Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции величины потенциал-управляемого кальциевого сигнала и его роль в мембрано-плазматических взаимодействиях в нервных клетках

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции величины потенциал-управляемого кальциевого сигнала и его роль в мембрано-плазматических взаимодействиях в нервных клетках"

1 '1 Ъ с4

АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ Ф1310Л0ГН !М. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

УДК 577.352.5:612.822

МАРТИНЮК АнатолШ бвгенович

МЕХАМ13МИ РЕГУЛЯЦП ВЕЛИЧИН,И ПОТЕН ЦДАЛ-КЕРОВАНО ГО КАЛЬЩбВОГО СИГНАЛУ I ИОГО РОЛЬ В МЕМБРАННО-ПЛАЗМАТИЧНИХ ВЗА6МОД1ЯХ У НЕРВОВИХ КЛ1ТИНАХ

03.00.02 — бюф5зика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацм на здобуття вченого ступеня доктора б!олог!чиих наук

КиУв— 1992

Робота виконана у 1нститут1 ф1зюлоп1 ¡м. О. О. Богомольця Академ!! на Укра5ни

ОфщШш опоненти:

доктор медичних наук, академж АН Украй: Шуба М. Ф.

доктор бтлопчних наук, професор Курський М. Д. доктор бюлопчних наук, професор Воробець 3. Д.

Праведна оргашзащя:

Дшпропетровський державний ушверситст

Захист вщбудеться « & > 1992 р. о_ годит на засвдаш

спец1ал13овано1 ради Д-016.15.01 при Ьнлитуп ф^з^олога ¡м. О. О. Богомолы АН Украши за адресою: 252024, Киш-24, вул. Богомольця, 4.

3 дисертащею можна ознайомитись у б^ииотеил 1нституту фЫолог ¡м. О. О. Богомольця Академи наук УкраГни.

Автореферат роз!еланий « »_1992 р.

Вчений секретар спещальзованоХ ради доктор б'юлогкних наук

3. О. СОРОК1НА-МАР1Н

I. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АктуаяьнЮть пробпеки. Юни Ca24" прийкають участь у контрол1 еличнни трансмекбранного потенц1алу 1 гвнераци р1знях форм лектрично! акгявност! на8рон!в. Вх1д 1он1в кальц1го в кл1тину врез 81дпов1дн1 потевд1ал-керован1 канала зв'язуе електричШ роцесн у иембран1 з кетабол!чними реакЩяни, 1ндукус довго ряваюч1 зиШй иейрональноХ 1 сииаптично1 акт и в пост 1, справляс плив на морфолог 1чн1 зн1ни в нейронах та !н. (для прикладу диз. гляди Augustina et al., 1987; Hess, 1990; Kater, Mills, 1991; ostyuk, 1992). Таким чином, 1он1зований Ca с по-сут1 головням нутр1шньокл1тишмм посерадникон в регуляцН функцюнувакня ервово! кл!тини. •

2+

Внутр1шнъокл!тинн1 ефекти 10н1в Ca надзвичайио заложать в1д

овдентрацН. Тону необидною умовога викояакня нини посвродницько!

ункц11 с дкнам1чниЭ баланс ills процесаня, до п1ДВЕиук>ть

2+

!5утрШньокл1тинний р1вень Ca I процесани, KOipl обио'.куать цой Ict. Порушення в регуляцН внутр!шнъокл1тинного р1вня в1льного Ca ркводять до зн1н багатьох тип1в кл1тинно1 д1ялыгаст1 1 смерт1 еЗрон1э (Schanne et al., 1979; Farber, 1981; Kater, Mills, 1991; hoi, 1988); na plBHl орган1зну це проявляеться у тяжких розладах ункц1й нервово! система. В даний час природа таких порушвнь аходиться у початков1к стадП зквчення (Raley-Susaan, Lipton, 990; Coulter et al., 1990) i по ц1й причин! можлявост! ix прямованого в1двернення обиажан1. Таккй стан поясшзеться, окреиа, в!дсутн1ст» нвобх1дно! 11!фориац11 про иолекуляри! основа ункц!оиузаиня Са-регудютзяс систем.

В!дом! два тилн npoascls, ио обкежують неконтрольоваияй р1ст кутр1шньокл1тинного калыию у результат! активацП в плазнатичн1 S ембран1 кальц1евих наиал1э I розватку кальц1евого взс!дного труку. Цо актлвац1я эатрянаного кашевого вих1дного струну i ригн1чоння внутр1вньокл1тлннимк 1онами кальц1и кальцЮвого Х1ДНОГО струну (Kostyuk, Krishtal, 1977; Дорошвико, Цкндронко, 979; Tillotson, 1979; Doroshsnko, KostyuK, Martynyuk, 1984; Погас* t al., 1983). Актквац1я потвнц1ал-иеропаного затрянакого l а-залеиного кал1евих аягЛднпх струн! з приводить до 1перполяр!1згц11 мйнбраня, «о скорочус раззпок потакщалу д!1 I,

в1дпо81дно, обмеауе вх!д кальц!ю в клиину. Одержання докладк 1кфорнац11 про роль 1ок1в Са2+ у функцю нуванн! в1дпов1дн кал1свих канал1а, було б дуже важлквин для розун1кня участ! ц структур в регуляцП величина похенц1ал-корованого кальц!сво сигналу. •

З'ясуваиня кохаШзму блокуванкя внутр1вньокл1твннккк Юна; кальц1ю кальц1свнх канал 1 в тех десять актуальна; воно, зокрвн; потрвбус вкзначонля рол! вкутр1шньокл1тякких кетабол!чнвх раакц у функц1онуванн1 - потешиал-керованкх калыиевих канал найронально! кекбранн. 0ввн1 досл1джэння вже були проведа (Воселовский, Федулова, 1SS1; Doroshenko, Kostyuk, Hartynyuk i al., 1984; Chad, Ekert, 1984), ала - ряд пятань погреб; грунтовншого вибчэння.

Багатъна досл1дннкани.лостулюегься Ютотна роль ЮВ1а кальц у регуляцП найроналыюго росту 1 диференЩювання нервово! кл1тк: (див. огляд Kater, Mills, 1991). В основ 1 цього пропасу пев; лаягкть Юнування т1сикх зв'язк!в м!ж потенЩал-керованш калыЛевини каналами 1 цктоскелотон кл1ткни. Досл!джеи холекулярних нохан1зн1в таких зв'язк1в коже дата нов! дак1 д.

розук1ння природа тривалих зи1н функцЮнування нервових хл1т!

2+

вкасл!док розладу Ca гомеостазу.

Пета i задач! яосл1дкеиь. Мата ц1с! роботи полагала досл1дагвнн! молекулярних механ1зн!в : регуляцП рос внугр1шньокл1тинкого р1вяя в1льного кальЩю, то нас н!сце П] онгиваци потеиц1ал-кврсваких кальц 1 свих какал! в нойрональ» ивмбраик; рол! кальц1свих сигнал!в, створюваиих рХзккке гкпа) кальц1 свих канал1в, у процесах нелокального розвктку 1 рос; нейрит1в; стану потакц1ал-керованкх кальц 1свих канал!в при rsbhi розладах бЮхХШчних про«ес!в у нервовХВ тканин!.

Для досягненая поставлено! хети наобх1дно було розв'яза; так! задач!:

1) Ввявитк 1 ДОСЛ1ДЯТК мехашзмя регуляцП Юнаия кальц: функцЮнування потенц1ал- керованкх кал!свих каналЮ ндЙрональн( меибракк.

2) Досл1дктн иолекулярн1 кехан1зна . пригШчеш

2+

внутр1шньокл!тннняхи юнаня Ca . високопорогов!

потвкЩал-керованнх кальц!свих канал!в.

3) ДОСЛ1ДВТК роль НЖЗЬКО- 1 ВИСОКОПОРОГОВИХ кальц 1СВ1

канал!в у процвсах диферанцХввання нойрон!в 1 росту Ix нойратИ

-г-

ивчитж К0ЖЛИВ1 зв'язки фунвдЮнування лотвнц1ал-керованих алмЦсвих какал1в 1 цитосколету кл1тини.

4) Досл1дити стан потентал-керовано! кальц1сво1 пров1дност1 рп вплквах, шо викликають <>1ох1н1чн1 зн1ни у мозку, котр1 упроводжуються зн1нани у цитоскелэт! нервових кл1тнн. Новизна отркианих результат1в.

1. ЗнаЯданий ефакт 1 досл1джаний кохан1зи кодулкэтчо! ди

2+

эвнШньокШтинних юк1в Са на канали потенц1ал-керованого

1л1евого затриманого вих1дного струну. Показано, що д1я

2+-

овн1шньокл1тккних 1он1в Са на досл1джуван1 канала

лосвредковусться.через антлваЩи проте1нк1нази С.

2- Вйявлэно д1ю lOHls К+ на 1нактивац1йн1 процеси у каналах ал1Евого затриманого вих1дного струну. З'ясованнй характер цього вида 1 запропонованяй механ!зк взаемодп цих кат!он1в з каналом.

3. Досл1яжений нехан1зм блокуючо! д11 внутр1шньокл1тиннкх 2+

ин1в Са на потенц1зп-керован! кальц1св1 канали. Показано, ио у

2+

снов! тако! д11 дожить актявац1я 1онаки Са цАМФ-фосфод1естераз наступив зняження фосфорклювання б1лк!в кальц1свого каналу.

4. Встановлена р1зна роль кальц1евих вх1днях струк1в, що

родукупться низько- 1 високопороговими кальц1свяки каналакя, у

2+

эгуляцП иорфолог1чш:х зм1н нейронХв. Вх1д Iohíb Са через satHonoporoBl кальц1ев1 канали tIcho пов'язаний з кехан1зманн шуску дкфаренц1йовки • нейрон1В! актнвн1сть високопороговях шьц1евих канал1в важлива для процес1в регуляцИ росту Н0йрит1в.

5. ЗнаЯдена иодуляц1я функц1онування високопороговхх этенц1ал-керованях кальц1евих каналХв при зм1нах тирозилювання ■тубушну. Посттранслнщане тирознлювання п1дтрикуе актившсть icOKonoporoBHx капмиевих канал1в, а замИдення Ь-тирозину у >0Н-герм1нал1 а-тубул1ну Ь-фен1лалан1ном супроводжусться зигШчонкяи акпл1тудм капьц1еэого струму:

6. Показано, що штучно порушення обм1ну ароматичних tiнокнслот у мозку нОвонародженних таарин, ща супроводжусться Инакя у структур! б1лк1в н1кротубулярно! системи, викликае »лективне i трквалв прягн1чення високопорогового кальц!свого ■ РУНУ У нейронах Ппокампу. Виявлена можлив1сть в1дновлення гнкцП високопороговях кальц!свих канал!в за допоиогою L-тирозину активатор1в тирозинових к1наз.

Практична uliniicTb роботи. 0грииан1 результат» ютотно

(зширюють наш! уявлення про властивост! 1 ф!э1олог1чну роль

Х-1609к

р1зних тип!в потенц1ал-нерованих кальц1евих канал1в 1 какал! кал1евого затриманого вюадного струиу. Проведен! дасл1джешл демонструютъ нов! принципа регуляцП внутр1тньокл1гиноп кальц1свого сигналу, що продукусгься потввд1ал-керованим1 калъц!евикя каналаки. Ц1 дан! мають важлкве значения дои розум1ння законом1рностей об'сднання субкл1тинних раакц!й ; складну систему, яну являс собою нейрон.

Дан1 про иояекулярн1 нехаШзми функцЮнування систем, щ( регулюють надходження 1он1в кальц!» усередкну кл1тини, i lx ста! при деяккх патолоПчних зк!нах нервово1 систени, с нёобх1дно> уловов створення селвктявних фармаколог1чних засоб1в, спрямованиз на в1двернення таких зм1н. Безпосередньо практичний 1нтерес мают1 дан1 про пркгн1чеиня високопорогового кальц!свого струму j нейронах г!покампу при умовах, що иоделююгь б!ох1м!чн! зк!нх ¡ нозку, харахтерн1 для фен1лкетокур11. Знайдене явище ноже кат] ключове значения для розук1ння природа розладу функц1й иозк] внасл!док цього захворпванкя X пошуку шяях!в 1х в1дновлоикя.

Апробация дисертац!йного матер!алу. На ochobI матер1ал11 дисаргац1йнно! роботк буля зроблек1 допов1д1 на Всесоюзн1й нарад] "8нутр1шньокл1тинний метабол1зм та 1онна пров1дн1сть" (Москва, 1987), на 5-ку Всесоюзноку симпоз1ук1 "Ф1310Л0ПЯ кед1атор1в' (Казань, 1984), на I, IX, 1 III Всесоюзних конференц1ях ш нейронауках (Ки1в, 1986, isas, 1990), на 8-му Шжнародномз б!оф1зичнону конгрес1 (Бр1сголь/Великобритан1я, 1984), на 14-i Иор!чн1й конференцИ Европейсько! асоц1ац11 нейронау! (Кембркдж/Великобриган1я, 1991), на М1жнародн1й конфбренц 11 пс нейронауках "К канал 1 нейрональн! иахан1зни*' (Шатуа д( ♦ 1лер8аль/Фравд1я, 1991), на 16-й нвйроб1олог1чн1й конференцИ "Кальшй 1 внутр1шньокл1тинна скгнал1за«1я" (Г1ф Сюр 1ввт/ Франц1я, 1991), на 3-й ЗусгрШ! Свропейського нвйролоПчногс товархства (Лозана/Швейцар1я, 199Z), на 15-й Щор1чн1й конференцИ Свропейсько! асоц1ац11 нейронаук (Нюкхен/Н1иеччина, 1992), на науковкх сем1 нарах 1нст*туту ф1з1олог11 1м. 0.0. Богонольця Af Укра1ня та 1н. . .

Структура та об'ем роботн. Дисертац!я вякладена на 271 стор1нках кашянописного тексту 1 складаеться 1з вступу, огляд) ливратуря (з розд!лн), опясу методик дослщжень, експерямвнталько! частиня 1 обговорення результат 1 в (4 розд1ля), заключно! частиня 1 вясковк1в. Б1бя!ограф1чний покажчяк включас

14 джерел. Робота I лпсгроваяа 71 маяюнком.

ОЕ'еКТИ I КЕТОДИ ДОСШДЖЕНЬ

Досл1дження акконан1 на на1дентиф1коваких 1зольованих [ервових кл1тинах колюск1в Helix pomatia, на клонованих кл1тинах |ейробластоии (NIE 115), феохроноцигони (РС12) 1 на культивованих :ейроиах г1поканпу однодеиних щур1в.

Енспериментальи1 дак1, що стосуються досл1джень механ1зм1в

2+

11 зовн1шньокл1тинних 1ой1в Ca на какали кал1свого затриманого

2+

их1дного струну t внутр1шныжл1тинних 1сн1в Ca на

исокопорогов1 потешЦал-керован! кальц1св1 какали виконан! на в1денткф1кованих, 1зольованих нервових кл1тинах центрально1 ервово! систем» {навкологортанне к!льце ганглПв) виноградного ликака Helix poraatia. Експериненти по вивченню рол1 отенц1ал-керованях кальц1свих струм!в у процесах кл1тинно1 иференц1йовки 1 росту нвйрит1в, а також з'ясування кехан1зму д11 роматичних а«1нокнслот на високопорогов1 кальц1ев1 канали роводялисъ на клИинах мишачо! нейробластоми (л1н1я C13D0, клон 1Е-115) 1 клИинах фвохромоиитоки РС12. Дасл1джвння зк1н отенц1ал-кероЕа!юго калыЦевого транспорту, викликаних эрушеннямя обм1ну ароматичннх ак1ноклслот у козку, що характера! гся фен1лкетонур11, проводились на культивованих нейрснах [покаипу однодеиних щур!в. Б1ох1н1чн1 зм1ни у мозку

звонароджених иур1в, що характерн1 для феи1лкетонурХ1, створювали » методикою Aokl 1 Siegel (1970). Новонароджен! кури вм1щувались термостат з температурою 30i2 °С на 30 хв. В1дтак досл1пиик ?аринак уводили 1нтраперитояеально Ь-фен1лалан1н, розчинений у 42% NaCl (1 г на 1 кг ваги тварини). Коктрольним тваринан 1'скуваля екв1валентний об'ен 0,9% flaCl. П1сля Хн'екц11, тварин >верталя у термостат 1 вбивали через 160 хв. перебування у ньону.

Bel експериненти на 1зольованих нейронах молюск1в Helix >aatia були зиконан! за допоногою методу внутр1шньокл1тинно! >рфуз11 1 Ф1ксац11 мембранного потенц1алу (Kostyuk, Krishtal, is4) . В1дводення мембранного Потенц1алу 1 пропускания щяризуючого струму заоротнього зв'язку п1дсилювача ф1ксац11 дбувалось через сп1льняй електрод (хлорований ср1бний др1т), галученяй через заповнену KCl (изеиченяй розчин) енк1сть з

!-1609к

внутр1шньокл1тинник перфузуючим розчином. Вин1рювання

трансменбраникк 1онних струк1в проводила по методу потекц1йного заземления зовн1шньокл1тинного розчину шляхом пХд'сднання сполученого з нин хлор-ср1бного електроду до входу перетворювача струи- напруга.

Використовувалась електронна кокпэнсац1я посл!довного опору.

Шдсилений сигнал 1онного струну подавався кз вх1д аналогово-цифрового перетворювача НТА-1024 (Угорщина) 1 у цифровому вигляд! записувався у пак'ять цього приладу. Еик1сн1 струки, а також можлив1 неточност! аналогово! компенсацП струму зб!гу вилучалксь за допокогою дифрово1 сумацп струмових в1дпов1дой на р1вн1 за величиною до- 1 г1порполяризуюч1 зк1щання квкбранного потевд1алу. Для акал1зу викоркстовувались лише разультати, отринан! на кл1тинах, у яких величина струну зб!гу залишалась стац1онарною у доел1джуванкону д1апазон! трквалостей 1 ампл1туд тестуючих зк1щакь мембранного потенц1алу.

Головникк кат1онаки у розчинах для внутр1шньокл!тиино1 перфузП були Тр1с+ 1 К+у випадку досл1джень кал1свих вих1дних струи1в .1 Тр1с+ при досл1 датннях потенц1ал-керованих кальц1ев*х канал1в. Головними ан1онами були у. Нортону випадку 1 аспартат" У другому. НолярнЮть розчин1в складала 135 хМ, значения рН - 7,3. Эм1на 1одного складу розчик1в проводилась за рахунок усунэння ека1валентно1 к1лькост1 головних компонента. Контролький зобн1шньокл1тишшй розчин складався: СаС12 (1-20 нН) 1 тр!с-НС1. Сунарка молярШсть розчкну складала 130 мМ. Значения рН дор1внввало 7,4. Як 1 у випадку внутр1шньокл1тиннях розчкн1в, зк1на складу зовн1шньокл1тиншх розчин1в виконувалась зан1ною ока 1 валентно! к1лькост1 тр1с-ИС1.

Ко1щептрац1ю 1он1в кальц1ю у розчинах для виутр1шньокл1тинно1 перфузП вик1рпвалк за допоногою Са-селонтивного електроду {'Чнгол", Австр1я). Кал1бровочна "крива, побудована по вим1ряних значениях потенц1алу електроду пря розтаауванн1 його у розчинах з ф1ксованнни коицентрац1ями в!льного кальц1ю, нала нахил 29 мВ у област1 концентрац1й ю"2-10~6 Н 1 приблизно ю нБ при десятккратн1й зк1н1 у б1к мешиих концентрац1й са2+.

Вим1ряна за допомогою Са-селекгивного электроду концентрац!я

24-

Са у контрольному внутр1шньокл1тинному роэчкн! (130 КН тр1с-аспартату) складала Ю-5 М. При наявносг! у розчин! 2-Зх10"3

- б -

теоф1л1ку актявя1сть Са2+ складаяа 9i2x icT6 H; 2xio~3 К AT« 2 +

игасував концентрац1ю Ca б1ля двох раз1в. Розчин у який було здано 2х10_3 И АТФ I Ю-3 К СаС!^ мав пркблизно 2, Зхю"4 H са2+.

Bel експериненти на кл!тинах ссавц1в були виконан! за эпомогою методу роПстрацП струн1в в1д ц1ло! клИини (Hamill et l., 1931). Склян1 ШкропШетки виготовлялись 1з мол1бденового <ла 1 нали onlp 2-3 ион п1сля заповноння штучним иутр1шньокл1тинним розчином.

Цей метод дозволяе ефективно контролювати 1онний склад нутр1тньокл1тинного середовища, а також проводит» 1н'екц1ю р1зних эсл1дауваних речовин. До його вад потр1бно в1днести неможливють 1гаторазово1 зн1ни 8нутр1шньол1пэткоэого розчину, що дозволяло б зр1вкювати досл1джуван1 зн1ни з контролен. Для можливого эр1вняння на одн!й 1 т1й же кл1тин1 зм1н 1онних струн1в. ккликаних внутр1пшьокл1тиннхм введениям досл1джуваних речовин, з энтрольнин значениям струну була разроблона система, до дозволяе тнювати склад розчину у склян1й п1петц1 п1д час окспериконту. ззитивний тиск, створюваний за допоногою н1крогвинта у введвному м1кропШвтку кап1ляр1, виахтевхував розчин з тестуючою речовяною к1нчик ni потки. Кап1ляр м!г бути розташований на в1дстан1 вк1лькох ДВСЯТК1В м1крон в1д к1нчика П1П6ТКИ, що дозволяло досить видко 1 ефективно зм1нювати склад перфузуючого розчину.

Контрольн1 розчини для bclx тип1в кл1т и н ссавц1в булк цнаковими. Розчин, якик заповнпвалась скляка м1кроп1петка (розчин пя внутр1шньокл1тинно1 перфузП), нав (кН): CsCl-100, ЕГТА-5, а2АТФ-2, ИдС12-3, ЦАНФ-0,01, ГТФ-1, HEPES-20; рН 7,3. Кл1тини на окрявяону скл! 1з шаром пол1-11-л1зину, колагену або чистому ом1щаяись у експериментальну камеру заповнону розчином такого кладу (у мМ) : HaCl-110, СаС12~20, MgCl2-l,5, HEPES-5, глюкоза -5, тетродотоксин (ТТХ) - 0,003; рН 7,3. Зк1на склад1в зовнШньо-внутр1шньокл1тиного розчии1в проводилась шляхом зан1ни кв1валентно1 «1лькост1 NaCl 1 CsCl на досл1даувану речовину.

Електрнчна частина методу була реал!зована на баз1 1дсилювача РОК-ЗМ (Москва). Сигнал траасмекбранного Юнного груку подавався на вх!д аналогово-цнфрового порвтворювача эрсонально! ЕОМ СМ-1914 1 у цифровому вигляд1 записувався у 1К'ять цього припаду. Дал1 запис ножна було в1дтворити як на «спяв! БОН, так 1 на папер! за допомогою друкуючого пристрою.

>*-160Эк,

Важливим аспектом експлуатацИ пврсонально1 ЕОИ було викоркеташ II як програкованогр стимулятора, генеруючого 1кпульси потевШад необх1дно! амплИуди та форма у заданШ посл1довност1. I дозволяло проводит» електрхчнц витрювання у автоматичному режин. 3 ц1ею иатсю було розроблеко пакет програн для керуваш комплексом апарагури 1 натвхатично! обробки результат1в.

Bel експеркнекти виконан1 при к1ккатн11 температур! (+20 + !

°с).

РЕЗУЛЬТАТИ Д0СЛ1ДЖЕЩ. ТА ÏX ОБГОВОРЕННЯ

3

1. Досл1 даеняя-мвхан1зму д11 зовнШньокл1ткншос !он1в Са ка каШсакй затряхашсК вкх1днкй струм..

1.1 Д1я 1он!в Са 1 блокатор!в кальц1еввх какал!в с потовд1ал-керований кал1свив затриманий вих1дний струи.

Деполяркзац1я нанбракк (Vfc) 1зольовавнх нейрон!вколюск1 Helix pomatia до -30 хВ в!д Шдтрикуючого потеши алу (V^) • -SO м 1ндукувала i розвиток калыд1свого вх1дкого I кая1свог

вих1 дного струм1в (Хк)- 1з зб1лыяеняяк деполяризацП кал1свн струк ставав дон1куючкх. Вих1диий струи шгидко эростав д максимального значения 1 дал! повШьно зб1льшувався на протяз Шдтрикуючо! деполяризацП. Вольт-амперна характеристика кал1свог вих1дного струму, яобудована за зкаченняня струну в к1нц 1нпульсу, кала М-под1бну форму. Введения ЕГТА у кл1тяну виклккал пригн1чення доагстриваючого. компоненту вих1дного струму, 1, я результат цього, зкикалз Н-под!бна область вольт-анперно характеристики. Шковий (1нактивуючийся). конпонент катевог вих1дного струну, на в1дк1ну в1д пов1льно зроставчого, повн1ст: збер1гався у ЕГТА-перфузован!й (10 нН) кл1тин1.

Перфуз1я нейрону розчинаки, то м!стили f (47 мМ) як головки: ан!бн, !ндукувала так! ж зм1ни у каШсвому внх1дному струм1, як введения ЕГТА. •

1нактивуючийся компонент кал1свого затримакого вях1дноп струму, який зпдно з вищенаведеними данями, не иригн!чустьс; внасЩдок вилучення Са 1з внутр!шньокл1тинного розчяку, бу| об'скток подальшогр досл1дасення. У вс!х наступних екслерякентах.

Ik спец1ально застережених випадк1в, розчини для

нутр1шньокл1тинно1 лерфузП м1стили ЕГГА (10 KM), TplC-F (47 мМ),

С1 (50 кМ). теоф!л!н (3 MM), 1 тр1с-ОН (20 кН), рН 7.3. Головний

овн1шньокл1тннний розчин складався 1з S мМ СаС12 1 120 мМ

piС-НС1, рН 7.4. Вихористаияя роэчиШв такого складу сгворювало

кови для рег1страц11 потенц!ал-керованого кал1еого затриканого

кх1дного струну у практично чистому вкгляд1. Як видно з малюнку

, ампл1туда 1нактквуючогося компоненту кал1свого затриканого

кх1дного струну зб1льшуваласъ 1з зб1льиенняк зовн1шньокл1тинно1 2+

онцентрацИ Са . При цьону спостер1Гався переважний р1ст

1кового значения струну пор1вняно з величиною струму у к1нц1

эполяризуючого зн1щ0ння мембранного потенц1алу. Анал1з

эльт-амперно! характеристики струму, потенц!Кованого niдвищеннян

2+

эвн1шньокл1тинно1 ковдентрацП Са в1д 1 до 10 мм, показуе, що

айб1льш ефективний р1ст кал1свого струну п1д впливон 1он1в

1льц1ю иав м1сце у област1 тестуючих потенц1ал1в в1д -10 до

20-+30 нВ; при б1льш високкх спостер1галось спов1льнвння росту

груну. По Klpl зб1льшення ампл1туди 1нактивуючогося компоненту

1л1свого струму з ni двищеннян зовн!шньокл1тинно! концентрацН

зн1в кальц1ю прискорювалась його 1нактивац1я на фон1. Шдтринуючо!

2+

зполяризац11. Зниження зовн1шньокл1тинно1 концентрацН 1он1в Са -3 -4

з 10 -10 Н, поряд 1з зненшенняк акшИтуди викликало практично звне пригн1чення 1нактивуючогося компоненту кал1свого затриканого 1Х1дного струму. В межах доел!джуваних низьких зовн1шньокл1тинних

2+* — А

5йцентрац1й Юн1в Са (до 10 М) не споствр1галось зб1льшення сруку зб1гу, що було описанэ у робот1 Armstrong 1 Lodge-Barneo 1987).

Д1я loiilB кальц1ю на доел!джуваний струн була оборотной 1

>звивалась значно пов1льн1ше (>S кин. ) пор1вняно 1з швидк1стю

IKlHÜ зовн1шньокл1тннного розчину (<1 хв. ). Зк1на

>вн1иньокл1тинно1 концентрацН Юн1в кальцио виразно проявлялась

¡льки на акпл1туд1 струму 1 його спад! на протяз1 тестуючого

Ццення мембранного погенц1алу; пок1тного зн1щення вольт-амперно!

фактеристики струму чи криво! стац1онарно! 1нактявац11 по ocl

>тенц1ал1в не спостер1галось. Ц1 результата сп1впадають з данини

плих автор 1 в про незначний вплив зовн1шньокл1тинних двовалентних

iTloHlB на через вплив на яоверхневнй заряд меибрани (Gilly,

•astrong, 1982а, b; Grissner, Cahalan, 1939; Tsuda et al., 1983).

2+ o+ ' 2+

H1 один 1з 1нших двовалонтлих кат1он!в (Co , Cd , Ea ,

-lGODx

Ид2*) не чинив дИ на кал1свий канал, аналоПчно! д11 1он1 кальц!ю. В заложкосп в1д ф1зичних властивостей даних кат!он1в як! визначаютъ силу зв'язуэання 1х з кат1он-зв'язуючою групою вони з р!зною ефективн1стю прягн1чували потенц1алткеровани

А

5 1 «1

Б

[ -20-10 9 19 г» М 44

I

ы -»-И • и Ш ЗС и «

шУ п>У

на кал1свх

2+

Нал. 1. Ефект зовн1шньокл1тинних 1он1в Са затримаиий вкх1дний струи.

(А) Записи струм1в, зарвестрованих при показаних на нал гост-зщщоннях кекбранного погенц1алу; (б) в1дпов1д1: вольт-амперн! характеристики кал1свого струну (зл1ва), вольт-акперна характеристика 1„, то в1дображае зи1ну струну пр

24-

П1двищаин1 зовн1шиьокл1тннно1 ковдантраП Са в1д 1 до 10 > (справа). Концентрация 1он1в Са у зовн1шньокл1тиннону розчи» показана на малюнку, у нМ. -50 мВ.

кал1свий вих1дний струи. Форма вольт-анперно! характерист«

кал1евого вих1дного струну, заблокованого данкки двовалентни»

кат1онани, була блкзькою до форма ВАХ I , потенц1йовано! 2+

1онани Са (нал. 1Б).

0трикан1 результат» дали п1дставу зробити висновок, що д! двовалентних кат1он1в на кал1евий затринаний вих1дний стр)

дбуваеться не через вплкв на поверхкввкй заряд нейрокально! мбрани, а с результатом б1льш тонного впливу на процеси, ■в'язан! з функцЮнуванням даних канал1в.

Рецептором зв'язування 1он1в кальц1га у багатьох б1олог1чних

юцесах, у току числ! зв'язаних з транспортом кат1он1в, являсться

>лекула кальмодул1ну. Шдтверда.енняк цього с результат« ряду

61т, що. показують ножлив1сть пригн1чення потэнц1ал-залежного 2+

:оду IohIb Са {Sand et al.,1983; Hennessy, Kung, 1984), а також юсередкованих ник кл1тинних функц1й (clapham, Noher, 1984) при вн1шньокл1тинкому прикладенн! речовин, здатних блокувати .льмодул1н-запажн1 процеси (1нг1б1тор1з калькодул1ну). На ольованих внутр1шньокл1тиино-перфузованих нейронах молюск1в нами ло ран1шэ показано, що 1нг1б1тори калькодулину здатн! зм1к»вати тенц1ал-залежну кальц1еву пров1дн1сть при апл1кац11 1х до вн1шньо! поверхн1 сокатячно! мембрани. Ця д1я проявлялась у 1льшенн1 калъШевого струму при низьких концентрац1ях речовин I го пригн1ченн1 при п1двищенн1 останн1х (Мартышок, Дорошенко, 36; Doroshenko et al., 1988). Результати отрикан1 у дан1й робот! зволяють думатя, до кальц1й-зв'язуюча трупа, що опосередковуе ю двовалонтних кат1он1в на канали кал!свого затриманого х1дного струну В1др1знясгься в1д под1бно1 у кальщсвих каналах му, до блокатори кальмодул1ну не викликали зм1н I,, . Иоправда,

л

явилось, що блокатори потенЩал-керованих калыцевих канал1в

:1федип1н 1 верапам1л) достатньо ефективно пригн1чували ш:х1дний

рук через потенц!ал-керован1 кал1св1 канали. При цьону д1я

рапам1лу на Х„ посилювалась 1з зб1льшенням зовн1шньокл1тинно1 2+

нцентрацП 1он1в Са (нал. 2). ВерапаШл не т1льки знижував ксимальну ампл1туду струну, але й значно прискорював його спад фон1 п1дтринуючо1 деполяризац1I мембрани, При наявкост1 рапак1лу у зовн1шньокл1тинному розчин1 час половинного спаду руку скорочувався в1д 69 до 23 мс.

Потенц1ал-кероваиий кал1евий затриманий вих1дни8 струм був тливим не т1льки до блокатор1в калыНсвих канал1в, ало й 1нювався у в1дпов1дь на прикладення 1х агон1ст!в. Д1я BAY К Я644 О цН) на 1к нала складний характер: поряд 1з зб1лызеннян пл1туди струну посилювалась його 1нактявац1я на фон1 дтринуючо! дополярхзац11. 0станн1й параметр був б!льш чутливим прикладання агок1сту, н1ж зм1яа ампл1туди струму (в середньому пя 7Х}. На деяких кл1тянах зм!ни акпл1туди струму у в1дпов1дь на

прикладання BAY К не в1дбувалось, однак пом1тно посилювалась iSoi 1нактивац1я на протяз! тестуючого зиНдення нембранно!

потенц!алу.

Нал. 2. Д1я верапаи1лу2 на кал1евий затриианнЯ "Вих1днкй стрз при р1зккх концентрац1ях Са у зовн1шньокл1тиннону розчин1.

Д1аграиа показус плоду п1д кривою заблокованого струму nicj додання до зовн1шиъокл1тинного розчину 10 И верапан1лу. Величя] струну у контрол1 в!дпов1дае 100 X. Концентрация 1он1в кальц1с зовн1ишьокл1тинноку розчин1 показана на калюнку (ММ). На встав1 приведений приклад кривих кал1евого струму: верхня крива контроль, нижня - п1сля приклад<шня верапак1лу. Е1ля в!дпо81дн) кривих показана кокцентращя Са у зовн1шньокл1тинкону розчн! (кН). Vfa= -50 ИВ. +30 кВ.

Вицввикладен! • результата дозволили зробнтн вхеновок nj

наявн1сть високоспациф1чно1 Са-зв'язуючо1 д1лянкн у нэврональн!

номбран1, цо опосорвдковус вплив двовалентних кат1он1в на кана)

2+

кал1евого затриканого вих1диого струну. Зв'язування Са з Ц1( д1лянкою с необх1днов уковоо функц1онування даних канал 11 Вилучоння Са 1з зовн1шньокл1тинного розчнну або прикладаш кальц!свих блокатор!в викликас прхгн1чення затрхманого кал1сво]

1КТ*вуючогося вях1дного струму у соиаткчн!й нембран1 :л1джуванхх нейрон1в.

Спецяф1чиа роль зови1шш>окл1тянних 1он1в кальц1ю у дтриханн1 функц1онування потащЦал-керованях кал1еаих ,канал1в у далыпоку булл' продвконстрована пря досл1дженн! кал!сво! оз1дност1 у аксон! кальиара, Г л1нфоцятах людини (Armstrong, pez-Barneo, 1987} Armstrong, Miller, 1990? Grissner, Cahalan, B9}r а такоя у нейронах холюсх1в Helix (Tsuda et al., 1988).

1.2. Д1я зовн1шнъокл1т*нних loHlB К+ на кал!свкй затряманяй 8кх1дкя1 струн.

7 наших екслвриментах було показано, до додання до 1ЭКая1С90Г0 ЗОВН1ЕГКЬОКЛ1ТЯННОГО розчину lOHlB К+ приводить до Ялыпвння акпп1тудх кал!еэого вяхЩного струну, нвзважаючи на те, i в1дпов1дняй електрох1н1чннй потенц!ал пр* цьоку зкеншуеться. юичення ефекту кало н1сце пр* кокцзктрад!ях 1оя1в К+ у >вн1шньокл1тяннону роэчнн1 б1ля 20 кМ (внутршньокл1тинна

JL

знцантраШя К 50 КМ). Д1я 1он1зованого кап! в була оборотном 1 шл!туда струку энензуэаяась пр* вялученш кал1ю 1з :вн1шньокл1тинного середовкща. Д1я зовн1шньокл1тинних Iohib к+ появлялась т!лькя на потонц1ал-керованоиу кал!сзсну затряманону гх!дяону ctpyxl. Характерное рясо» цього струн у с наявнють нактяввцП ка протяз1 Шдтрянуючо! деполяризаци 1 надзвичайно ов1льне його в1дновленнл п1сля реполяркзацИ ненбрани. Для оловянного В1ДН0ВЛЭВНЯ акпл1туда 1нактивованого струну було отр1бно, що5 час н!ж анЩвяяяня порэвищував 40 с (перша д!аграна) мал. 3). З'ясувалось, що додання до безкал1свого оан1шньокл1тннного розчину 1он1в кал!» никликало значне пов1яькеннд "швядкого" конпоявнт? спаду струку (^ зи1!говалось 1д 60 не у бвзиаШевону розчян1 до 167 не у розчин1, що н1стив к+ 10 кН)>. Поряд 13 спов1льнэннян 1 нактнвад11 струку скорочувався ос, необх1дкий для в1дновленн* струку в наел 1 док реполяризацн енбрани. Як вядно на цъону иалюнху, час половинного в1дновлення на.кт«вованого прв1нпуяьсох струну у розчян1, що и1стхв Ю+ :корочуэаася до 7 с (у безкыисвому розчжи1 40 с). 0писан1 эн1нн у кактиващйних процаеах Шконого конпонэяту кал1евого вих!дяого :труиу п1Д впяявои зовн1шньокл!гвнних Iohib к+ иожуть бут»

1-1009*

причиною эгадуианого в ища аб1льтекня амшПтудх Для перев!г цього лрнпущення булк проведен! спец1альн1 експерххентх, п!д ч яккх вжм!рввався ступ1нь 1нактхвацП струку, 1нактжвованс попередк1н зн1щвннян кэхбранного потешЦалу протяжи1ст*> р1в* чесу эроствнкж струму до хакммуну (-10 хс). КондхцЮну*

А В

Кал. 3. Д1я завн1шнкокл1тикних 1он1в К на погевд1а кероваыкК кал1евий затриманхй вхх1днив струк.

(А) Схема досл1д1в (два посл1довнхх зкщення кекбранно потвнц1алу з р1знхкк I нтервалакк м1ж никх), а також крив1 струк1 эаресстрован! у безкал1свому (X) 1 у К-м1сткону (5 К зовн1шкьокл 1 тикних розчинах (2). Час х1к зх1щенняих 10 е. (I Д1аграна, яка показуе в!дновлення струку у в1дпов1дь + реполярязац1ю иекбранж у час1 при р1зн*х концентпац1ях 1он1а К зовн1шньокл1тинному роэчявХ. Концентрация 1он1в К дасться ва на. По ос1 абсцнс - час, ко в1дпов1дас Штервалу н1ж зн1щевня: мембранного погеюЦалу; по ос! ордхват - норковане значен в1дковленого струку що 1нактивувався п!д «ас першого тост-зн1иен: мембранного потекщалу. За ЮОХ взята - велячхна струму, I 1нактжвувався п1д час першого зк1вдэння менбранного потенЩал; Приймалось, по величина струку у х1нц! першого дэполяржзуючо: змИденкя в1 дображас к1льк1сть иеХнахтхвовавхх канал1в. В1дн1каю< ц» величину в1д Щкових значень струку, викпкканкх пэршяи наступили зк!щаннякх, отримувалж в1длов1дно . величж! 1нактивованого 1 в1дновлеиого струн!в. V. - -50 кВ, ЧЛ- +40 кВ.

гкИцекня некбранного потенЩалу протяжи!стю 10 кс зиеншувш ампл1туду струку " на 25*, що складас прхблхзно Т8Х вс1< 1нахтхвац11 на протяз1 160 не . Це оэначас, що значка частя) канал! в 1иактквукчогося . затрхианого кал!евого В«х! дного стру)

- и -

да Шактивована вяе п1спя досягнаняя п1кового значения струму, а ксхмальна ампл1туда заресстрованого струму буде значно кенъша X яка б капа к1сцв у раз! в1дсутност! 1нактхвац11. Послабления актявацИ канал1в затриканого кап1свого вхх1дного струну п1д :лявон К+ 1 прхводхть до зб1льшення анпл1тудк струну.

Вкявилось, що нодхф1коц1я верапан1пом спаду на протяз!

дтринуючо1 деполяркзацн (див. стор. 9 ) приводила до того, до .ступне п1двищеиня концентрацН !он!в К+ у зовн1шнъокл1тиннону 13чин1 (siд S до 20 кН) не справляло впляву на 1нактивац1йн1 юцесх у кал 1 свих каналах.

Надал1 аналоПчкхЗ ефект зовн1шньбкл1тннних 1он1в К+ був жазанвй на Т-л1нфсцитах людини (Crissmer, Cahalan, 19Э9) 1 Птел1альних кл1т«нах щур1в (DeCoursey, 1990).

Опхсана д!я зовн1шньокл1гянних 1он1в К* на знаходиться у 1дпов1дност1 з данями Олдр!ча i сп1вр. (19S9; 1990а, б; 1991) про зяекуляря1 мохатзи* 1нактхвацП потвнц!ал-керованих кал 1 свих 1нал1в. Ц1 автора показал», цо за 1нактхвац!ю этенц1ая-керованого кал1свого каналу в1дпов!дас частина с)Л1пептядного ланцюга канального б1лку, яка знаходиться б1ля пазматично! поверхн1 мекбранх 1 у б1льпост1 вкпадк1в заряджена озитявно ' (К-терм1наль). Електростатачна в!дштовхування Ml* озитивно эаряджвнхн Н-докеком I !оном К буде вхкликатя пов1льнення 1нактивацН струму 1, в1дпов1дно, зб1льаення його нпл1туди. ТакяЯ вплив зовн1вшьокл1?яннях 1он!в К+ на нактивац1Вний домен кожпявий лише при уков1 1х дн на в1дкритий анал. В1двернення д11 зовн1шкьокл1тинних 1он1в К+ на кал1евкй трун верапан1лок, а також характер гтригШчення цим блокаторок труку. св1дчать про внутрХпньоканальну локал1зац!ю д1лянки в'язування для дакого агента, тобто його ефект можливкй при Ков1, що канал знаходиться у в1дкрхтону стан!. Як вже було 1дзначено, Шдвшцення зовн1аньокл1тхнно! концентрацН Са2+ поряд з зб1лыаанняк ампл1туди зб1лыпуе ефектившсть блокуючо! д11 ерапам1лу на цей струм. Це дае л!дстави вважати, до у результат!-|1двищеиня зовн1шньокл1тинно1 концентрацН Са2+ зб1льшусться час |1дкрнтого стану калювих канал1в - зв1дси зб1льшення ампв1тудх :труму, п1двищения ефактнвност! блокування струну верапак1лом 1 юсилвння його 1нактивацП (т1лькх в1дкритий канал коже яактивуваткся).

Виявленяй ефект зовн1шньокл!тинних 1он1в кал!ю можна

• !х_!в09к

розглядати як одни 1з нехан!зк1в регуляц!! функцЮнування какал кал1евого эатрикакого струну, котрий коже кат* важлх: ф1зЮлопчнэ значения для орган1зи1в, у якхх мавть к!еде зкач: колявання Юнного складу зови1пшьокл!т)шного середовища. .

1.3. Кетабол1чна обуновлеШсть функцЮнування канал калювого затриканого вхх1дного струну.

Нами отримаио ряд данях, що св1дчать про залежн1ет

функцЮнування канал1в кал!свого затркианого вкх1дного струму

кекбран1 нервових кл1тин колюск!в в1д внутр1шньокл1тиннкх 0бк1НН]

процес1в. 1кактквуючийся затриханий калювкй в*х1дний стр;

зкеншувався по Klpl перфузП нейрону штучник солякик розчиноз

(контрольний розчхн). Слов1льнжти спад величины струну можно 6yi

2+

шляхом введения у вкутр1шньокл1тинни8 розчхн АТФ (2 кН) 1 Hg I

НИ). В окремих випадках у результат 1 ulcl процедура спостер1гало(

нав1ть деякв в1дновлення акпл!тудх струку. Найб1лыв ефектхвт

засобон в1дверкення сладу струку у ход! внутр1шньокл1г*ннс

перфузП виявився розчин, що н1стквпроте1нк!назуС (ферхе*

вилучений 1з иозку велико! рогато! худоби, концентрат я 10 нкг/j

2+

акгивнЮть 3 нмоль/иг б!лку), АТФ 1 Ид (мал. 4А).

Пол1м1кскн В (блокатор проте1нк!казк С). введений внутр!шньокл1тянний розчин, пригн1чував 1нактивуючийся коипонег халЮвого вих1дного струму, (кал. 4Б).

На п!дстав1 наведених результат!в, хожна зробитж висновок, в важлявим факторон, що ходутое фуккцЮиальний ста потенЩал-керованих кал1евих капал! в, являеться фосфориловавд канальних б!лк1в проте1нк1назох> с. Найб1льш йн0в1рняйнехан1э посклення анлл!туди Юного струму, 1ндукованого фосфорхлюванняк, зб!льшакня часу vв1дкритого стану каналу. Такхй. хехан!зм бу експерикентально ' п1дтверджений для цАМФ-залежко! :нодуляц1 погекц1ал-керованого кальцЮвого струку (Reuter et al., 1982).

Резуяьтати дако1 роботи вказують на ножливе зб1льшення час

в[дкритого стану халЮвнх канал 1 в п!д вплявон зовн1шньокл1тхннх

2+-

1он1и Ca - гаке к, як у в1дпов!дь на виутр1шньокл1тхнне введен» проте!нк1нази С. В1доно, що для актяаацп проте1нк1назх С поряд 1 д!ацилгл!церолок 1 фосфатид!лсерином иеобх!дна наявн!сть Юн!

12+ (Ерапй et а1., 1991). Вилучення 1он1в Са24" 1э >вн1шш>окл1?икного середовища чи пригн1чення активност!

Л

1Ю

1к

г*

«9

49 Н

ГГНП

к г»

и

%

7

'Д/ Г

1 / , /

- - Г Г - *

Мал. 4. Ефект внутр1шньокл1тияяого введения проте1нк1назя С ) 1 пол1н1ксина В (Б) на кал!свий затринаний вих1дний струн.

Пврфуздя неброну контрольная розчинок (квадрати) 1 таких же зчянои, то к1 стив 10 № проте1нк1нази С чи 100 ¿¡М лол1н1ксину В руЖКИ). МОКОНТ* ЭН1НХ . ВНутр1ШНЬ0КЛ1ТИНКЯХ РОЗЧЯН1В В1ДК1Ч0Н! р1лочкани. На вставц1 приведен! характерн1 записи струн!в. По 1 абсцяс - час експериненту; по ос1 ординат - норнована по дношакн» до початкового значения аипд1туда. кал!свого струну.

отеПж1назя С супроводжувалось аналог1чнин пригнХченняк

-1609* .

1нактивуючогося компоненту кал1свого затркманого внх!дного стру> • 2+ Все разок сказано дозволяе зробкти висновок, що д1я 1он1в Са

доел!джуваний канал опосередковуетъся через актива!

2+

проте1нк!нази С. Под1бний ефект 1он1в Са на потекц1ал-керова1

затриманий кал!евкй струм, опоервдкований через актива*

проте1нк1нази С, недавно показаний на нейронах Xenoj

(Desarraenien, Spitzer, 1991).

Наведен1 у дангй робот! фактк дозволяють розглядати Kai

кал1свого затриканого вих1дного струну як складну структуру,

мае баготоступ1нчату систему регуляцП: 1) зн1на кембраннс

потекц!алу; 2) проникаюч1 1онн К+; 3) зовн1шнъокл1тинн1 1они Са'

4) внутр1шнъокл1гинн1 обк1нн1 процеси. Наявн1сть тако! склад!

регуляторно! систеки активност! кал1свих канал1в робить Ix гвуч:

днкак1чною системою, то дозволяе модиф1кувати свою актиаШстъ

урахуванняк змХныючкхся, умов функц1онування нервово! клХтвкя.

2+

Внявлений нами ефект зоен1шньокл1т*шшх JohIb Ca ка

спостер1гаеться у к1л1колярнону д1апазон1. Показано,, що у Tai

межах зм1нюсться кокцонтрац!я 1он1в кальц1ю у гемол1нф1 когазс!

ка прогяз1 року (Сорокина, Зеленская, 1965). Тому, наявнХс

2+

модулюючо! д11 IohIb Ca на кал1сву пров1дн1сть мае важл]

ф1з1олог1чна значения для таких орган!зн1в. П1двнще1

2+

зовн1шньокл1тинно1 концентрацИ Са приведа до наступш

зб1льшення входу кальц1в у кл1тину п1д час потенц!алу д11 че|

иотенц1ал-керован1 кальц1св1 канали. Одночасна ж noTSHUlai

кал!свого затркманого вих1дного струму п1д впливом Шдвище!

2+

зовн1шньокл1тинко1 концентрацИ Са ноже розглядатися

захисняй нехан!зк, спрямованкй на в1двернення надк1рного ро< внутр!шньокл1тинного р1вня вХльного калмЦю, що генеруст! потенц!ал-керованими нальц1свими каналами. У цьому в1дноше! канали кал1свого затринаиого вих1дного струну можутъ розглядат! як одна 1з ланок системк регуляцП величин» потенц1ал-керован< кальц1свого сигналу.

1нший, б1льш розповсюдженкй, нехан1зм регуляцП велит потенц1ал-корованого кальЩевого сигналу буде розглядатися наступноку розд!л1.

2. Досл1даення нсхан1зку дп внутр1шт>окл1тинких 1он1в са2+ на потещ1ал-керований кальц1евий струм нейронально! мекбраня.

Експернмеятя по вявченюо механ1зку д11 внутр1шньокл1тинних н1в малый о на калыиевяй вх1дний струн буля проведен1 при дтримуючому менбранноку потенц1ал1 -50 кВ. При таких значениях кбрашгого потенц1алу низькопорогов1 канали практично повн1стю актявован1, 1 моясе бути активований лише високопороговий мпонент кальц1евого струму. Ефект внутр1пньокл1тннних 1он1в льц1ю на високопороговяй кальц1евий струи у нейронах колвск1в ¡Их рота^а 1 був предметом досл1 джеиня, результати якого водяться у цьоку розд1л1.

Досл1джешгя мезсая1зя1в цього явяца показало, що змедаення

титула кальц1свого вх1дного струму у процес1 перфузИ нейрону

учним соляним розчянох вХдбувасться б1лыа пов1льно, н1ж зам1на

¡утр 1шньокл1 тинного перфузуачого роз чину. У данях экспериментах

'ЗЧИН ДЛЯ Внутр1шньокл1тинно1 перфузИ М1СТИ8 130 ки

>1с-аспартату 1 на кав ЕГТА. Концентрат я в!льного кальц1ю у

ккх розчннах, вкк1ряка за допомогою Са-селективного елоктроду, -5

ладала -10 Н. Додання до внутр1шньокл1тинного перфузуючого

-4

13чину (130 мМ тр1с-аспартату) 5x10 К Сас12 приводило до б1льш ¡идкого спаду их 1 дно г о струму 1ои1в кальц1ю.

Спад струму у гроцес1 перфузИ нейрону стандартиин розчикок, таконс розчинон э п1двщеною концентрацию в1льного кальц1в лежав 81д температур*. Зияження температура в1д +20 до +6 °с [кликало приблизко трикратие спов1льненкя швидкоси спаду струну [ал. 5А). Ней факт вказуе на наявн1сть эв'язку н1ж знижениям :Льц1сво1 пров1дност1 ва протяз! внутр1шш,окл1тинио1 перфузИ 1 Иное у якихось б1ох1и1чних процесах. Ран1ше нами було показано, > таке вимивання струму пов'язанв з порушеннями у ход1 д1ал1зу ¡Крону внутр1шньокл1тииних цАМФ-залежних процес1в: додання до ,ал1зуючого розчнну екзогвиого цикл1чного АМФ або катал1тично! гбодиниШ протв1нк1нази А разом з АГФ 1 МдС12 пом1тно ■аб1п1зувало кальЩеву пров1дн1сть меибраяи (СогозЬепко, >styuI:, НагЪупуиК, 1982).

Важливкк фактором, . цо приймас участь у регуляцП системи 5м1ну ЦККЛ1ЧН0Г0 АКФ с 1ояя кальц1ю. 1он1зований кальц1й впливас I актиэшсть практячно'вс1* фериент1в системи обм1ну 3'5'АНФ

'-1609*

(ИоЫзоп еЬ а1., 1971), однак вкзначалъною лайкою у рагуляц внутр1шньокл1тинного р1бня цАНФ с цАМ«>-фосфод1естеразк, I г1дрол1зують цкклШнмй АИФ до адексзккмонофосфату. Активн1сть щ феркеит!в зб1пьшусться з Шдвшценням р!вяя в1лького. кальц1. усередкш кл!тин», котрий опосередковус свою д!ю чер( кальнодул1н. Вс1 ц1 дан1 дозволили нам пркпустктн, що у осноз блокуючо1 дп внутр1пнъокл1тинного кальц1ю на кальц 1 ев1 кана: лежать знижеиня р1вня цикл!чного АНФ у результат! активац! Са-калъмодул1к-залежних цАНФ-фосфод1естераз. Подальша робота б у; направлена на перев!рку цього припущення.

Для отрииания доказ1в того, до цАНФ-фосфод1естеразк беру! участь у опосередкуванн1 бпокуючо! дп внутр!шньокл1тинно1 кальц1ю на потенц1ал-керован1 кальц!ев1 капали ин поставили ря експерикенПв з використанняк специф1чних блокатор1в цх ферненПв.- Теоф!л1н у концентрат! 3 нн ефективно спов1льнк ивидк1сть г1дрол1зу цикл¡много АИФ до аденозиннонофосфат цАМФ-фосфод1естеразанк. Як видно на налюнку 5Б

внутр1шньокл1тинн8 введения теоф1л!ну значно зменшуваяо швкдк1ст ослабления кальц1евого струну у ход! перфузП. Д1я теоф1л1н носила оборотнкй характер, ! п1сля переходу у контрольний розчи спад струку прискорювався. Аналог1чний ефект на зи1ку величин кадмиевого вх1дного струку чинкля к 1нш1 речовкни 1з труп ксантиШв. Однак необх!дно В1дн1титн, що теоф!л1н 1 блкзьк1 йон за х1м1чною будовою речовики, взаенод1ють з цАНФ-фосфод1есгеразах без залучення .у цен процес Са-зв'язуючого центру ферменту.. Тон, б!льы прякими аргументами у перев!рц1 уча.ст1 1он1в Са2+ доел!джуваних процесах були результата !з використанням блокатор1 кальмодул1ну - б1лка, виконуючого роль рецептора Са2+ ; цАМФ-фосфод1естеразах. Додання у перфузуючий розчин блокатор; кальмодул1ну - трифторперазину викликало под1бне теоф!л1н; спов1льнення кальШевого вх1дного струму (мал. 5В). Ефёктквш концвнтраЩя блокатора кальмодул!ну була 10 дМ. що близько Д1 значения концентрата цих речовин, котр1 викликають половин» блокування активност! калькодул1ну. 1денткчна д1я блокатор11

кальиодул1ну 1 блокатор1в цАКФ-фосфод1естераз на с додаткови]

а

св1дченняк на користь того, «о 8нутр1шньокл1тинн1 1они Са впливають на активн1сть кальц1евих канал1в саме через активацИ цАНФ-фосфод1естераз.

1м!дазол, активатор цАМФ-фосфод!естераз, введений з

внутр1шньокп1гкнн*а розчин. тлукував б1лыз швидке, пор1вняко з контролен, зкеншэння струну.

100 %

80 SO 40 20

100 %

80 60 40 20

7

/ 7 7

/ / '

/ / / /

/ / / /

/ ✓ <

/ / f /

/

/ i

В

100 %

80 60 40 20

5 10 15 20 25 30 35

100 %

80 60 40 20

5 10 15 20 25 30 35

5 10 15 20 25 30 35

5 10 15 20 25 30 35

Нал. S. Зм1на акпл1туди високопорогового калыд1евого вх1дного струну у ход! парфуз11 нейрону штучник соляник розчином.

(A) nepml 3 хв. експерииеиту нейрон перфузувався розчинон, що Н1СТИ8 ,130 нМ тр1с-аспартату; дал1 - 128 кН тр!с-аспартату I 5x10 Н СаС12- Широк! стовпчик* - температура

розчину +S °С; вузьк1 стовпчикн - температура розчину 4-20 °С.

(B) РОЗЧНН ДЛЯ ВНуТр1ШНЪОКЛ1ТИНН01 ПОрфуЗН MiCTMB: 130 кМ тр1с-аспаргату (темн1 стовпчикн), 12В кН тр!с-аспартату + 3 иН теоф1л1ну (св1тл! стовпчикн).

(В) Склад перфузуючого розчину: 130 хК тр1с-аспартату (тенн! стовпчикн) 1 129 кН тр1с-аспаргату > 10 дМ тркфторперазину (св1тл! стовпчини).

(Г) Перш1 4 хв. експериненту кл!тина перфузувалась

контрольним розчинон; дал1 контроль + 5x10 к СаС12 (вузьк1

стовпчики) або контроль 4- 1, lxiO-3H CaClgi 5хЮ-6Н CAMP, 10~3М АТР

1 3xio"3M Mgci2 (широк1 стовпчики).

По ocl абсцис дасться час експериненту хс (хв. ); по ocl

ординат - нормована до початкового значения амплиуда ICa- Vh=»

-50 нВ, Vt» +20 MB..

Найб1льш ефективник засобом -в1двернення блокусчо! д11 внутрШньокл1ткшюго кальц1ю ка кальц1евий вх1дна£ струи був модиф1кованмй Ейутр1шньокл1ткнн1гй рознив, цо kIcthb поряд 13 теоф!л1ном 1 АТФ. 1оки Mg2+ I цикл1чнвй АИФ. Внутр1пньокл1тннна порфуз1я нейрону таких розчнном у значн1й Klpl спов!лыгювала ивндк1сть спаду ICq, вхкликанного Шдвнщенним bkIctom в1льного цвтоплазкатичного кальц1ю (10~5Н) (нал. 5Г).

Отрккан! паи* результата денонструють залучення

2+

цАМФ-фосфод1естераз у д1ю внутр1шньокл1тиннхх 1он1в Са на BxcoKonoporoBl кальц1ев1 канали. В подальшоку Чад 1 Нкерт (1984) одержали експеримэнтальн1 доказж участ1 цо одного ферненту схстени обк!ну цикл1чного АИФ - Са-кальмодул1н-залежних фосфатаз у розвктку Са-1ндуковано1 !нактивац!1 потенц1ал-керованого кальц1свого струну.

Таким чинок, отрикан1 результат« значно розширюють наше уявлення про систему кехан1зм1в регуляцН величикх внутр1шньокл1тинного р1вня в1льного калы]1ю, що гекерусться потенц1ал-кероваиими кальц1свинн каналани. Ill механ1зки вкикаються вже прх 3K1H1 зовн!иньокл1тинно1 концентрацН кальц1х> 1 1нтеисиф1куюгься при надходженн1 даких катюн!в усереднну клИини. Наявн1сть тако! складно! систеки контролю ■ величина потенц1ал-керованого кальциевого сигналу дозволяв останньону прийнати участь у регуляцН р1знонав1тнхх процес1в, що прот!кають у яервових кл1тинах. Одним 1з таких процес1в, що лежить у основ 1 розввтку нарвово! систеки, с кл1тинна дифференц!йовка 1 р1ст нейрит! в.

3. Лосл1дження зв'язку н1ж функц1онуванняк погошлал-керова-нкх кальц1свих канал! в 1 станок цитоскелету клИини.

У цьоку розд1л1 кх роэглянемо результат! досл1джень рол1 р1звих потекц1ал-керованях кальц1свих струн1в у процесах кл1тинно1 дкферекц1йовкх 1 росту нейрхт1в, а також зм1н* функц1овального стану данхх канал1в при експеркиэитальних вплввах на цитоскелет. Придатнкк об'сктон для таких досл1джень с злояк1сно пврероджеШ КЛ1ТХНХ кхшачо! нейробластоив Н1Е 115. Ц1 клХтинк, ка в1дм1ну в1д нормальнее нейроШВ. здатн! спонтанно дкференцШватвся 1

гакеруватя иайратж (:Uchl ct al., 1976; Hoolenar, Spector, 1978; Quandi, Narahashi, 19S4). Така властяв1сть кл1тин MIE 115 дозволяс на протяз! короткого перЮду часу, коля спостер!гасться р1ст нейрит! в, прокоитролювати стан потенцХал-кероваких кальШсвкх канал! в.

Недиференц1йован1 кл1тян» нейробластоми являвть собою сферичн1 утворення д!аметрон 15-30 ккк, що не кають будь-якях в1дростк1в. Особлявост1 залеясност! потенц1ал-керованого к&льц1свого вх1дного струну, що генерусться мембраной неднфершщ1йовавих кл1тян нейробластоми N1E 115, в1д величяня п1дтринупчого номбранного потенц1алу, noplr його актявацП, к1нвтячн1 характеристики, а також стаб1пьн1сть в уновах зан1ни внутр1шньокл1тянного середовида дозволяють зробити вксновок, що в1н генерусться головнях чином нязькопороговинн калыЦсвхми каналами (Т-каналя по терм1нолог1! Fox et al., 1984).

В»е через 24 години п1сля пос1ву злояк1сно переродасен1 кл1тяня иабуваля фенотипу нормальних нейрон1в. Диференц1йовка кл1тин t р1ст нейрит1в супроводиувались появою пов1льно 1нактивуючогося компоненту кальц1евого вх1дного струму, noplr активацП 1 максимум вольт-анперко1 характеристики даного струму були зШ1дон1 на 20-30 мЗ у область позитнвннзс значень мембранного потенц!алу пор1вняио з низькопороговим компонентом. На в!дм1ну в!д Т-компоненту кальц1свого струму, цей струм був менш чутливик до зн1ни п1дтрннуючого мембранного лотв!щ1алу, мало 1нактнвуэався пря зменшанн! останнього до -40 мВ 1 пом1тно вимивався на протяз1 перфузП кл1тини штучним солянин розчином. Ц1 дан1 дозволяють розглядатк його як високопороговий калъц1свяй вх1дний струн, що з'являсться у процес! росту нейрит!в. В дан1й робот1 не проводилось розд1лення високопорогового кальц1свого струму на компоненти, 1 у подальшоку в!к розглядасться як сумарний високопороговий струм.

М1сце знаходкення високопорогових кальц1свих канал1в, ивидше всього, . т1сно пов'язане 1з яембраноп нейрит1в, тому що в1докремлення в1дростк1в В1д сомя клиини вяклякало повно пригнШення високопорогових кальц1свих струм1в. Дендритна лока.л1зац1я високопорогових калы]1свхх канал1в, повно, с причиною незадов1льно1 ф1ксац11 мембранного яотенц!алу у

електроф1зюлог!чкому експерямент1.

Кальц!евий струм у мембран! недиференц1йованях кл1тин

нейробластокх, до генерусться низькопороговимх кальц1еви«к

каналам, вхявквся вжсоко чутливин до эовн!мъокл1 тинного 2+

прикладення Cd . Уже у концентраци 10 рН Юни кадм1ю у значн1й

Klpi блокувалк йог о (-40Х). Характерное особлив1стю д11 1он1в

кадк!ю на низькопороговхй 1с& був наступний пов1льнхй розвкток

пригн1ченнл струну п1сля в1дносно стр1иного початкового блоку у

в1дпов1дь на прикладенкя данно! рэчовини. Напевна, така

особлвв1сть д1! iohIb Cd2+ на калыЛсвий струн була причиною того,

що КЛ1ТХНК, яки культивувалися на протяз! 24-36 годин у середовхщ1

1з 10 (Ж CdClj, на гекерували пок1тного кальщсвого струку.

Важливою рисов таких кл1тин було те, що б!льш1сть 1з них

залишалась сферичнкми без будь-яких в!дростк1в на протяз1 всього

пер1оду слостережею, (2-3 дн1). Аналог1чн1 експерикенти булх

проведен1 з використаннян 1ншого блокатора нязькопороговкх

кальц1евих канал1в - ам1лориду. 5 дМ ам1лориду вякликаля значке

пригн1чення нвзькопорогового кальц1свого струну у

недиференц1йованих кл1тинах кейробластони Н1Е 115. додання

ан1лориду у такяй концентраци у серодовище культивування

2+

приводило до того, що клХтини, як 1 у присутност1 lOHlB Cd

втрачалк здагн!сть до спонтанно! диференЩйовки. Б1льш!сть 1з них

залишались сферхчяикх, без будь-яких в1дростк1в на протяз1 2-3

дн1в культивування.

Зовс1м 1нш1 зк1«и у морфологи КЛ1ТИН нейробластокх калл

м1сце . при додакш у середовища культивування верапак!лу -

блокатора високопороговхх кальц!свих канал1в. Культивування кл1тин

-5

Н1Е 115 при наявност1 у- середовищ! верапак1лу (5x10 М) супроводжувалось ростом значно довоих, н!ж у контрол!. 1 керозгалужених нейрит!в. Вин1рювання потекц1ал-керованих кальшсвих струм1в у таких кл1 тинах показали наявн1сть т1льк* низькопорогового компоненту. Бисокопороговий кальЩсвий струм у таких кл1тинах був повн1ст» прнгн1чений.

Виявилось, що под1бних зк1н у корфолог!! кл1т»н нейробластокх можна досягкути 1 за допомогою вальпроево! кислоти (Valproic acid). Ця речовина використовусться як актхконвульсант при еп1лептичних разладах. Припускасться, mo Н д1я направлена на пригн1чення кальц1сво! 1 натр1сво! пров!дност1 нейронально! мембрани (Coulter et al., 1989b; 1990). Вальпросва кхслота (10~4М), додана у середовище культивування, 1ндукувала, под1бно до вералан!лу, р!ст довгхх 1 нерозг&луженях нейрит!в. Як 1 у

акеперянентмс !з верзпаШлом, у цях кл1тянах м1г бутя з&реестрованяХ т1льки нязькопороговяй компонент калыЦевого вх1дного струму.

Вяявленяя норфолоПчнях энт у кл1тянах нвйробластомх пря кодяф1кац11 потенц 1 ал- керовано I кальц1сво! провщност! дозволяс пряпустят* наявн1сть т!сних функц1окалъннх зв'язк1в к1ж станом цятоскелету кл1тяни 1 актявн1ст» калъц1свих канал1в. Нвявв! експерямектальн1 дан! д1йсно вказують на хожляву залежШсть функц1онуванкя калъШсвях канал1в в1д стану' м!кротубулярно! Сястеми КЛ1ТНЯЯ (Гикийа et а1., 1979). Мя досл1дялж

функц1онування потанЩал-кврованях кальц!свях канал 1 в у повврхн9в1Й нембран! кл1тяи нэвробластоин пря прякладенн1 речовяи, що руйнують Хх м1кротубулярну систему. Додання у середовяще культивування колхШяву або в1нбластину у концентрат I 10 дК повн1ств прягн1чувало дяференцИовку кл!тин нейробластомя. 111 кя1тхня эалшалясь сферхчнями без будь-яккх в1дростк1в на протяз1 всього часу культивування. Кл!т*ия кайробластомя, що культявуваляся у таких умовах, не каля пом1тно! кальц1сво! пров1 дност1. Пеобх1дно в! дзначяти, до колх1цкн 1 в1нбласгян руйнують м1кротрубочкя на окрвм1 субодинхц!, вяклнкаючн значн1 структуря1 ЭМ1НЯ в ну т"р1шкьокл! тинного натряксу. Тону пригн1чвння кальц1евого струку не обов'язково мохе в1дображатя порушэння специф1чних зв'язк1з м1ж цятоскелетон кл1тяни 1 кальЩсвянк каналами. Пряймасчя да до увагя, ми наиагались знайти б1льш м'як1 метода модяф1кацЦ К1кротубулярно1 сястени кл1тяни 1 при цьону простехятх стая калъЩево! пров1дносп нейрональио! мембрани. ' 1з Л1тературнях данях в1домо, що Ь-тирозин прийнас участь у посттрансляц1йн1Я нодиф!кац11 а-тубул1ну 1, завдякя цьому, може чянити вплхв на стан цитоскелету. З'ясувалось. що високопороговхй компонент кальЩевого струму був б1льш выражений у вяпадку, коля кл1тяни культквуваяясь у серэдовящ1 1з п1двнщеннн внЮток Ь-тирозину. Додання 30 цМ Ь-тярозяну у середовяще культявування або перфуз!я нейрону внутр1шньокл1тянним розчинон. що м1стяв таку^ ж к!льк1сть дано! аШнокислотк, супроводжувалось зб1лыпенням ампл1тудя вясокопорогового кальщевого струму I спов1лъноннян швндкост! його спаду у, ход! експеркхенту. Однак б1льш значною в1дн1нн1стю вясокопорогового компоненту кальЩсвого струму у обробленях тяроэянок кштинах була Його б1льша стаб1льн1сть у час! пор1вняно з контролем. ПокИних зк!н у к!нетячнях параметрах

кальц1евого струну, а такох toro аотеяШалозалежност1 но спостер1галось. Д1я L-тнрозкну була спец*ф1чнсю по Б1дношешш до високопорогового кальц1свого струку 1 не нала помИного впляву ш Т-кокпонвнт струну. Дал! ки б1льш детально розглянехо результат« досл1джень механ1зиу дп арокатичних ан1нокислот на високопороговий калыЦсвий вх1дний струн, котр.1 були проведен! на нейрон-под!бн1й кл1тинн1й Л1н11 1з пухлинк надниркового шару -феохромоцитом! РС12.

Ц1 кл1тини, завдяки сво!м властввостяк, с б1льш придаткам об'сктом для вивченкя даних npoueclB, н1ж днференц1йован1 кл!т*нк нейробластохи NIE 115. Для них характерна наявн1сть у плазхатячн!й мекбран1 т1льки високопороговкх кальц1свих какал1в. Кр!к того, округла форма 1 приблизно одкаков1 розк1ри роблять Ix б1льш зручнини для використання у елекгроф!э1олог1чних досл1джоннях noplвидно з диферекц1йованини кл1ткками нейробластомк, при робот 1 з якипн влникають проблем» адекватно! ф1ксгац!1 мембранного потенщалу 1 якост1 зам!ни внутр1шньокл!тиниого розчину.

Наш1 результат!, як i дан1 1шпих автор! в (Шуба, Лобанова, 1SS5; Streit, Lux 1987), показали наявн!сть т1льки високопорогового компоненту кальц1свого вх1днога струму у мембран! недиференц!йованих кл1тин феохромоцитоиЕ РС12. Незважапчи на спец!алыгай склад перфузуючих розчин!в, цей струн у вс!х досл1джуваних кл1 тинах знешувався у час! п1сля початку перфузП. На протяз1 перших 2S хв. перфузЛ л!кова ампл1туда зменшувалась до 48±1ZX в1д початкового значения (середне значения ± S.D., iv=9). Додання L-тирозику до внугр!шньоп1петкового розчину значно спов1льнювало спад кальц1свого струку у час1. Значения величина капьц1свого струку через 2В хв. перфузП клИйни розчином, що М1СТИВ 20 цМ L-тирозииу, складало 106±28Я (середня величина ± S.D., п=11) значения floro аипл!худи ка початку перфузП (вим!ряно!о на максимум! вольт-акперно! характеристики). Однак сл1д в1дк1тити, що найб1льш характерною рисою дп Ь-тирозину було спов!льненкя спаду струму у npoueci перфузП кл!тини штучник солянин розчинок (як 1 на кл!тинах нейробластомк), ir деяких випадках L-тирозин вводився у кл!тину через певн1 1нтервали часу п1сля початку перфузП кл1тини стандартним .розчином. Така процедура була иожливою у результат1 використання систоми зам1ни внутр1шньоп1петкового розчину (дкв. Иетодя). Ц! ексиеримент* показали, що ефект L-тирозину (20 jiHJi заложить значкам чином в1д

швкдкосП початково! зк1нх I п1д час перфузп кл1тини. Якщо 1Са зменшувався швядко, 1гтирозин д1яв досить ефективно. Кл1тяни 1з б1лып сПйкямя струнами буля квнш чутляв1 до введения L-тирозину. При цьону в1дновлюючий ефект L-тирозяну на 1Са на був пост1йнин (кал. 6). П1сля досягнення максимального значения знову почянався спад струну . Це1 спад м1г бутя зуновлений змешенням концентрацН L-тирозину у п1петц1 через припннення його надходження кр1зь кап1ляр внасл1док зкеншения позитивного тиску у систем1, або 1нш*мк причинам«. Пов1льни1 спад 1Са мав м1сце нав1ть п1д час постИно! перфузП кл1тян тнрозин-м1сткик розчинон. Для того, щоб перев1рити спецяф1чн1сть д11 ц1с! ароматично! ан1нокислотн, у деяких кл1тинах сгандартний внутр1шньокл1тинний розчин зам1нсвався на розчин, ио н!стив 20 ци Ь-леНиину. Пом1тнвх зм!н у спад1 1Са пор1вняно з контролен не спостер!галось.

1>-фен1лалан1н с попередникон у синтез! тирозину 1 у б1льшост1 випадк1в чинить 1накпу в1д тирозину д!о. В наших експериментах 1<-ф9Н1лалан1я (20 ¿iM) !кдукував прискорення 'спаду 1Са> що мав Hjcite пря перфузП кл1тяня стандартнин розчином (мал. 6). Якщо 1<-фен1лалан1к (20 цН) посПйно знаходився у перфузуючому розчин1, то значения величин* 1Са через 25 хв. п1сля початку перфузП зиижувалось до 33 t 15 X його початково! акпл1туди (середнс значения t S.D., п=9). У окреких експериментах зустр1чались кл1тинх, у яких пригн1чуту д1ю Ь-фен1лалан1 ну на 1С було важно вид1лкти на фон1 спаду у контрольному розчин1, однак практично не було кл1тии, де б хало н1сце в1дновлення струму, под!бне тирозин- 1ндукованому. Д1я Ь-фен1лалан1ну була специф1чною по в!дношенн» до калыЛсвого струму 1 на проявлялась на активносп 1кпих тип1в Юнних канал 1 в.

Очевидно, ефект вроматичнях ам1нокислот на 1Са не пов'язаний 1з синтезом натехолан1н1в, тому то блокатор цього пронесу -<х-нетил-0,Ь-тирозян впливав на струн аналоПчно L-тирозину.

На даний час э1домий один р!дк1сний механ1зн посгтрансляцИного включения тирозину у пол1пептидний ланцюг - ив реаюНя тярозялювания а-тубул1ну, що катал1зуеться. ферментом тярозлн-тубулШ л1газою (Barra et al., 1974). Пря надм1рному П1дв*щвнн1 р1вня фен1лалан1ку У орган1зн1 ноже натя к1сце эан1щення тярозяиу у СООН-терк1нал1 а-тубул1ну ц1ею ам1нокяслотою (Rodriguez, Borisy, 1979). току сане о-тубул1н ноже бути найб1лып йнов!рною д!дянкою, що опосередковус «Id арон&тячнях ам!нокислот

на калъц1св«г ртрух. Иоправда, првпущекня про тубул1н-опосередаовану д1ю арокатичлих ан1нокислот на високопороговхй калъц1еви! струм не узгоджусться з наши* спостереженняк, цо в н лучения АТФ 1з перфузуючого розчнну не

Мал. 6. Ефект внутр1шньокл1тинного введения Ь-тирозину (кружки) 1 Ь-фен1лалан1 ну. (квадрат«) на вясокопорогови! потенц1ал-каровашгИ кальц1сзмй струи у клИинах феохрокоциток* РС12. Пврфуз1я починалась контрольна« розчинон (свил1 синволи) ] продовжуваласъ тирозин- або фэн1лалан1н-и1сткик розчвкаки (темн1 сикволи). Абсциса - час п1сля початку перфузИ; ордината -норкована ампл1туда 1Са. -60 нВ; У^ +20 мВ.

позначвлось на ефект1' 1>-тирозину, хоча тирозилювавня тубул1ну с АТФ-залежним процесон. Однак к окна дуиати. цо ця розб!жн1сть с касл1дком в1дсутност1 пряного зв'язку . К1к р1виек АТФ у парфузуючоиу розчин1 1 концентрацию цього нуклеотиду б!ля внутр1шцьо! поверхн1 мембран*.

Наведен! у аьоку розд1л1 результата дозволяють зробжтв вжсновок про р1зну. роль низько- 1 внсокопорогових кальтсвжх струн1в у процесах рвгуляцН росту не8р*т1в . 1 диференц!йовки нервовхх кл!тин. Пригн1чення низ ькопорогового компоненту струму

приводить до блокування нехан1э«1в запуску кл1тинно! диференц1йовки, тод! як актявац1я високопорогового кальц1свого струну приводить до обмеження подовжання нервових в1дростк1в 1 посилення IX розгалужекост1. Особливост! розпод1лу канап1в у кл1тин1, час IX появн у поверхнвв1Я квибран1. а такояс функц1ональн1 властявост! узгоджуються з таким висновком. Для детального з'ясування цього ваяслявого питания наобх1дн! подальш1 досл!дження з викоркстанняк високоспециф1чких блокатор1в окремих тип1в кальц1свих канзл1в. Однак вже тепер можна зробити ряд попередк1х висновк1в, що мають важливе практична значения. Один 1з ннх мае в1дношоння до широко використовуваних у наш час серцевих препарат1в, сингезованих на ochobI диг1дроп1рид1кових блокатор1в вясокопорогових кальц1евих канал1в, Систематично вживання таких л1к1в, йнов1рно, буде мати сторонн! ефекти у вигляд! порушанкя утвореняя нервових зв'язк!в у мозку, що буде супроводжуватися порушанняня панят1 1 т. п.

Другим важлявям результатом досл1д!в . на клонованих кеВроно-под1бких кл1тинах с встановлення факту, що L-тирозин I 1г-фан1лалан1н е аитагок1стичними внутр1шньокл1тинними модуляторами йотенц1ап-керованих високопорогових . кальц1евих канал1 в. Ц1 результата становлять наукову фундаиентальну ц1нн1сть у план1 опясу нового, ран1ше нев!домого, мехая1зму регуляцП величиня потенц1ал-каровакого кальц1свого сигналу. Однак 1х значим!сть не обмежуеться чисто науковин 1нтересон! в1домо, до порушення обмхну данях ароматкчних ам1нокислот е причиною тяжких розлад1 в функц1й нервово! системн. Одержання вказаних даних сгннуловало проведения подальиих експерикент1в яа нейронах мозку i л rivo - в умовах. блязькях до умов патолопчного порушення обм1ну фен1лалан1ну 1 тирозину у орган1зм1.

Л. Досл1дженння зм1н кальц1сикх струк1в нэйрон1в г1покампу а умовах, до ноделюють порушення обм1ну ароматичних. ам!нокислот.

При П1двященн1 р1вня 1.-фвн1лалан1ну у - орган1зм1 ця аминокислота може зам!щати L-тирозии у С00Н-тарк1пал1 о-тубул1ну. Таке зам1щенкя тирозину фен1лалан1нон у тубул1н1 нойрон1в головного мозку щур!в було показано в умовах, що акспериментально

выкликали у них тварин порушення, характерн1 для феШлкетонур! I (Rodriguez, Borisy, 1979). ФеШлкетонур 1 я - генетично захворювання людини, при якоку порушення функцП головного нозку пов'язане 1з зниженою активн1стх> або в1дсутн1стю феркенгу

фен1лалан1н-4-гидроксилазк у печ!нц1. Метабол!чники насл1дкаки тако! в1дсутност1 цього ферненту с надлшпок фвн1лалан1ну, котрий нагромадауеться у кров! I спинн1й р1дин1 1 веде до Шдвищення р1вня фен!лалан1ну у козку. У хворях. розвиваються глибок1 зи1ни Функц1й мозку, що характеризуются зокрека порушенняки здатност! до навчання 1 пакят1. Експерииенгалыю г1перфен1лан9к1я коже бути викликана у тварин (див. Методи). Встановлення факту впливу посттрансляц1йно1 кодификацП а-губул!ну на потенц1ал-керований кальц1свий транспорт дозволило нам використати цю нодель, з одного боку, для б1льш точного доведения знайденного явища 1, з 1ншого, для того; що б наблизитись до розук1ння причин розладу функц1й иозку при цьону захворюванн1.

Експерименти проводились на культивованих нейронах г1покакпу одноденних щур1в. Пор1вкювались результати, отрикан! на нейронах, 1зольованих 1з нозку контрольних тварин 1 тварин, котрим вводився 1/-фен!лалан1к.

В еиектроф!зюлог1чний експерикент брались кл1тини, що знаходились у культур1 на протяз1 5-7 дн1в. Так1 кл1тини нали характер«! фенотип1чн! ознаки зр1лих нейрон1в. Використання для внутр1иньокл1тинно! перфузи. безкал!евого розчину, що и!стив 100 им CsCl, 1 наявШсть у зовн!иньокл1тинному розчин1 ТТХ дозволяло усунути кал1евий вих1дний 1;. натр1евай вх1дний струни. В таких уковах у в1дпов!дь на сгуШнчаТу деполяризац1ж> мекбранх до -60 -SO kB в1д р!вня' пХдтрииуючого некбранного потенщалу -90 нв активувався потенцяалозалежний кальЩевиЙ вх1дний струи (кал. 7). ГСа досягав каксинального значения при Vfc= +¿0 kB 1 зкэншувався до нуля при .«• +50-+60 мВ. На протяз1 деполяризуючого зк!щення кекбранного лотенц1алу кальц1свий струн 1нактивувався. 1нактивац1я мала складний характер 1 иогла бути розд1лена на швидкий 1 пов1льний коипоиенти (пост1йн1 часу 5-20 кс 1 дек1лька сотень н1л1секунд. в1дпов1дно). Швидко!нактивуючийся кокпонент загального струну кав максимальна значения при -20+-10 kB 1 складав 31 i 13 ! сунарного 1Са (середне значения ± S.D., п=12). Зн1щення Шдтримуючого кекбранного потеиц1алу до -50 мВ приводило до пригн!ченкя низькопорогового компоненту ХСа, 1 високолороговий

компонент струму ставав док1нуючям. цей компонент струну демонстрував високу чутливЮть до внутр1шньокл1тинно1 перфузП I вимивався за час б1ля 20 хв., тод1 як швидко1нактивуючийся компонент залишався досить ст1йким.

,„ шУ

-во ■ -50 -20 10 40

Мал. 7. Кальц1евий вх!дний струн у культивованих нейронах гШоканпу новонароджених щур1в.

Усереднена вопьт-акперна характеристика 1Са У нейронах

г1покампу контрольних тварин (квздрати) 1 така ж волът-амперна характеристика струму у нейронах г1покакпу новонародженних щур1в, котрин вводився 1гфен1лалан1н (кружки). Вертикалън1 л1н11 показують стандартна, в1дхилення (п = 12 1 7, в1дпов1дно). Вольт-акперн1 характеристики будувались по значениях струму, норнованних до анпл1туди при -10 нВ; У^-Ю мВ в1дпов1дав

максимуму вольт-акперно! характеристики для ниэькопорогового компоненту 1Са. -90 мВ.

Описан1 ефекти зм1ни п1 дтринуючого мембранного потенц1алу 1 внутр1шньокл1тинно1 перфузи показують наявн1сть двох популяЩй кальц1свих канал!п у г1покаипальних нейронах новонароджених щур1в: низькопорогових нетабол1чно незаяежних 1 високопорогових кетабол1чно залежних. У подальшому сунарний кальцЮвий струн розд1лявся на низько- 1 високопороговий конпононти у залежност!

в1д чутлквост1 до п! дтрикуючого мехбранного потенщалу 1 В1ДНОШОШШ до порушекня внутр1шньокл1ткнних обмиших процес!в.

Досл1дження функц1онування описаних тип1в кальц1свих канал1в у нейронах г1покакпу, 1зольованих у щур!в з п1лвищених bmIctok у плаз к1 Ь-фэн1лалан1ну, показали иаявн1сть значних зх1н. Спостер1галось надзвичайнв знхжвння високопорогово1 кальц1сво! пров1дност1. в той же час у фуякц1онуванн1 низькопорогових калыцсвих канал Is ке було 1 стог них зм1н. Тону сп!вв1 дношення н1ж анпл1тудакк вХ1дних кальц!евих струн1 в, створюваних в!дпов1дно високо- 1 низьколороговини каналами, яке у нейрон1в контрольних тварин складало у середньону 416±130Х, знижувалось при П1д8ищенн1 р1вня Ь-фен1лалан1ну до 40i30X. Вказан1 зм1ни були специф1чн1 для кальц!свих канал!в; достов1рних зм1н у функц!онуванн! 1нших тип18 1онних канаяХв знайдено не було.

Важливою расою встановлених зм1н кальц1евих струн!в виявилось иожливе !х часткове в!дновлення у культавованих нейрон!в у випадку, якщо у середовище культивування додавався L-тирозин (у концентрацП 50 иЯ). При цьому величина високопорогових кальц!евих струк1в знову ставала значно б1лыиою в1д величин» низькопорогового струку (середнс сп1вв1дношення 280±57Х) (кал. 8). Под1бний ефект на величину високопорогового кальц1евого струну чинив пол1-Г.-л1зяк, котрий с. активатором гирозинових к!каз (Brunati et al., 1989).

Отриман1 результата дозволяють припустит» участь у досл1джуванкх зн1нах функц!онування кальц1сснх канал1в тих самих Внутр!шньокл1тинних процес1в; як! були знайден1 у кл1тинах феохромоцитони РС12 1 нейробластоки N1E 115; у культивованкх нейронах ппокампу одноденних цур1в високопороговий кальц 1свий струм модулпсться ароматичними ак1нокислотами - посилюсться L-тирозином 1 пригн1чусться Ь-фен1лалан1нох. Аналог 1 я спостер1гаеться не т1льки на р1вш <рункц 1 онування 1 онних канал1в, але й у структурних зм1нах цих двох груп досл1дкуваних кл1тин. Як було сказано вищв, блокування високопорогових кальщевих канал1в викликас глибок1 порушення у морфологи кл1тин нейробластомк N1E 115: у них утворюються вкдовженн! 1 нерозгалу«ен1 нейрити. Важливо в!дзначитн, до под1бн1 зм1ни у дендритному дерев1 кали н1сце при досл1дженн1 нейрон1в кори мозку екбр1он1в людкни, що xsople фен1лкетонур!сю (Levy, Waisbren, 1983).

Очевидно, с вс! Шдстави припустнтя, що знаййен! накк зк!нк у

хопекулярних механизмах функцЮнування потевд1ал-квроват»с кальц!свих канал!в у нервових кл1тинах п1д час штучного порушення виутр1шньокл1тяшгого р! пня ароматичних ан!нокислот иожуть

тУ

-80 -50 -20 10 40

Нал. 8. Ефекг Ь-тярозину ка кальШсвяЗ вх1дихЗ струм у культивованих нейронах г1покампу.

Так1 а, граф1ки, як 1 на хая. -8, та вольт-амперна характеристика 1Са (середне значения 18.0., п=7) у г1поканпальнях

нейронах, . цо кульгквувалися у середовищ з 50 дН Ь-тирозину (трикутники). У^» -90 нВ.

в1д!гравати суттсву роль при порушаннях хбзковях функц1В у випадку аналоПчних зк1н, характарних для . фен1лкетонурН. Одним !з насл!дк1в такого прягн1чення внсокопорогових кальщевях канал 1 в ноже бути порушення кейрональних зв'язк1в у хозку.

Зм1ня у поводкенн1 щур1в з експеримектально викликаною 4ен1лкетонур1сю вкпючаютъ нездатнЮть до навчання 1 порушення !)ам'ят1 (Козака, Теика<3а, 1980). Под1бн1 зх1нх у повед1шЦ тварян ножуть бутя викликан1 також в ну тр шньоцеро бральною 1н'скц1сп в1нбластину - речовяни, що руйнус к1кротубулярну систему кл1тяни (Мчгакаа!, 1980). I сама у «-тубул1н1 кають к!сце зн&чн! зн!ня

ан1нокислотного складу при 1нтраперитонеальн1й 1н'скц11 Ь-фен1лалан1ну. В тканин1 мозку коктролъних щур1в на 1 Н тубул1ну припадас 0,54 Н тирозину 1 0,02 И фен1лалан1ну. П1сля 1ндукц11 г1перфен1лалан1немП одноразовою 1нтраперитонеально» 1н'скц1ею Ь-фен1лалан1ну число тубул1нових молекул, ' що м1стять фен1лалан1новий залишок эб1льшусться приблизно у S раз1в (Rodriguez, Borisy, 1979). Усе сказано разон дозволяс нам зробити висновок, що найб1лыл Ёмов1рною д1лянкою, що опосередковуе д1ю арокатичних ам1нокислот на потенц1ал-керований кальц1свий струм с а-тубул1н. Однак тубул1н с не т1льки головним структурним компонентой м1кротрубочок, а також 1нтегральнин б1лкои поверхнево1 иембрани (Carraway et al., 1989). Для того, щоб в1дпов1сти на питания, який 1з конпонект1в тубул1ну б1льш т1сно зв'язаний 1з функц1сю кальЩсвих канал1в, необх!дн! подальш! досл1дження.

В И С Н О В К II

1. Методой внутр!шньокл1тинно1 перфузИ у посднанн1 1з ф1ксац!ею мембранного потенц1алу на ряд1 нейрональних структур вивчено кехак1зми рогуляцИ п1двищэння внутр1шньокл1 тинного р1вня в1льного кальц1ю, що генеруетъся погенц1ал-керованини кальц1евини каналаки, 1 участь цих процес1в у кодуляцн певних мэмбранно-цитоплазматичних взасмод1й.

2+

2. Досл1джений механизм регуляцИ зовн1шньокл1тиннини 1онами Са

потешИал-керованих кал1евих канал 1 в у нейронах молюск1в.

2+

Показано, що зв'язування Са 1з специф1чною Са-зв'язуючою

д1лянко1о у кенбран! викликас зб1лыпення анпл1туди 1к- Така

властхв1сть канал1в кал1свого затриианого вих1дного струму

2+

дозволяс 1н виступати фактором регуляцИ входу Са через потенц1ал-керован1 кальц1св1 канали п1д час потенц1алу ДИ.

3. Внутр1шньокл1тинне введения катал1тично! субодиниц1 Са-залажно1

проте1нк1кази С вккликало зб!льшення аипл1тудн потенц1ал-

кероваиого кал1свого вкх1дного струму. под1бно зб1лыпенню

2+

концентрацп зовн1шньокл!тинних юн1в Са . 0трхман1 результат«

2+

дозволяють припустит», що д1я зовн1шньокл1тхнних 1он1в Са на потенд1ал-керован1 кал1св1 канали опосередковуеться через

актквац1ю проге1нк1нази С I наступне фосфорнлювання б1лк!в, що нають в1дношення до функц1онування кал1свого каналу,

4. Показана здатн1сть зовн1шньокл1тннних 1он1в К+ спов1лънювати

1нактивац1ю 1 прискорювати де1нактивац1ю кал1евого затриманого

вих1дного струну. Доел!джоння кехан1зну пъого ефекту, а такозс

встановлоння ножливост! його в1двернення 1з допоногою верапан1лу,

дало п1дстави для висновку, то зб1лыпення анпл1туди

потевд1ал-керованого кал1евого струну при п1двищонн1

2+

зовн1шньокл1тинно1 концентрацН 1ои1в Са 1 внутр1шньокл1тинно! 1н'скц11 прота1нк1нази С с рвзультаток зб1лшоння часу в1дкритого стану данях канал!в.

5. Досл1джекяй нехан1зк пригШчення акгявкост1 вяеонопорогових

кальц1евих канал1в у поверхнов1й мембран! при п1двищ8нн1

внутр1шнъокл1тинного р1вня в1лького кальц1ю. Показано, що блокуюча

2+

д1я внутр!шньокл1тинних 1он1в Са опосеродковусться через активац1ю Са-калъмодул1н-залежних цАМФ-фосфод1естераз 1 наступив зниження внутр1шньокл1тинного р19НЯ ЦИКЛ1ЧНОГО АИФ 1, В1ДПОВ1ДНО, зкекпення ступени фосфорилкэвапня кальц1езкх канал1в.

6. Показано, що п1двшцення внутр1шиьокл1ткгаго1 концентрацН юшв

кальц1ю, яке генеруетъея потанц1ал-керовани>?л калъцЮвими

каналани, е важливик фактором регуляцП морфолог 1чних зм1н у

2+

нейронах. Вх1д 1он1в Са через низькопорогоз1 потенц1ал-керован1 канали т1сно пов'язаний 1з функцЮнуванняк систем, що забезпочугать запуск диференц1йовки нейрон1в. Пригн1чення цього компоненту струму у недиференц1йованих кл1тинах нейробластоки Н1Е 113 призводило до втрати нинк здатност! до спонтано! диференц1йовки.

7. 0тринан1 доказ* участ1 кальц1свого струму через високопорогов1 потенц1ал-керован1 канали у мехаШзмах, що зд!йснюють регуляциэ росту нейрит1в. Пригн1чоння високопорогового кальц1свого вх1дного струму супроводжувалось аноркальним подовжвнняк 1 зменшеннян ступеню розгалуженост1 нойрит1в у диференц1йованих кл1ткнах нейробластони. Наявн1сть низькопорогового струму у менбран1 цих кл1тин не позначалась на процес1 росту 1х нейрит1в.

8. Виявлений новий нехан1зм кодуляцН функц1онування

виссжопорогоЕих потеки1ал-керования кальц1свях канед!в !з боку цитоплазиатичних процес1в. Показано, що введения у кликну феохрокоцитомя ароматично! ах1нокислоти L-тирозину посилюс в1дпов1дний кальц!евий . струм, а 1-фен1лалан1н його пригн!чуе. Висунуто припудення, ио механ1зм д!1 цих аронатичних ан1нокислот опосередковусться через нодиф1кац1в <£-тубуп1ну. Тирозхлювання о£—тубул1ну п1дтринуе активн1сть високопорогових кальц1свих канал1в. а занИцяння тирозину у СООЯ-терк1нал! тубул1ну фен1лалан1нок викликае 1х пригШчення.

9. Показано, що штучно порушвння обм1ну аронатичних ам1нокислот у мозку новонароджеких щур!в, характерна для генетичного захворювання фен1лкетонур1I, супроводжусться селективним 1 триваючик пригн1ченняк високопорогового кальц1свого ^струму у нейронах 'г1покакпу. Культивування кл1тин у присутносП тирозину або активаюр1в тирозинових к1наз приводить до в1дновлення погенц1ал-керованого кальщсвого транспорту. 0триман1 результати дозволяють припустити важливу роль потевд1ал-керованого кальщсвого транспорту у генезис! роз'ладу функц1й головного козку при цьоку захворюванШ.

10. Отринан1 результати дозволяють зробитк висновок, що механ1зк регуляцп внутр1шньокл1тинних сигнал1в, що генеруються входон loHlB капьиНэ через потенц1ал-керован1 кальц1св1 какали, являс собою складний багатостад1йний . прочее, який вкличасться уже при 3KÍH1 зовн1шньокл1тинно1 концентрат! кальцИэ, 1 Д1я якого актив1зусться при входженн! каяьцЮ усередину клпвни. Порушення у функц1онуванн1 р1зних ланок цього процесу ноже лежати у ochobI вкннкнення тяжких розлад!в мозкових функц!й.

Основн! положения дисертацП опубл1кован1 у таких роботах:

1. Doroshenko P.A., Kostyuk P.G., Hartynyuk A.E. Intracellular metabolism of adenosine-3,5-cyclic monophosphate and calciun inward current in perfused neurones of Helix pocatla // Neuroscience.- 1982.- 7, -P. 2125-2134.

2. Дорошенко п.Á. , Иартыкок A.E. Возможная связь блокирующего действия внутриклеточных ионов кальция на кальциевый входящий ток в соматической иекбране нейронов колльсков с внутриклеточной системой обмена цАМФ // Аокл. Ш СССР.- 19В2. - 265, -С. 431-494.

3. Kostyuk P.G., Doroshenko P.A., Martynyuk A.E. Role of cAMP-

dependent phosphorylation in maintaining the calcium conductance of a nerve cell membrane. Abstract. Ill-d Soriet-Sviss symposium "Biol, membranes : structure and function". 1983, -P. 176.

4. Дорошенко П. А., Картыгож А. Б. . Метаболическая обусловленность функционирования потенциалозависикых кальциевых каналов // Тез. 5 Всесоюзного симпозиума <£иэиология медиаторов», Казань- 1984. -С. 88.

5. Kostyuk P.G., Doroshenko P.A., Ilartynyuk А.Е., Vesalovsky N.S., Fedulova S.A., Shuba If.M. Metabolic dependence of calcium channel function in the somatic membrane of nerve cell // Abstract. 8th Intern. Biophys. Congress, Bristol, UK.- 1984. -P. 91.

6. Костюк П.Г., Дорошенко П.А., Мартынюк А. Е. Исследование метаболической зависикостн активности кальциевых каналов соматической мвкбраны нервной клетки // Биол. мембраны- 1984,- 1, -С. 18-26.

7. Мартынюк А.Е., Дорошенко П.А. Влияние блокаторов калкодуляна на процесс ингибирования внутриклеточными ионамд Са потенциалозавиеккой кальциевой проводимости мембраны нервной клетки // ДОКЛ. АН СССР- 1984.- 274, -С. 471-473.

8. Kostyuk 'Р.G., Doroshenko P.A., Martynyuk А.Е., Veselovsky N.C., Fedulova S.A. Calcium channels and cAMP metabolism in nerve cells. Exp. Brain Research, Series 14, Springer verlag, Berlin, Heidelberg, 1986, p. 9-16.

9. Мартынюк A.E. Два типа кальций-зависимых каналов калиевого выходящего тока в соматической мембране нейронов моллюсков // Нейрофизиология- 1987.- 19. -С. 185-191.

10. Мартынюк А.Е. Действие внеклеточных ионов калия на калиевый выходядиий ток, зависящий от внеклеточных ионов кальция //Нейрофизиология- 1987.- 19, -С. 3S1-356.

11. Мартынюк А.Е. Блокирующее действие кальмкдазолиума и хлорпррказина на калиевый выходящий ток, зависящий от внутриклеточных ионов кальция // Нейрофизиология- 1987.- 19, -С. 356-361.

12. Мартынюк А. Е. Циклический AMP предотвращает спад кальциевого тока в соматической кенбрана нейронов моллюсков// В кн. «Внутриклеточнь/О метаболизм и ионная проводимость* под ред. Костяка П. Г., Москва, 1987.

13. Kostyuk P.G., Martynyuk А.Е. Potassium outward current dependent on extracellular calcium in snail neuronal membrane // Neroscience- 1988. 24. -P. 1081-1087.

14. Мартынюк A. E. , Тесленко В.Я. Инактивация калиевого выходящего тока зависящего от внеклеточных ионов кальция // Нейрофизиология- 1988,- 20, -С. 602*610.

15. Мартынюк А.Е. Предотвращение спада калиевого выходящего кнак-тивируюздегося тока в соматической кенбране нейронов моллюсков про-теинкиназой С // Тез. II Всесоюзной конференции по нейронаукаи, Киев, 1988. -С. 48.

15. Нартыник A. E. Исследование фармакологической и метаболической зависимости задержанного инактивируюиегося калиевого выходящего тока в соматической мембране нейронов моллюсков // Нейрофизиология- 1989.- 21, -С. 52-ES. ..

17. Картынюк А.Е., Погорелая Н.Х. Действие тирозина и фенилалани-на на потенциалозависимый кальциевый ток в менбране клеток феохро-моцнтоны PC 12 // Тез. III-й Всесоюзной конференции по иейронаукам, Киев, 1990, -С. 32.

18. Kostyulc Р.С., Martynyuk А.Б. bong-lasting modulation of calcium channels by complex mechanisms // Abstract. Regional meeting of the International Union of Physiol. Sci., Prague, 1991, -P. .42.

19. Kostyk P.G., Martynyuk A.E., Pogorelaya N.Ch. Effects of intracellular administration of L-tyrosine and L-phenylalanine on voltage-operated calciun conductance in PC12 pheocromocytoma cells )/ Brain Research- 1991.- 550, -P. 11-14.

20. Martynyuk A.E., Savina S.V., Skibo G.G. Blocking effect of intraperitoneal injection of phenilalanine on high-threshold currents in rat hippocampal neurones // Brain Research- 1991.552, -P. 328-331.

21. Нартыник A.E. Погорелая, Н.Х. Бляяняе внутриклеточного введения L-тирозина и L-фенилаланина на потенциалозависиньш кальциевый ток в клетках феохромоцятокы РС12 // Нейрофазиолагия-1991,- 23, -С. 105-111.

22. Картынзок А.Е. , Савина С.В., Скибо Г.Г. Ингибированио высокопорогового кальциевого тока в нейронах гиппокампа крыс при интра-леритонеальной иньевдии фенилаланина // Нейрофизиология- 1991.-

23. -С. 98-104.

23. Мартынюк А. Е., Савина С. В., Скибо Г. Г. L-тирозин восстанавливает кальциевый ток в нейронах гиппокампа крыс, подавленный в > результате интраперитонеальной инъекции Ь-фенилаланина // Нейрофизиология- 1331. - 23, -С. 245-247.

24. Мартынюк А. Е.. Скибо Г. Г. , -Савина С. В. Изменение потенциало-завксикого кальциевого тока в нейронах гиппокампа крыс при экспериментально вызванной фешшкетонурии If Та» же, -С. 33.

25. Martynyuk А.Е., Skibo G.G., Savina S.V. The change of the calcium currents in cultivated hippocarapal neurons after act'ion of phenylalanine /f ¿bstr. XVI-th neurobiologycal conference "Calcium and intraneuronal signalling", Gif Sur Yvette, 1991, -P. 6.

26. Kostyuk P.G, , Martynyuk A.E., Skibo G.G., Savina S.V. Calciuia currents in cultivated hippocamjial neurones in conditions imitating biochemical changes characteristic of phenylketonuria // Abstr. Third Heeting of the European Neurological Society, Lausanne, 1992, -P. 246.

27. Костюк П. Г., йартынюк А.Е. Возможные молекулярные механизмы нарушений мозговых функций при фенилкетонуряи. 1992 (В печати)