадратичная ошибка показана в скобках. Все эксперименты проведены при 150С.

По нашему мнению низкая сила при максимальной активации может объясняться либо малым числом замкнутых миозиновых мостиков, либо низкой силой, развиваемой каждым мостиком [Huxley, A. F. (1957)]. Чтобы оценить долю присоединенных мостиков, мы сравнили жесткость (изменение силы в ответ на быстрое изменение длины) в активном мышечном волокне и в мышечном волокне в ригоре [Higuchi, Н. & Goldman, Y. Е. (1991) Nature (London),352], где все миозиновые мостики считаются присоединенными [Cooke, R. & Franks, К. (1980) Biochemistry 19; Thomas, D. D. & Cooke, R. (1980) Biophys. J.,3233-35]. Быстрое удлинение красных и белых волокон в активном сокращении производило немного меньшее изменение силы, чем в ригоре. Следовательно, при активном сокращении значительная часть миозиновых мостиков является присоединенной (Табл. 1). Совершенно отличный результат был получен для мышц плавательного пузыря - даже при вдвое большем удлинении в активном сокращении, изменение силы было много меньшим, чем в ригоре.

Часть II. Результаты измерения скорости гидролиза АТФ

«Скицированный тритоном XI00» пучок из 3 волокон мышц плавательного пузыря переводили из релаксирующего раствора в предактивирующий (Рис. 3) для удаления ЭГТА из волокна. Слабый Са-связывающий лиганд НДТА в предактивирующем растворе не влиял на рСа внутри волокон, задаваемый последующими растворами. Существенной работы АТФаз в этих растворах не наблюдалось (флуоресценция НАДН стабильна во времени). В растворе с рСа=5,75 флуоресценция НАДН снижается со временем из-за гидролиза АТФ в НСПР-Са**, на графике скорость работы АТФаз НСПР-Са** представлена как АТФазарс«-5,75' При рСа=4,4 измеряется максимальная скорость АТФазап0л„,я> равная сумме АТФаз циклирующих актомиозиновых мостиков и АТФаз НСПР-Са+*. После «отравления» НСПР-Са с

гидролизом АТФ актомиозиновыми мостиками. Разность АТФазап<

АТФаза

отравленная

= АТФазе НСПР-Са и почти равна АТФазерс.^/и.

В других опытах мы «отравляли» мышцу с помощью 20 цМ ТВС> и 20 ^М СРА при рСа=5,75, и тогда скорость АТФаз за 30 секунд снижалась до 0, из чего следует, что примененные яды действительно полностью выключают АТФазы НСПР-Са4"* и что при рСа=5,75 нет циклирования актомиозиновых мостиков.

4400

Время, сек

Рис.4. «Сканированный сапонином» пучок из 2-3 волокон мышц плавательного пузыря помещали в "кофеиновый" раствор, чтобы освободить СПР от кальция. Препарат после этого отмывали в "релаксирующем" растворе с ЭГТА, далее отмывали ЭГТА в "основном" растворе и заменяли его на "загрузочный", содержащий 82% СаР1ЖА-2 и 18% ГСША-2. Так как СаР1тА-2 очень слабо флуоресцирует (X. ~ 430-480 нм) при возбуждении светом с X ~ 400-420 нм, то флуоресценция обеспечивается, в основном, свободной РИКА-2.

СПР мышечного волокна поглощает кальций из окружающего волокно раствора и, по мере увеличения концентрации свободной FURA-2, растет измеряемая нами флуоресценция в окружающем растворе. На вставке в увеличенном масштабе видно, что периодически происходит падение флуоресценции с последующим возобновлением роста. Чтобы проверить причастность рианодиновых рецепторов в СПР к Са-стимулируемому выбросу Са из ретикулума наружу, волокно помещалось в "загрузочный раствор с красителем Рутениевым красным", который может инактивировать рианодиновые рецепторы в СПР. В таком растворе рост флуоресценции монотонный, из чего следует, что неравномерный рост флуоресценции в первом "загрузочном" растворе мог быть связан с Са-стимулируемым выбросом Са из ретикулума.

Увеличение флуоресценции означает рост концентрации несвязанной FURA-2 в растворе. То есть, Са4"1", закачиваемый в СПР, удаляется из раствора, омывающего волокно. Наклон кривой соответствующего графика представляет скорость поглощения Са++ в СПР мышечного волокна. В максимуме она достигала около 0,8 пикомолей/секунду в объеме раствора 5 цл или 0,8 ммоль/сек в пересчете на литр мышечного объема или 2,6 ммоль/сек в пересчете на литр объема СПР

При помещении волокон в "тритоновый" раствор мембраны СПР очень быстро становятся проницаемыми для кальция, и Са++ выходит в окружающий раствор [Fryer M.W, Stephenson D.G.I996], где может быть измерен по падению флуоресценции FURA-2 (для такого эксперимента концентрация FURA-2 выбиралась много больше, чем 50 цМ). Нами показано, что потенциально может накапливаться до 30 ммоль кальция на литр объема волокон, или до 100 ммоль кальция на литр объема СПР в присутствии оксалата. Без оксалата и без рутениевого красного эти уровни не достигаются из-за индуцированного кальцием выброса кальция.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на экстраординарную скорость одиночного сокращения мышцы плавательного пузыря, стационарная скорость использования АТФ в скицированных волокнах не слишком высока. При 15°С мышца плавательного пузыря использует АТФ с несколько меньшей скоростью (1,22 ммоль/сек/(литр мышцы)), чем быстро сокращающиеся мышцы земноводных - например, 1,6 ммоль/сек/(литр мышцы), измеренной для скицированных волокон Xenopus laevis [Stienen и другие 1995], или 2 ммоль/сек/(литр мышцы), измеренной для интактных мышечных волокон Rana pipiens [DeFuria & Kushmerick, 1977; Rome & Kushmerick, 1983].

Скорость расщепления АТФ в миозиновом мостике (11,2 сек-1) в плавательном пузыре - вдвое выше, чем в мышцах Xenopus (6 сек-1);

Vmax была также вдвое выше: 12 против 5,5 (длин мышцы)сек [Lannergren & Hoh, 1984]. В целом миозиновые мостики плавательного пузыря имели несколько меньшую полную скорость АТФазы по сравнению с мышцей в Xenopus. В мышце плавательного пузыря с увеличенным объемом СПР, только 50% объема занято миофибриллами [Appelt и другие, 1991], из чего следует более низкая, чем в других мышцах, концентрация миозиновых мостиков (69 рМ) [Rome и другие, 1999а]. Поэтому, при заданной оборачиваемости АТФ в каждом миозиновом мостике работающая мышца использует меньше АТФ. По сравнению с быстро сокращающимися волокнами белых мышц того же объекта волокна плавательного пузыря имеют подобную константу скорости прикрепления миозинового мостика (f), но они имеют в 10 раз большую константу скорости его размыкания (g) [Rome и другие, 1999]. Именно высокое значение g обеспечивает мостикам очень быстрое открепление и высокую скорость релаксации мышцы, необходимую для высокочастотных сокращений-расслаблений

Измеренная нами скорость АТФазы, связанной с (0,45

ммоль/сек/(литр мышцы)) умеренно велика, (то есть, в пределах того, что наблюдается для других мышц), несмотря на то, что мышца плавательного пузыря имеет самый быстрый когда-либо измеренный процесс выброса-откачки Са1"1", [Rome и другие, 1996]. Предположив, что 2 иона Са4"1' переносятся при расщеплении одной молекулы АТФ, получим, что скорость нагнетания эквивалентна 0,9

ммоль/сек/(литр мышцы). Почти такую же величину - 0,8 ммоль/сек в пересчете на литр мышечного объема - мы получили в эксперименте, описанном в Ч. III, в котором поглощение кальция в СПР измерялось прямым методом по его откачке из раствора, окружающего волокно, и уходу из комплекса CaFURA-2.

Удивительно, что скорость нагнетания Са++, измеренная нами в скицированном волокне, намного ниже предполагаемо необходимой для непрерывного сокращения мышцы плавательного пузыря на высоких частотах "гудка" (80-100 Герц при 15°С). Если принять, что количество , выпущенного в течение каждого сокращения равно количеству, необходимому, для насыщения тропонина С (ТпС, 70 цМ.; ТпС концентрация взята так, чтобы быть равной концентрации цепей миозина [Yates & Greaser, 1983a,b]), то непрерывный призыв самца требовал бы стационарной скорости откачки Са'" около 5,6-7 ммоль/сек/(литр мышцы), (то есть, в 6 - 8 раз выше, чем скорость откачки , измеренная нами). Однако, рыбы-жабы не «гудят» непрерывно, они издают довольно короткие звуки (0,4 сек) с последующими относительно длинными паузами (6-60 секунд) [Fine, 1978].

Высокая концентрация -связывающих мест на парвальбумине (3

мМ) и НСПР-Са++ (0,76 мМ) [Appelt и другие, 1991; Feher и другие, 1998] кажется достаточной для связывания Са++, освобожденного в течение "гудка" (2,5 ммоль/(литр мышцы)). Мы показали, что СПР плавательного пузыря способен связать 30 ммоль Са** в литре мышцы. Это в 12 раз больше освобождаемого из ретикулума во время "гудка", и, следовательно, ретикулум не должен опустошаться.

ВЫВОДЫ

1. Разработан единый методический подход и создана установка со сменными блоками для высокоточного измерения in vitro комплекса основных параметров мышечного сокращения на интактных и скинированных волокнах: силы и скорости сокращения и расслабления мышц; скорости использования АТФ актомиозиновыми мостиками; скорости использования АТФ кальциевыми насосами саркоплазматического ретикулума (НСПР-Са++, СПР); скорости выброса кальция из СПР и обратной закачки кальция в СПР; жесткости волокна при активном сокращении и в ригоре; длины саркомеров; длины и двух диаметров волокна; веса волокна.

2. Впервые показано, что сверхбыстрые мышцы плавательного пузыря не отличаются кардинально ни по скорости использования АТФ, ни по распределению расхода АТФ между актомиозиновыми мостиками и НСПР-Са++ от мышц других типов.

3. Впервые проведены прямые измерения выброса кальция из СПР мышечных волокон (без выделения СПР из мышц) и его обратной закачке в СПР.

4. Показано, что сверхбыстрые мышцы достигают огромной скорости одиночного сокращения при сравнительно невысокой стационарной скорости гидролиза АТФ за счет:

а) наличия в них малого числа присоединенных актомиозиновых мостиков;

б) на порядок более высокой, чем в других мышцах, скорости размыкания мостиков при одинаковой скорости замыкания мостиков;

в) наличия высокой концентрации внутриклеточного Са** буфера (парвальбумина), быстро отбирающего у тропонина, что инактивирует актин и инициирует процесс расслабления всего лишь через несколько миллисекунд после активации сокращения;

г) аномально высокого содержания НСПР-Са""" в сверхбыстрых мышцах, позволяющего полностью удалить из центров связывания в парвальбумине и тропонине во время паузы между звуковыми сигналами;

д) сдвига порога активации сокращения от 100-300 нМ Са++ в "обычных" мышцах до 3000 нМ в сверхбыстрых мышцах плавательного

пузыря.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты открывают перспективы для применения новой модели для биологических исследований, а именно - модели интактного саркоплазматического ретикулума мышц плавательного пузыря рыбы-жабы, пригодной для исследований без выделения из мышц и сопутствующего выделению повреждения.

Методы работы с микрообъемами объектов и растворов могут быть использованы в разнообразных исследованиях.

Исследование по теме диссертационной работы были поддержаны грантами Национального Научного Фонда и Национального Института. Здоровья, США: NSFIBN-9514383, NIH AR38404 and NIH AR46125

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Rome L.C., Chris С, Syme D.A., Connaughton M. A., Ashley-Rose М, Klimov A.A., Tikunov В. A., Goldman Y. E. Trading force for speed: Why superfast crossbridge kinetics leads to superlow forces // Proc. Nat.-Acad. Sci. USA, May 1999, v.96, p. 5826-583l,Physiology

2. Rome L.C., Klimov A. A., & Young I. S. A new Approach for Measuring Real-Time Calcium Pumping and SR Function in Muscle Fibers // Biol. Bull, October 1999, v. 197, p.227-228 Featured Article

3. Rome L.C., Klimov A.A. Superfast contraction without superfast energetics: ATP usage by SR-Ca** pumps and crossbridges in Toadfish swimbladder. muscle // The Journal ofPhysiology, 2000, v.526.2, p. 279-286

4. Rome L.C., Klimov A. A. Superfast contraction // Materials of the BIOPHYSICAL SOCIETY ANNUAL MEETING, February 13-17, 1999, Baltimore, USA

5. Rome L.C., Klimov A. A., Young I.S. Measuring real-time calcium pumping and SR function in muscle fibers // International symposium "Biological motility", 2004, Pushchino, p.58-60

6. Rome L.C., Klimov A. A. ATP usage by SR-Ca2+ pumps and crossbridges in toadfish swimbladder muscle // International symposium "Biological motility",2004, Pushchino, p.266-269

Основные сокращения:

FURA-2 - по каталогу из "Molecular Probes" F-1201.

2 ° F-1201 ÎJ «

{H3CC0CH20CCK,)oN tJ(CK2COCK2OCCHj)2

{H3CC0CH20CCK,)ON

0-CH2CH2-0

V

C-0CH,0-C-CH3 ■■ fc 11 J

о

о

АТФ - аденозин 5 '-трифосфат; АДФ - аденозин 5'-дифосфат;

ТЭС, TES -N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid Фн=НР042" , неорганический фосфат; АТФаза - аденозинтрифосфатаза:

ЭГТА-этиленгликоль-бис( р-аминоэтиловый эфир)-тетрауксусная кислота:

НДТА-гексаметилен-диамин-тетрауксусная кислота;

СПР-саркоплазматический ретикулум;

(НСПР-Са^) -Са - насосы СПР;

TBQ - 2,5-di - (tert-butyl) -1,4-benzohydroquinone;

СРА - Cyclopiazonic acid;

A2P5=P1,P5-di(adenosine-5 l)pentaphosphate;

PEP -фосфоенолттировиноградная кислота С(СООН)(СН2)(Н2РО4);

PK - pyravate kinase, пировинограднокислая киназа. пируват киназа;

LDH - lactic dehydrogenase, дегидрогеназа молочной кислоты;

НАД1', НАД+- никотинамид-R, окисленная форма; где R - аденин-динуклеотид;

НАДН, НДДН - никотинамид-R, восстановленная форма;

рСа = -lgfCa**], где [Са'"] -концентрация свободных ионов кальция (М/л);

i Г

R НАД+^ЬНАДН R

№13906

Принято к исполнению 04/06/2004 Заказ № 251

Исполнено 07/06/2004 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Климов, Андрей Алексеевич

Список использованных сокращений ц ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Конструкция локомоторных мышц и мышц плавательного пузыря рыбы-жабы

2. Механические параметры мышц различных типов

3. Представления о регуляции скорости мышечного сокращения

4. Методы исследований 16 ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ 17 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 18 ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 18 II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ

1.1. Растворы 19 1.1.1. Раствор Рингера для рыб

1.1.2. Деполяризующий раствор

1.1.3. Скинирующие растворы для перфорирования мембран волокон

1.1.4. Релаксирующий раствор для дезактивации волокон в экспериментах по измерению скорости работы АТФазы

1.1.5. Предактивирующий раствор для замены ЭГТА на НДТА в волокнах в экспериментах по измерению скорости работы АТФазы

1.1.6. Активирующие растворы с заданными концентрациями [Са*4"] для экспериментов по измерению скорости работы АТФазы

1.1.7. Приготовление эквимолярных растворов КгЭГТА и СаЭГТА и растворов с заданным рСа

1.1.8. Растворы для экспериментов по измерению скорости работы кальциевых насосов саркоплазматического ретикулума

1.2. Объекты исследования

Глава 2. МЕТОДЫ 29 2.1. Подготовка мышечных волокон к исследованию

2.1.1. Подготовка интактных мышечных волокон.

2.1.2. Приготовление скинированных волокон мышцы 3 О

2.1.3. Закрепление концов скинированных волокон 31 I 2.1.4. Перенос скинированных волокон в кювету для измерений

2.2. Исследовательские установки

2.2.1. Кювета для скинированных волокон с регулированием температуры, подачей и перемешиванием растворов

2.2.2. Установки для экспериментов на скинированных волокнах

2.3. Методы измерений

2.3.1. Измерение скорости гидролиза АТФ

2.3.2. Измерение использования АТФ миозиновыми мостиками

АТФазы мостиков)

2.3.3. Измерение механических свойств интактных мышц

2.4. Использованные программы и статистическая обработка результатов 44 III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ НА СКИНИРОВАННЫХ

ВОЛОКНАХ

Глава 3. ИЗМЕРЕНИЕ АТФазной АКТИВНОСТИ ВОЛОКОН МЫШЦ * ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ РЫБЫ-ЖАБЫ

3.1. Стратегии для определения соотношений использования АТФ между кальциевыми насосами саркоплазматического ретикулума и миозиновыми мостиками

3.2. Скорость работы АТФазы Са** насосов и миозиновых мостиков в скинированных волокнах плавательного пузыря

Глава 4. ИЗМЕРЕНИЕ СКОРОСТНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МЫШЦ

РЫБЫ-ЖАБЫ

4.1. Измерения жесткости в активных скинированных волокнах и вычисление доли присоединенных миозиновых мостиков.

4.2. Скорость развития СИЛЫ (kjevelop) И скорость повторного развития СИЛЫ (kredevelop)

4.3. Вычисления кинетики миозинового мостика.

Глава 5. ИЗМЕРЕНИЕ СКОРОСТИ КАЛЬЦИЕВЫХ НАСОСОВ

САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ В СКИНИРОВАННЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКНАХ

5.1. Разработка установки и методов для измерения потоков Са из окружающего раствора в волокно и обратно

5.2. Скорость работы кальциевых насосов саркоплазматического ретикулума

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА

СКИЦИРОВАННЫХ ВОЛОКНАХ

6.1. Высокая скорость одиночного сокращения при низких энергетических затратах.

Сравнение с литературными данными

6.2. Распределения использования энергии во время сокращения между кальциевыми насосами саркоплазматического ретикулума и миозиновыми мостиками

6.3. Функция кальциевых насосов саркоплазматического ретикулума в мышцах 69 IV. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И КИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРЕХ ТИПОВ

ИНТАКТНЫХ И СКИНИРОВАННЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН

РЫБЫ-ЖАБЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы сверхбыстрого сокращения мышц плавательного пузыря рыбы-жабы Opsanus Tau"

Изучение мышцы и механизма сокращения мышечных волокон — важное направление в биологических и физических исследованиях. Мышцы различных животных позволяли экспериментаторам наблюдать механические реакции на различные воздействия, используя относительно простую аппаратуру, уже тогда, когда остальные части тел животных были «немыми», - слишком трудными для исследования.

Результаты, полученные на мышцах, успешно использовались в качестве основы постановки различных задач для других биологических тканей и клеток. Так, известно, что исследования электрического тока начались после того, как случайное открытие Гальвани конвульсий лягушачьей лапки, подвешенной между разными металлами, привело Вольта в конце 18 столетия к построению Вольтовой батареи (Эйнштейн и Инфельд, 1965). Поэтому следует ожидать, что появление нового объекта для мышечных исследований может дать новые возможности в изучении других биологических тканей. Например, чрезвычайно высокая концентрация насосов саркоплазматического ретикулума (CP) в изученных нами мышцах плавательного пузыря рыбы-жабы (toadflsh's swimbladder) позволяет использовать прямые методы для изучения CP без его выделения из клеток и сопряженного с этим повреждения.

Изучение механизма сверхбыстрого сокращения мышц (СБСМ) плавательного пузыря рыбы-жабы - сравнительно новый раздел современных мышечных исследований. Почти все известные нам работы на эту тему были выполнены в лаборатории физиологии мышечного сокращения, руководимой Ларри Ромом в Университете Пенсильвании, США или в сотрудничестве с его лабораторией. Очень важные результаты были получены автором в его лаборатории в последние годы и будут представлены в данной диссертации, м У беспозвоночных животных часто встречаются мышцы, способные сокращаться с частотой до сотен Герц, например, полетные мышцы комара и других насекомых. Однако для большинства позвоночных животных предельная частота сокращения с полным расслаблением между последовательными сокращениями ограничивается 10-20 Гц. Когда были обнаружены мышцы "погремушки" гремучей змеи, а также мышцы плавательного пузыря рыбы-жабы (Toadfish) и рыбы Midshipmen, способные сокращаться с частотами выше 100 Гц и при этом полностью расслабляться между отдельными твитчами, то оказалось, что имеющиеся представления о механизмах регуляции сокращения не способны объяснить наблюдаемый феномен. Эти мышцы позволяют рыбе-самцу издавать звуки - «гудеть» на частоте выше 100 Герц, призывая самку. Замечу, что самки тоже могут «гудеть», но делают это намного реже.

Сверхбыстрое потребление энергии мышцами происходит в высокочастотных движениях типа звукообразования, и визуального слежения. Мышцы этого класса обычно генерируют низкие силы. Существуют различные модели, описывающие * мышечное сокращение (Дещеревский В. И., 1971). Можно написать уравнение взаимодействия миозиновых мостиков (М) с актином (А) с образованием актомиозина (AM) в упрощенном виде: м + а = ма. В прямом направлении реакция описывается так называемой "константой скорости замыкания мостиков", а в обратном направлении реакция идет со скоростью, описываемой "константой скорости размыкания мостиков".

В наших экспериментах в волокнах мышц плавательного пузыря развивалась в 10 раз большая скорость разъединения АМ-мостиков по сравнению с быстро сокращающимися локомоторными волокнами белых мышц, (предназначенными для движения тела), при этом скорость прикрепления миозиновых мостиков оставалась неизменной. Такая кинетика приводит к тому, что пул присоединенных к актину миозиновых мостиков в течение сокращения сверхбыстрых волокон невелик (их в 6 раз меньше, чем в локомоторных волокнах) и, таким образом, они развивают низкую силу. Это отличие констант прикрепления миозиновых мостиков к актину и их размыкания по сравнению с «обычными» мышцами, вероятно, является общим механизмом, который обеспечивает выбор между силой и скоростью для всех сверхбыстрых мышечных волокон.

Анализ литературы показывает, что за последние 65 лет после открытия Энгельгарта и Любимовой, связавших использование АТФ с энергетикой жизненых * процессов (Engelhard & Lubimova,1939) был достигнут заметный прогресс в изучении энергозатрат в различных процессах, обеспечивающих мышечное сокращение.

Считается, что скорость использования энергии изометрически сокращающейся мышцей пропорциональна скорости ее одиночного сокращения. Было найдено, что как в медленных, так и в быстрых мышцах от 25% до 40% полной энергии используется Са++ насосами саркоплазматического ретикулума (НСР-Са**) и остаточная часть -миозиновыми мостиками.

Мы исследовали энергетические затраты НСР-Са++ в самой быстрой, из известных у позвоночных, мышце плавательного пузыря рыбы-жабы в сравнении с затратами в других мышцах, а также скорость использования энергии, ожидаемую сверхвысокой.

Для определения долей потребления АТФ миозиновыми мостиками и НСР-Са++ был разработан метод раздельного измерения скорости использования АТФ в НСР-Са++ и миозиновыми мостиками, основанный на проведении реакций, сопряженных с « преобразованием флуоресцирующего НАДН в нефлуоресцирующий НАД* в растворе, окружающем скинированные сапонином мышечные волокна.

К нашему удивлению, несмотря на сверхбыстрое сокращение, скорость использования АТФ мышцами плавательного пузыря оказалась не выше, чем та, которая обнаружена в намного более медленных локомоторных мышцах земноводных.

Предложен механизм СБСМ, объясняющий огромную скорость одиночного сокращения при сравнительно невысокой стационарной скорости гидролиза АТФ за счет: а) наличия в них малого числа присоединенных АМ-мостиков; б) на порядок более высокой, чем в других мышцах, скорости размыкания мостиков при одинаковой скорости замыкания мостиков; в) наличия высокой концентрации внутриклеточного Са"1"1" буфера (парвальбумина), быстро отбирающего Са++ у тропонина, что инактивирует актин и инициирует процесс расслабления всего лишь через несколько миллисекунд после активации сокращения; г) аномально высокого содержания HCP-Ca^ в сверхбыстрых мышцах, позволяющего полностью удалить Са++ из центров связывания в парвальбумине и тропонине во время паузы между звуковыми сигналами; д) сдвига порога активации сокращения от 100-300 нМ Са++ в "обычных" мышцах до 3000 нМ в сверхбыстрых мышцах плавательного пузыря.

Наконец, оказалось, что полная скорость использования АТФ не столь высока, как ожидалось, и относительные ее доли, использованные НСР-Са++ (37%) и миозиновыми мостиками (63%), находятся в пределах величин, измеренных для других мышц.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Климов, Андрей Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. Разработан единый методический подход и создана установка со сменными блоками для высокоточного измерения in vitro комплекса основных параметров мышечного сокращения на интактных и скинированных волокнах: силы и скорости сокращения и расслабления мышц; скорости использования АТФ АМ-мостиками; скорости использования АТФ кальциевыми насосами саркоплазматического ретикулума (НСР-Са**, CP); скорости выброса кальция из CP и обратной закачки кальция в CP; жесткости волокна при активном сокращении и в ригоре; длины саркомеров; длины, диаметра и толщины волокна; веса волокна.

2. Впервые показано, что сверхбыстрые мышцы плавательного пузыря не отличаются кардинально ни по скорости использования АТФ, ни по распределению расхода АТФ между АМ-мостиками и НСР-Са** от мышц других типов.

3. Впервые проведены прямые измерения выброса кальция из CP мышечных волокон (без выделения CP из мышц) и его закачки обратно.

4. Предложен механизм СБСМ, объясняющий огромную скорость одиночного сокращения при сравнительно невысокой стационарной скорости гидролиза АТФ за счет: а) наличия в них малого числа присоединенных АМ-мостиков; б) на порядок более высокой, чем в других мышцах, скорости размыкания мостиков при одинаковой скорости замыкания мостиков; в) наличия высокой концентрации внутриклеточного Са"1-1" буфера (парвальбумина), быстро отбирающего Са*4" у тропонина, что инактивирует актин и инициирует процесс расслабления всего лишь через несколько миллисекунд после активации сокращения; г) аномально высокого содержания НСР-Са"1-1" в сверхбыстрых мышцах, позволяющего полностью удалить Са** из центров связывания в парвальбумине и тропонине во время паузы между звуковыми сигналами; д) сдвига порога активации сокращения от 100-300 нМ Са** в "обычных" мышцах до 3000 нМ в сверхбыстрых мышцах плавательного пузыря.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю признательность Ларри Рому, сотрудникам лаборатории мышечного сокращения Биологического Отдела Пенсильванского Университета, где была выполнена основная часть работы, Борису Тикунову за электрофоретические исследования, Иану С. Янгу за помощь в написании статей.

Я очень благодарен академику Глебу Михайловичу Франку, привлекшему меня к исследованию мышечного сокращения и поддерживавшему меня советами и помощью и Валерию Васильевичу Ледневу, в лаборатории которого проведена часть работ.

Я очень благодарен Ларисе Константиновне Сребницкой, Зое Александровне Подлубной, Алексею Витальевичу Финкелыптейну за ценные советы и помощь в редактировании диссертации и автореферата.

Сердечно благодарю мою жену за помощь, оказанную при написании диссертации.

Исследование по теме диссертационной работы были поддержаны грантами Национального научного Фонда США и Национального Института Здоровья, США: "Supported by NSF IBN-9514383, NIH AR38404, and NIH AR46125 to L. Rome."

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты открывают перспективы для применения новой модели для биологических исследований, а именно - модели саркоплазматического ретикулума мышц плавательного пузыря рыбы-жабы, пригодной для исследований без выделения из мышц и сопутствующего выделению повреждения.

Методы работы с очень небольшими объемами объектов и растворов могут быть использованы в разнообразных исследованиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Климов, Андрей Алексеевич, Пущино

1. Alberty, R. Effect of рН and metal ion concentrations on the equilibrium hydrolysis of adenosine triphosphate to adenosine diphosphate //J. Biol. Chem. 1968. - Vol. 243. - P. 1337.

2. Alexander, R. M., Jayes, A. S., Maloiy, G. M. O., Wathuta, E. M. Allometry of the leg muscles of mammals // J. Zool. (London). 1981. - Vol. 194. - P. 539-552.

3. Appelt, D., Shen, V., Franzini-Armstrong, C. Quantitation of Ca ATPase, feet and mitochondria in super fast muscle fibers from the toadfish, Opsanus tau // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 1991. - Vol. 12. - P. 543-552.

4. Baylor, S.M., Hollingworth, S. Fura-2 calcium transients in frog skeletal muscle fibres // J. Physiol. 1988. - Vol. 403. - P. 151-192.

5. Bottinelli, R., Canepari, M., Reggiani, C., Stienen, G. J. M. Myofibrillar ATPase activity during isometric contraction and isomyosin composition in rat single skinned muscle fibres //J. Physiol. 1994. - Vol. 481. - P. 663-675.

6. Brenner, B. Effect of Ca2+ on cross-bridge turnover kinetics in skinned single rabbit psoas fibers: implications for regulation of muscle contraction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 3265-3269.

7. Burchfield, D., Rail, J. A. Temperature dependence of the crossbridge cycle during unloaded shortening and maximum isometric tetanus in frog skeletal muscle // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 1986. - Vol. 7. - P. 320-326.

8. Cannell, M. B. Effect of tetanus duration on the free calcium during the relaxation of frog skeletal muscle fibres //J. Physiol. 1986. -Vol. 376. - P. 203-218.

9. Conley, К. E., Lindstedt, S. L. Controversies about Symmorphosis // Optimization in Biological Design / Eds. Weibel, E. R., Taylor, C. R., Bolis, L. Cambridge U.K: Cambridge Univ. Press, 1998 - P. 147-154.

10. Cooke, R., Franks, K. All myosin heads form bonds with actin in rigor rabbit skeletal muscle // Biochemistry. 1980. - Vol. 19. - P. 2265-2269.

11. Crow, M. Т., Kushmerick, M. J. Correlated reduction of velocity of shortening and the rate of energy utilization in mouse fast-twitch muscle during a continuous tetanus // J. Gen. Physiol. -1983.-Vol. 82.-P. 703-720.

12. Defuria, R. F., Kushmerick, M. J. ATP utilization associated with recovery metabolism in anaerobic frog muscle // Am. J. Physiol. 1977. - Vol. 232, C. - P. 30-36.

13. Ellis-Davies, G. C. R., Kaplan, J. H. Nitrophenyl-EGTA, a photolabile chelator that selectively binds Ca2+ with high affinity and releases it rapidly upon photolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. Vol. 91. - P. 187-191.

14. Engelhard V. A., Lubimova M. N., Myosin and adenosinetriphosphatase // Nature. 1939. -Vol. 144, № 3650. - P. 668-669.

15. Fajer, P. G., Fajer, E. A., Brunsvold, N. J., Thomas, D. D. Effects of AMPPNP on the orientation and rotational dynamics of spin-labeled muscle cross-bridges // Biophys. J. -1988.-Vol. 53.-P. 513-524.

16. Feher, J. J., Waybright, T. D., Fine, M. L. Comparison of sarcoplasmic reticulum capabilities in toadfish (Opsanus tau) sonic muscle and rat fast twitch muscle // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 1998. - Vol. 19. - P. 661 -674.

17. Fine, M. L. Seasonal and geographical variation of the mating call of the oyster toadfish Opsanus tau L. // Oecologia. 1978. - Vol. 36. - P. 45-57.

18. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J., Smith R., Sutoh K., Holden H. M., Rayment I. Structural studies of myosin: nucleotide complexes: A revised model for the molecular basis of muscle contraction // Biophys. J. 1995. - Vol. 68, Suppl. 19S-28S (b).

19. Franzini-Armstrong, Clara, Feliciano Protasi, Venkat Ramesh, Shape, Size, and Distribution of Ca2+ Release Units and Couplons in Skeletal and Cardiac Muscles // Biophys J. -1999. -Vol. 77, №. 3.- P. 1528-1539.

20. Frueh, B. R., Hayes, A., Lynch, G. S., Williams, D. A. Contractile properties and temperature sensitivity of the extraocular muscles, the levator and superior rectus, of the rabbit // J. Physiol. -1994.-Vol. 475. P. 327-336.

21. Fryer, M. W, Stephenson, D. G. Total and sarcoplasmic reticulum calcium contents of skinned fibres from rat skeletal muscle // J. Physiol. 1996. - Vol. 493. - P. 357-370.

22. Goldman, Y. E. Measurement of sarcomere shortening in skinned fibers from frog muscle by white light diffraction // Biophys. J. 1987. - Vol. 52. - P. 57-68.

23. Goldman, Y. E., Hibberd, M. G., Trentham, D. R. Relaxation of rabbit psoas muscle fibres from rigor by photochemical generation of adenosine-5'-triphosphate // J. Physiol. 1984.1. Vol. 354. P. 577-604.

24. Goldman, Y. E., Huxley, A. F. Actin compliance: are you pulling my chain? // Biophys. J. 1994. - Vol. 67. - P. 2131-2133.

25. Hibberd, M. G., Dantzig, J. A., Trentham, D. R., Goldman, Y. E. Phosphate release and force generation in skeletal muscle fibers // Science. 1985. - Vol. 228. - P. 1317-1319.

26. Higuchi, H., Yanagida, Т., Goldman, Y. E. Compliance of thin filaments in skinned fibers of rabbit skeletal muscle // Biophys. J. -1995. Vol. 69. - P. 1000-1010.

27. Hill, A. V. The dimensions of animals and their muscular dynamics // Science Progress. -1950.-Vol. 38.-P. 209-229.

28. Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle // Proceedings of the Royal Society B. 1938. - Vol. 126. - P. 136-195.

29. Higuchi, H., Goldman, Y. E. Sliding distance between actin and myosin filaments per ATP molecule hydrolysed in skinned muscle fibres // Nature. 199L - Vol. 352. - P. 352-354.

30. Homsher, E., Kean, C. J. Skeletal muscle energetics and metabolism // Annual Review of Physiology. 1978. - Vol. 40. - P. 93-131.

31. Hou, T.-T., Johnson, J. D., Rail, J. A. Parvalbumin content and Ca2+ and Mg2+ dissociation rates correlated with changes in relaxation rate of frog muscle fibres // J. Physiol. 1991. - Vol. 441.-P. 285-304.at

32. Hou, T.-T., Johnson, J. D., Rail, J. A. Effect of temperature on relaxation rate and Ca**, Mg2+ dissociation rates from parvalbumin of frog fibres // J. Physiol. 1992. - Vol. 449. - P. 399410.

33. Howard, J. Molecular motors: structural adaptations to cellular functions //Nature. 1997. -Vol. 389.-P. 561-567.

34. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction // Progress in Biophysics and Biophysical Chemistry. 1957. - Vol. 7. - P. 255-318.

35. Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle // Biophys. J. 1994. - Vol. 67. -P. 2411-2421.

36. Inesi, G., Millman, M., Eletr, S. Temperature-induced transitions of function and structure in sarcoplasmic reticulum membranes // Journal of Molecular Biology. 1973. - Vol. 81. - P. 483504.

37. Johnston, I. A. Dinamic properties of fish muscle // Fish Biomechanics / Eds. Webb, P. W., Weihs, D. New York: Praeger, 1983. - P. 36-67.

38. Josephson, R. K., Young, D. Synchronous and asynchronous muscles in cicadas // J. Exp. Biol. -1981. -Vol. 91. P. 219-237.

39. Konishi M., Olson, A., Hollingworth, S., Baylor, S. M. Myoplasmic binding of fura-2 investigated by steady-state fluorescence and absorbance measurements // Biophys. J. -1988.-Vol. 54.-P. 1089-1104.

40. Lannergren, J., Hoh, J. F. Y. Myosin isoenzymes in single muscle fibers from Xenopus laevis: analysis of five different functional types // Proceedings of the Royal Society B. 1984. - Vol. 222. -P. 401-408.

41. Launikonis, B. S., Stephenson, D. G. Effect of saponin treatment on the sarcoplasmic reticulum of rat, cane toad and crustacean (yabby) skeletal muscle // J. Physiol. 1997. - Vol. 504. - P. 425-437.

42. Lindstedt, S. L., McGlothlin, Т., Percy, E., Pifer, J. Task-specific design of skeletal muscle: balancing muscle structural composition // Сотр. Biochem. Physiol. 1998. - Vol. 120(1). - P. 3540.

43. Lovell, S. J., Knight, P. J., Harrington, W. F. Fraction of myosin heads bound to thin

44. Ф filaments in rigor fibrils from insect flight and vertebrate muscles // Nature. 1981. - Vol.293. P. 664-666.

45. McMahon, Т. A. Using body size to understand the structural design of animals: quadrupedal locomotion // J. Appl. Physiol. 1975. - Vol. 39. - P. 619-627.

46. Mendelson, M. Electrical and mechanical characteristics of a very fast lobster muscle // J. * Cell Biol. 1969. - Vol. 42. - P. 548-563.

47. Metzger, J. M., Moss, R. L. Kinetics of a Ca(2+)-sensitive cross-bridge state transition in skeletal muscle fibers. Effects due to variations in thin filament activation by extraction of troponin СИ J. Gen. Physiol. 1991. - Vol. 98. - P. 233-248.

48. Page, S. G., Huxley, H. E. Filament lengths in striated muscle // J. Cell Biol. 1963. - Vol. 19. - P. 369-390.

49. Pate, E., Cooke, R. Energetics of the actomyosin bond in the filament array of muscle fibers // Biophys. J. 1988. - Vol. 53. - P. 561-573.

50. Rayment I. The structural basis of the myosin ATPase activity // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271.-P. 15850-15853.

51. Rome, L. C. Scaling of muscle fibres and locomotion // J. Exp. Biol. 1992 - Vol. 168. - P. 243-252.

52. Rome, L. C., Kushmerick, M. J. The energetic cost of generating isometric force as a function of temperature in isolated frog muscle // Am. J. Physiol. 1983. - Vol. 244, C. - P. 100-109.

53. Rome, L. C., Lindstedt, S. L. The quest for speed: muscles built for high frequency contractions // News in Physiological Sciences. 1998. - Vol. 13. - P. 261-268.

54. Rome, L. C., Syme, D. A., Hollingworth, S., Lindstedt, S. L., Baylor, S. M. The whistle and the Ф rattle: the design of sound producing muscles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P.8095-8100.

55. Rosenbluth, R. Sarcoplasmic reticulum of an unusually fast-acting crustacean muscle // J. Cell Biol. 1969. - Vol. 42. - P. 534-547.

56. Schaeffer, P. J., Conley, К. E., Lindstedt, S. L. Structural correlates of speed and endurance in skeletal muscle: the rattlesnake tailshaker muscle // J. Exp. Biol. 1996. - Vol. 198. - P. 351-358.

57. Stienen, G. J. M., Zaremba, R., Elzinga, G. ATP utilization of calcium uptake and force production in skinned muscle fibres of Xenopus laevis // J. Physiol. 1995. - Vol. 482. - P. 109122.

58. Syme, D. A., Connaughton, M. A., Rome, L. C. A device for measuring steady-state ATP utilization in single skinned muscle fibers // Biol. Bull. 1997. -Vol. 193. - P. 251-252.

59. Sweeney, H. L., Stull, J. T. Alteration of cross-bridge kinetics by myosin light chain phosphorylation in rabbit skeletal muscle: implications for regulation of actin-myosin interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 414-418.

60. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms // J. Appl. Physiol. 1993. - Vol. 75. - P. 2337-2340.

61. Thomas, D. D., Cooke, R. Orientation of spin-labeled myosin heads in glycerinated muscle fibers // Biophys. J. 1980. - Vol. 32. - P. 891-906.

62. Tikunov, В. A., Levine, S, Mancini, D. Chronic Congestive Heart Failure Elicits Adaptations of Endurance Exercise in Diaphragmatic Muscle // Circulation. 1997. - Vol. 95, № 4. - P. 910916.

63. Tullis, A., Block, B. Expression of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase isoforms in marlin and swordfish muscle and heater cells // Am. J. Physiol. 1996. - Vol. 271 (Regulatory Integrative Сотр. Physiol. 40). - P. R262-R275.

64. Wakabayashi, K., Sugimoto, Y., Tanaka, H., Ueno, Y., Takezawa, Y., Amemiya, Y. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction // Biophys. J. 1994. - Vol. 67. - P. 2422-2435.

65. Wendt, I. R., Stephenson, D. G. Effects of caffeine on Ca-activated force production in skinned cardiac and skeletal muscle fibres of the rat // Pflugers Archiv. 1983. - Vol. 398. -P.210-216.

66. Woledge, R. C. The energetics of tortoise muscle // J. Physiol. 1968. - Vol. 197. - P. 685-707.

67. Woledge, R. C., Curtin, N. A., Homsher, E. Energetic Aspects of Muscle Contraction. New York: Academic Press, 1985.

68. Yates, L. D., Greaser, M. L. Quantitative determination of myosin and actin in rabbit skeletal muscle // Journal of Molecular Biology. 1983a. - Vol. 168. - P. 123-141.

69. Yates, L. D., Greaser, M. L. Troponin subunit stoichiometry and content in rabbit skeletal muscle and myofibrils // J. Biol. Chem. -1983b. Vol. 258. - P. 5770-5774.

70. Дещеревский, В. И. Экспериментальные основы и постулаты кинетической теории мышечного сокращения // Механизмы мышечного сокращения. М.: Наука, 1971.-С. 210-219.

71. Эйнштейн, А., Инфельд, Л. Эволюция физики. М.: Наука, 1965. - С. 72. Статьи автора по теме диссертации и «Биологическая подвижность»:

72. Климов, А. А. Лазерный ТВ микроскоп // Техника кино и телевидения.- 1976. № 7. -С. 69-71.

73. Климов, А. А., Макаров, А. Д., Руденко, Т. И. Изучение конформационных изменений хлоропластов методом ТВ микроскопии // Физиология растений. 1975. - Т. 22, вып. 5.-С. 877-881.

74. Климов, А. А., Андреев, О. А. О точности измерения длины саркомеров сокращающихся мышц методом лазерной диффракции // Биофизика. — 1982. Т. XXVII, вып. 1.-С.111- ИЗ.

75. Герц, С. М., Климов, А. А., Макаров, А. Д., Руденко, Т. И., Шмелева, В. Л. Изучение конформационных колебаний в фосфорилирующих хлоропластах // Физиология растений. 1982. -Т. 29, вып. 6. - С. 1095 - 1101.

76. Климов, А. А., Самосудова, Н. В., Сребницкая, Л. К. Локализация Са в мышцах с двойной регуляцией кальция // Биофизика. 1981.- Т. XXVI, вып. 2.- С. 319-322.

77. Сидоренко, Н. П., Климов, А. А. Укорочение толстых нитей как результат скольжения нитей // Биофизика.- 1994.- Т. 39(1). С. 153-155.

78. Rome, L. C., Klimov, A. A., Young, I. S. A new Approach for Measuring Real-Time Calcium Pumping and SR Function in Muscle Fibers // Biol. Bull. 1999b. - Vol. 197. - P. 227-228.

79. Rome, L. C., Klimov, A. A. Superfast contraction without superfast energetics: ATP usage by SR-Ca++ pumps and crossbridges in Toadfish swimbladder muscle // J. Physiol. -2000. Vol. 526.2. - P. 279-286.

80. На обложке этого выпуска журнала изображение рыбы-жабы и графики автора

81. Тезисы и депонированные статьи

82. Климов, А. А. Исследование сокращения саркомеров мышечных волокон речного рака при спонтанной контрактуре // Биофизика живой клетки. Пущино,1973. Т. 4, вып. 1. - С. 175-177.

83. Климов, А. А. Исследование сокращения мышечных волокон речного рака и жука плавунца с помощью ТВ-микроскопа // Всесоюз. симпозиум по биофизике и биохимии мышц: Тез. докл. Тбилиси: Метцниереба, 1974. - С. 100-102.

84. Климов, А. А. Изменение анизотропного диска во время спонтанного сокращения мышц жука-плавунца // Биология и научно-технический прогресс: Тез. докл. Пущино,1974.-С. 143-145.

85. Антипов, Е. Е., Дашевский, И. Е., Климов, А. А. Применение Лазерного ТВ-микроскопа для прижизненных исследований регионального кровообращения //

86. Методы исследования функций организма в онтогенезе: Сб. тез. Всесоюзной конференции. 1975.

87. Будницкий, А. А., Климов, А. А, Сребницкая Л. К. Исследование укорочения анизотропного диска во время сокращения поперечно-полосатых мышечных волокон членистоногих // Молекулярная и клеточная биофизика. М.: Наука, 1977. - С. 268 -277.

88. Климов, А. А., Попов, В. И. Укорочение анизотропных дисков в саркомерах неполетных мышц жука-плавунца. Оптическая и электронная микроскопия //

89. Криогенные методы в электронной микроскопии. Пущино, 1977. - С. 63-66.

90. Климов А. А. Лазерный сканирующий поляризационный микроскоп // V Всесоюзная конференция по проблемам автоматизации анализа микроскопических изображений: Сб. тезисов. — Пущино, 1977. С. 32.

91. Климов, А. А., Самосудова, Н. В., Сребницкая Л. К. Исследование локализации Са в мышцах Balanus Rostratus Н // XI Всесоюзная электронно-микроскопическая конференция. Биология: Тез. лекций. М.: Наука, 1979.-. Т. II. - С. 224.

92. Климов, А. А., Гогвадзе 3. Е., Сребницкая Л. К. Изменение структурно-механических свойств скелетных мышц лягушки в процессе фиксации глутаровым альдегидом // Структурные основы и регуляция биологического старения.- М.: Наука, 1980.-С. 187-192.

93. Климов, А. А. О взаимодействии миозиновых голов с актином на различных фазах мышечного сокращения // Всесоюзный Биофизический Конгресс: Сб. тез. — М., 1982. Т. И. - С. 45.

94. Климов, А. А. Устройство для измерения механо-структурных характеристик поперечно-полосатых мышц // Оборудование и автоматизация научных исследований в биологии: Сб. тез. Всесоюзной конференции. Кишинев, 1981. - Ч. II. - С. 65.

95. Климов, А. А., Шаповалов, А. Н. Молекулярный механизм укорочения гладких мышц // XII Конгресс Украинского физиологического общества им. Павлова: Тезисы. -Киев, 1986.

96. Климов, А. А. Применение программируемого калькулятора МК-56 для расчета концентраций основных ионов для физиологических исследований // Деп. ВИНИТИ 7819-V-87,11/9/87.- 12 с.

97. Климов, А. А., Шаповалов, А. Н. Модель регуляции сокращения гладких мышц // Биофизика и биохимия биологического старения: VIII Всесоюз. симпозиум. Тбилиси: Метцниереба, 1987.-С. 16-18.

98. Желамский, С. В., Климов, А. А., Шаповалов, А. Н. Состав белков и организация сократительного аппарата гладких мышц // Деп. Укр. НИТИ N 2827 УК 89,12/8/89. -105с.

99. Желамский, С. В., Климов, А. А., Шаповалов, А. Н. Регуляция сократительной активности гладких мышц // Деп. Укр. НИТИ N 2828 УК 89, 12/8/89. 101 с.

100. Желамский, С. В., Климов, А. А., Шаповалов, А. Н Связанный с миозином механизм регуляции укорочения гладких мышц // Деп. Укр. НИТИ N 2829УК 89, 12/8/89. 100 с.

101. Желамский, С. В., Климов, А. А., Шаповалов, А. Н. Сократительный аппарат гладких мышц и его регуляция // Деп. Укр. НИТИ N 189 УК 90,2/5/90.- 103 с.

102. Klimov, A. A., Pollack, G. Н. Local volume changes in tetanus of isolated frog muscles // Biological Motility: International Symposium. Pushchino, 1994. - P. 98.

103. Deshcherevskaya, N. P., Klimov, A. A. A model of myosin-actin interaction // Biological Motility: International Symposium. Pushchino, 1994. - P. 98.

104. Rome, L. С., Klimov, A. A. The price of speed: ATP usage by crosssbridges and AND Ca2+ pumps in the superfast toadfish swimbladder muscle // Biological Motility: International Symposium. Baltimore (USA), 1999.

105. Rome, L. C., Klimov, A. A., Young, I. S. Measuring real-time calcium pumping and SR function in muscle fibers // Biological Motility: International Symposium. Pushchino, 2004. -P. 58-60.

106. Rome, L. C., Klimov, A. A., Young, I. S. ATP usage by SR-Ca2+ pumps and crossbridges in toadfish swimbladder muscle // Biological Motility: International Symposium. Pushchino, 2004. - P. 266-269.

107. Статьи автора по немышечным темам:

108. Климов, А. А. Влияние направления вращения пленок "Биохром" на светопропускание реальных поляризационных устройств // Свето-чувствительные биологические комплексы и оптическая регистрация информации. Пущино, 1985. - С. 145-152.

109. Тирас, X. П., Сребницкая, JI. К., Ильясова, Е. Н., Климов, А. А., Леднев, В. В. Влияние слабого комбинированного магнитного поля на скорость регенерации планарии Dugesia Tigrina // Биофизика. 1996. - Т. 41 (4). - С. 826-831.