Механизмы регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений

Богданова, Лилия Рустемовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений"

На правах рукописи

Богданова Лилия Рустемовна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ В МИКРОГЕТЕРОГЕННЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2012

Работа выполнена в лаборатории биофизической химии наносистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН).

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

заведующий лабораторией КИББ КазНЦ РАН, г. Казань Юрий Федорович Зуев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ведущий научный сотрудник КИББ КазНЦ РАН, г. Казань Геннадий Алексеевич Великанов

кандидат химических наук, доцент

КФУ, г. Казань

Марал1 Ахмедович Зиганшин

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, химический факультет, г. Москва

Защита состоится 13 ноября 2012 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите диссертаций та соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан 4 октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Анастасия Анатольевна Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКтаРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Большую роль в ферментативных процессах играет расщепление сложноэфирных и пептидных связей, протекающее под действием эстераз и протеаз. Среди эстераз отдельно выделяют группу липаз -водорастворимых ферментов, которые катализируют гидролиз нерастворимых эфиров [Wong, 2002; Brockman, 2004]. Одна из наиболее интересных характерных особенностей липолитических ферментов - уникальные физико-химические условия катализируемых ими реакций. Катализ происходит на поверхности раздела фаз, что существенно осложняет его исследование и в то же время позволяет использовать дополнительные факторы для регуляции активности фермента в микрогетерогенной системе. Стоит отметить, что не только липолиз, но и многие другие ферментативные реакции в живых системах протекают вблизи или на поверхности раздела фаз. In vivo ферменты адсорбированы на поверхности биологических мембран, встроены в мембрану или иммобилизованы внутри замкнутых мембранных структур [Martinek et al., 1989; Seddon et al., 2004; Antalis et al., 2011]. Поэтому исследование липолиза включает в себя фундаментальные и практические задачи, связанные с механизмами действия ферментов в микрогетерогенных средах.

Необходимо отметить, что липазы функционируют и в гомогенной среде, однако в данном случае их активность, как правило, невелика. Особенностью липаз, выделяющей их среди других ферментов, работающие на поверхности раздела фаз, является поверхностная активация, т.е. резкое увеличение активности при концентрациях субстрата, превышающей предел его растворимости [Sarda, Desnuelle; 1958]. В системах in vivo субстраты липаз, как правило, находятся в составе сложных коллоидных структур. Во многом благодаря этому при моделировании и исследовании липолитических процессов в качестве эффекторов используют разнообразные амфифильные соединения. Характер их воздействия на каталитическую систему определяется целым комплексом свойств молекул поверхностно-активных веществ (ПАВ), таких как структура, заряд головной группы, агрегационные и солюбилизационные свойства. Проблеме функционирования липаз в растворах амфифильных соединений посвящено много исследований. В литературе рассматриваются две модели, с помощью которых делается попытка подвести молекулярную платформ}' к регуляции активности липаз: ферментативная и субстратная. Первая основана на изменении структуры фермента в области активного центра при взаимодействии с поверхностью жировой капли субстрата. Согласно субстратной модели регуляция липолитической активности осуществляется за счет изменения локальной концентрации субстрата и его доступности активному центру фермента. Обе предложенные модели имеют ряд существенных недостатков, и поэтому не могут с единых позиций объяснить накопленный эмпирический материал. Таким образом, несмотря на наличие достаточно большого количества данных по каталитической активности и строению липаз вопрос о механизмах регуляции их

активности и о влиянии свойств границы раздела фаз на этот процесс до сих пор до конца не изучен. Эта проблема представляет как фундаментальный интерес для понимания механизмов катализа липолитических реакций, так и может иметь важное прикладное значение при регуляции активности липаз в производственных процессах.

Цель и задачи исследования. Целыо работы являлось исследование молекулярных механизмов регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений и поиск взаимосвязи между физико-химическими и каталитическими характеристиками систем.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. С применением комплекса физико-химических методов охарактеризовать агрегационные свойства амфифильных соединений различного строения: классических анионных и катионных поверхностно-активных веществ, геминальных ПАВ, солей желчных кислот с пленарным распределением полярных и гидрофобных фрагментов и триблоксополимера.

2. Количественно оценить солюбилизацию субстрата в растворах амфифильных соединений. Проанализировать характер воздействия амфифильных соединений на состояние коллоидной системы, образованной субстратом.

3. Провести анализ спектров триптофановой флуоресценции липазы Candida rugosa и усгановить механизмы влияния рассматриваемых амфифильных соединений на структуру фермента.

4. Исследовать каталитическую активность липазы Candida rugosa в микрогетерогенных системах на основе изученных амфифильных соединений. Определить кинетические параметры реакции ферментативного гидролиза п-нитрофениллаурата (ПНФЛ).

5. На основе сопоставительного анализа кинетических параметров реакции ферментативного гидролиза ПНФЛ, а также данных по солюбилизации субстрата и изменению структуры фермента в растворах амфифильных соединений определить факторы регуляции активности липазы Candida rugosa.

Научная новизна работы. Получены данные о влиянии широкого спектра амфифильных веществ различного строения на структуру и каталитическую активность липазы Candida rugosa. Впервые получены количественные параметры, характеризующие солюбилизирутощую способность мицеллярных растворов исследованных амфифильных соединений по отношению к субстрату.

Определены кинетические параметры исследуемой реакции в растворах амфифильных соединений. Впервые показана возможность конкурентного ингибирования липазы в растворах исследованных катионных ПАВ. Впервые определены константы скорости и энергии активации элементарных стадий реакции гидролиза п-нитрофениллаурата липазой Candida rugosa в растворах дезоксихолата натрия. Показано, что регуляция активности липазы в растворах амфифильных

соединений осуществляется за счет изменения формы организации субстрата и его доступности к активному центру фермента.

Научно-практическая значимость работы. Изучение регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах имеет большое значение для понимания принципов функционирования ферментов, а также для решения многих прикладных вопросов, связанных с применением ферментативного катализа. Результаты работы могут быть использованы для направленного воздействия на активность фермента, что имеет большое значение для технологий биокатализа.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях биологической, биотехнологической и физико-химической направленности, занимающихся современными проблемами энзимологии, исследованием взаимосвязи структуры и функции биомакромолекул, а также изучением влияния микроокружения на активность ферментов. Представленные материалы могут использоваться в учебном процессе при чтении курсов лекций по биофизике, биохимии и молекулярной биологии.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНД РАН по теме «Межмолекулярные взаимодействия и молекулярная динамика как факторы регуляции функциональной активности белков» (номер госрегистрации №0120.0 803026) и частично поддержаны грантами РФФИ № 05-03-33110-а, № 09-03-00778-а, а также грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»). Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международном симпозиуме «Липиды и оксилипиньг растений» (Казань, 2008); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009); на Российской конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010); на XVII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2010); на I Всероссийском симпозиуме по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на IV Съезде Биофизиков России (Нижний Новгород, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи (из них 3 в журналах из списка ВАК; 1 в сборнике) и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 198 источников, из них 175 зарубежных. В работе представлено 8 таблиц и 45 рисунков.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Материалы. В работе использовали липазу Candida rugosa (КФ 3.1.1.3) производства Sigma (США); субстраты - п-нитрофениловые эфиры уксусной, пропионовой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой и пальмитиновой кислот производства MP Biomedicals LLC; амфифильные соединения: додецилсульфат натрия (ДСН), бромид цетилтриметиламмония (ЦТАБ), дезоксихолат натрия (ДХН), хенодезоксихолат натрия (ХДХН), холат натрия (ХН), триблоксополимер Плюроник F-127 и бета-казеин производства Sigma. Дибромид Ы.К'-бисгексадецил-^Н^Ы'-тетраметил-Ы.К'-гексилендиаммония (далее Гем) был предоставлен к.х.н. А. Б. Миргородской (ИОФХ им. А. Е. Арбузова КазНЦ РАН).

1.2. Кинетические измерения. Кинетические кривые регистрировали на спектрофотометре Lambda 25 (Perlón Elmer, США) с термостатируемым юоветным отделением. Раствор инкубировали при заданной температуре в течение 10 минут. Реакцию инициировали введением субстрата. Если не указано иное, концентрация фермента в реакционной смеси составляла 3.5xl0"g M, концентрация субстрата -8x10"s M. В экспериментах по определению параметров уравнения Михаэлиса-Ментен концентрацию субстрата варьировали в диапазоне (1-8)х10~5М. За скоростью гидролиза субстрата следили по изменению оптической плотности при 400 нм (поглощение анионной формы п-нитрофенола), определяя тангенс угла наклона касательной к прямолинейному начальному участку кинетической кривой. Максимальную скорость реакции и константу Михаэлиса определяли из зависимостей начальных скоростей реакции от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка.

1.3. Флуоресценция. Для регистрации спектров флуоресценции триптофановых остатков в молекуле липазы использовали спектрофлуориметр Флюорат-02-Панорама (ЛЮМЕКС, Россия). Регистрацию проводили в диапазоне 310400 нм (через 1 нм) при длине волны возбуждения 295 нм. Концентрация белка в образцах составила 0.1 мг/мл (1.8x10"6 М). Перед измерением образцы в кварцевых кюветах (оптический путь 1 см) термостатировали при заданной температуре в течение 10 минут.

1.4. Динамическое светорассеяние. Эксперименты по динамическому светорассеянию проводили на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments, Великобритания). Растворы предварительно отфильтровывали и термостатировали при заданной температуре в течение 10 минут.

1.5. Микроскопия. Эксперименты проводились на лазерном конфокальном сканирующем микроскопе LSM-510 Meta (Carl Zeiss. Германия) в световом режиме. Источник света: гелий-неоновый лазер, 543 нм.

1.6. Определение коэффициентов самодиффузии. Измерения коэффициентов самодиффузии (КСД) выполнены на спектрометре ЯМР AVANCE III (Bruker, Германия) с датчиком TXI 5мм, оснащенным градиентной катушкой. Для измерения

КСД использована импульсная последовательность "стимулированное эхо" с биполярными градиентами. Измерения КСД проведены на ядрах протонов 'Н (600.13 МГц). Градиент магиитного поля в экспериментах изменяли в интервале от 0 до 0.5 Тл-м"1 при постоянном времени диффузии и длительности импульсов градиента магнитного поля.

1.7. Исследование солгобнлизационпой емкости мицелл ПАВ. В качестве зонда использовали п-нитрофеииллаурат (ПНФЛ). К растворам ПАВ заданной концентрации объемом 4 мл добавляли 0.005 г ПНФЛ. Растворы выдерживали при 22°С в течение 5 часов при постоянном перемешивании. По истечении указанного времени растворы отфильтровывали для удаления нерастворившегося зонда. Для оценки количества солюбилизированного вещества проводили щелочной (рН=10) гидролиз ПНФЛ с последующим фотометрическим определением концентрации продукта (п-нитрофенол).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Общая характеристика липазы Candida rugosa

Согласно данным литературы липазы гидролизуют субстраты со средней и длинной алкильнон цепью, хотя многие научные группы используют короткоцепные субстраты, такие как, например, триацетин, п-нитрофенилбутират [Hernandez et al., 2011; Famet el al., 2010]. Для того, чтобы определить зависимость активности липазы Candida rugosa от длины цепи субстрата были проведены эксперименты по ферментативному гидролизу п-нитрофениловых эфиров различных кислот: уксусной (С1, ПНФА), пропионовой (С2, ПНФПр), каприловой (С7, ПНФКл), каприновой (С9, ПНФК), лауриновой (СП, ПНФЛ), миристиновой (С13, ПНФМ) и пальмитиновой (С15, ПНФП), а также определены кинетические параметры этих реакций.

Рис. 1. Концентрационная зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза субстрата: А - ПНФПр, Б - ПНФМ (рН=7.2, [Я]„=35 иМ. 23°С).

Для эфпров с длиной алкплыюго радикала 7-15 атомов углерода зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата имеет классический вид (кривая с насыщением), а лля короткоцеппых ПНФА и ПНФПр насыщения в

исследованном диапазоне

Таблица 1. Кинетические параметры реакции гидролиза п-пнтрофспнловмх субстратов с разном длиной алкилыюн цени (рН=7.2.

наолюдапось

концентрации (рис.1).

Тот факт, что насыщение липазы субстратом со средней длиной цепи достигается при меньших концентрациях, позволяет заключить, что сродство фермента к таким субстратам выше, чем к пнзкомолскуляриым. Об этом также свидетельствуют полученные значения кинетических параметров реакции гидролиза (таблица 1).

Таким образом, липаза Candida rugosa, как и большинство липаз [Farnet el al., 2010], предпочтительнее гидролпзует субстраты со средней длиной алкнльной цепи, которые, по-видимому, прочнее связываются с ферментом на начальном этапе каталитического процесса за счет множественных гидрофобных взаимодействий.

Субстрат 11с V.MAX. 10"s М/с Км, 10"5 М 105 (с-М)"1

ПНФА 1 3 28 0.03

ПНФПр т 43 24 0.51

ПНФКл 7 78 4 5.57

ПНФК 9 107 1.5 20.38

ПНФЛ 1 1 144 1.8 22.86

ПНФМ 13 126 1.4 25.71

ПНФП 15 70 3 6.67

2.2. Влнянис температуры на активность липазы Candida rugosa

Активность ферментов во многом определяется их коиформацией, которая в свою очередь зависит от свойств окружающей среды, таких как концентрация опп водородных ионов, температура, ионная

сила. На рис. 2 представлен температурный профиль активиости липазы Candida rugosa в реакции гидролиза ЛНФЛ. Максимальная активность фермента наблюдается при температуре 35°С. При повышении температуры от 15° до 35°С увеличение скорости реакции достигается за счет классического механизма активации Аррениуса, характерного не только для Рис. 2. Температурный профиль активности ферментативных, но и для обычных липазы Candida rugosa в реакции гидролиза химических реакций. При температуре ПМФЛ (рН=7.2. f£lu=35 нМ. [51„=80 мкМ).

выше 35°С начинается денатурация фермента, т.е. изменение его конформации и ограничение его каталитических способностей.

2.3. Агрегационныс свойства амфифильных соединений

Строение молекул ПАВ предопределяет особенности образованных ими супрамолекулярных агрегатов. Соединения, используемые в данной работе, можно разделить на 4 группы с учетом особенностей их строения.

Рис. 3. Структуры амфифильных соединений.

1. Додецилсульфат натрия (ДСН) и бромид цетилтриметиламмония (ЦТАБ) имеют структуру, типичную для классических ПАВ (рис. 3), в которой можно четко выделить полярную головную группу и гидрофобный радикал. Их агрегационное поведение подробно изучено [Smith, 1979; Modaressi et al., 2007; Зуев и др., 2007].

2. Соли желчных кислот (СЖК) характеризуются планарным распределением полярных и гидрофобных фрагментов. Основу этих молекул составляет жесткий стерановый остов с гидрофобными метальными и метиленовыми группами с одной стороны молекулы и полярными гидроксильными и карбоксильной группами с другой (рис. 3).

дсн

сн3

F-127

Таблица 2. Значения ККМ, коэффициентов самодиффузии и 3. В молекулах

геминальных ПАВ (рис. 3) две заряженные головные группы соединены углеводородным фрагментом. В этом случае на мицелло-образование может влиять изменение конформации спей-серного мостика.

4. Триблоксо-полимер (Плюроник Р-127, рис. 3) образован из блоков двух типов: гидрофильного полиэтиленоксидного фрагмента и гидрофобных полипропиленоксидных.

Представленные в таблице 2 результаты исследования агрегации классических

ПАВ (ДСН и ЦТАБ) хорошо согласуются с данными, приводимыми в литературе. В отличие от традиционных ПАВ, агрегация СЖК происходит ступенчато. Радиус мицелл СЖК монотонно увеличивается с концентрацией (рис. 4). Критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) геминального ПАВ на три порядка ниже его мономерного аналога (ЦТАБ). Триблоксополимер в исследованном диапазоне концентраций при 20°С представлен в виде мономеров.

Важным свойством мицелл ПАВ является их солюбилизационная емкость, т.е. способность увеличивать растворимость соединений, плохо растворимых в воде, за счет включения их в структуру мицелл [11а1^е1-Уа{*ш е1 а/., 2005]. Особенности строения амфифильных веществ и физико-химические характеристики образуемых ими агрегатов оказывают влияние на солюбилизационные свойства их растворов.

эадиуса мономеров (Рт, Д„) и мицелл ПАВ (Рм, Им) при 20 С

ПАВ ККМ, мМ от, Ю-10 м^/с Ю"10 м2/с Кта, нм Км. нм

ДСН 7.5 4.37 0.41 0.39 4.2

ЦТАБ 0.5 3.33 0.39 0.52 4.4

ДХН 2.8 3.68 * 0.47 *

ХДХН 3.7 3.64 0.47 *

хн 9.7 3.61 * 0.48 *

Гем 0.007 3.30 0.54 0.52 3.2

Р-127 представлен в виде мономеров в исследованном диапазоне концентраций (2-1600 мМ)

* - переменная величина, зависящая от концентрации ПАВ

Рис. 4. Зависимость средних размеров мицелл от концентрации ДХН.

2.4. Растворимость субстрата в воде и в растворах амфнфнльпых соединений

Использованный субстрат (ПНФЛ) - гидрофобное соединение, трудно растворимое в воде. При концентрациях выше 10 мкМ происходит его самоассоциация с образованием мицеллярных агрегатов [Мег^ег, 1979; Мегщег, Уепка1агат, 1986]. Наши данные по динамическому светорассеянию, ЯМР-самодиффузии и микроскопии подтверждают агрегационное состояние субстрата в растворе в рабочем диапазоне концентраций.

Солюбилизацию ПНФЛ растворами ПАВ оценивали при помощи молярной солюбилизационной емкости (х) и коэффициента распределения вещества между мицеллой и водой (Р):

(1)>

СПЛВ-ККМ

(2),

где Яовщ - общая растворимость солюбилизируемого вещества,

— его растворимость

в воде, С/ив ~ концентрация ПАВ, ККМ - критическая концентрация мицеллообразования.

С точки зрения термодинамики солюбилизация рассматривается как распределение вещества между мицеллярной и водной фазами, и стандартная свободная энергия солюбилизации может быть рассчитана по формуле:

ДО^-ЛПпР (3),

где Л - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура, Р -

коэффициент распределения вещества между мицеллярной и водной фазами.

В таблице 3 представлены результаты солюбилизации ПНФЛ в исследуемых системах. Раствор геминального ПАВ характеризуется самой высокой солюбилизационной емкостью, что, по-видимому, объясняется низким значением ККМ. Высокой солю-билизирующей способностью отличаются ДСН

Таблица 3. Солюбилизация ПНФЛ в водных растворах амфифильных соединений (22°С)_____

Система Спав, М v /v Р кДж/моль

вода 0 1

Гем 0.1 1310 0.026 1309 -17.59

ЦТАБ 0.1 674 0.014 673 -15.96

ДСН 0.1 618 0.013 617 -15.75

ХДХН 0.1 430 0.009 429 -14.86

дхн 0.1 360 0.007 359 -14.42

хн 0.1 125 0.003 124 -11.82

Б-127 0.11а1 3.5

Бета-казеин 2-10Ь 6

|а) из расчета на мономерное звено

и ЦТАБ - ПАВ с классическим строением, сходным со строением гидрофобного субстрата. Вероятно, именно сходство структур ПНФЛ и ПАВ является причииой его высокой растворимости. Алкильные радикалы молекул ДСН и ЦТАБ сохраняют высокую подвижность и гибкость в составе мицелл. Это позволяет вытянутым гидрофобным молекулам ПНФЛ легко встраиваться в ядро мицелл.

В растворах СЖК растворимость ПНФЛ существенно ниже. Этот факт можно объяснить невысокими значениями чисел агрегации . СЖК и стерическими препятствиями со стороны жесткого стеранового остова их молекул. В исследованном ряду СЖК растворимость ПНФЛ возрастает по мер>е увеличения их гидрофобности.

В растворах бета-казеина даже при концентрациях ниже ККМ растворимость субстрата в шесть раз выше, чем в воде. Как для молекул этого белка, так и для его мицелл характерна достаточно «рыхлая» структура, что, по-видимому, является причиной увеличения растворимости субстратг при концентрациях бета-казеина ниже ККМ [Farrel el а!., 2006; Home, 2006]. Поскольку в исследованном диапазоне концентраций триблоксополимер представлен в виде мономеров, в его растворах солюбилизации ПНФЛ не наблюдалось.

Метод ЯМР-самодиффузии на Таблица 4. Влияние концентрации ДХН примере ДХН позволил проанализировать на коэффициент самодиффузии и радиус изме„ение структуры коллоидной

системы, образованной субстратом, при варьировании концентрации ПАВ (таблица 4). Характер изменения радиуса частиц свидетельствует о взаимодействии ПНФЛ с ДХН и образовании смешанных агрегатов. Ниже ККМ молекулы ДХН встраиваются в агрегаты, образованные водонерастворимым субстратом. По достижении ККМ образующиеся мицеллы «растворяют» ПНФЛ за счет его солюбилизации. При высоких концентрациях ДХН размер смешанных агрегатов не отличается от размера мицелл ДХН.

Таким образом, можно заключить, что форма организации микрогетерогенной системы меняется с концентрацией ПАВ. В мицеллярных растворах исследованных соединений происходит концентрирование субстрата вследствие его солюбилизации.

ассоциатов ПНФЛ

Сдхн, мМ Одхн, Ю-'^/с Опнфл. Ю'10м2/с Кпнфл, нм

0 0.09 20

0.1 4.29 0.037 48

2.5 4.28 0.06 30

5 4.08 0.23 7.8

7 4.00 0.63 2.9

10 3.24 0.70 2.5

19 2.40 1.50 1.2

30 1.90 1.25 1.4

2.5. Изменение структуры липазы Candida rugosa в растворах амфифильных соединений

При анализе влияния амфифильных веществ на структуру липазы Candida rugosa, использовалась модель дискретных классов триптофанов в белках [Abornev, Burstein 1992; Burstein et al., 2001; Reshetnyak, Burstein 2001]. На рисунке 5 представлен суммарный спектр триптофановой флуоресценции 5 остатков триптофана с номерами 119, 161, 188, 221, 489 липазы Candida rugosa [Grouchulski et al., 1993] в буферном растворе. Разложение спектра на логнормальные компоненты по известному алгоритму [Burstein el al., 2001], позволяет выделить две компоненты с максимумами 329 и 357 нм. Анализ поверхности, доступной растворителю, выполненный при помощи программы MOLMOL, показал, что аминокислотный остаток Тгр188 наиболее экспонирован в растворитель (около 8.8% поверхности остатка доступно для воды). Остатки Тгр 119, 161, 221 и 489 находятся в глубине белковой глобулы и их поверхность, доступная растворителю, крайне мала (не более 3.5%). Этот расчет позволил предположить, что длинноволновая компонента с максимумом 357 нм определяется флуоресценцией Тгр 188, в то время как коротковолновая (329 нм) - флуоресценцией Тгр 161 и Тгр 489. Для Тгр 119 и Тгр 221 существует возможность тушения их флуоресценции за счет взаимодействия с соседними аминокислотными остатками.

В таблице 5 представлены значения максимумов флуоресценции липазы в растворах амфифильных веществ, а также результаты разложения суммарных

спектров на компоненты. Влияние

Таблица 5. Положение максимумов суммарной флуоресценции (Х„„(ср)) остатков триптофана липазы Candida rugosa и положения максимумов компонент (Х'ш„ и Хпт„) в буфере и в растворах амфифильных веществ (Спав

исследованных ПАВ на структуру липазы различно. В растворах ЦТАБ, ДХН и ДСН наблюдается красный сдвиг флуорес-

система ^ши(ср), нм maxj нм 1" л таю H M

буфер 346.0 328.6 356.6

Гем 336.0 327.0 362.3

ЦТАБ 345.2 331.0 358.6

ДСН 348.2 329.1 359.9

ДХН 349.2 332.6 360.8

ХДХН 345.5 329.0 357.3

ХН 345.2 328.5 357.3

F-127 345.0 329.2 357.0

Рис. 5. Спектр флуоресценции липазы Candida rugosa в буфере (рН=7.2, 25°С) и результат его разложения на компоненты.

ценции обеих компонент, что позволяет предположить разворачивание белка. Проникновение молекул растворителя вглубь фермента приводит к увеличению полярности микроокружения триптофановых остатков. В растворах ХН и ХДХН, в отличие от раствора ДХН, а также в растворе триблоксополимера не происходит достоверного изменения положения максимума флуоресценции обеих компонент, но наблюдается незначительный голубой сдвиг максимума суммарной флуоресценции, вызванный перераспределением интенсивностей компонент. Самые существенные изменения спектра наблюдаются в растворе Гем: происходит голубой сдвиг максимума суммарной флуоресценции на 10 нм, и красный сдвиг максимума длинноволновой компоненты на 5 нм.

Таким образом, по результатам, представленным в разделах 2.4 и 2.5, можно заключить, что исследованные амфифильные вещества оказывают влияние как на структуру фермента, так и на форму организации субстрата в растворе.

2.6. Кинетические параметры реакции ферментативного гидролиза ПНФЛ

Все попытки модифицировать каталитическую систему амфифильными соединениями приводили к снижению активности фермента. В растворах ДСН, ЦТАБ, Гем, бета-казеина и триблоксополимера наблюдалось резкое снижение активности фермента при увеличении концентрации ПАВ. В случае СЖК концентрационная зависимость носила сложный характер, наблюдались минимум и максимум активности, положение которых не менялось с температурой (рис. 6). При 42°С активность липазы в точке максимума на 20% выше по сравнению с буфером, что мы объясняем повышением устойчивости липазы по отношению к тепловой денатурации в растворах ДХН.

Анализ зависимостей начальной скорости гидролиза ПНФЛ от концентрации

субстрата в рамках уравнения Михаэлиса-Ментен позволил проследить, как изменяются основные кинетические параметры реакции в растворах исследуемых: амфифильных веществ (таблица 6). В растворах бета-казеина, триблоксополимера и Гем кинетические параметры уравнения Михаэлиса-Ментен определить не удалось в виду низкой активности фермента, что не позволило варьировать концентрацию субстрата. Существенное снижение активности фермента в растворах катионного ЦТАБ и анионного ДСН и искажение

Рис. 6. Концентрационная зависимость активности липазы Candida rugosa в растворах ДХН (температура I - 30°С, 2 -37°С, 3 - 42°С, 4 - 48°С).

формы кинетических кривых также не позволило достоверно оценить кинетические параметры реакции при концентрациях амфифила выше 0.03 и 0.3 мМ соответственно.

Во всех исследованных системах вне зависимости от особенностей строения амфифила и заряда головной

группы наблюдается снижение эффективности катализа (У). Поскольку амфифилы оказывают влияние и на величину максимальной скорости (У/мх) и на константу Михаэлиса (Км), ингибирование происходит по смешанному механизму.

В растворе ЦТАБ наблюдается снижение максимальной скорости реакции почти в 40 раз по сравнению с буфером, что, вероятно, вызвано изменением структуры фермента, затрагивающим активный центр. Сходство структур ЦТАБ и субстрата, а также трехкратное увеличение константы Михаэлиса доказывают конкурентный характер ингибирования. Эффективность катализа в растворе ЦТАБ минимальна, а в растворах Гем вообще не удалось определить кинетические параметры в виду низкой активносги фермента. Эти результаты позволяют заключить, что катионные ПАВ оказывают наибольшее ингибирующее действие на каталитический процесс. Этот вывод подтверждается и данными по изменению структуры фермента и солюбилизацин субстрата в растворах ЦТАБ. Снижение максимальной скорости реакции, эффективности катализа и увеличение константы Михаэлиса в растворах ДСН не так значительно по сравнению с раствором ЦТАБ той же концентрации. Данные по триптофановой флуоресценции липазы и солюбилизации ПНФЛ в растворах ДСН, как и в случае ЦТАБ, также доказывают смешанный механизм регуляции активности фермента.

Зависимость начальной скорости реакции от концентрации СЖК носит сложный характер (рис. 6). Для выявления причин подобной зависимости кинетические параметры реакции в растворах этих ПАВ определялись в трех точках.

Таблица 6. Константа Михаэлиса {Км), максимальная скорость (Ущх), каталитическая константа (ксш) и эффективность катализа (у) реакции гидролиза ПНФЛ

липазой Candida rugosa в растворах амфифильных веществ

Система Спав, мМ Км, jiM Vmax.-10-e М-с"1 k-cat» -i с s, 106 (М-с)'1

буфер 0 10 95 27.2 2.7

ДСН 0.03 19 82 23 1.2

0.3 17 30 í¡.5 0.5

ЦТАБ 0.03 30 2.4 0.69 0.02

дхн 2.4 5.6 18 5.1 0.9

4.8 61 44 12.6 0.2

хдхн 2.5 1.6 7.2 2.1 1.3

6 54 22 (¡.3 0.1

хн 5 15 53 15.3 1.0

12 20 71 20.1 1.0

Кинетические параметры нелинейно меняются с концентрацией ПАВ, что усложняет интерпретацию полученных результатов. Для того, чтобы понять молекулярные механизмы действия СЖК на каталитический процесс, недостаточно приведенных характеристик. Поэтому на примере ДХН был проведен анализ изменения констант скорости и энергий активаций элементарных стадий изучаемой реакции с концентрацией амфифила.

2.7. Исследование механизма ингибируюшего действия СЖК на активность липазы Candida rugosa

В рамках теории Михаэлиса-Ментен рассматриваемую реакцию ферментативного гидролиза ПНФЛ можно представить следующей схемой:

к' . __ fe . „. . „ к^

Е + S'

- ES

ЕА + Р

Е + Р

2 ,

где Е - фермент, £ - субстрат, ЕБ - фермент-субстратный комплекс, ЕА -ацилированный фермент, Р/ и Р> - продукты реакции.

В общем случае параметры уравнения Михаэлиса-Ментен, константу каталитическую (кса1), константу Михаэлиса (Км) и эффективность катализа (.у), можно представить в виде функции констант скоростей индивидуальных стадий реакции [Нес^йчэт, 2002]:

(4),

к, + к,

К,

к. +к,

(5).

Для определения констант скоростей и энергий активации каждой из элементарных стадий реакции использовалось уравнение температурной зависимости константы скорости реакции в рамках уравнения Аррениуса [Ayala, Di Cera, 2006]:

R 7" Ta

к = k0 exp

(6),

где E - энергия активации, k0 - константа скорости при температуре Т0, R -универсальная газовая постоянная, Т— абсолютная температура.

Для определения констант скоростей, энергий активации каждой из элементарных стадий реакции и эффективности катализа были проанализированы температурные зависимости константы каталитической (кса,) и эффективности катализа (s) в рамках уравнения Аррениуса б температурном диапазоне 15 - 48°С (рис. 7, таблица 7) [Ayala, Di Cera, 2006]: 1 1

exp

'l -4 1 + —exp 2,0 --±■11

R {T Го JJ R J

(7),

схр

Е, +Е, - £_,[ 1 I

+ —ехр к,»

Л 7" 7;

(8),

где ЕI, Е_и Е2 - энергии активации элементарных стадии, /с,„ - соответствующие константы скорости при температуре Т0.

Рис. 7. Температурные зависимости каталитической константы (А) и эффективности катал мча (Б) реакции гидролиза ПМФЛ липазой СипсЧЗи т^паи в буферном растворе (/) н растворах ДХН (2 - 2.4мМ,3 - 4.8мМ) в координатах Арреииуса.

Таблица 7. Константы скорости (к), энергии активации (Е) элементарных стадии реакции и эффективность катализа (5) для реакции ферментативного гидролиза ПНФЛ в буфере и в растворах ДХН (для 25°С при условии к2<<к,<)_______

Сдхн, к|, 10" к-ь к:, Е|. Е.ь Е2, Б, 10"

мМ М-1 с"' -1 с с"' кДж-моль" кДжмоль"' кДжмоль"1 М-'с"1

0 2.6 9.2-10"" 27.2 26.0 372.6 61.1 2.7

2.4 1.5 3.3 5.1 47.7 185.1 51.9 0.9

4.8 7.7 4.6 10- 12.6 41.9 41.0 84.6 0.2

Сравнительный анализ данных, представленных в таблице 7. показывает, что ДХН влияет на все элементарные стадии реакции. Эффективность катализа в растворах ДХН существенно ниже, чем в буфере. Как видно из формулы 7 эффективность катализа определяется вкладом всех трех экспериментально определенных констант скорости. Сравнив степень изменения констант к./ и к: в растворах ДХН. можно заключить, что уменьшение эффективности катализа в большей степени определяется изменением константы скорости диссоциации фермент-субстратного комплекса к.,. Уменьшение энергии активации этой стадии

может быть вызвано дестабилизацией этого комплекса в растворах ДХН; в результате происходит смещение равновесия обратимой стадии образования фермент-субстратного комплекса в сторону исходных реагентов.

Были рассмотрены два возможных механизма регуляции активности липазы. Первый связан с изменением структуры фермента в растворах амфифильных соединений. Данные триптофаиовой флуоресценции показывают, что в растворах ДХН происходит частичное разворачивание белка (таблица 5). Однако, очевидно, нельзя связывать наблюдаемые изменения активности липазы только с изменением структуры фермента. В растворах ХДХН и ХН также наблюдается сходный характер ингибирования, но согласно данным триптофаиовой флуоресценции не происходит разворачивания фермента. Второй механизм регуляции активности связан с изменением условий реакционного контакта субстрата с ферментом в растворах амфифильных соединений. Данные по ЯМР-самодиффузии (таблица 4) и солюбилизации субстрата (таблица 3) демонстрируют образование смешанных агрегатов между ДХН и ПНФЛ, что в свою очередь отразится на свойствах поверхности жировых капель и условиях взаимодействия субстрата с ферментом. Основываясь на приведенных исследованиях физико-химических свойств растворов ДХН, его влияния на состояние субстрата и структуру фермента, была предложена следующая модель функционирования липазы в растворах СЖК (рис.8).

ассоциированный субстрат

qWPO

Ok\\. • i,/, о

о. о

1 rP

о ex.

молекула ДХН /

.о

мицеллы ДХН

О'

о.

+ДХН <ккм

©О о©

X) р

+ДХН

>ккм

фермент

Рис. 8. Модель функционирования липазы Candida rugosa в растворах ДХН.

ПНФЛ в водном растворе образует агрегаты. При концентрации ДХН ниже ККМ вследствие высокого сродства к гидрофобной поверхности [Maldonado-Valderrama et al., 2011] его молекулы будут встраиваться в агрегаты, образованные субстратом. Появление анионных молекул на поверхности субстрата препятствует

сорбции липазы (область ее активного центра также несет отрицательный заряд [Cygler, Schrag, 1999]) и образованию фермент-субстратного комплекса, что отражается в уменьшении k¡ ив увеличении E¡ при низких концентрациях ДХН. При концентрациях ДХН выше 2.8 мМ, происходит самоассоциация амфифильных молекул. Мицеллярные растворы СЖК, как было показано ранее, характеризуются достаточно высокой солюбилизационно:3 емкостью по отношению к гидрофобному ПНФЛ. При этом отрицательный заряд головных групп ДХН в мицеллах скомпенсирован противоионами двойного электрического слоя и не препятствует контакту с липазой. Увеличение константы скорости и уменьшение энергии акгивации образования фермент-субстратного комплекса {kh Е,) при концентрации ДХН 4.8 мМ свидетельствуют об увеличении доступности субстрата для активного центра фермента. Таким образом, можно заключить, что агрегация ДХН способствует локальному концентрированию участников реакции, облегчая образование фермент-субстратного комплекса (мицеллярный каталитический эффект). Однако в целом эффективность катализа остается низкой. Сравнивая энергию активации процессов диссоциации фермент-субстратного комплекса (E.¡) и процесса ацилирования фермента (£?), можно заключить, что, несмотря на увеличение константы скорости образования фермент-субстратного комплекса в 4.8 мМ растворе ДХН, эффективность катализа и там остается низкой вследствие непродуктивного распада комплекса.

Дальнейшее увеличение концентрации ДХН вызывает снижение начальной скорости реакции вследствие увеличения числа мицеллярных агрегатов и разбавления субстрата. Таким образом, при ферментативном гидролизе ПНФЛ липазой Candida rugosa в растворах СЖК уровень активности фермента в первую очередь определяется коллоидным состоянием субстрата и условиями фермент-субстратного взаимодействия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема регуляции активности липаз амфифильными соединениями широко изучается. Наблюдаемые изменения активности фермента традиционно связывают с модификацией его структуры в раствора* ПАВ и с изменениями состояния субстрата в растворе.

свидетельствуют об изменении характера мик]х>гетерогенной системы, образованной субстратом, в растворах ПАВ. Таким образом, в данной работе было показано, что введение в систему амфифильных соединении оказывает влияние как на структуру фермента, так и на характер коллоидной системы.

Показано, что модификация реакционной среды амфифильными веществами негативно сказывается на активности липазы Candida rugosa и эффективности катализа. Анализ кинетических параметров реакции гидролиза, а также определение констант скорости и энергий активации элементарных стадий позволили заключить, что регуляция активности липазы Candida rugosa в микрогетерогенных растворах на основе СЖК в первую очередь осуществляется за счет изменения формы организации субстрата в растворе и изменения его доступности к активному центру фермента.

Полученные в нашей работе результаты расширяют современные представления о механизме функционирования липаз, а также открывают новые возможности для регуляции их активности.

ВЫВОДЫ

1. На основании сопоставительного анализа кинетических параметров реакции ферментативного гидролиза п-нитрофениллаурата, а также данных ЯМР, динамического светорассеяния, флуоресценции и солюбилизации субстрата установлено, что основными факторами регуляции активности липазы Candida rugosa в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений являются изменение структуры фермента и состояния коллоидной системы, образованной субстратом.

2. Установлено, что в мицеллярных растворах амфифильных соединений происходит солюбилизация субстрата и модификация поверхности раздела фаз вследствие образования смешанных агрегатов. Большей солюбилизационной емкостью обладают бромид цетилтриметил аммония, додецилсульфат натрия и геминальный алкиламмонийный ПАВ, строение которых сходно со строением субстрата.

3. Показано, что степень воздействия амфифильных соединений на структуру липазы Candida rugosa различна: в растворах бромида цетнлтриметиламмония, дезоксихолата натрия, додецилсульфата натрия и геминального алкиламмонийного ПАВ происходит частичное нарушение структуры фермента. В растворах холата натрия, хенодезоксихолата натрия и триблоксополимера конформационные изменения белка минимальны.

4. Установлен конкурентный характер ингибирования липазы Candida rugosa в растворах катионных бромида цетилтриметил аммония и геминального алкиламмонийного ПАВ.

5. На основе анализа температурных зависимостей параметров уравнения Михаэлиса-Ментен установлено, что снижение эффективности катализа в растворах дезоксихолата натрия связано с преимущественным влиянием амфифила на обратимую стадию образования фермент-субстратного комплекса.

6. Предложена модель регуляции активности липазы Candida rugosa в растворах солей желчных кислот, основанная на мицеллярном каталитическом эффекте -изменении микроокружения субстрата и его доступности активному центру фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Роль поверхностного потенциала в каталитическом действии мицелл катионных поверхностно-активных веществ с гидроксиал(сильным фрагментом в головной группе / А.Б. Миргородская, Л.Р. Богданова, JI.A. Кудрявцева и др. // Журнал общей химии. - 2008. - Т. 78, № 2. - С. 179-186.

2. Мицеллообразование в растворах дезоксихолата натрия / JI.P. Богданова, О.И. Гнездилов, Б.З. Иднятуллин и др. // Коллоидный журнал. - 2012. - Т. 74, № 1. С. 3-9.

3. Мицеллярный каталитический эффект как регулятор активности липаз / JI.P. Богданова, Е.А. Ермакова, Б.З. Идиятуллин и др. // Доклады академии наук. -2012. -Т. 446, № 4. С. 456-459.

Работы, опубликованные в материалах конференций

4. Богданова, JI.P. Влияние межфазной поверхности на каталитическую активность липазы Candida rugosa / Л.Р. Богданова, Ю.Ф. Зуев // Сб. тезисов / Изд. КГУ. - Казань, 2008. - С. 51.

5. Богданова, Л.Р. Поверхностная активация липазы Candida rugosa в растворах амфифильных соединений / Л.Р. Богданова, Б.З. Идиятуллин, Ю.Ф. Зуев // Сб. тезисов / Изд. ФизтехПресс КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2009. - С. 333.

6. Богданова, Л.Р. Влияние дезоксихолата натрия на константы скорости элементарных стадий реакции ферментативного гидролиза п-нитрофенилового эфира лауриновой кислоты / Л.Р. Богданова, Е.А. Ермакова, Ю.Ф. Зуев // Сб. тезисов / Изд. КГУ.-Казань, 2010.-С. 15.

7. Идиятуллин Б.З. Агрегация дезоксихолата натрия в водных растворах / Б.З. Идиятуллин, Л.Р. Богданова // Сб. тезисов / Изд. КГУ. - Казань, 2010. - С. 24.

8. Агрегационное поведение дезоксихолата натрия / Б.З. Идиятуллин, Л.Р. Богданова, Р.Х. Курбанов и др. // Сб. статей / ИФМК УНЦ РАН. - Уфа - Казань -Москва - Йошкар-Ола, 2010. - Ч. 1. - С. 244-247.

9. Агрегационное и солюбилизационное поведение дезоксихолата натрия / Л.Р. Богданова, О.И. Гнездилов, Б.З. Идиятуллин и др. // Сб. тезисов / Изд. Печатъ-Сервис-XXI век. - Казань, 2011. - С. 58.

10. Влияние деэоксихолата натрия на активность липазы Candida rugosa / JI.P. Богданова, Б.З. Идиятуллин, Е.А. Ермакова, Ю.Ф. Зуев // Сб. тезисов / Изд. Карельский научный центр РАН. - Петрозаводск, 2011. - С. 361.

11.Ферментативная активность липазы Candida rugosa в присутствии мицелл бета-казеина / Н.Л. Захарченко, Л.Р. Богданова, Т.А. Коннова, Ю.Ф. Зуев // Сб. тезисов / ННГУ им. Н.И. Лобачевского. - Нижний Новгород, 2012. - С. 112.

1 2- 2 08 47

2012340347

Подписано в печать 01.10.2012 г. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл.печ.л. 1,4 Уч-изд.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 14/10

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59,292-65-60

2012340347

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богданова, Лилия Рустемовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Липазы. Характеристика. Распространение в природе.

1.2. Поверхностная активация.

1.3. Молекулярная структура липаз.

1.3.1. Панкреатические липазы.

1.3.2. Микробные липазы.

1.4. Тенденция липаз к самоассоциации.

1.5. Механизм реакции гидролиза.

1.6. Кинетика межфазного катализа.

1.7. Микрогетерогенные системы на основе амфифильных соединений.

1.7.1. История вопроса.

1.7.2. Поверхностно-активные вещества (ПАВ).

1.7.3. Мицеллообразование.

1.7.4. Структура мицелл.

1.7.5. Солюбилизация. Влияние на скорость реакций.

1.8. Липиды. Физическое состояние субстрата в растворе.

1.9. Адсорбция белков на поверхности вода/масло.

1.10. Липазы в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений.

1.11. Постановка цели исследования.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выбор липолитического фермента.

2.2. Выбор субстрата.

2.3. Выбор амфифильных веществ.

2.4. Материалы.

2.5. Кинетические измерения.

2.6. Флуоресценция.

2.7. Динамическое светорассеяние.

2.8. Микроскопия.

2.9. Определение коэффициентов самодиффузии.

2.10. Исследование солюбилизационной емкости мицелл ПАВ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Общая характеристика липазы Candida rugosa.

3.1.1. Селективность липазы Candida rugosa по отношению к п-нитрофениловым субстратам с разной длиной алкильной цепи.

3.1.2. Реакция ферментативного гидролиза ПНФЛ. Влияние температуры на активность липазы Candida rugosa.

3.2. Агрегационные свойства амфифильных соединений.

3.2.1. Мицеллообразование типичных ПАВ.

3.2.2. Мицеллообразование солей желчных кислот.

3.2.3. Мицеллообразование геминального ПАВ.

3.2.4. Мицеллообразование триблоксополимера.

3.3. Растворимость субстрата в воде и в растворах амфифильных соединений.

3.4. Изменение структуры липазы Candida rugosa в растворах амфифильных соединений.

3.5. Активность липазы Candida rugosa в растворах амфифильных соединений.

3.5.1. Анионные поверхностно-активные вещества.

3.5.2. Катионные поверхностно-активные вещества.

3.5.3. Неионные поверхностно-активные вещества.

3.6. Механизм реакции ферментативного гидролиза ПНФЛ.

Определение констант скорости элементарных стадий реакции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений"

Большую роль среди ферментативных процессов играют процессы расщепления сложноэфирных и пептидных связей, протекающие под действием эстераз и протеаз [Uhlig, 1998; Wong, 2002]. Среди эстераз отдельно выделяют группу липаз - водорастворимых ферментов, которые катализируют гидролиз нерастворимых эфиров [Wolley, Petersen, 1994; Sharma et al., 2001; Wong, 2002; Brockman, 2004]. Одна из наиболее интересных характерных особенностей липолитических ферментов - это уникальные физико-химические условия катализируемых ими реакций. Катализ происходит на поверхности раздела фаз, что существенно осложняет его исследование и в то же время позволяет использовать дополнительные факторы для регуляции активности фермента в микрогетерогенной системе. Необходимо отметить, что не только липолиз, но и другие ферментативные реакции в живых системах протекают вблизи или на поверхности раздела фаз. In vivo ферменты адсорбированы на биологических мембранах, встроены в мембрану или иммобилизованы внутри замкнутых мембранных структур [Martinek et al, 1989; Seddon et al., 2004; Antalis et al., 2011]. Поэтому исследование липолиза сочетает в себе фундаментальные и практические задачи, связанные с механизмами действия ферментов в микрогетерогенных средах.

Липазы функционируют и в гомогенной среде, однако их активность в такой системе, как правило, невелика. Особенностью липаз, выделяющей их среди других ферментов, работающих на поверхности раздела фаз, является поверхностная активация, т.е. резкое увеличение активности при концентрациях субстрата, превышающих его предел растворимости [Sarda, Desnuelle; 1958]. Однако in vivo, как правило, субстрат не присутствует в системе сам по себе, изолированно от других веществ, а находится в сложной многокомпонентной коллоидной системе. Во всех биологических растворах, в которых происходит расщепление липидов, присутствуют разнообразные амфифильные вещества, которые выступают в качестве эффекторов. Характер воздействия амфифильных веществ на каталитическую систему определяется целым комплексом свойств молекул ПАВ, таких как структура, заряд головной группы, агрегационные и солюбилизационные свойства. Проблеме функционирования липаз в растворах амфифильных соединений посвящено много исследований. В литературе рассматриваются две модели, с помощью которых делается попытка подвести молекулярную платформу к регуляции активности липаз: ферментативная и субстратная [Verger, 1980; Thuren, 1988; Reis et al., 2009; Reis et al., 2010]. Ферментативная модель основана на изменении структуры фермента в области активного центра при взаимодействии с поверхностью жировой капли субстрата. Согласно субстратной модели регуляция липолитической активности осуществляется за счет изменения локальной концентрации субстрата и его доступности активному центру фермента. Обе предложенные модели имеют ряд существенных недостатков, и поэтому не могут с единых позиций объяснить накопленный эмпирический материал. Таким образом, несмотря на наличие достаточно большого количества данных по каталитической активности и строению липаз вопрос о механизмах регуляции их активности и о влиянии свойств границы раздела фаз на каталитический процесс до сих пор до конца не изучен. Эта проблема представляет как фундаментальный интерес для понимания механизмов катализа липолитических реакций, так и может иметь важное прикладное значение при регуляции активности липаз в производственных процессах.

Целью работы являлось исследование молекулярных механизмов регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений и поиск взаимосвязи между физико-химическими и каталитическими характеристиками систем.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. С применением комплекса физико-химических методов охарактеризовать агрегационные свойства амфифильных соединений различного строения: классических анионных и катионных поверхностно-активных веществ, геминальных ПАВ, солей желчных кислот с планарным распределением полярных и гидрофобных фрагментов и триблоксополимера.

3. Провести анализ спектров триптофановой флуоресценции липазы Candida rugosa и установить механизмы влияния рассматриваемых амфифильных соединений на структуру фермента.

4. Исследовать каталитическую активность липазы Candida rugosa в микрогетерогенных системах на основе заявленных амфифильных соединений. Определить кинетические параметры реакции ферментативного гидролиза п-нитрофениллаурата.

5. На основе сопоставительного анализа кинетических параметров реакции ферментативного гидролиза п-нитрофениллаурата, а также данных по солюбилизации субстрата и изменению структуры фермента в растворах амфифильных соединений определить факторы регуляции активности липазы Candida rugosa.

Для выполнения поставленных задач были использованы следующие методические подходы:

1) измерение коэффициентов самодиффузии в растворах амфифильных соединений (метод ЯМР);

2) исследование распределения частиц по размерам в растворах субстрата и в системах белок-амфифил, субстрат-амфифил (методы динамического светорассеяния, микроскопии, ЯМР);

3) оценка растворимости ПНФЛ в буферном растворе и в растворах заявленных ПАВ;

4) регистрация спектров флуоресценции триптофановых остатков в составе липазы Candida rugosa в буферном растворе и в растворах заявленных ПАВ;

5) регистрация кинетических кривых реакции ферментативного гидролиза ПНФЛ в буферном растворе и в растворах заявленных ПАВ (метод УФ-спектроскопии) и определение начальных скоростей реакции;

6) исследование температурных зависимостей параметров уравнения Михаэлиса-Ментен в буферном растворе и в растворах дезоксихолата натрия.

Научная новизна работы. Получены данные о влиянии широкого спектра амфифильных веществ различного строения на структуру и каталитическую активность липазы Candida rugosa. Впервые получены количественные параметры, характеризующие солюбилизирующую способность мицеллярных растворов исследованных амфифильных соединений по отношению к субстрату.

Научно-практическая значимость работы. Изучение поверхностной активации липаз в микрогетерогенных системах имеет большое значение для понимания принципов функционирования ферментов, а также для решения многих прикладных вопросов, связанных с применением ферментативного катализа. Результаты работы могут быть использованы с целью направленного воздействия на активность фермента, что имеет большое значение для технологий биокатализа.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Межмолекулярные взаимодействия и молекулярная динамика как факторы регуляции функциональной активности белков» (номер госрегистрации №0120.0 803026) и частично поддержаны грантами РФФИ № 05-03-33110-а, № 09-03-00778-а, а также грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»). Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды»

Казань, 2009); на Российской конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010); на XVII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2010); на I Всероссийском симпозиуме по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на IV Съезде Биофизиков России (Нижний Новгород, 2012).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Богданова, Лилия Рустемовна

Выводы

2. Установлено, что в мицеллярных растворах амфифильных соединений происходит солюбилизация субстрата и модификация поверхности раздела фаз, вследствие образования смешанных агрегатов. Большей солюбилизационной емкостью обладают бромид цетилтриметиламмония, додецилсульфат натрия и геминальный алкиламмонийный ПАВ, строение которых сходно со строением субстрата.

3. Показано, что степень воздействия амфифильных соединений на структуру липазы Candida rugosa различна: в растворах бромида цетилтриметиламмония, дезоксихолата натрия, додецилсульфата натрия и геминального алкиламмонийного ПАВ происходит частичное нарушение структуры фермента. В растворах холата натрия, хенодезоксихолата натрия и триблоксополимера конформационные изменения белка минимальны.

4. Установлен конкурентный характер ингибирования липазы Candida rugosa в растворах катионных бромида цетилтриметиламмония и геминального алкиламмонийного ПАВ.

6. Предложена модель регуляции активности липазы Candida rugosa в растворах солей желчных кислот, основанная на мицеллярном каталитическом эффекте - изменении микроокружения субстрата и его доступности активному центру фермента.

Заключение

Проблема регуляции активности липаз амфифильными соединениями широко изучается. Наблюдаемые изменения активности фермента традиционно связывают с модификацией его структуры в растворах ПАВ и с изменениями состояния субстрата в растворе.

В данной работе было проведено комплексное исследование влияния различных амфифильных соединений, отличающихся по структуре и заряду головных групп, на участников реакционного процесса. Измерение триптофановой флуоресценции фермента позволило оценить структурные изменения, происходящие с белком в растворах ПАВ. Данные по солюбилизационной емкости мицеллярных растворов, а также результаты ЯМР-самодиффузии свидетельствуют об изменении характера микрогетерогенной системы, образованной субстратом, в растворах ПАВ. Таким образом, в данной работе было показано, что введение в систему амфифильных соединений оказывает влияние как на структуру фермента, так и на характер коллоидной системы.

Полученные в нашей работе результаты расширяют современное понимание процесса функционирования липаз, а также открывают новые возможности для регуляции их активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богданова, Лилия Рустемовна, Казань

1. Системы на основе неионных амфифильных соединений: агрегация и каталитические свойства / Ю. Р. Аблакова, А. Б. Миргородская, Л. Я. Захарова, Ф. Г. Валеева // Изв. АН., Сер. Хим. 2010. - Т. 4. - С. 768773.

2. Богатова, О. В. Химия и физика молока: Учебное пособие. / Богатова О. В., Догарева Н. Г. Оренбург: ГОУ ОГУ, 2004. - 137 С.

3. Мицеллообразование в растворах дезоксихолата натрия / Л. Р. Богданова, О. И. Гнездилов, Б.З. Идиятуллин и др. // Коллоидный журнал. 2012. - Т.74. - С. 3-9.

4. Мицеллярный каталитический эффект как регулятор активности липаз / Л. Р. Богданова, Е. А. Ермакова, Б. 3. Идиятуллин и др. // Доклады академии наук. 2012. Т. 446. - С. 456-459.

5. Динамическая структура мицелл геминальных алкиламмонийных ПАВ / Н. Н. Вылегжанина, А. Б. Миргородская, В. А. Панкратов, Ю. Ф. Зуев // Коллоидный журнал. 2010. - Т. 72. - С. 162-170.

6. Влияние электролитов на каталитические свойства и структурные характеристики мицелл бромида додецилпиридиния / Л. Я. Захарова, Д. Б. Кудрявцев, Л. А. Кудрявцева и др. // Ж. Общ. Хим. 2002. - Т. 72. - С. 458-464.

7. Катализ реакций нуклеофильного замещения в супрамолекулярных системах / Л. Я. Захарова, А. Б. Миргородская, Е. П. Жильцова и др. // Изв. АН, Сер. Хим. 2004. - Т. 53. - С. 1-17.

8. Захарченко, Н. Л. Влияние микроокружения трипсина на константы скорости элементарных стадий реакции гидролиза этилового эфира №-бензоил-Ь-аргинина / Н. Л. Захарченко, Е. А. Ермакова, Ю. Ф. Зуев // Биоорганическая химия. 2008. - Т. 34. - С. 404-408.

9. Самодуффузия додецилсульфата натрия в предмицеллярных и низкоконцентрированных мицеллярных растворах в присутствиифонового электролита / Ю. Ф. Зуев, P. X. Курбанов, Б. 3. Идиятуллин, О. Г. Усьяров // Коллоидный журнал. 2007. - Т. 69. - С. 482-487.

10. Корниш-Боуден, Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден Пер. с англ. / под. ред. Б. И. Курганова - М.: Мир, 1979. - 280 с.

11. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович. -М.: Мир, 1986.-496 С.

12. Левашов, А. В. Мицеллярная энзимология: методы и техника / А. В. Левашов, Н. Л. Клячко // Изв. АН. Сер. хим. 2001. - №10. С. 16381651.

13. Каталитические свойства микрогетерогенных систем на основе катионных ПАВ в процессах переэтерификации / А. Б. Миргородская, Л. А. Кудрявцева, Н. Н. Вылегжанина и др. // Кинетика и катализ. 2006. -Т. 47.-С. 9-15.

14. Реакция эфиров карбоновых кислот с фенолятами в прямых микроэмульсиях на основе бромида цетилтриметиламмония / А. Б. Миргородская, Ф. Г. Валеева, Л. А. Кудрявцева и др. // Ж. Общ. Хим. -2006.-Т. 76.-С. 621-627.

15. Смешанные мицеллярные системы геминальных алкиламмонийных ПАВ и длинноцепных аминов / А. Б. Миргородская, Л. А. Кудрявцева, Н. Н. Вылегжанина и др. // Известия АН, Сер.Хим. 2010. - Т. 59. - С. 774-780.

16. Каталитические системы на основе дикатионных ПАВ для щелочного гидролиза эфиров фосфоновых кислот / А. Б. Миргородская, Ф. Г. Валеева, С. С. Лукашенко и др. // Кинетика и катализ. 2012. - Т. 53. -С. 1-8.

17. Смешанные мицеллярные системы геминальное поверхностно-активное вещество-неионный полимер / А. Б. Миргородская, Е. И. Яцкевич, JI. Я. Захарова, А. И. Коновалов // Коллоидный журнал. 2012. - Т. 74. - С. 96-103.

18. Миттел, К. Мицеллобразование, солюбилизация и микроэмульсии / К. Миттел. М.: Мир, 1980. - 598 С.

19. Русанов, А. И. Мицеллообразование в растворах поверхностно-активных веществ / А. И. Русанов. СПб.: Химия, 1992. - 280 С.

20. Савин, С. Б. Поверхностно-активные вещества / С. Б. Савин, Р. К. Чернова, С. Н. Штыков. М.: Наука, - 1991. - 250 С.

21. Фрайфелдер Д., Физическая биохимия / Д. Фрайфелдер. М: Мир, 1980.-580 С.

22. Abornev, S. М. Decomposition fluorescence spectra of tryptophan residues in proteins based on log-normal components by a least squares method / S. M. Abornev, E. A. Burshtein // Mol Biol (Mosk). 1992. - Vol. 26. - P. 13501361.

23. Alexander, A. E. Colloid Science / A. E. Alexander, P. Johnson. London: Oxford Univ. Press, - 1949. - 837 P.

24. Alexander, M. Dynamic light scattering techniques and their applications in food science / M. Alexander, D. G. Dalgleish // Food Biophysics. 2006. -Vol. l.-P. 2-13.

25. Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies / A. Aloulou, J. A. Rodriguez, S. Fernandez et al. Il Biochim. Biophis. Acta, Mol. Cell Biol. Lipids 2006. -Vol. 1761. - P. 995-1013.

26. Antalis, T. M. Membrane-anchored serine proteases in health and disease / T. M. Antalis, T. H. Bugge, Q. Wu // Progress in molecular biology and translational science / E. Di Cera, ed. Amsterdam - Boston: Elsevier, 2011. -Vol. 99.-Ch. l.-P. 1-50.

27. Micellar structures of dimeric surfactants with phosphate head groups and wettable spacers: a small-angle neutron scattering study / V. K. Aswal, S. De, P. S. Goyal et al. II Phys. Rev. E. 1999. - Vol. 59. - P. 3116-3122.

28. Aswal, V. K. Formation of rodlike block copolymer micelles in aqueous salt solutions / V. K. Aswal, A. G. Wagh, M. Kammel // J. Phys.: Condens. Matter. 2007. - Vol. 19. - P. 116101-116109.

29. Ayala, Y. M. A simple method for the determination of individual rate constants for substrate hydrolysis by serine proteases / Y. M. Ayala, E. Di Cera // Prot. Sci. 2000. - Vol. 9. - P. 1589-1593.

30. Atomic force microscope visualization of lipid bilayer degradation due to action of phospholipase A2 and Humicola lanuginose lipase / K. Balashev, N.

31. J. DiNardo, T. H. Callisen et al. II Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. -2007.-Vol. 1768.-P. 90-99.

32. Beisson, F. Methods for lipase detection and assay: a critical review / F. Beisson, A. Tiss, C. Riviere, R. Verger // Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000. -Vol. 102.-P. 133-153.

33. Bengtsson, G. Lipoprotein lipase moves rapidly between lipid droplets / G. Bengtsson, T. Olivecrona//FEBS Lett. 1983. -Vol. 154. - P. 211-213.

34. Oligomeric structure of hepatic lipase: evidence from a novel epitope tag technique / D. E. Berryman, J. J. Mulero, L. B. Hughes et al. II Biochim. Biophys. Acta, Protein Struct. Mol. Enzymol. 1998. - Vol. 1382. - P. 217229.

35. Blow, D. M. Role of burid acid group in the mechanism of action of chymotrypsin / D. M. Blow, J. J. Birktoft, B. S. Hartley // Nature. 1969. -Vol. 221.-P. 337-340.

36. Borgstrom, B. On the interactions between pancreatic lipase and colipase and the substrate, and the importance of bile salts / B. Borgstrom // 1975. Vol. 16.-P. 411-417.

37. Horse pancreatic lipase. The crystal structure refined at 2.3 A resolution / Y. Bourne, C. Martinez, B. Kerfelec et al. II J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 238. P. 709-732.

38. A serine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase / L. Brady, A. M. Brzozowski, Z. S. Derewenda et al. II Nature. 1990. - Vol. 343.-P. 767-770.

39. Brenner, S. The molecular evolution of genes and proteins: a table of two serines / S. Brenner // Nature. 1988. - Vol. 334. - P. 528-530.

40. Localization of lipase genes on Candida rugosa chromosomes / S. Brocca, R. Grandoni, D. Breviario, M. Lotti // Curr. Genet. 1995. - Vol. 28. - P. 454457.

41. Brockman, H. L. The hydrolysis of tripropionin by pancreatic lipase adsorbed to siliconized glass beads / H. L. Brockman, J. H. Law, F. J. Kezdy // J. Biol. Chem. 1973. - Vol. 248. - P. 4965-4970.

42. Brockman, H. L. Kinetic behavior of the pancreatic lipase-colipase-lipid system / H.L. Brockman // Biochimie. 2000. - Vol. 82. - P. 987-995.

43. Brockman, H. L. Lipases / H. L. Brockman // Encyclopedia of biological chemistry / W. J. Lennarz, M. D. Lane, eds. New York: Elsevier, 2004. - P. 571-575.

44. Bunton, C. A. Organic reactivity in aqueous micelles and similar assemblies / C. A. Bunton, G. Savelli // Adv. Phys. Chem. 1986. - Vol. 22. - P. 213309.

45. Burdette, R. A. Interfacial reaction dynamics and acyl-enzyme mechanism for lipoprotein lipase-catalyzed hydrolysis of lipid p-nitrophenyl esters / R. A. Burdette, D. M. Quinn // J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261. - P. 1201612021.

46. Burstein, E. A. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms / E. A. Burstein, S. M. Abornev, Y. K. Reshetnyak // Biophys. J. 2001. - Vol. 81. - P. 16991709.

47. Carey, M. C. The characteristics of mixed micellar solutions with particular reference to bile / M. C. Carey, D. M. Small // Am J. Med. 1970. - Vol. 49. -P. 590-608.

48. Carman, G. M. Lipid signaling enzymes and surface dilution kinetics / G. M. Carman, R. A. Deems, E. A. Dennis // J. Biol. Chem. -1995. Vol. 270. - P. 18711-18714.

49. Chang, G.-G. Reverse micelles as life-mimicking systems / G.-G. Chang, T.-M. Huang, H.-C. Hung // Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China B. 2000. -Vol. 24.-P. 89-100.

50. Mechanism of pancreatic lipase action. I. Interfacial activation of pancreatic lipase / C. Chapus, M. Semeriva, C. Bovier-Lapierre, P. Desnuelle // Biochemistry. 1976. - Vol. 15. - P. 4980-4987.

51. Chaudhuri, A. Structural transition in micelles: novel insight into microenvironmental changes in polarity and dynamics / A. Chaudhuri, S. Haldar, A. Chattopadhyay // Chem. Phys. Lipids. 2012. - Vol. 165. - P. 497-504.

52. Cygler, M. Structure and conformational flexibility of Candida rugosa lipase / M. Cygler, J. D. Schrag // Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Biol. Lipids. -1999.-Vol. 1441.-P. 205-214.

53. Branched threadlike micelles in an aqueous solution of a trimeric surfactant / D. Danino, Y. Talmon, H. Levy et al. II Science. 1995. - Vol. 269. - P. 1420-1421.

54. Das, S. Aggregation and adsorption behaviors of sodium deoxycholate in water-ethylene glycol medium / S. Das, U. Thapa, K. Ismail // Bull. Chem. Soc. Jpn. 2010. - Vol. 83. - P. 1352-1358.

55. Adsorption and activity of Candida rugosa lipase on polypropylene hollow fiber membrane modified with phospholipid analogous polymers / H.-T. Deng, Z.-K. Xu, X.-J. Huang et al. II Langmuir. 2004. - Vol. 20. - P. 10168-10173.

56. Derewenda, Z. S. The crystal and molecular structure of the Rhizomucor miehei triacylglyceride lipase at 1.9 A resolution / Z. S. Derewenda, U. Derewenda // J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 227. - P. 818-839.

57. A monolayer and bulk study on the kinetic behavior of Pseudomonas glumae lipase using synthetic pseudoglycerides / A. M. T. J. Deveer, R. Dijkman, M. Leuveling-Tjeenk et al. //Biochemistry. 1991. - Vol. 30. - P. 10034-10042.

58. Effect of head group size, temperature and counterion specificity on cationic micelles / A. Di Michele, L. Brinchi, P. Di Profio et al. II J. Colloid Interface Sci.-2011.-Vol. 358.-P. 160- 166.

59. Ericsson, B. Effect of cationic amphiphiles and temperature on lysozyme conformation / B. Ericsson, P-O. Hegg, K. Martensson // J. Dispersion Sci. Technol. 1987. - Vol. 8. - P. 271-287.

60. Ericsson, B. Effects of amphiphiles on trypsin activity and conformation / B. Ericsson, P.-O. Hegg, K. Martensso // J. Dispersion Sci. Technol. 1987. -Vol. 8.-P. 289-301.

61. Lipid classification, structures and tools / E. Fahy, D. Cotter, M. Sud, S. Subramaniam // Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Biology Lipids. -2011. -Vol. 1811.-P. 637-647.

62. Reversibility and irreversibility of adsorption of surfacatants and proteins at liquid interfaces / V. B. Fainerman, R. Miller, J. K. Ferri et al. II Adv. Colloid Interface. Sci. 2006. - Vol. 123-126.-P. 163-171.

63. A modified method based on p-nitrophenol assay to quantify hydrolysis activities of lipases in litters / A. M. Farnet, L. Qasemian, L. Goujard et al. II Soil Biol. Biochem. 2010. - Vol. 42. - P. 386-389.

64. Casein micelle structure: What can be learned from milk synthesis and structural biology? / H. M. Farrell Jr., E. L. Malin, E. M. Brown, P. X. Qi // Cuit. Opin. Colloid Interface Sci. 2006. - Vol. 11.-P. 135-147.

65. Fendler, E. J. Micellar catalysis in organic reactions: kinetic and mechanistic applications / E. J. Fendler, J. H. Fendler // Adv. Phys. Org. Chem. 1970. -Vol. 8. - P.271-^406.

66. Interfacially activated lipases against hydrophobic supports: effect of the support nature on the biocatalytic properties / G. Fernandez-Lorente, Z. Cabrera, C. Godoy et al. II Process Biochem. 2008. - Vol. 43. - P. 1061— 1067.

67. Fontell, K. Micellar behavior in solutions of bile-acid salts. I. Vapor pressure of the aqueous solutions and the osmotic activity of the bile-acid salts / K. Fontell // Kolloid-Z. Z. Polym. 1971. - Vol. 244. - P. 246-252.

68. Primary structure of the glycans of porcine pancreatic lipase / B. Fournet, Y. Leroy, J. Montreuil et al. II Eur. J. Biochem. 1987. - Vol. 170. - P. 369371.

69. Cis-trans isomerization is rate-determining in the reactivation of denatured human carbonic anhydrase II as evidenced by proline isomerase / C. Fransson, P. O. Freskgard, H. Herbertsson et al. II FEBS Lett. 1992. - Vol. 296. - P. 90-94.

70. Membranolytic activity of bile salts: influence of biological membrane properties and composition / P. Garidel, A. Hildebrand, K. Knauf, A. Blume // Molecules. 2007. - Vol. 12. - P. 2292-2326.

71. Structure of uncomplexed and linoleate-bound Candida cylindracea cholesterol esterase / D. Ghosh, Z. Wawrzak, V. Z. Pletnev et al. II Structure. 1995. - Vol. 3. - P. 279-288.

72. Goni, F. M. Phospholipases C and spingomyelinases: lipids as substrates and modulators of enzyme activity / F. M. Goni, L.-R. Montes, A. Alonso // Prog. Lipid Res. 2012. - Vol. 51. - P. 238-266.

73. Molecular dynamics of microbial lipases as determined from their intrinsic tryptophan fluorescence / M. Graupner, L. Haalck, F. Spener et al. Il Biophys. J. 1999. - Vol. 77. - P. 493-504.

74. Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate bindidng site in Candida rugosa lipase / P. Grochulski, F. Bouthillier, R. J. Kazauskas et al. Il Biochemistry. 1994. - Vol. 33. - P. 3494-3500.

75. Insights into interfacial activation from an open structure of Candida rugosa lipase / P. Grouchulski, Y. Li, J. D. Schräg et al. II J. Biol. Chem. 1993. -Vol. 268.-P. 12843-12847.

76. Two conformational states of Candida rugosa lipase / P. Grochulski, Y. Li, J. D. Schräg, M. Cygler // Protein Sei. 1994. - Vol. 3. - P. 82-91.

77. Rapid exchange of pancreatic lipase between triacylglycerol droplets / H. Haiker, H. Lengsfeld, P. Hadvary, F. Carriere // Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Biol. Lipids. 2004. - Vol. 1682. - P. 72-79.

78. Hasan, F. Industrial applications of microbial lipases / F. Hasan, A. A. Shah, A. Hameed // Enzyme Microb. Technol. 2006. - Vol. 39. - P. 235-251.

79. Hedstrom, L. Serine protease mechanism and specificity / L. Hedstrom // Chem. Rev. 2002. - Vol. 102. - P.4501-4523.

80. Lipase activation by nonionic detergents. The crystal structure of the porcinelipase-colipase-tetraethylene glycol monooctyl ether complex / J. Hermoso, D. Pignol, B. Kerfelee et al. II J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. -P. 18007-18016.

81. Temperature dependence of the interaction of cholate and deoxycholate with fluid model membranes and their solubilization into mixed micelles / A. Hildebrand, K. Beyer, R. Neubert et al. II Colloids Surf., B. 2003. - Vol. 32.-P. 335-351.

82. Holwerda, K. Vergleichemde undersuchungen über die verseifungsgeschwindigkeit einiger ein sauriger triglyceride unter einfluss von pankreasextrakt / K. Holwerda, P. E. Verkade, A. H. A. Willigen // Ree. Trav. Chim. 1936. - Vol. 55. - P. 43-57.

83. Home, D. S. Casein micelle structure: models and muddles / D. S. Home // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2006. - Vol. 11. - P. 148-153.

84. Extracellular lipase from Pseudomonas aeruginosa is an amphiphilic protein / K. E. Jaeger, F. J. Adrian, H. E. Meyer et al. II Biochim. Biophys. Acta, Protein Struct. Mol. Enzymol. 1992. - Vol. 1120. - P. 315-321.

85. Topological characterization and modeling of the 3D structure of lipase from Pseudomonas aeruginosa / K.-E. Jaeger, S. Ransac, H.B. Koch et al. IIFEBS Lett. 1993. - Vol. 332. - P. 143-149.

86. Jain, M. K. The kinetics of interfacial catalysis by phospholipase A2 and regulation of interfacial activation: hopping versus scooting / M. K. Jain, O. G. Berg // Biochim. Biophys. Acta, Lipids Lipid Metabol. 1989. - Vol. 1002.-P. 127-156.

87. Biocatalysis using gelatin microemulsion-based organogels containing immobilized Chromobacterium viscosum lipase / T. R.-J. Jenta, G. Batts, G. D. Rees, B. H. Robinson // Biotechnol. Bioeng. 1997. - Vol. 53. - P. 121131.

88. Role of counterion of the surfactant molecule on the micellar structure in aqueous solution / J. V. Joshi, V. K. Aswal, P. Bahadur, P. S. Goyal // Curr. Sci. 2002. - Vol. 83. - P.47-49.

89. High-throughput evaluation of the critical micelle concentration of detergents / T. Jumpertz, B. Tschapek, N. Infed et al. II Anal. Biochem. 2011. - Vol. 408.-P. 64-70.

90. Kataoka, K. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance / K. Kataoka, A. Harata, Y. Nagasaki // Adv. Drug Delivery Rev. 2001. - Vol. 47. - P. 113-131.

91. Advances in polymeric micelles for drug delivery and tumor targeting / U. Kedar, P. Phutane, S. Shidhaye, V. Kadam // Nanomedicine. 2010. - Vol. 6.-P. 714-729.

92. Kelley, D. Interactions of bovine serum albumin with ionic surfactants in aqueous solutions / D. Kelley, D. J. McClements // Food Hydrocolloids. -2003.-Vol. 17.-P. 73-85.

93. Koradi, R. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures / R. Koradi, M. Billeter, K. Wthrich // J. Mol. Graphics Modell. -1996.-Vol. 14.-P. 51-55.

94. Substrate-selective dehydrocondensation at the interface of micelles and emulsions of common surfactants / M. Kunishima, K. Kikuchi, Y. Kawai, K. Hioki // Angew.Chem., Int. Ed. 2012. - Vol. 51. - P. 2080-2083.

95. Lipase-surfactant interactions studied by neutron reflectivity and ellipsometry / L.-T. Lee, B. K. Jha, M. Malmsten, K. Holmberg // J. Phys. Chem. B. -1999. Vol. 103. - P. 7489-7494.

96. Li, G. Model for bile salt micellization and solubilization from studies of a «polydisperse» array of fluorescent probes and molecular modeling / G. Li, L. B. McGown // J. Phys. Chem. 1994. - Vol. 98. - P. 13711-13719.

97. Lin, Y. Temperature-dependent adsorption of Pluronic F127 block copolymers onto carbon black particles dispersed in aqueous media / Y. Lin, P. Alexandridis // J. Phys. Chem. B. 2002. - Vol. 106. - P. 10834-10844.

98. Liou, Y.-C. Aggregation behavior of Candida Rugosa lipase / Y.-C. Liou, A. Marangoni, R. Y. Yada // Food Res. Int. 1998. - Vol. 31. - P. 243-248.

99. Cloning and nucleotide sequences of two lipase genes from Candida cylindracea / S. Longhi, F. Fusetti, R. Grandori et al. II Biochim. Biophys. Acta, Gene Struct. Expr. 1992. - Vol. 1131. - P. 227-232

100. Cloning and analysis of Candida cylindracea lipase sequences /M. Lotti, R. Grandori, F. Fusetti et al II Gene. 1993. - Vol. 124. - P. 45-55.

101. Crystal structure of a secreted lipase from Gibberella zeae reveals a novel "double-lock" mechanism / Z. Lou, M. Li, Y. Sun et al. II Protein & Cell. -2010.-Vol. l.-P. 760-770.

102. Louwrier, A. On the issue of interfacial activation of lipase in nonaqueous media / A. Louwrier, G. J. Drtina, A. M. Klibanov // Biotechnology and bioengineering. 1996. - Vol. 50. - P. 1-5.

103. Oil-induced aggregation of block copolymer in aqueous solution / J.-H. Ma, Y. Wang, C. Guo, H.-Z. Liu // J. Phys. Chem. B. 2007. - Vol. 111. - P. 11140-11148.

104. The role of bile salts in digestion / J. Maldonado-Valderrama, P. Wilde, A. Macierzanka, A. Mackie // Adv. Colloid Interface Sci. 2011. - Vol. 165. -P. 36-46.

105. Martin, C. A. Carbon-13 NMR investigations of Aerosol OT water/oil microemulsions / C. A. Martin, A. Linda // J. Phys. Chem. 1981. - Vol. 85. - P.3938-3944.

106. Micellar enzymology: its relation to membranology / K. Martinek, N. L. Klyachko, A. V. Kabanov et al. II Biochim. Biophys. Acta. 1989. - Vol. 981.-P. 161-172.

107. Matsuoka, K. Micelle formation of sodium deoxycholate and sodium ursodeoxycholate / K. Matsuoka, Y. Moroi // Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Biol. Lipids.-2002.-Vol. 1580.-P. 189-199.

108. Three-dimensional structure of tosyl-a-chymotrypsin / W. Matthews, P. B. Sigler, R. Henderson, D. M. Blow // Nature. 1967. - Vol. 214. - P. 652656.

109. McBain, J.W. Colloid Science / J.W. McBain. Boston: Heath D.C, 1950. -439 P.

110. McClellan, S. J. Exclusion of bovine serum albumin from the air/water interface by sodium myristate / S. J. McClellan, E. I. Franses // Colloids Surf., B.-2003.-Vol. 30.-P. 1-11.

111. Menger, F. M. Chemistry of interfacial organic processes / F. M. Menger // Pure Appl. Chem. 1979 - Vol. 51. - P. 999-1007.

112. Menger, F. M. A microscopic hydrophobicity parameter / F. M. Menger, U. V. Venkataram // J. Am. Chem. Soc. 1986. - Vol. 108. - P. 2980-2984.

113. Menger, F. M. Gemini Surfactants / F. M. Mener, J. S. Keiper // Angew. Chem. Int. Ed. 2000. - Vol. 39. - P. 1906-1920.

114. Adsorption characteristics of mixed monolayers of a globular protein and a non-ionic surfactant /R. Miller, V. B. Fainerman, A.V. Makievski et al. Il Colloids Surf. A. -2000. Vol. 161.-P. 151-157.

115. CTAB aggregation in aqueous solutions of ammonium based ionic liquids; conductimetric studies / A. Modaressi, H. Sifaoui, B. Grzesiak et al. Il Colloids Surf., A. 2007. - Vol. 296. - P. 104-108.

116. Role of the solvophobic effect on micellization / M. L. Moya, A. Rodriguez, M. M. Graciani, G. Fernandez // J. Colloid Interface Sci. 2007. - Vol. 316. -P. 787-795.

117. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa lipase in the open conformation / M. Nardini, D. A. Lang, K. Liebeton et al. II J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275.-P. 31219-31225.

118. The crystal structure of triacylglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic aspartate / M. E. M. Noble, A. Cleasby, L. N. Johnson et al. IIFEBS Lett. 1993. - Vol. 331. - P. 123-128.

119. Norde, W. Adsorption of proteins from solution at the solid-liquid interface. W. Norde // Adv. Colloid Interface Sci. 1986. - Vol. 25. - P. 267-340.

120. Otzen, D. Protein-surfactant interactions: A tale of many states / D. Otzen // Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 2011. - Vol. 1814. - P. 562591.

121. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functionality /J M. Palomo, M. Fuentes, G. Fernandez-Lorente et al. Il Biomacromolecules. 2003. - Vol. 4. - P. 1-5.

122. Influence of the conformational flexibility on the kinetics and dimerization process of two Candida rugosa lipase isoenzymes / M. A. Pernas, C. Lopez, M. L. Rua, J. Hermoso // FEBS Lett. 2001. - Vol. 501. - P. 87-91.

123. Regulation of the interfacial activation within the Candida rugosa lipase family / M. A. Pernas, L. Pastrana, P. Fucinos. M. L. Rua // J. Phys. Org. Chem. 2009. - Vol. 22. P. 508-514.

124. Surfactant/nonionic polymer interaction. A NMR diffusometry and NMR electrophoretic investigation / E. Pettersson, D. Topgaard, P. Stilbs, O. Söderman // Langmuir. 2004. - Vol. 20. - P. 1138-1143.

125. Piotto, M. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions / M. Piotto, V. Saudek, V. Sklenar // J. Biomol. NMR. -1992.-Vol. 2.-P. 661-665.

126. Polgar, L. The nature of general base-general acid catalysis in serine proteases / L. Polgar, M. L. Bender // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1969. -Vol. 64.-P. 1335-1342.

127. Rangel-Yagui, C. O. Micellar solubilization of drugs / C. O. Rangel-Yagui, A. Pessoa-Jr, L. C. Tavares // J. Pharm. Pharmaceut. Sei. 2005. - Vol. 8. -P. 147-163.

128. Noninvasive methods to determine the critical micelle concentration of some bile acid salts / S. Reis, C. G. Mountinho, C. Matos et al. II Anal. Biochem. -2004.-Vol. 334.-P. 117-126.

129. Lipases at interfaces: a review / P. Reis, K. Holmberg, H. Watzke et al. II Adv. Colloid Interface Sei. 2009. - Vol. 147-148. P. 237-250.

130. Interfacial mechanism of lipolysis as self-regulated process / P. Reis, H. Watzke, M. Leser et al. II Biophys. Chem. 2010. - Vol. 147. - P. 93-103.

131. Effects of head group size on micellization of cetyltrialkylamonium bromide surfactants in water-ethylene glycol mixtures / M. A. Rodriguez, M. Munoz, M. M. Graciani et al. II Colloid Surf., A. 2007. - Vol. 298. - P. 177-185.

132. Rosen, M. J. Surfactants and interfacial phenomena / M.J. Rosen. New Jersey: John Wiley & Sons, 1989. - 444 P.

133. Rottman, C. Getting a library of activities from a single compound: tunabillity and very large shifts in acidity constants induced by sol-gel entrapped micelles / C. Rottman, D. Avnir // J. Am. Chem. Soc. 2001. -Vol. 123. - P.5730-5734.

134. Rovery, M. An improved large scale procedure for the purification of porcine pancreatic lipase / M. Rovery, M. Boudouard, J. Bianchetta // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 525. - P. 373-379.

135. Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindracea /M. L. Rua, T. Diaz-Maurino, V. M. Fernandez et al. II Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj. 1993. - Vol. 1156.-P. 181-189.

136. Rua, M. L. Rapid purification of two lipase isoenzymes from Candida rugosa /M. L. Rua, A. Ballesteros // Biotechnol. Tech. 1994. - Vol. 8. - P. 21-26.

137. Thermoalkalophilic lipase of Bacillus thermocatenulatus: large-scale production, purification and properties: aggregation behaviour and its effect on activity / M. L. Rua, C. Schmidt-Dannert, S. Wahl et al. II J. Biotechnol. -1997.-Vol. 56.-P. 89-102.

138. Sarda, L. Action de la lipase pancreatique sur les esters en emulsion / L. Sarda, P. Desnuelle // Biochim. Biophys. Acta. 1958. - Vol. 30. - P. 513-521.

139. Scheiner, S. Molecular orbital studies of enzyme activity: catalytic mechanism of serine proteinases / S. Scheiner, W. N. Lipscomb // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - Vol. 73. - P. 432-436.

140. Schlieben, N. H. Expression, purification, and aggregation studies of His-taged thermoalkalophilic lipase from Bacillus thermocatenulatus / N. H. Schlieben, K. Niefind, D. Schomburg // Protein Expression Purif. 2004. -Vol. 34.-P. 103-110.

141. Schrag, J. D. 1.8 A refined structure of the lipase from Geotrichum candidum / J. D. Schrag, M. Cygler // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 230. - P. 575-591

142. Seddon, A.M. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera / A.M. Seddon, P. Curnow, P.J. Booth // Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. -2004.-Vol. 1666.-P. 105-117.

143. Shaheen, A. Influence of various series of additives on the clouding behavior of aqueous solutions of triblock copolymers / A. Shaheen, N. Kaur, R. K. Mahaj an//Colloid Polym. Sci. 2008. - Vol. 286.-P. 319-325.

144. Sharma, R. Production, purification, characterization, and applications of lipases / R. Sharma, Yu. Chisti, U.C. Banerjee // Biotechnology Advances. -2001.-Vol. 19.-P. 627-662.

145. Colloidal Surfactants / K. Shinoda, T. Nakagava, B. Tamamushi, T .Isemura. -New York: Academic Press, 1963. 136 P.

146. Binding of Rhizomucor miehei lipase to emulsion interfaces and its interference with surfacatants / P. Skagerlind, M. Jansson, B. Bergenstahl, K. Hult // Colloids Surf., B. 1995. - Vol. 4. - P. 129-135.

147. Lipase- surfactant interactions / P. Skagerlind, B. Folmer, B. K. Jha et al. // Progr. Colloid Polym. Sci. 1998. - Vol. 108. - P. 47-57.

148. Small, D.M. Size and structure of bile salt micelles / D. M. Smal // Molecular association in biological and related systems / Goddard E.D., ed. -Washington: American Chemical Society, 1968. Ch. 4. - P.31-52.

149. Smith, D. H. Concentration and temperature dependence of the counterion self-diffusion coefficient in aqueous solutions of hexadecyltrimethylammonium bromide / D. H. Smith // J. Colloid Interface Sci. 1979.-Vol. 68.-P. 70-81.

150. Soderman, O. NMR studies of complex surfactant systems / O. Soderman, P. Stilbs // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1994. - Vol. 26. - P. 445-482.

151. Soderman, O. NMR studies of surfactants / O. Soderman, P. Stilbs, W. S. Price // Concepts Magn. Reson. 2004. - Vol. 23A. - P. 121-135.

152. Stamatis, H. Bioorganic reactions in microemulsions: the case of lipases / H. Stamatis, A. Xenakis, F.N. Kolisis // Biotechnology Advances. 1999. - Vol. 17.-P. 293-318.

153. Stamato, F. M. L. G. The catalytic mechanism of serine proteases: single proton versus double proton transfer / F. M. L. G. Stamato, E. Longo,. L. M. Yoshioka // J. Theor. Biol. 1984. - Vol. 107. - P. 329-338.

154. Starov, V. Why do aqueous surfactant solutions spread over hydrophobic substrates? / V. Starov, N. Ivanova, R. G. Rubio // Adv. Colloid Interface Sci. 2010. - Vol. 161.-P. 153-162.

155. Stilbs, P. Fourier transform pulsed-gradient spin-echo studies of molecular diffusion / P. Stilbs // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1987. - Vol. 19. -P. 1-45.

156. Strejskal, E. O. Spin diffusion measurements: spin echoes in the presence of a time-dependent fied gradient / E. O. Strejskal, J. E. Tanner // J. Chem. Phys. 1965. - Vol. 42. - P. 288-293.

157. Su, Y.-L. Formation of a hydrophobic microenvironmemt in aqueous PEO-PPO block copolymer solutions investigated by Fourier transform infrared spectroscopy / Y.-L. Su, J. Wang, H.-Z. Liu // J. Phys. Chem. B. 2002. -Vol. 106.-P. 11823-11828.

158. Micro-environmental influences on the fluorescence of tryptophan / F. Sun, W. Zong, R. Liu et al. II Spectrochim. Acta, Part A. 2010. - Vol. 76. - P. 142-145.

159. Svendsen, A. Lipase protein engineering / A. Svendsen // Biochim. Biophys. Acta, Protein Struct. Mol. Enzymol. 2000. - Vol. 1543. - P. 223-238.

160. Tadros, T. F. Surfactants / T. F. Tadros. Academic Press, 1984. - 342 P.

161. Thuren, T. A model for molecular mechanism of interfacial activation of phospholipase A2 supporting the substrate theory / T. Thuren // FEBS Lett. -1988.-Vol. 229.-P. 95-99.

162. Tonova, K. Reversed micelle solvents as tools of enzyme purification and enzyme-catalyzed conversion / K. Tonova, Z. Lazarova // Biotech. Adv. -2008.-Vol. 26.-P. 516-532.

163. Uhlig, H. Industrial enzymes and their applications / H. Uhlig, ed. New York: John Wiley&Sons, 1998. - 472 P.

164. Crystallographic and molecular-modeling studies of lipase B from Candida antarctica reveal a stereospecificity pocket for secondary alcohols / J. Uppenberg, N. Ohrner, M. Norin et al. // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. -P. 16838-16851.

165. The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica / J. Uppenberg, M. T. Hansen, S. Patkar, T. A. Jones 11 Structure. 1994. - Vol. 2. - P. 293-308.

166. Verger, R. Enzyme reactions in a membrane model. 1. A new technique to study enzyme reactions in monolayers / R. Verger, G. H. De Haas // Chem. Phys. Lipids. 1973. - Vol. 10. - P. 127-136.

167. Verger, R. Action of Phospholipase A at interfaces / R. Verger, M. C. E. Mieras, G. H. de Haas // J. Bio. Chem. 1973. - Vol. 248. - P. 4023-4034.

168. Verger, R. "Interfacial activation" of lipases: facts and artifacts / R. Verger // Trends biotechnol. 1997. - Vol. 15. - P. 32-38.

169. Verger, R. Enzyme kinetics of lipolysis / R. Verger // Meth. Enzymol. -1980.-Vol. 64.-P. 340-392.

170. Walstra, P. Physical chemistry of foods / P. Walstra. New York: Marcel Dekker, 2003.-807 p.

171. Warshel, A. Theoretical correlation of structure and energetic in the catalytic reaction of trypsin / A. Warshel, S. Russel // J. Am. Chem. Soc. 1986. - Vol. 108.-P. 6569-6579.

172. How do serine proteases really work? / A. Warshel, G. Naray-Szabo, F. Sussman, J.-K. Hwang // Biochemistry. 1989. - Vol. 28. - P. 3629-3637.

173. Thermo-sensitive polymeric micelles based on poly(N-isopropylacrylamide) as drug carriers / H. Wei, S.-X. Cheng, X.-Z. Zhang, R.-X. Zhuo // Prog. Polym. Sci. 2009. - Vol. 34. - P. 893-910.

174. Wells, M. A. The mechanism of interfacial activation of Phospholipase A2 / M. A. Wells // Biochemistry. -1974. -Vol. 13. P. 2248-2257.

175. Winkler, F. K. Structure of human pancreatic lipase / F. K. Winkler, A. D'Arcy, W. Hunziker. // Nature. 1990. - Vol. 343. - P. 771-774.

176. Wong, J. H. Facilitated proton transfer in enzyme catalysis / J. H. Wong // Science. 1968.-Vol. 161.-P. 328-334.

177. Wong, D. W. S. Lipase / D.W.S. Wong // Handbook of Food Enzymology / J. R. Whitaker, A. G. J. Voragen, D. W. S. Wong, eds. New York: Marcel Dekker, 2002. - Ch. 53. - P. 667-680.

178. Woolley, P. Lipases their structure, biochemistry and applications / P. Woolley, S.B. Petersen, eds. - Cambridge: Cambridge University Press, 1994. -377 P.

179. Crystal structure of a mono- and diacylglycerol lipase from Malassezia globosa reveals a novel lid conformation and insights into the substrate specificity / T. Xu, L. Liu, S. Hou etal. II J. Struct. Biol. 2012. - Vol. 178. -P. 363-369.

180. Yoshida, E. Block copolymer micelles with dye loaded on their shells or cores / E. Yoshida, T. Naito // Colloid Polym. Sci. 2008. - Vol. 286. - P. 1203-1207.

181. Zaheer, Z. Sub- and post-micellar catalytic and inhibitory effects of cetyltrimethylammonium bromide in the permanganate oxidation of phenylalanine / Z. Zaheer, Raiuddin // Colloids Surf., B. 2009. - Vol. 69. -P. 251-256.

182. The factors determining the micellar rate effect in nucleophilic substitution reaction / L. Y. Zakharova, F. G. Valeeva, R. A. Shagidullina, L. A. Kudryavtseva // J. Mol. Liq. 2001. - Vol. 1. - P.79- 86.

183. Zana, R. Fluorescence probing study of the association of bile salts in aqueous solutions / R. Zana, D. Guveli // J. Phys. Chem. 1985. - Vol. 89. -P. 1687-1690.

184. Zana, R. Ciant micelles: properties and applications / R. Zana, E. W. Kaler, eds. CRC Press, 2007. - 554 P.

185. Critical micelle concentration of some surfactants and thermodynamic parameters of their micellization / A. Zdziennicka, K. Szymczyk, J. Krawczyk, B. Janczuk // Fluid Phase Equilib. 2012. - Vol. 322-323. P. 126-134.

Информация о работе

Богданова, Лилия Рустемовна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Механизмы регуляции активности липаз в микрогетерогенных системах на основе амфифильных соединений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы