Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиней и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens в комплексе с полиэлектролитами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиней и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens в комплексе с полиэлектролитами"

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий им. К.И.Скрябина»

На правах рукописи

Каштиго Татьяна Викторовна

Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиней и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens в комплексе с полиэлектролитами

Специальность03.00.04-бнохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004 год

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химики Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологий им. КИ.Скрябина

Научныйруководитель: доктор химических наук Зайцев С.Ю.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Клопов Михаил Иванович, доктор биологических наук Букова Наталья Константиновна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).

Защита состоится «12» января 2005 г. в час. ¿и ИНН. на заседании специализированного совета Д 220.042.04 в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологий им. К.И.Скрябина.

Адрес: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел.:(095)377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологий им. КИ.Скрябина.

Автореферат разослан«1 п^^л^лХ 2004г.

Ученый секретарь специализированного совета

Фомина В.Д.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Ферменты и их ферментативные комплексы широко применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, текстильно-кожевенной, фармацевтической и косметической и отраслях промышленности, в медицине и сельском хозяйстве, органическом синтезе и биохимическом анализе. Возможность применения ферментов осложнены по ряду причин: ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции.

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал к развиты теоретические представления о методах иммобилизации различных ферментов, позволяющие решить указанные проблемы. Целью иммобилизации является повышение устойчивости ферментов к денатурирующим агентам и придание им заданных технологических свойств, в частности возможность повторного использования и легкость выделения из реакционной смеси.

Одними из наиболее широко использующихся ферментов являются липазы, которые относятся к третьему классу ферментов (гидролазам) и способны гидролизовать сложноэфирные связи в молекулах ряда липидов (главным образом - триглицеридов). По нашему мнению, управление липолитической активностью будет играть важную роль в новых методах лечения нарушений жирового обмена и в контроле за сердечнососудистыми заболеваниям, поэтому изучение возможности изменения активности липаз является важным и актуальным.

В настоящее время в биохимических лабораториях и научно -исследовательских институтах ведутся исследования, основанные на

различных методах иммобилизации ферментов: сорбция на носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей и отдельных полимеров. Проводились исследования по сравнению методов иммобилизации липаз из различных источников. Однако данных о регуляции ферментативной активности липаз в комплексах на основе двух противоположно заряженных синтетических полиэлектролитов до начала наших работ в литературе не было. Такие исследования позволяют глубже понять природу многих важных биохимических процессов, протекающих в живых системах, а также создавать новые материалы для биотехнологии и медицины.

Цель работы. Исследовать влияние разнозаряженных полиэлектролитов и условий протекания каталитической реакции на активность липаз из различных источников, а также определить оптимальные условия иммобилизации липаз в полимерное окружение.

Положения выносимые на защиту.

— данные по влиянию условий среды на каталитическую активности липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней;

данные по влиянию положительно заряженного полиэлектролита (ЛАМА - полидиаллилдиметиламмоеий галогенид) и отрицательно заряженного полиэлектролита (ПСС - полистиролсульфонат натрия) на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; данные по влиянию неорганических солей на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней в комплексе с полиэлектролитами (двухкомпонентные комплексы);

оптимальные композиции высокоэффективных препаратов иммобилизованной липазы из Pseudomonasfluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней на основе разнозаряженных полиэлектролитов (трехкомпонентные комплексы)

Научная новизна. Впервые получены стабильные комплексы на основе липазы и двух противоположно заряженных полиэлектролитов, проявляющие повышенную каталитическую активность. Предложена модель формирования таких двух- и трехкомпонентных комплексов.

Изучено влияние знака заряда полиэлектролита на активность липаз из поджелудочной железы свиней и из бактерии Pseudomonas fluorescens.

Проведено сравнительное изучение влияния полимерно-ионного окружения и др. факторов среды на ферментативную активность липазы из Pseudomonasfluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней.

Впервые подобраны оптимальные условия для иммобилизации различных типов липаз в комплексы с полиэлектролитами.

Практическая ценность работы

Полученные экспериментальные данные по иммобилизации липаз в комплексы с различными полиэлектролитами имеют практическую ценность для разработки новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов.

Установленное влияние полимерного окружения на фермент позволяет использовать полиэлектролиты как аллостерические модуляторы активности, а также стабилизаторы ферментов.

Сравнительное исследование активности липаз микробного и животного происхождения даёт возможность выбора подходящего фермента и условий иммобилизации для определённого вида липазы, в целях экономии средств, при производстве и использовании препарата в различных отраслях промышленности.

Результаты и основные научно-методические положения диссертации используются в лекционном курсе и лабораторном практикуме по курсу дисциплин: «Биохимия» (3 курс ВБФ), «Биоэнергетика. Энзимология», «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций» и «Биохимия мембран» (4 курс ВБФ) при подготовке специалистов высшей квалификации по специальности 012300 - «Биохимия» в ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И. Скрябина».

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии в Казани в 2002 г.; на Всероссийской научно-технической конференции в Мурманске в 2003 г.; на DC Международной конференции «The problems of solvation and complex formation in solutions», Plyos, 2004; на Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, Москва, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 печатных работ, из них 5 статей и 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура и объем работы. Материалы диссертационной работы изложены на 108 страницах машинописного текста. В работе приведено 5 рисунков и 16 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, практического предложения, списка литературы и приложения. Указатель литературы включает 123 источников (42 отечественных и 81. зарубежных источника).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Обзор литературы

В первом разделе представлен анализ данных литературы об особенностях структурной организации, физико-химических свойствах и источниках липолитических ферментов, в частности липаз из Pseudomonas fluorescens и поджелудочной железы свиньи.

Во втором разделе рассматриваются цели и методы иммобилизации ферментов (липаз в частности), а также различные области применения модифицированных биокатализаторов.

Экспериментальная часть

Глава 2. Материалы иметоды

Первый раздел содержит данные об объектах исследований и материалах, используемых в опытах, а также описание методик приготовления растворов. В работе использовались липазы:

1) из бактерии Pseudomonas fluorescens (Фирма «Fluka, Biochemica»), MM = 40 000 г/моль (обозначен как препарат 1), начальная активность фермента 36 Ед/мг, при чистоте 25%;

2) из бактерии Pseudomonas fluorescens (Фирма «Fluka, Biochemica»), MM = 33 000 г/моль (обозначен как препарат 2), начальная активность фермента 2998 Ед/мг, при чистоте порядка 90%;

3) из поджелудочной железы свиней (КФ 3.1.1.3) Hogpancreas (Фирма «Fluka, Biochemica»), MM = 50 000 г/моль (обозначен как препарат 3), начальная активность фермента 42 Ед/мг, при чистоте -20%.

В качестве субстрата во всех случаях использовали триацилглицерол (фирменное название «триацетин») общей формулы - С9Н14О6, MM = 218,21 г/моль, чистота более 99 % (Фирма «Sigma»).

Полиэлектролиты: Полистиролсульфонат натрия (ПСС), ММ = 183103 г/моль (Фирма «Sigma»), 6,6-103 г/моль и МО6 г/моль (Фирма

«Fluka, Biochemica»), использовался как полианион. Полидиаллилдиметиламмоний хлорид и бромид (ЛАМА), ММ = 2,4*10 г/моль (IPF, FRG), использовался как поликатион.

Второй раздел включает описание методов и приборов, используемых в работе, формулы и принципы расчета полученных величин.

Активность липаз была измерена методом потенциометрического титрования с помощью автоматического титратора «РНМ - 290 pH-stat» ("Radiometer", Копенгаген) по скорости гидролиза триацетина (рабочий раствор приготовлен из 0,1М раствора триацетина, 0,05М СаС^ и 0.05М NaCl) в стандартных условиях (25°, 765 мм рт.ст., рН=7,0). Полученные данные обработаны с помощью компьютерной программы «Stat Talk» (версия 1.2а). Активность исследуемых растворов липаз была пересчитана в процентах по отношению к контрольной пробе и представлена в отдельных таблицах для удобства сравнения.

При приготовлении двухкомпонентного комплекса (состоящего из липазы и одного полимера), липазу смешивали с раствором полиэлектролита ПСС или ПАМА, в заданных соотношениях перемешивали в течении 15 минут на магнитной мешалке и проводили измерение ферментативной активности.

Для приготовления трехкомпонентного комплекса (состоящего из липазы и двух противоположно заряженных полимеров), к раствору 10 мл одного полимера заданной концентрации медленно и при постоянном перемешивании приливали 3 мл смеси липазы и другого полимера (имеющего тот же заряд, что и липаза при выбранном рН).

Концентрации исходных растворов обоих полимеров Сп рассчитывались по следующей формуле: C„ = S(C„x K)x(Mi/M2),

где Сл- исходная концентрация липазы, К- мольные отношения полимеров к ферменту, M1 и М2- молекулярные массы одного заряженного звена

соответствующего полимера, что составляет 206,0 для ПСС или 161,5 для ПАМА (индексы 1 и 2 указывают на порядок смешивания соответствующих полимеров).

Растворы приготовленных комплексов липаз с полиэлектролитами были «обеспылены» путем фильтрации через 0,45 мкм мембранные фильтры. Смешивание проводили непосредственно в спектрофотометрической кювете. Измерение светорассеяния приготовленных комплексов проводили с помощью специально калиброванного спектрофотометра.

Во всех случаях степень осаждения комплексов после центрифугирования была выше 95% за исключением ряда комплексов, полученных в буферных растворах при рН 9,0 и 11,0. Оценка степени включения липазы в комплекс, проводилась по разнице между общей активностью липазы в системе (дисперсии) и в супернатанте (после центрифугирования дисперсии). Полученная величина соответствует эффективной активности липазы в комплексе.

Третий раздел включает статистическую обработку результатов.

- Для результатов экспериментов были получены статистические оценки достоверности и погрешности. С этой целью были определены критические значения критерия достоверности на основе распределения Стыодента с учетом принятой для научных экспериментов величины уровня значимости 0,05 (Р<0,05) или значения доверительной вероятности 0,95. Реальные значения критерия достоверности превышают критические значения более чем в 2 раза, что говорит о высокой степени достоверности экспериментальных данных.

Глава 3. Результаты и ихобсуждение.

Раздел 3.1. Изучение влияния ряда факторов среды (солей. рН. температуры) на активность липаз из различных источников

Одним из факторов, влияющих на скорость гидролиза триацилглицеридов под действием липаз, является введение в систему неорганических солей. Известно, что NaCl в небольших концентрациях необходим для липолиза малорастворимых триглицеридов.

Результаты серии опытов по изучению активности липаз, приготовленных в растворах солей (NaCl, КН2РО4, NaHfO4 приведены в таблице 1. За контроль принималась активность фермента, приготовленного в дистиллированной воде. Характерно, что у всех видов липаз каталитическая активность заметно выше в растворе фосфата калия, нежели хлорида натрия, однако во всех случаях она равна или выше контроля. Это является следствием как изменения ионной силы раствора, так и природы катиона и аниона. Во всех случаях, увеличение ферментативной активности липазы из поджелудочной железы свиней (препарат 3) существенно выше, чем для липазы из Pseudomonas fluorescens (препарат 2). Это связано с высокой чувствительностью панкреатической липазы к присутствию солей, в том числе в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, при увеличении концентрации соли выше определенного значения, например при 0,05 М растворе КН2РО4, как правило наблюдается относительное уменьшение каталитической активности липаз (114 % - препарат 3; 100 % - препарат 2), по сравнению с таковой при 0,01 М растворе (129 % и 122 %, соответственно).

Показано существенное изменение активности липаз из Pseudomonas fluorescens (препарата 2) и Hogpancreas (препарата 3) при изменении рН среды приготовленного раствора (Табл. 2), для сравнения измеряли активность липазы того же вида в стандартных условиях, приготовленную при рН 7,0.

Таблица 1. Активность липазы из Pseudomonas fluorescent и Hog pancreas в неорганических солях.

Липаза Активность*, %

NaCl (1М) шро, (0,01 М) шро, (0,05 М) NaHpO, (0,01 М)

Препарат 2 100 122 100 107

Препарат 3 100 129 114 118

*критические значения критерия достоверности на основе распределения Стьюдента с учетом принятого для научных экспериментов значения уровня значимости равное или менее 0,05 (здесь и во всех остальных таблицах Р < 0,05)

Таблица 2. Зависимость каталитической активности липаз от рН среды.

рН Активность*, %

Препарат 2 Препарат 3

5,0 73 63

6,0 75 64

7,0 100 100

9,0 127 120

11,0 64 61

*Р<0,05

Активность липаз из Pseudomonas fluorescens и Hogpancreas при рН

5,0 составила 73 % и 63 %, соответственно. Указанное уменьшение каталитической активности липаз объясняется приготовлением их растворов при рН, близких к изоэлектрической точке (липаза из Pseudomonas fluorescens pi = 4,5, липаза из Hogpancreas pl=5,2) При рН,

находящемся в зоне рН-оптимума для данных видов липаз, активность ферментов возросла от 100 % до 127% для препарата 2 и до 120% для

препарата 3 (Табл. 2). При рН 11,0, т.е. значительно выше рН-оптимума, активность препарата 2 и 3 понизилась, что характерно для всех липаз и соответствует литературным данным.

Результаты опытов по измерению относительной активности липаз из Pseudomonas fluorescem и Hogpancreas при изменении температуры от 25°С до 70°С в основном соответствовали литературным данным.

При температуре 60°С ферментативная активность липазы из Pseudomonas fluorescens немного повысилась и составила 111% по отношению к контролю, что свидетельствует о термостабильности данного фермента. Дальнейшее повышение температуры до 70°С приводит к падению ферментативной активности, а в дальнейшем, и к инактивации липазы из Pseudomonas fluorescens. Активность препарата 3 уже при 50°С снижалась до 68%, что свидетельствует о низкой термостабильности липазы из Hogpancreas.

Раздел 3.2. Исследование влияния заряда полиэлектролитного окружения на липазы из различных источников.

Для изучения влияния полимеров на активность липаз были прдобраны противоположно заряженные полиэлектролиты: политиролсульфонат натрия (ПСС) использовался как полианион; полидиаллилдиметиламмоний бромид (ЛАМА) использовался как поликатион.

Показано, что в присутствие отрицательно заряженного полимера (ПСС) увеличивается каталитическая активность препарата 1 на 26 % (при соотношении 1:1). Это связано, по-видимому, с активным участием ПСС в процессе мицеллообразования ТГ и последующего действия липазы на мицеллярные агрегаты субстрата. При увеличении количества ПСС в системе (10 : 1, 100 : 1) активность препарата 1 несколько падает, в сравнении с эквимолярным соотношением, причем, она все еще выше

активности липазы контрольной пробы при 10 : 1 и становится ниже при 100:1 (табл. 3).

Таблица 3. Активность липазы из Pseudomonas fluorescens и Hog pancreasв комплексе с одним полимером.

Липазы Активность* липаз, %

ПСС : Липаза ПАМА : Липаза

1:1 10:1 100:1 1:1 10:1 100:1

Препарат 1 126 111 94 95 102 90

Препарат 3 100 129 100 92 129 105

*Р<0,05

Значительное увеличение активности липазы при увеличении относительной концентрации полимера для препарата 3 до 1:10, связано с активацией липазы на границе раздела фаз, сформированной полимерными клубками полиэлектролита.

Присутствие ПАМА незначительно уменьшает активность препарата 3 на8%ина5% у препарата 1, при соотношении 1:1 (табл. 3).

В случае равенства относительных концентраций фермента и полимера (1:1), уменьшение активности липазы (заряженной отрицательно при нейтральных рН) в присутствии ПАМА (заряженного положительно) можно объяснить их сильным электростатическим взаимодействием и конформационными изменениями, тогда как в присутствии ПСС (при соотношении фермент:полимера=1:1) активность липазы из Hog pancreas не меняется, а бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens даже увеличивается.

Таким образом, активность липазы существенно зависит не только от природы и заряда полимера, но и от его концентрации относительно фермента.

Раздел 3.3. Изменение активности ферментов в двухкомпонентном комплексе (с одним полиэлектролитом) и неорганическими солями

Из данных таблицы 4 следует, что активность липазы из Hogpancreas в комплексе с одним полиэлектролитом и неорганическими солями (№С1, КН2РО4) увеличивается при молярном соотношении полимер : липаза равном 10 : 1 (во всех случаях) и падает при соотношении как 100 : 1, так и 1:1 (причем, в последнем случае часто даже ниже контроля).

Таблица 4. Активность липазы из Hog pancreas (препарат 3) в комплексе с полимерами и неорганическими солями.

Полимеры Полимер:липаза Активность* при 0,01МКН2Р04,% Активность* при 1,0 М NaCl, %

псс 1:1 90 98

10:1 142 122

100:1 100 108

ПАМА 1:1 102 92

10:1 127 129

100:1 104 105

*Р<0,05

«Ускоряющий каталитический эффект» солей при гидролизе триацетина панкреатической липазой в двухкомпонентном комплексе с полимером (при соотношении полимер липаза = 10 : 1), по-видимому, связан с оптимальными условиями для процесса мицеллообразования и последующего действия липазы на мицеллярные агрегаты, что характерно и для действия панкреатической липазы в желудочно-кишечном тракте.

Результаты:, полученные при исследовании активности бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens в комплексе с ПСС (Табл. 5) также свидетельствуют об активации липазы в присутствии полимера и неорганических солей, однако такой четкой зависимости активности от соотношения полимер : липаза, как в случае липазы из поджелудочной

железы свиней, не наблюдалось (Табл. 5)

Таблица 5. Активность липазы из Pseudomonas fluorescens (препарат 2) в комплексе с полимером (ПСС) и неорганическими солями.

Полимер:липаза Активность* при 0,0 Ш КН2РО4,% Активность* при l,0MNaCl,%

1:1 114 120

10:1 100 124

100:1 122 107

*Р<0,05

Таким образом, изменяя полимерно-ионное окружение липазы можно управлять липолитической активностью фермента в заданном направлении.

Раздел 3.4. Иммобилизация липазы из Pseudomonas fluorescens в смесь из двух полиэлектролитов (трехкомпонентные полиалектролитные комплексы)

В работах ученых Химического факультета МГУ (В.А. Кабанов, А Б. Зезин и др.) были детально изучены механизмы электростатического взаимодействия между синтетическими полиионами и условия образования полиэлектролитных комплексов, а также взаимодействия фермент - полиэлектролит. Однако, до начала наших работ, изучение активности липаз при ассоциации с двумя противоположно заряженными полимерами не проводилось. Комплекс между поликатионом, полианионом и белком образуется за счет взаимодействия сильно ионизированных групп, т.е. вдали от изоэлектрической точки белка. Образование такого комплекса происходит при смешивании белка и поликатиона с раствором полианиона в случае низких значений рН, или при смешении белка и полианиона с раствором поликатиона в случае высоких рН.

В большинстве опытов образование комплекса ПЭЛК происходило при мольном соотношении второго полимера к первому полимеру, равном 0,6. Таблица б. Активность липазы из бактерий Pseudomonas fluorescens (препарат 1) в трехкомпонентных комплексах.

Полимер Общая Активность* Эффективна

№ ПЭ1к :липаза активность* в я

ПЭ ПЭ2 - РН моль/ в системе, % супернатант активность*

Ж Липаза моль е,% в комплексе, %

1 0,6 3,0 10:1 11 6 5

2 0,6 9,0 10:1 34 13 21

3 0,6 9,0 50:1 67 21 46

4 0,6 9,0 100:1 92 30 62

5 0,6 11,0 50:1 99 76 23

6 0,6 11,0 100:1 104 73 31

7 0,6 11,0 200:1 119 61 58

*Р<0,05

При приготовлении трехкомпонентного комплекса при рН = 3,0 почти полностью теряется каталитическая активность препарата 1, т.к. это значение рН ниже величины изоэлектрической точки для липазы из Pseudomonas fluorescens, где у липазы происходит изменение общего заряда молекулы. При увеличении рН до 9,0-11,0 липаза активируется в поликатион - полианионной системе вследствии образования относительно крупных частиц комплекса, что подтверждает способность липаз активироваться вблизи поверхности раздела фаз. Наивысшая активность препарата 1 наблюдалась при образовании комплекса при рН 9,0 что согласуется с рН-оптимумом бактериальной липазы (рН 8,0-9,0).

Соотношение полиэлектролит : липаза также играет важную роль при приготовлении комплекса с высокой активностью. Так, наилучшие результаты были получены при относительно низкой концентрации

препарата 1 в системе (1 : 100). Вероятно, это связано с тем, что при увеличении концентрации липазы в ПЭЛК происходит конкуренция между белком и поликатионом, в результате которой белок вытесняется из полиэлектролитной системы. Соотношение 1 : 100 дает наилучшие результаты как по структурным параметрам комплекса, так и по связыванию липазы в трехкомпонентные комплексы (Табл. 6, ПЭЛК 4 и 7). Этот эффект можно объяснить как способностью препарата 1 лучше иммобилизоваться в поликомплексы с избытком полимеров, так и увеличением его активности в составе такого поликомплекса. Дальнейшее уменьшение относительной концентрации липазы в комплексе с полиэлектролитами ведет к уменьшению эффективности иммобилизации липазы и агрегации комплексов, что соответствует также литературным данным.

Коллоидно-химическая стабильность полученных комплексов достаточно высока, например, после двух недель хранения при 4°С сохраняется более 90% исходной активности липазы в комплексе.

Соотношение липазы к полимерам = 1 : 100 является наиболее оптимальным также для включения препарата 2 в трехкомпонентный комплекс (Табл. 7, ПЭЛК 3 и 5), т. к эффективная активность таких комплексов была достаточно высокой вследствии образования полимерно-мицеллярных агрегатов с большой поверхностью рагдездела фаз, где липаза активируется.

Полиэлектролитные комплексы, приготовленные при значении рН 9,0 (ПЭЛК 3), и рН 11,0 (ГОЖ 5), отличаются на 15 % по общей активности и на 14 % по эффективной активности (в ПЭЛК 3-64 %, ПЭЛК 5-50 %), что является хорошим показателем оптимальности условий получения комплексов.

Увеличение молекулярной массы одного полимера (ПСС) приводит к увеличению общей активности полиэлектролитного комплекса, (ПЭЛК 7) до 66 %, и незначительное увеличение эффективной активности (на 5 %).

Результаты таблицы 6 и 7 свидетельствуют о повышении каталитической активности полиэлектролитных комплексов во всех случаях при приготовлении их на основе низко и высоко очищенной липазы (препараты 2 и 1, соответственно). Таким образом, начальная активность фермента и чистота препарата практически не влияет на каталитическую активность всего полиэлектролитного комплекса.

Таблица 7. Активность липазы из бактерий Pseodomonas fluorescens

(препарат 2) в трехкомпонентньп комплексах.

Полимеры Общая Актив Эффективная

№ рН : липаза активность* ность* в активность* в

пэлк моль/моль в системе, % суперна танте,% комплексе, %

1 9,0 10:1 25 5 20

2 9,0 50:1 55 20 35

3 9,0 100:1 76 12 64

4 9,0 200:1 52 33 19

5 11,0 100:1 61 11 50

6 11,0 200:1 52 26 26

7 9,0 10:1 66 41 25

9,0 10:1 74 62 12

9 *** 9,0 10:1 99 71 28

10**** 11,0 10:1 82 76 6

11*** 11,0 10:1 70 69 1

12*** 9,0 10:1 83 25 58

13*** 9,0 50:1 145 105 40

14*** 9,0 100:1 184 131 53

* Р < 0,05; ** - Мм ПСС = 100-10 г/моль; *** - только раствор липазы приготовлен в

фосфатном буфере (0,01 М Na2HPO4), **** - все растворы приготовлены в фосфатном буфере

Раздел 3.5, Иммобилизация липазы из Пои Pancreas в смесь из двух полиэлектролитов (трехкомпонентные полиэлектролитные комплексы)

Как следует из таблицы 8, препарат 3 (липаза из поджелудочной железы свиней, приготовленная в фосфатном буфере) проявляет высокую общую активность в системе (ПЭЛК 3 и 4 - 72 %) и эффективную активность в комплексе (ПЭЛК 3-63 %, ПЭЛК 4 - 68 %). Такой эффект связан по-видимому, с активацией липазы в буферном растворе за счет ионных взаимодействий и оптимального расположения активного центра фермента, при этом разница в коэффициенте мольного соотношения полимеров ПАМА / ПСС (Табл. 8, ПЭЛК 3 и ПЭЛК 4) существенной роли не играет.

Хотя наивысшую общую ферментативную активность в дисперсии наблюдали при образовании комплексов ГОЖ 5 и 6, для получения которых все растворы (как липазы, так и полиэлектролитов) были приготовлены в фосфатном буфере, эффективная активность сохраняется в комплексе только на уровне 45 и 40 % соответственно. Таким образом ПЭЛК 5 и 6 нельзя считать оптимальными, так как липаза не прочно включается в трехкомпонентные комплексы при использовании для их приготовления солей и легко из них диффундирует в супернатант при центрифугировании.

Песмотря на достаточно высокую эффективную активность липазы в случае ПЭЛК 7, коэффициент мольного соотношения ПАМА / ПСС, равный 1,0 приводит к повышенной агрегации и нестабильности комплексов.

Таблица 8. Активность липазы из поджелудочной железы свиньи в поликомплексах полимеры-фермент.

№ пэж Поли меры рН Полимеры :липаза моль/моль Общая активность * в системе, % АКТИВНОСТЬ* в супернатант е, % Эффективна я активность* в комплексе, %

1 0,3* 9,0 100:1 15 1 14

2 0,6 9,0 100:1 14 6 8

3** 0,3 9,0 100:1 72 9 63

4** 0,6 9,0 100:1 72 4 68

5*** 0,3 9,0 100:1 180 135 45

6*** 0,6 9,0 100:1 180 140 40

7*** 1,0 9,0 100:1 177 116 61

8 0,6 11,0 100:1 38 14 24

*Р<0,05

** - только раствор липазы приготовлен в фосфатном буфере (0,01 М №2НР04); *** - все растворы приготовлены в фосфатном буфере (0,01 М Ма2НР04)-

Выводы:

1. Детально изучен процесс формирования двух- и трехкомпонентных комплексов полиэлектролитов с липазами из различных источников и предложена модель этого процесса. Показано существенное влияние таких факторов как: соотношение фермент : полиэлектролит, неорганических солей, рН среды, на активность и стабильность фермент-полиэлектролитных комплексов.

2. Показано, что как природа катиона и аниона, так и концентрация солей при приготовлении растворов липаз из Pseudomonas fluorescens и поджелудочной железы свиней существенно влияют на их ферментативную активность. Так, соли неорганических фосфатов оказывают активирующее влияние на все изученные типы липаз (до 22-29

%) по сравнению с NaCl, который не оказывает влияние на активность липаз, но является обязательным компонентом среды электрохимической ячейки.

3. Обнаружено, что соотношение полимер : фермент играет важную роль для проявления каталитической активности обоих типов липаз в комплексе. В большинстве случаев оптимальное соотношение для проявления ферментативной активности обоих типов липаз в двухкомпонентном комплексе является соотношение 10 :1.

4. Изучено влияние полимерного окружения (полиэлектролитов ПСС и ПАМА) на ферментативную активность указанных липаз в различных мольных соотношениях. Показано, что присутствие отрицательно заряженного полимера (ПСС) в двухкомпонентном комплексе увеличивает каталитическую активность до 129 % у липазы из поджелудочной железы свиней при соотношении полимер : липаза = 10 : 1 и до 126 % у бактериальной липазы из Pseudomonasftuorescens (полимер: липаза = 1: 1). Положительно заряженный полимер (ПАМА) при соотношении полимер : липаза =1:1 напротив несколько снижает каталитическую активность липаз до 92 % и 95 % соответственно.

5. Обнаружено влияние солей на ферментативную активность липаз в двухкомпонентных комплексах с полиэлектролитами, при различных мольных соотношениях. Так, каталитическая активность липазы из Hog Pancréas в присутствии ПСС и солей возрастает до 142 % (полимер : липаза = 10:1) и до 124 % у липазы из Pseudomonas fluorescent (полимер : липаза = 10:1).

6. Найдены оптимальные условия получения трехкомпонентных комплексов (двух полиэлектролитов и липазы из бактерии Pseudomonas

fluorescens или липазы из поджелудочной железы свиней) с высокой ферментативной активностью. Так для липаз из Pseudomonas fluoiescens и из Hog Pancréas главными условиями являются соотношение полимер : липаза — 100 : 1 и значение рН среды 9,0. Это позволяет получить

стабильные комплексы с высокой эффективной активностью (свыше 60 %) и стабильностью при хранении.

Рекомендации по использованию

Разработанный подход к иммобилизации липаз существенно отличается от других технологий иммобилизации ферментов своей простотой, воспроизводимостью и стабильными параметрами проб. Полученные полиэлектролитно-липазные комплексы могут быть использованы как перспективный биокаталитический материал, для разработки новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Stracture-fimctional studies of protein-poly electrolyte complexes / S. Yu. Zaitsev, T.V. Cashtigo, I.V. Gorohova, A.A. Zinchenko, H. Dautzenberg // Biomedical sciences 2001. - Moscow, 2001. - P.24.

2. Каштиго Т.В. Регуляция ферментативной активности бактериальной и панкреатической липаз в полиэлектролитных комплексах / Зайцев С.Ю., Горохова И.В., Каштиго Т.В., Даутценберг X. // Материалы Всероссийской научно-производственной конференции по проблемам ветеринарии я зоотехнии. - Казань, 2002. - Часть 1. - С.50-51.

3. Регуляция ферментативной активности липазы из Pseudomonas fluorescens в полиэлектролитных комплексах: Сб. науч. тр./ МГАВМиБ им. К.И. Скрябина; Вет.-биолог. фак. - Москва, 2002. - С.4-9.

4. General approach for lipases immobilization in polyelectrolyte complexes / S. Yu. Zaitsev, T. V. Cashtigo, I.V. Gorohova, A.A. Zinchenko, H. Dautzenberg // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng- 2003. - Vol. 221. -P.209-220.

5. Каштиго Т.В. Ферментативная активность липаз в полиалектролитных комплесах / Капггаго Т.В., Зайцев С.Ю., Кривошеее А.А. // Наука и образование. - Мурманск, 2003 - Часть 4. - С.169-171.

6. Иммобилизация панкреатической липазы свиньи в полиэлектролитные комплексы // Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В., Иванова ОА, Горохова И.В., Даутценберг Д. Доклады РАСХН. - 2004 г. - №6.-С.39-40.

7. Enzymatic activity changes for lipases in the polyelectrolyte complexes / S. Yu. Zaitsev, T. V. Cashtigo, OA Ivanova, I.V. Gorohova, H. Dautzenberg. // International conference - The problems of solvation and complex formation in solutions. - Plyos, Russia. - 2004. - P.45.

8. Каштиго Т. В., Иванова О. А, Зайцев С.Ю. Изменения ферментативной активности липазы из поджелудочной железы свиньи / Сб. науч. тр. // Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посв. 85 - летаю МГАВМиБ им. КИ.Скрябина. - Москва, 2004. - Часть 2. - С. 27-30.

Отпечатано в 00 0 «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.06.2000 г. Подписано в печать 8.12.2004 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,44

Печать авторефератов730-47-74,778-45-60

»2 68 0 í

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каштиго, Татьяна Викторовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

Раздел 1.

1.1 Современные представления о липолитических ферментах

1.2 Липазы

1.3 Структурная организация липаз

1.4 Фермент - субстратный комплекс

1.5 Кинетика липолиза

1.6 Влияние жирных кислот

1.7 Термолабильность ферментов

1.8 Зависимость активности ферментов от рН среды

1.9 Влияние неорганических солей на липолиз

Раздел 2.

2.1 Современные аспекты иммобилизации ферментов

2.2 Иммобилизованные ферменты

2.3 Методы иммобилизации ферментов

Глава 2. Материалы и методы

Раздел 1. Материалы

Раздел 2.Методы

Раздел 3 Статистическая обработка

Глава 3. Результаты собственных исследований

Раздел 3.1 Изучение влияния факторов среды на липазы из различных источников

Раздел 3.2 Исследование влияния заряда полимерного окружения на липазы из различных источников

Раздел 3.3 Изменение активности ферментов в комплексе с одним полиэлектролитом и неорганическими солями

Раздел 3.4 Иммобилизация липазы из Pseudomonas fluorescens в смесь из двух полиэлектролитов

Раздел 3.5 Иммобилизация липазы из Hog pancreas в смесь из двух полиэлектролитов

Выводы

Рекомендации по использованию

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиней и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens в комплексе с полиэлектролитами"

Ферменты и ферментативные системы широко применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильно-кожевенной, косметической и других отраслях промышленности, а также в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, биохимическом анализе и т. д. До сих пор развитие прикладной энзимологии сдерживается дороговизной многих ферментов, особенно их чистых препаратов. Возможность применения ферментов также осложнены по ряду причин: ферменты неустойчивы при хранении, при различных воздействиях, особенно тепловых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции [4,5,21,30].

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал и развиты теоретические представления о методах иммобилизации различных ферментов, позволяющие решить указанные проблемы. Целью иммобилизации является повышение устойчивости ферментов к денатурирующим агентам и придание им заданных технологических свойств, включая возможность повторного использования и легкость выделения из реакционной смеси [21, 45].

Одними из наиболее широко использующихся ферментов являются липазы, которые относятся к третьему классу ферментов (гидролазам) и способны гидролизовать сложноэфирные связи в молекулах ряда липидов (главным образом - триглицеридов). По-нашему мнению, управление липолитической активностью будет играть важную роль в новых методах лечения нарушений жирового обмена и в контроле за сердечно-сосудистыми заболеваниям, поэтому изучение возможности изменения активности липаз является важным и актуальным.

Большой интерес представляет практическое использование липаз в пищевой и других отраслях промышленности. Липазы микроорганизмов в сочетании с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод. Липазы, гидролизующие триглицериды с образованием глицерина и жирных кислот, входят в состав набора реактивов для определения содержания триглицеридов во всех биологических жидкостях[7,25 - 27, 29]. Возрастающие масштабы использования липаз в биохимии и биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в связи с чем в настоящей работе проводилось сравнение липаз из разных источников: липазы из поджелудочной железы свиньи и бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens [ 25-27,29].

В настоящее время в биохимических лабораториях и научно-исследовательских институтах ведутся исследования, основанные на методах иммобилизации ферментов: сорбция на носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей и отдельных полимеров [13,20,24, 47, 56, 57, 106]. Однако данных о регуляции ферментативной активности липаз в комплексах на основе двух противоположно заряженных синтетических полиэлектролитов до наших работ в литературе не было. Такие исследования позволяют глубже понять природу многих важных биохимических процессов, протекающих в живых системах, а также создавать новые материалы для биотехнологии и медицины.

Целью данной работы являлось исследование влияния разнозаряженных полиэлектролитов и условий протекания каталитической реакции на активность липаз из различных источников, а также определение оптимальных условий иммобилизации липаз в полимерное окружение.

Научная новизна. Впервые получены стабильные комплексы на основе липазы и двух противоположно заряженных полиэлектролитов, проявляющие повышенную каталитическую активность. Предложена модель формирования таких двух- и трехкомпонентных комплексов.

Изучено влияние знака заряда полиэлектролита на активность липаз из поджелудочной железы свиней и из бактерии Pseudomonas fluorescens.

Проведено сравнительное изучение влияния полимерно-ионного окружения и др. факторов среды на ферментативную активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней.

Впервые подобраны оптимальные условия для иммобилизации различных типов липаз в трехкомпонентные комплексы с полиэлектролитами.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по иммобилизации липаз в комплексы с различными полиэлектролитами имеют практическую ценность для разработки новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов.

Установленное влияние полимерного окружения на фермент позволяет использовать полиэлектролиты как аллостерические модуляторы активности, а также стабилизаторы ферментов.

Сравнительное исследование активности липаз микробного и животного происхождения даёт возможность выбора подходящего фермента и условий иммобилизации для определённого вида липазы, в целях экономии средств, при производстве и использовании препарата в различных отраслях промышленности.

Результаты и основные научно-методические положения диссертации используются в лекционном курсе и лабораторном практикуме по курсу дисциплин: «Биохимия» (3 курс ВБФ), «Биоэнергетика. Энзимология», «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций» и «Биохимия мембран» (4 курс ВБФ) при подготовке специалистов высшей квалификации по специальности 012300 - «Биохимия» в ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И.Скрябина».

Положения выносимые на защиту. данные по влиянию условий среды на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; - данные по влиянию положительно заряженного полиэлектролита (ПАМА - полидиаллилдиметиламмоний галогенид) и отрицательно заряженного полиэлектролита (ПСС -полистиролсульфонат натрия) на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; данные по влиянию неорганических солей на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней в комплексе с полиэлектролитами (двухкомпонентные комплексы); оптимальные композиции высокоэффективных препаратов иммобилизованной липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней на основе разнозаряженных полиэлектролитов (трехкомпонентные комплексы).

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии в Казани в 2002 г.; на Всероссийской научно-технической конференции в Мурманске в 2003 г.; на IX Международной конференции «The problems of solvation and complex formation in solutions», Plyos, 2004; на Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, Москва, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 печатных работ, из них 5 статей и 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Каштиго, Татьяна Викторовна

Выводы:

1. Детально изучен процесс формирования двух- и трехкомпонентных комплексов полиэлектролитов с липазами из различных источников и предложена модель этого процесса. Показано существенное влияние таких факторов как: соотношение фермент : полиэлектролит, неорганических солей, рН среды, на активность и стабильность фермент-полиэлектролитных комплексов.

2. Показано, что как природа катиона и аниона, так и концентрация солей при приготовлении растворов липаз из Pseudomonas fluorescens и поджелудочной железы свиней существенно влияют на их ферментативную активность. Так, соли неорганических фосфатов оказывают активирующее влияние на все изученные типы липаз (до 22-29 %) по сравнению с NaCl, который не оказывает влияние на активность липаз, но является обязательным компонентом среды электрохимической ячейки.

3. Обнаружено, что соотношение полимер : фермент играет важную роль для проявления каталитической активности обоих типов липаз в комплексе. В большинстве случаев оптимальное соотношение для проявления ферментативной активности обоих типов липаз в двухкомпонентном комплексе является соотношение 10:1.

4. Изучено влияние полимерного окружения (полиэлектролитов ПСС и ПАМА) на ферментативную активность указанных липаз в различных мольных соотношениях. Показано, что присутствие отрицательно заряженного полимера (ПСС) в двухкомпонентном комплексе увеличивает каталитическую активность до 129 % у липазы из поджелудочной железы свиней при соотношении полимер : липаза =10:1 и до 126 % у бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens (полимер : липаза =1:1). Положительно заряженный полимер (ПАМА) при соотношении полимер : липаза =1:1 напротив несколько снижает каталитическую активность липаз до 92 % и 95 % соответственно.

5. Обнаружено влияние солей на ферментативную активность липаз в двухкомпонентных комплексах с полиэлектролитами, при различных мольных соотношениях. Так, каталитическая активность липазы из Hog Pancreas в присутствии ПСС и солей возрастает до 142 % (полимер : липаза = 10 : 1) и до 124 % у липазы из Pseudomonas fluorescens (полимер : липаза =10:1).

6. Найдены оптимальные условия получения трехкомпонентных комплексов (двух полиэлектролитов и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens или липазы из поджелудочной железы свиней) с высокой ферментативной активностью. Так для липаз из Pseudomonas fluorescens и из Hog Pancreas главными условиями являются соотношение полимер : липаза = 100 : 1 и значение рН среды 9,0. Это позволяет получить стабильные комплексы с высокой эффективной активностью (свыше 60 %) и стабильностью при хранении.

Рекомендации по использованию результатов диссертационной работы

Полученные полиэлектролитно-липазные комплексы могут быть использованы как перспективный биокаталитический материал для новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов. Разработанный подход к иммобилизации липаз существенно отличается от других технологий иммобилизации ферментов своей простотой, воспроизводимостью и стабильными параметрами проб.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каштиго, Татьяна Викторовна, Москва

1. Асатиани B.C. Биохимическая фотометрия. М.: Изд. АН СССР, 1957.- с.248-253.

2. Беззубов Л.П. Химия жиров. М. Пищев. Пром-ть, 1975. - 279 с.

3. Белов С.В. Исследование гидролиза в монослоях новых липидоподобных субстратов и трилаурина под действием липазы Pseudomonas fluorescens / Белов С.В., Шнайдер М.П., Иванов А.Е. // Биоорганическая химия, 2000. том 26, №3. - С. 231-237.

4. Березов T.T., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. -3-е изд., испр. и доп. М.: Медицина, 1998. 704 с.

5. Брокерхоф X. Липолитические ферменты./ Брокерхоф X., Дженсен Р.; Под ред. Акад. А.Е.Браунштейна и Е.В.Горяченковой. М.: Мир, 1978. - 396 с.

6. Бургелев О.О., Каплун А.П., Козлов Л.В., Лисакова С.В., Дьяков В.Л.,

7. Швец В.И. Механизм ингибирующего эффекта полианионов и поликатионов. Биоорганическая химия, 2003.- т.29,- №2 -С.139-142.

8. Быковская Г. Использование ферментов в хлебопечении: Хлебопродукты / Быковская Г.- 2000. №5.- С.12.

9. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты. / Под ред. И.В.Березина, К.Мартынека. М.: Изд-во МГУ, 1982.

10. Васильев В.П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа: Учеб. для студ. Вузов. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2002. - С.210.

11. Горохова И. В. Увеличение каталитической активности липазы из Pseudomonas fluorescens при соосаждении с суспензией гексан-1, 2-диола / Горохова И. В., Иванов А. Е., Зубов В. П.// Известия Академии наук. Серия хим. Москва, 2001. - №1. - С. 146-148.

12. Горохова И. В. Соосаждение липазы из Pseudomonas fluorescens с гидрофобными соединениями как подход к ее иммобилизации при катализе в неводных средах / Горохова И.

13. B., Иванов А. Е., Зубов В. П. // Биоорганическая химия, 2002. -т. 28. -№1.-С. 56-61.

14. Горохова И. В. Изучение взаимодействия и активации липазы из Pseudomonas fluorescens в монослоях и преципитатах ПАВ / Горохова И. В., Иванов А. Е., Зайцев С. Ю., Зубов В. П. // Известия Академии наук. Серия хим. Москва, 2003. - № 4.1. C. 38-47.

15. Дарст Р., Ионоселективные электроды. М.: Мир, 1972.- 73 с.

16. Диксон М. Ферменты / Диксон М., Уэбб Э., пер.англ.,- М.: Мир, 1982.-т.1.-с. 370-392.

17. Денуэль П. Система липаза-колипаза как модель липолитического биокатализа / Денуэль П. // Физ.-хим. проблемы ферм, катализа. М.: Наука, 1984. - 250с.

18. Зайцев С.Ю. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты: Учебн. Пособие/ Зайцев С.Ю., Конопатов Ю. В. СПб.: Изд-во Лань, 2004. - 384 с.

19. Изумрудов В. А. Успехи химии / Изумрудов В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Москва, 1991.-т. 60.-е. 1570-1585.

20. Иммобилизованные ферменты / Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. и др. М.: Высш. шк., 1987.- 159 с.

21. Иммобилизованные клетки и ферменты // Под редакцией Дж.Вудворда.- М.: Мир, 1988. 215 с.

22. Инфракрасные спектры поглощения полимеров и вспомогательных веществ. Под. ред. Чулановского В.М. // Химия. Ленинград, 1969.

23. Кабанов В. А., Зезин А. Б., Изумрудов В. А. Итоги науки и техники / Серия биотехнология, т. 4. М.: ВИНИТИ, 1987. - С. 159-198.

24. Калунянц К.В. Применение продуктов микробиосинтеза в животноводстве / Калунянц К.В., Ездаков Н.В., Пивняк И.Г. -М.: Колос, 1988.-288 с.

25. Камман К. Работа с ионоселективными электродами / Камман К. М.: Мир, 1980.-25 с.

26. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. -М.: ДеЛи принт, 2002.- 179 с.

27. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.-Москва, 1989.

28. Котова Г.А. Получение аминокислот с использованием иммобилизованных ферментов / Котова Г.А., Безбородов A.M. // ОНТИТЭИ Микробиопром, Москва, 1978.

29. Кугушева Л.И. Применение ферментсодержащих мембран для определения органических соединений / Кугушева Л.И., Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б., Ягодина О.В. И Журн.анал.химии,- 1992.- т.47.- Вып.8. С.1478-1483.

30. Лейтес Ф.Л. Гистохимия липолитических ферментов в норме и припатологии липидного обмена. М.: Медицина, 1967.

31. Логинов А.С. Ингибиторы протеолитических ферментов поджелудочной железы / Логинов А.С., Амиров Н.Ш., Черноярова О.Д. // Вестник академии мед. наук СССР. 1989 -№1 - С.53-61.

32. Марри Р. Биохимия человека / Марри Р., Греннер Д., Мейсес П., Родуэлл В. // Пер. с англ. М.: Мир, 1993. - т. 1. - 384 с. -т.2. -415 с.

33. Мидгли Д., Торренс К. Потенциометрический анализ воды. М.: Мир, 1980.

34. Никольская Е.Б., Кузнецова Л.П., Кострова В.М. // Ж. аналитической химии. 1989. - Т.44. - № 5. - С.936.

35. Никольская Е.Б. Ионный обмен и ионометрия / Никольская Е.Б., Волонт Л.А., Рудаков В.В. Ленинград: ЛГУ, 1982. Вып.З. -С.214.

36. Рахимов М.М. Субстратная специфичность иммобилизованных липаз / Рахимов М.М., Джанбаева Н.Р. // Доклады академии наук СССР, Биохимия, 1976. Том 229. -№6.

37. Трофимова О.Д., Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов: Автореф. Дис. канд.биол.наук: 3.00.02 / О.Д.Трофимова; Воронежский гос.ун-т. - Воронеж, 2004.-16 с.

38. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир., 1980.-с. 373-388.

39. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе. М.: Мир, 1991.

40. Химическая энциклопедия. Изд-во Большая Российская энциклопедия, Москва, 1995. Т.4. - С.78-80.

41. Черноярова О.Д. Ингибиторная способность крови по отношению к липазе у больных хроническим панкреатитом. / Черноярова О.Д., Астафьева О.В., Винокурова Л.В.,

42. Кондашова З.Д. // Российский гастроэнтерологический журнал.- 1998. №2. - С.103.

43. Alford J.A. Bacterid. / Alford J.A., Pierce D.A. 1963. v.24. -p.86.

44. Alford J.A., Pierce D.A., Suggs F.G. / J. Lipid Res., 1964. №5 - P. 390.

45. Atsushi Harada. Switching by Pulse Electric Field of the Elevated Enzymatic Reaction in the core of Polyion complex micelles / Atsushi Harada, Kazunori Kataoka // J.Am.Chem.Soc. 2003. -P.125.

46. Baillargeon M.W. Lipase modified for solubility in organic solvents / Baillargeon M.W.,Sonnet P.E. // Ann. NY Acad.Sci, 1988. -v.545. P.244-249.

47. Barros R.J. Effect of Enzyme Loading on Immobilized a-Chymotrypsin Activiti in Organic Medium, sigillum Biotrans'95 / Barros R.,J., Wehtye E., Adlercreutz P, 1995.

48. Benzonana G., Desnuelle., Biochim. Biophys. Acta, 1968. v.164.- p.47.

49. Bernard C. Memoire sur le pancreas et sur la role du sue pancreatiquea dans les phenomenes digestifs, particulierement dans la digestion des matieres grasses neuters / Bernard C. // Bailliere et Fils. Paris, 1856.

50. Bjorklund A. Some Lipolytic Psychrophilic Pseudomonas Bacteria and their Hydrolysis of Edible Fats / State Inst. Tech. Res.// Finland, Julkaisu 156 Publ., Helsiki, 1970.

51. Brokerhoff H., Biochim. Biophis // Asta, 1968. v. 159. - P.296.

52. Bosley Y.A. Blueprint for f lipase support: Use of hydrophobic controlled-pore glasses as model systems / Bosley Y.A., Clauton Y.C. // Biotechnology and Boiengineering, 1994. v. 43. - P. 934938.

53. Coleman M.H., Advan. Lipid Res., 1963. №1.

54. Cygler M. Understanding interfacial properties of lipases / Cygler M., Schrag J.D. // Method in enzymology, 1997. v. 284.

55. Dong L.C. Thermally reversible hydrogels.3.Immobilization of enzymes for feedback reaction control / Dong L.C., Hoffman A.S. // J. Control. Release, 1986. v.4. - P.223 - 227.

56. Dong L.C. Thermally reversible hydrogels swelling characteristics and activities of copoly gels containing immobilized asparaginase in Reversible Polimeric Gels / Dong L.C., Hoffman A.S. // ACS Symposium series. Washington, 1987. - P.236 - 244.

57. Dautzenberg H, Rother G. Macromol. Chem. // Macromol. Symp, 1992.-v.61. -P.94-113.

58. Dautzenberg H, Rother / G. Polym. Sci. Part В // Polym. Phys., 1988.-№26. -P. 353 -366.

59. Dautzenberg H. Immobilization of trypsin in polycation-polyanion complexes / Dautzenberg H., Karibyants N., Zaitsev S.Yu. // Macromol. Rapid Commun, 1997. v.18. - P. 175-182.

60. Entressangles В., Desnuelle P. // Biochim. Biophys. Acta, 1968. -№159.-P. 285.

61. Emilie Passicos. Regioselective acylation of flavonoids catalyzed by immobilized Candida Antarctica lipase under reduced pressure / Emilie Passicos, Santarelli X., Coylon D. // J. Biotechnology Letters, 2004. v.26. - №13. - P. 1073-1076.

62. Erdmann H. Ausgewaehlte Beispile fuer die Anvendung von Lipasen in der organisch praparativen Chemie Jarbuch Biotechnologie / Erdmann H., Fritsche K., Schneider M., 1986/1987.-P.353-379.

63. Finkelstein E., Strawich E.S., Sonnino S // Biochim. Biophis. Acta, 1970. v.206. - P. 380.

64. Fukui A., Tanaka A., Iida T. // FEBS Lett., 1976. P. 66 - 179.

65. Heinrich C.P., Noack K., Wiss O. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000. v. 49. - P. 1427-1432.

66. Hoffman A.S. Application of thermally reversible polymers and hydrogels in therapeutics and diagnostics / Hoffman A.S. // J. Control. Release, 1987. v.7. - P. 297-305.

67. Hokin L.E. Handbook of physiology / Hokin L.E. // Amer. Physiol. Soc. J. Field, ed., Williams and Wilkins, Baltimore, Meryland, 1967.-Sect. 6, -V. II.-P. 935.

68. Huttunen J. K. Fed.Proc. / Huttunen J. K., Ellingboe J., Pittman R. C., Steinberg D. // Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 1970. №29. -P.267.

69. Ivanov A.E. Methods for immobilization of Lipase and their use in ester syntesis / Ivanov A.E., Schneider M.P. // J. Molecular Catalysis B: enzumatic, 1997. №3. - P.303 - 309.

70. Kaetsu I., Kimamura M., Fuyimura Т., Yoshida M., Asano M., Kasai N.,

71. Tamada M. // Radiat. Phys. Chem., 1986. №27. - p. 245.

72. Kirchener G., Scollar M. P., Klibanov A.M. // J. Amer. Chem. Soc., 1985.-№107.-P. 70-72.

73. Koops B.C., Verheij H.M., Slotboom A.J., Egmond M.R. Effect of chemical modification on the activity of lipases in organic solvents. Elsevier // Enzyme and Microbial Technology, 1999. №25. — p.622.631.

74. Klibanov A.M., Samochin G.P., Martinek K., Berezin I.V. // BiotechnologyandBoiengineering, 1977. №19.-p. 1351.

75. Kudryashova E.V. Enzyme Polyelectrolyte Complexes in Water — Ethanol Mixtures: Negatively Charged Groups Artificially1.troducedinto a-Chymotrypsin Provide Additional Activation and Stabilization

76. Effects / Kudryashova E.V.,Gladilin A.K., Vakurov A.V., Frederic1. Heitz,1.vashov A.V., Mozhaev V.V. // J. Biotechnology and Bioengineering,1997. v.55.-№.2.

77. Jensen R.G. Progr. Chem. Fats Other Lipids, 1971. v.l 1 - p.347.

78. J. Xia. Protein-Polyelectrolyte Complexes / J. Xia, P. L. Dubin // P. L. Dubin, J. Bock, R. M. Davies, D. N. Schulz, C. Thies (Eds.).

79. Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1994. Chap. 15. - P. 247-271.

80. Laboureur P., Labrousse M./ Bull. Soc. Chim. Biol., 1966. №48. -p. 747.

81. Laumen K., Breitgoff D., Schneider M.P. // J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1988. v.22. - P. 1459.

82. Laura M.B. Variables that affect immobilization of Mucor Miehei Lipase on Nylon membrane / Laura M.B., Gustavo A.S.P., Heizir F., Jose L., Eduardo H. // J. Kluwer of Microbiology and Biotechnology, 2004. v.20. - №4.- p.371-375.

83. Lawrens R.C., Dairy Sci. Abstr.,1967. №29. - P.l.

84. Lawrens R.C., Fryer T.F., Reiter B. Nature. London, 1967. -v.213. -p.1264.

85. Lipases. Part A Biotechnology / Ed. By Byron Rubin, Edward A.Dennis // Methods in Enzymology, 1999. - vol. 284. - p. 327-347.

86. Lipases / Ed.by Borgstrom B. and Brockman H.L.// Elsevier, Amsterdam, N.Y., Oxford, 1984.

87. Litchfield C. Analysis of Triglycerides / Litchfield C. // Academic Press. New York, 1972.

88. Lu J.Y., Liska B.J., Appl. Microbiol., 1969. №18. - p. 104-108.

89. Margolin L. Dokl. Acad. Nauk. USSR // Margolin L., S. F. Sherstyuk, V. A. Izumrudov, V. K. Svedas, A. B. Zezin, V. A. Kabanov, 1985.-№284. P.997.

90. Martinek К., Klibanov A. M., Goldmacher V. S.,Chernusheva A.V., Mozhaev V.V., Berezin I.V., Glotov V.O., Biochim. Biophys.Acta, 1977.-v.485.-p. 13.

91. Mattson F. H., Volpenhein R.A. // J. Amer. Oil Chem., 1966. Soc. 43-P. 286.

92. Mattson F. H., Volpenhein R.A. // J. Lipid Res., 1966. №7. - P. 356.

93. Mencher J.R., Alford J.A. // Gen. Microbiol., 1967. №48. - P. 317.

94. Metod in enzimology / Enzime // Ed. By K. Mosbash. N.Y.: Academic Press, 1976. - v. 44. - P. 999.

95. Mirrison J.D. Assymmetric synthesis / Mjrrison J.D. // New York, Academic. Press, 1983-85. Vol. 1-5.

96. Mori Т., Tosa Т., Chibata I. // J.Solid-Phase Biochem., 1, 1976. -p.15-26.

97. Nashif S.H., Nelson F.E. // Dairy Sci. Abstr., 36, 1953. p. 481.

98. Nacrae A.R., Hammond R.C. // Biotechnol. Biophys. Acta, 1989. -V.575.-P. 156.

99. Nunez A., Ashby R., Foglia T.A., Solaiman D.K.Y. LC/MS analysis and lipase modification of the sophorolipids produced by Rhodotorula bogoriensis. J. Biotechnology Letters, 2004. v.26. -№13. - p. 1087-1093.

100. Okahata Y., Niikura K., Ijiro K., Enzyme Lipid Complex, 1995. -p.9.

101. Okahata Y., Ijiro K. //Chem. Soc. Chem. Commun, 1992.- v. 65. -p.2411.

102. Okahata Y.,Hatano A., Ijiro K., Enhancing Enantioselectivity of a Lipid coated Lipase via Imprinting Methods for Esterification in Organic

103. Solvents // Azymmetry, 1995. №6. - P.1311-1322. 103.0kumura S., Iwai M., Tsuyisaka Y. // Biochim. Biophys.Acta.-1989.-V.575.-p. 156.

104. Philipp В., H. Dautzenberg, K. J. Linow, J. Koetz, W. Dawydoff, // Progr. Polym. Sci., 1989. №14. - p. 91.

105. Ramachandra Murty V. Hydrolysis of rice bran oil using an immobilized lipase from Candida rugosa in isooctane / Ramachandra Murty V., Jayadev В., Muniswaran P.K.A. // J.Kluwer. Biotechnology Letters, 2004. - v.26. - №7. - p.563-567.

106. Reetz M.T. Efficient Immobilization of Lipase by Entrapment in Hydrophobic Sol-Gel Materials / Reetz M.T., Zonta A., Simpelkamp // J. Biotechnology and Bioengineering, 1996. v.49. -p.527-534 .

107. Retey Y.,Robinson Retey Y., Robinson Y.A., Stereospecificity in organic chemistry and enzymology. Weinheim, Verlag Chemie, 1982.

108. Sangpill Hwang, Jungoh Ahn, Sumin Lee, Tai Gyu Lee, Seungjoo Haam, Kangtaek Lee, Ik-Sung Ahn, Joon-Ki Jung. Evaluation of cellulosebinding domain fused to a lipase for the lipase immobilization // J.Kluwer, 2004. v.26. - №7. - p.603-605.

109. Sarda L. Action de la lipase pancreatique sur les esters en emulsion / Sarda L., Desnuelle P. // Biochim. Biophis. Acta, 1958. Vol. 30.

110. Semeriva M., Benzonana G., Desnuelle P.// Biochim. Biophis. Acta, 1969.-v.191.-p. 598.

111. Semeriva M., Dufour C., Biochim. Biophis. Acta, 1972. v.260. -p. 393.

112. Slotboom A.J., de Haas G.H., Bonsen P.P.M., Burbuch-Westerhuis G.

113. J., van Deenen L.L.M.// Chem. Phys. Lipids, 1970. v.4. - p. 15.

114. Slotta K.H. The Enzymes /P.D. Boyer, H. Lardy and K. Myrback, eds. // 2nd rev. ed, Academic Press, New York, 1960. v. 4. - p. 551.

115. Somkuti G.A., Babel F.J., Appl. Microbiol, 1968. v.16. - p. 617.

116. Somkuti G.A., Babel F.J., Somkuti A.C., Appl. Microbiol, 1969. -v.17. p. 606.

117. S. Dumitriu, E. Chornet, P. F. Vidal, C. Moresoli, Biotechnology Techniques, 1995. v.9. -p.833-836.

118. S. Dumitriu, E. Chornet, Adv. Drug Delivery Reviews, 1998. -v.31. p.223-246.

119. Retey Y. Stereospecificity in organic chemistry and enzymology / Retey Y.,Robinson Retey Y., Robinson Y.A. // Weinheim, Verlag Chemie, 1982.

120. Tischer Immobilisierte Systeme in der Anwendung, Forschung und Entwicklung, 1996. v.54. - p.252-275.

121. Y. Li. Structure and Flow in Surfactant Solution / Y. Li, P. L. Dubin, C. A.Herb, R. K. Prud'homme // Eds., ACS Symposium. -Series 578, Am.Chem.Soc., Washington, DC, 1994. Chap.23. -p. 320.

122. Yamanaka S. Regiospecific interification of triglyceride with celite adsorbed lipase / Yamanaka S., Tanaka T. // Meth. Enzymol, 1987.-v. 136.-p.404-411.

123. Ulbrich R., Schellenberger A., Damerau W., Biotechnology and Boiengineering, 1986. v.28. - p.511.

124. Unen D-J. Studies on the mechanism of crown-ether-induced activation of enzymes in non-aqueous media / Unen D-J., Engbersen F.J., Reinhoudt D.N. // Elsevier. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001. v.l 3. - p.877-882.

125. Verger R. / Thesis // Faculte des Sciences de Marseille, 1970.

126. Wills E.D. // Biochim. Biophys. Acta, 1960. №40. - p.481.

127. Zaks A., Klibanov A.M. // Science, 1984. v.224. - p. 1249.

128. Zaks A., Klibanov A.M. // Proc. Natl. Sci. USA. v.85.- 1985. -p. 3192.

129. Zhen Yang. Synthesis of Protein-Containing Polymers in Organic Solvents / Zhen Yang, Darrel Williams, Alan J. Russel // Biotechnology and Boiengineering, 10-17, 1995.-p.45.1. АКТ ЗАКЛЮЧЕНЫ1. УТВЕРЖД. Проректо ФГОУ Ц'профес « /.

130. Скрябина, .И. Василевич 2004г.

131. На что и составлен настоящий акт.1. Что и удостоверяется:

132. Председатель учебно—методической комиссии ветеринарно-биологического факультета, доцент кафедры органической и биологической химии, заслуженный работник высшей школы

133. Декан ветеринарно биологического факультета,/ доктор биологических наук, £доцент кафедры радиобиологии ;1. V А

134. Заведующий кафедрой органической и биологической химии, доктор химических наук1. Л.А. Фролова1. Л.В. Рогожина1. С.Ю. Зайцев