Механизмы модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином

Шайхутдинова, Асия Равильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином"

На правах рукописи

ШАЙХУТДИНОВА ЛСИЯ РАВИЛЬЕВНА

МЕХАНИЗМЫ МОДУЛЯЦИИ РАБОТЫ НИКОТИНОВОГО РЕЦЕПТОРНО-КАНАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ХЛОРГЕКСИДИНОМ

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2005

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Никольский Евгений Евгеньевич

кандидат биологических наук, Скоринкин Андрей Иванович

Официальные онпоненты: доктор медицинских наук

чл.-корр. РАМН заслуженный деятель науки РФ профессор Зефиров Андрей Львович

доктор физико-математических наук старший научный сотрудник Котов Николай Викторович

Ведущая орханизация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет»

Защита состоится 2005 г. в /£' часов на заседании

диссертационного совета К002.005.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН (420111, г Казань, а/я 30, ул. Лобачевского 2/31).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке КазНЦ РАН по адресу: 420111, г.Казань, а/я 30, ул. Лобачевского 2/31.

Автореферат разослан

» . хлси/ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

^Ч-ч // y iy

WM 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В нервно-мышечном соединении

постсинаптические токи, возникающие в ответ на выделение медиатора из моториою

нервного окончания могу г и ¡меняться биологически активными веществами, имеющими

различные механизмы действия. Как правило, самою факта влияния вещества на

параметры постеинаптического тока недостаточно для определения конкретного

механизма модулир>ющего действия Ситуация осложняется еще и iew, что многие

биологически активные вещества имеют многокомпонентный механизм дейС1вия

(Colquhoun, 1981; Ralevic, Burnstock, 1998; Chíodini et al., 2001)

Прежае всего, вещества, уменьшающие амплитуду постсинаптических токов,

могут действовать или на процесс выброса медиатора из нервного окончания, или

непосредственно на его рецепторы на постсинаптической мембране, или сочетать оба этих

действия. Одним из подходов к решению вопроса о пре- или пос1синашическом

механизме действия вещества является исследование его влияния на постсинантическис

токи, возникающие при вызванном и спонтанном квантовом освобождении медиатора.

Если i оворить о веществах, уменьшающих амплитуду постсинаптических токов за

счет влияния непосредственно на постсинаптические рецешорно-канальные комплексы,

то их можно разделить па три класса: блокаюры, аллостерические модуляторы и

ускорители лесенситизашш (Cockroft et al., 1990; Conley, Brammar, 1996; Changeux et al,

1998. Arias, 1998, Jackson, 1999; Krusek et al., 2004). Ьлокаторы принято подразделять на

конкурентные, занимающие на рецепторе посадочные места для агониста и тем самым

мешающие его посадке и последующему открытию каната, и неконкурентные,

взаимодействующие с ионным каналом (Colquhoun, 1981). Неконкурентные блокаторы

делят на три подгруппы - блокаторы закрытого капала, блокаторы открытого канала и

блокаторы открытого канала ловушечного типа, которые впервые были описаны для

глутаматных рецепторов (Lingle, 1983; Gurney, Rang, 1984). Различают медленные,

быстрые и средние блокаторы открытого канала, медленные ускоряют спад

постсинаптических токов, быстрые - замедляют, средние - делают его двухфазным.

Аллостерические модуляторы взаимодействуют со специфическими участками

рецепт орно-канального комплекса и меняют кинетику его работы; ускорители

десенситизашш повышают вероятность перехода рецепторно-канального комплекса в

десенситизированпое непроводящее состояние, являясь, фактически, специализированной

разновидностью аллостсрических модуляторов.

Вещества, способные модулировать синаптич^иую mummy, пппшотья либо

КОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I

лекарствами, либо ядами, полому большой интерес с пра^лГОЙ||в|-Ц|в|оретииеской

CneMftor/Д//!

точки зрения представляют вещества, способные оказывать длительное ингибирующее воздействие на синаптическую передачу, однако сейчас известно немного таких веществ Блокагоры ловушечного типа могут длительное время оставаться в закрытом канале ионотропного рецептора, но только в отсутствии агониста, то есть в неактивном синапсе (Blanpied et al 1997; Gmiatullin et al, 2000) Длительное воздействие на ионотронные рецепторы могут оказывать некоторые токсины (Уткин и др, 1999: Bambrick, Gordon, 1994; Tsetlin, Hucho, 2004; Lewis, 2004), но их эффекг обусловлен необратимостью связывания с рецептором или каналом, что сильно шраничивает возможности их применения Вещества же безопасные и способные, при этом, оказывать длительное воздействие на активно работающий синапс до сих пор известны не были

Ранее были получены данные о слабо обратимом ингибирующем дейовии нетоксичного и широко применяемого в клинической практике амфифильною антисептика хлоргексидииа на постсинаптические токи в нервно-мышечном соединении (Соко шва и др . 1998). Однако точный механизм и особенности действия »того вещества до сих пор не были исследованы и преде тавляют собой актуальную, теоретически и практически значимую задачу. Для более полного понимания механизма взаимодействия молекулы хлоргексидииа и рецепторно-каналыгого комплекса, наряду с электрофизиологическими экспериментами необходимо было провести модельные исследования, которые способны более детально прояснить поэтапное развитие экспериментально наблюдаемых эффектов

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования было выяснение механизмов, посредством которых реализуется действие хлоргексидииа на никотиновый рецептор мышечного типа

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи

1 Исследовать действие хлоргексидииа на параметры вызванных и спонтанных постсинаптических токов в нервно-мышечном соединении лягушки.

2 Найти экспериментальные условия, пошоляющис определи ib механизм действия хлоргексидииа как ускорителя десенситизации, конкурентного или неконкурентного блокатора, аллостерического модулятора

3 С помощью математического моделирования проверить выдвинутую на основе экспериментов гипотезу о механизме действия хторгексидина и определить константы в кинетической схеме его взаимодействия с никотиновым хо шнорецептором мышечного типа.

щ.а<* .*»»и»*О-*»» >"'' » :-.<-' *•»£ | I ^rij't*""* '' ' * Г

V »V-

fcr* - 1. * ""

Положении, выносимые на защиту.

1 В действии хлоргексидина па никотиновый холинорецептор мышечного типа присутствуют два компонента, блокада открытого канала медленного типа и аллостерическая модуляция рецепгорно-канального комплекса.

2. Аллостерическая модуляция рецепторно-канально! о комплекса преобладает в действии хлоргексидина и обеспечивает 70% общего эффекта. Как аллостерический модулятор хлоргексидин снижает сродство холинорепептора к агонисту и верояшость нахождения канала в открытом состоянии.

Научная новизна. Впервые для никошновых холинорецепторов мышечного типа показано существование вещества, имеющего двухкомпонен гный механизм действия -блокирование открытого канала и аялостерическую модуляцию кинетики рецепторно-канального комплекса. Причем наличие и преобладающая роль механизма аллостеричсской модуляции для хлоргексидина показаны как экспериментально, так и с помощью математического моделирования.

Впервые найдены функции, описывающие динамику изменения концентрации ацегилхолина и активное™ ацетштхолинэстеразы в синаптической щели нервномьптгечного соединения холоднокровных. Впервые построена и исследована математическая модель, описывающая кинетику взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорецептором мышечного типа.

Выдвинут хшкнеза о возможности существования нового механизма пролонгированного действия для аллостерических модуляторов, связанного со способностью вещества растворяться в липидах мембраны и оказывать модулирующее дейивие через специализированные места посадки, находящиеся в зоне липид-белкового взаимодействия. В эгом случае обратный переход модулятора из лшшдной фазы в водную будет сильно затруднен и эффект вещества долю не будет "отмываться", несмотря на обратимое связывание этого вещества с рецепторно-канальным комплексом.

Научно-практическая ценность. Полученные в данной работе результаты углубляют паши представления о работе никотинового рецептора мышечного типа и, в частности, вносят вклад в понимание механизмов функционирования синоптическою аппарата скелетных мышц. Одновременное экспериментальное и модельное исследование юнких механизмов, обусловливающих особенности действия слабообратимых ингибиторов ионных токов, является новым методическим подходом, позволяющим приблизиться к пониманию принципов модуляции работы ионогроиных рецепторов. Эти данные помогут понять механизм действия некоторых лекарств с пролонгированным

синаптическим эффектом, а также могут лежать в основе создания новых лекарственных средств, мишенями для которых явчяются синаптические структуры Полученные зависимости, описывающие динамику изменения концентрации ацетилхолина и активности ацетилхолинэстеразы в синаптической щели, можно использовать при моделировании кинетики процессов в нервно-мышечном соедипении холоднокровных

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы дотожены на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (Казань, 2003, 2004, 2005), 6-й, 7-й, 8-й международных путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002, 2003, 2004), VI Всероссийском симпозиуме и школе-семинаре молодых ученых и учителей (Набережные Челны, 2004), XI Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, 2004), международном симпозиуме "Neuron differentiation and plasticity - Regulation by intracellular signals" (Москва, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной школе-конферешита "lntematioanl workshop in cell physiology" (С-Пстсрбург, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом страниц состоит из введения, обзора литерагуры, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список литературы включает 170 источников, из них 145 - иностранных авторов. Диссертация содержит 20 рисунков и 1 таблицу.

1. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполняли на изолированном нервно-мышечном препарате m Cutaneus pectoris лягушек г. Ridibunda в осенне-зимний период. Животных содержали в террариуме при температуре окружающей среды 5-6°С Перед началом эксперимента животных выдерживали при комнашой температуре (20-22°С) в течение 3-4 часов. Изолированную мышцу с фрагментом нерва, фиксированную на подложке из смолы Sylgard (Down Corning, Midband, MJ), помещали в жепериментальную ванночку из органического стекла с рабочим объемом 5 мл Для предотвращения сокращений мышцы при одновременном сохранении высокого квантово1 о состава токов концевой пластинки (TKII) использовали методику «рассеченного» препарата (Волкова и др , 1975)

В течение эксперимента через ванночку непрерывно протекал раствор Рингера для холоднокровных следующего состава (ммоть/л)- NaCl - 113 0, KCl - 2.5, NaHCOj - 3 0,

СаСЬ - 1.8, рН рас тора поддерживали на уровне 7 3. Исследуемые вещества растворяли в paciBope Рингера с последующей проверкой рН В экспериментах были использованы следующие препараты: хлоргексдина би1люконак aipomra (Sigma), армии (ИОФХ, Россия). По параметрам острой токсичности (ГОСТ 12 1 007-76) дезинфицирующее средство и кожный ангасептик хлоргексидина биглюкопат (20%) относится к 4 классу малоопасных соединений (ЛД50 более 10 г/кг)

Регистрацию постсинаптических токов осуществляли с применением стандартной методики двухэлектродной фиксации потенциала. Электроды были заполнены 2.4 моль/л КС1 и имели сопротивление 3-5 МОм. Сигналы после усиления оцифровывали АЦП с частотой 50 кГц и обрабатывали на ПК с помощью орш инальной программы, созданной в нашей лабораюрии Усредняли по 120-150 миниатюрных юков концевой пластинки (мТКП) или по 20-25 многоквантовых токов (ТКП) При регистрации мТКП порог устанавливали на уровне, в 1.5-2 раза превышающем шум Все полученные данные представлены как средняя величина ± стандартная ошибка (п = число синапсов), статистическая значимость оценивалась с помощью парно! о теста Стьюдента; полученные данные считали достоверными при Р < 0.05. Зависимость доза-эффект для хлоргексидина описывали уравнением Хилла:

где Аь -амплитуда гока при данной концентрации вещества, Ас - амплитуда тока в контроле, b - концентрация вещества, пн - коэффициент Хилла, ICso равно той концентрации ингибитора, при которой исследуемый параметр становится равен половине исходного.

При математическом моделировании использован метод, основанный на решении системы обыкновенных дифференциальных уравнений вида (Chretien, Chauvet, 1998):

1де Р(0 - вектор вероятностей нахождения рецепторно-канального комплекса в разных состояниях, О - матрица переходов между состояниями. Величина тока считалась пропорциональной вероятности нахождения комплекса в состоянии с открытым каналом.

А,

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Влияние хлоргексидина на амплитудно-временные параметры ТКП.

Хлоргексидин в концентрации 5 мкмоль/л при редком раздражении нерва (0 05 имн/с)

вызывал снижение амплитуды и посюянной времени спада ТКП до 34 2-1-7 3% и 53 513.2% (п = 10, Р<0 05) соответственно (Рис 1) Амплитуда и постоянная времени переставали меняться через 20-25 мин после подачи хлоргсксидина В диапазоне 1-15 мкмоль/т наб подалось дозозависимос снижение амплитуды и постоянной времени спада хлоргексидином. Аппроксимация усредненной кривой доза-эффект для амплитуды ТКП уравнением Хилла позволила установить значения 10™, составившее 4 7 мкмоль/л при -70 мВ, и пн, равное 0 9; последнее свидетельствует о том, что действие на холинорецептор производится одной молекулой хлоргексидина

Обращает на себя внимание факт слабой обрагимосш эффекта хлор!ексидина Так, при )далении хлоргексидина (концентрации 5 мкмоль/ 0 мосле развития его эффекта из омывающего препарат раствора за 50 мин амплитуда ТКП достоверно пе изменялась (Рис 1) Столь медленная "отмывка" в сочетании с нстоксичностью хлоргексидина свидетельствуют о юм чю основным механизмом действия этого вещества не могут быть ни конкурентная блокада, ни блокада открытого или закрытого канала При этом сильное влияние хлоргексидина на постоянную времени спада ТКП свидетельствует, что он не являетсяможет быть конкурентным блокатором или блокатором закрытого канала Однако нельзя исключить возможность того, что он способен блокировать открытый капал

2мсек

40нА

^ контроль хлоргексидин 5мкМ

160^ хлоргексидин 5 мкМ

О ¿мили гуда + время спада

40 60

время, мин

Рис.1 Влияние хлоргексидина биглюконата на амплитудно-временные параметры ТКП. А. ГКП в контроле, через 25 мин после подачи хлоргексидина и через 30 мин отмывки. Б. Изменение амплитуды и времени спада ТКП в течение эксперимента.

1.1. Влияние хлоргексидина на квантовый состав ТКП. Для определения влияния хлоргексидина на квантовый состав ТКП необходимо было определить действие вещества в одной концентрации на ГКП и мТКП. При исследовании действия

хлоргексидина на мТКП мы не мопи использовать концентрации 5, 10 или 15 мкмоль/л, так как в этом случае резко ухудшалось соотношение сигнал-шум и сигналы терялись в шуме При концентрации хлоргексидина 2 мкмоль'т амп шгуда мТКГТ снижалась до 63 2±17 8%, а амплитуда ТКП - до 69.1 ±6 3% от контроля. Отсутствие разницы в изменении амплитуд спонтанных и вызванных токов свидетельствует об оюутствии влияния хлоргексидина на квантовый состав ТКП и, следовательно, о постсинаптическом действии исследуемого вещества

2.3. Влияние хлоргексидина на ТКП в режиме высокочастотной стимуляции. Снижение амплитуды и времени спада ТКП характерно для разных веществ, блокаторов, атлостерических модуляторов, веществ, ускоряющих десенситизацию С целью уточнения механизма действия хлоргексидина были проведены эксперименты при стимуляции нерва "пачками" импульсов с частотами от 0.1, до 60 имп/с Амплитуда 20 сигнала в пачке по отношению к первому в контроле при стимуляции с частотой 0.1 имп/с составила 94.2±3.3%, с частотой 1 имп/с - 95.6±1.8%, с частотой 10 имп/с 108.3±7.8%, а с частотой 60 имп/с - 119.6±13 1% (п = 4). При перфузии нервно-мышечно1 о препарата раствором, содержащим хлоргексидин (2 мкмоль/л), потенциация в пачках сменялась депрессией, наиболее выраженной для более высокой частоты (86.7±4.5%, 72.2+4.3%, 57.1±2.8%, 31 7±4 2% при частотах стимуляции соответственно 0.1,1.10 и 60 имп/с, п = 4 для каждой частоты).

Снижение амтыигуды последовательных ТКП при ршмической стимуляции является типичным признаком действия как медленных блокаторов открытого канала, так и ускорителей дссенситизации (Скоринкнн, Гипиатуллиц, 2004). Для проверки влияния хлоргексидина на скорость десенситизации холинорсцспторов была проведена серия экспериментов с использованием ингибитора ацетилхолинэстеразы - армина. В контрольных условиях армии в концентрации 5 мкмоль/л (достаточной для ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы) не вызывал достоверного увеличения амплитуды, но увеличивал постоянную времени спада ГКП на 325.6±29.8% (п = 4, Р < 0.05). При использовании хлоргексидина в концентрации 2 мкмоль/л на фоне действия армина амплитуда 20 сигнала в пачке по отношению к первому при стимуляции с частотой 0 1 имп/с составила 82 3±9.1%, с часто I ой 1 имп/с - 82.6±6.7%, а с частотой 10 имп/с - 59 7±8 9% (п - 4). Этот результат не отличался достоверно от эффекта хлоргексидина на фоне активной ацетилхолинхолинэстеразы Поскольку величина депрессии при ингибировании ацетилхолинэстеразы достоверно не менялась, можно заключить, что хлоргексидин не является веществом, ускоряющим десенситизацию.

125-

т ▼

▼

50-

25-

-20 мВ

-70 мВ

т-1-1-//-г

3 4 5 15 16

время, мин

Рис.2. Временное частичное разблокирование каналов при сочетании деполяризации клешчной мембраны с продолжающимися раздражениями нерва. Частота раздражений нерва - 0 05 имп/с. Сплошпая линия внизу графика отражает моменты переключений мембранного потенциала между уровнями -70 мВ и -20 мВ. При первой деполяризации раздражения нерва продолжались, при второй (равной по длительности) - прекращались. Кресшки изображают амплитуды вызванных токов в контроле, кружки - после 25 мин действия 5 мкмоль/л хлоргексидина, Tpeyi ольники - для сравнения после 40 мин действия 20 мкмоль/л мекамиламина (то есть для обоих веществ после выхода амплитуд токов на постоянный уровень). Во всех случаях за 100% принят средний уровень амплитуд до первой деполяризации Видно чю одна деполяризация без раздражений нерва не приводит к разблокированию. В контроле временная деполяризация мембраны не вызывает никаких эффектов независимо от раздражений нерва.

2.4. Эффект частично! о разблокирования рецепторно-канального комплекса.

На фоне развившеюся эффекта хлоргексидина сочетание деполяризации клеточной мембраны с продолжающимся раздражением нерва вызывало час пгчное разблокирование каналов, хотя одна лишь деполяризация без раздражений нерва не приводила к эффекту разблокирования, указывая на принципиальное значение сочетания двух стимулов (Рис. 2) Величина разблокирования, оцепиваемая по отношению амплитуд первого сигнала после возврата к нормальному мембранному потенциалу и последнего сигнала перед деполяризацией (от -70 мВ до -20 мВ) при концентрации хлоргексидина 5 мкмоль/л, составила 124.4113.6% (п = 4) То есть характерный для блокаторов ловушечного типа феномен разблокирования наблюдался и при действии хлоргексидина на никотиновые холинорецепторы мышечного типа. Однако необходимо отметить, что в отличие от случая

с аналогичным эффектом частичного разблокирования для известного блокатора лову щечного типа мекамиламина, для хлоргексидина эффект разблокирования сохранялся длительное время (около 5 мин) после во ¡врата к нормальному потенциалу мембраны (Рис 2).

2.5. Влияние экзогенного агониста карбахолина па скорое п. отмывки хлоргексидина. Описанный в предыдущем разделе эффект частичного разблокирования рецепторов при сочетании деполяризации клеточной мембраны с акгивацией рецепторов позволил предположить, что хлоргексидин является блокатором открьиого канала ловушечного типа. В этом случае можно было ожидать, что его эффект будет быстро устраняться в условиях постоянной активации холинорецептора во время отмывки. Поэтому была проведена серия экспериментов с использованием холипомиметика карбахолина Надо отметить, что сам карбахолин снижал амплигуду ТКП, но этот его эффект полное 1ью "отмывался" за 25 мин. Через 35 мин после начала действия хлоргексидина в концен ¡рации 10 мкмоль/л и выхода амплитудно-временных параметров ТКП на стационарный уровень в течение 20 мин препарат "отмывали" физиологическим раствором с добавлением карбахолина в концентрации 2 мкмоль/л, после чею его "отмывали" нормальным физиологическим раствором Мы не обнаружили ожидаемою быстрого восстановления параметров до контрольного уровня, что не согласуется с 1ицогезой о блокаде хлоргексидином открытого канала холинорецептора по ловушечному механизму.

2.6. Внеканальное действие хлор1 ексидипа на ионофопный холинорецептор.

Механизм действия хлоргексидина имеет много общего с механизмом действия блокаюров открытого канала, но одним из характерных свойств последних является быстрая "огмывка", чего в случае с хлоргексидином не наблюдалось Мы предположили, что в механизме действия хлоргескидина может быть два компоненты кроме блокады открытого канала он, возможно, оказывает на рецепюрно-канальный комплекс аллостерическое модулирующее воздействие. В этом случае медленная "отмывка" может объясняться тем, что места для посадки хлоргексидина в качестве аллостерического модулятора на рецепторно-канальный комплекс находятся в зоне липид-белкового взаимодействия. Тогда для воздействия па эти сайты амфифильный хлоргексидин должен вначале проникнуть в липидную мембрану и последующий его выход наружу при отмывке будет затруднен.

Для проверки I ипотоы о внекана,шном расположении мест посадки хлоргексидина в качестве аллостерического модулятора были проведены эксперименты, в которых хлоргексидин в концентрации 10 мкмоль/л подавался в отсутвии стимуляции нерва на

время, необходимое для полного развития ею эффекта в обычных экспериментах Мы исходили из того, что если хлоргексидин является блокатором открытого канала, то в отсутствии активации рецепторов, а, следовательно, и открывания каналов, он действовать не будет Однако в результате экспериментов мы получили снижение амплитуды 1КП до 54 5±1 5%, а времени их спада до 62 3±9.8% (Рис 3), причем после включения стимуляции параметры снижались до тех же значений, что и в экспериментах со стимуляцией нерва (то есть до 34 2±7 и 52 9±2.9 соответственно). Следовательно есть основания предполагать, что основным механизмом действия хлоргексидина, дающим около 70% эффекта, является аллостерическая модуляния работы никотиновою рецепторно-кавального комплекса, осуществляемая через участки, расположенные вне ионно! о канала мышечного холинорецепгора.

Рис. 3. Изменение амплитуды (А) и постоянной времени спада (Б) ТКП хлоргексидином (10 мкмоль/л) за время, необходимое для развития эффекта параметры в контроле - 1,при периодической (0.05 имп/с) стимуляции нерва - 2, в отсутствие стимуляции нерва - 3

Другим способом проверки справедливости этой гипотезы были эксперименты, проведенные в условиях предварительной блокады АХР концевой пластинки известным блокатором открытых каналов - атропином Под влиянием атропина (300 мкмоль/л происходило снижение амплитуды ТКП до 11.7±10 6%, а постоянной времени спада до 5 7±5.6% от контрольных зпачепий и этот эффект полностью "отмывался" в

течение 40 мин В случае подачи хлоргексидина на 20 мин на фоне развившегося эффекта агропина "отмывки" затем не наблюдалось, то есть хлор1ексидин прототжал действовать и при почти полной блокаде канатов атропином Этот факт также подтверждает справедливость гипотезы о том, что хторгексидин явтяется преимущественно аллоетерическим модулятором

2.7. Модельное исследование взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорецептороч мышечного типа.

Проведенное экспериментальное исследование показало, что хлоргексидин не является веществом, ускоряющим десепсшизацию, или блокатором открытого канала ювушечного типа Он также не может быть конкурентным блокатором или блокатором закрытою канала ввиду сильного влияния на постоянную времени спада ГЮ1 и мТКП и слабой "отмывки" В то же время хторгексидин проявляв! свойства харакхерные как для аллостерических модуляторов, так и для блокаторов открытого канала медленного типа; значит, механизм его действия должен бьпь по крайней мере двухкомпоненгным Для проверки этой гипотезы и выяснения конкретных значений констант скоростей реакции взаимодействия хлоргексидина с канально-рецепторным комплексом мы провели математическое моделирование кинетики этого взаимодействия В качестве базовой мы использовали следующую схему активации холинорецепторов (Colquhoun, 1998): kf к; а

R + А о AR + А A,R <->• A,R *,

k, k; а

i де А - анетилхолин, R - свободный рецептор, AR и A2R - рецептор, связанный с одной и двумя молекулами агониста соответственно, A2R* - двусвязный рецептор с открытым каналом, кГ, к], к2\ к2, ß, а - константы скоростей соответствующих реакций Перечисленные константы были взяты из данных лшерагуры (Stiles et al., 1999) и не подвергались изменениям при дальнейшем моделировании

Для проверки на модели гипотезы о "двойном" механизме действия хлоргексидина мы объединили две известные кинетические схемы схему аллоетерической модуляции холинорсцсптора и схему блокирования открытого канала.

R + A«AR + AoA,R Д A,R* +В о A,R*B

к, к2 а ть

+ М + М +М

ЬЯ1 I ьр1 Ь„4 I bp4 bm5 X bp5

Ч ß кь

RM + AoARM + AOA2RM^A2R*M +B4->A2R*MB k, kl a »b

где В - хлоргексидин в роли блокатора, кь. Шь, кь' и ть' - константы связывания

открытого канала с хлор1ексидином и его освобождения, М - хлоргексидин в роли аллостерического модулятора, bmi, bm/|, bm;, bri. bP4, bp5 - константы, определяющие переход рецешора в модулированное состояние и возврат в нормальное. Нахождение значений перечисленных здесь констант и было основной целью математического моделирования.

2.7.1. Математическое моделирование изменения концентрации агониста при квантовом выбросе. Концентрация ацетилхолина в синаптической щели при квантовом выбросе определяется скоростью выброса медиатора из нервной терминали, диффузией его через синалтическую щель, удалением медиатора из щели за счет гидролиза и обратного захвата его терминалью и связыванием ацети.аолина с постсинаптическими рецепторами В соответствии с базовой кинетической схемой для описания изменения концентрации аиетилхолина в синаптической щели было использовано следующее дифференциальное уравнение'

где [А] - концентрация ацетилхолина, w(t) - скорость выброса агониста из нервного окончания, и описывает диффузию в щели и обратный захват ацетилхолина, f(t) -активность ацетилхолинэстеразы, [R], [AR] и IA2RJ - количество рецепторов, находящихся, соответственно, в свободном, односвязном и двусвязном состояниях. Сравнивая постсинаптические токи, полученные при активной и ингибироваппой ацетилхолинэстеразе, мы определили w(t) и f(t) для нервно-мышечного соединения лягушки и аппроксимировали их следующими уравнениями:

где скорость выброса выражена в ммоль/мс, активность ацетилхолинэстеразы в мс"1 Эти функции применялись при составлении дифференциальных уравнений, описывающих изменение концентрации ацетилхолина в синаптической щели.

2.7.2. Кинетика взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорсцептором мышечного типа При подборе значений кинетических констант для оценки адекватности модели экспериментальным данным использовали следующие критерии: 1) зависимость изменения амплитуды и постоянной времени спада от концентрации вещества, 2) 70%-е снижение амплитуды хлоргексидином в отсутствии открытых каналов; 3) кинетика изменения амплитуды во время частотной стимуляции При приведенных в 1аблице

= rtt)-u w-f(t) м + к, -[АЯ] + к- 14Х}-к;-[Л] Щ-Ъ ¡А] 1Щ,

/(0 = 207000

значениях констант мы смогли воспроизвести в модели все экспериментальные эффекты хлоргексидина На рис 4 приведены модельная зависимость доза-эффект для амплитуд ТКП в сравнении с экспериментальными точками и модельная кинетика изменения амплитуд ТКП во время частотной стиму.шщи в сравнении с экспериментальной Таким образом моделирование показало, что только двухкомлонешный механизм действия хлоргексидина, включающий в себя аллостерическую модуляцию и медленную блокаду открыто! о канала, может объяснить все особенности его действия

I аблица Полученные в результате моделирования кинетические константы

к/, л/ммоль-мс 160 кГ', л/ммоль-мс 130

кГ, 1/мс 18 кГ', 1/мс 20

кг+, л/ммоль-мс 80 кг ', л/ммоль-мс 65

кг", 1/мс 36 к2"', 1/мс 40

Р, 1/мс 36.7 Р\ 1/мс 12

а, 1/мс 1.7 (Н = 156 мВ) а', 1/мс 3 4 (Н = 156 мВ)

кь, л/ммоль-мс 0.08 кь', л/ммоль-мс 0 09

Шь, 1/мс 0.03 ть', 1/мс 0.03

Ьт1 0.00002 ЬР1 0,0000083

Ьщ4 0.00002 Ьр4 0.0000083

Ьт5 0.00002 Ьр5 0,0000083

Примечания- Выделенные жирным шрифтом константы взяты из данных литературы и не менялись при моделировании Для потенциалзависимых констант приведены значения при -70 мВ

А Б

(т,...........11 ........' .......I .1-1-1-—г-

001 01 1 10 о 5 10 15 20

[хлоргексидин^, мкМ/л номер сигнала в пачке

Рис. 4. А. Модельная зависимость доза-эффект лш амплитуд ТКП (линия) в сравнении с экспериментальными точками (о) Б Модельная кинетика изменения амплитуд ТКП во время частотной стимуляции (о) в сравнении с экспериментальной (•)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование посвящено изучению хлоргексидина на амплитудно-временные параметры ТКП и объяснению механизма его действия По основным эффектам своего действия на амплитуду и постоянную времени спада постсинаптических токов в условиях редкого раздражения, это вещество может быть отнесено к неконкурентным блокаторам медленного типа, однако более подробное исследование показало, что хлоргексидин не может быть юлько блокатором открытою канала. Отличия в механизме действия хлоргексидина проявляются в его способности влиять на рецепторно-канальные комплексы, даже когда их ионные каналы закрыты или заблокированы

С учетом предложенного набора тестов (высокочастотная стимуляция, действие на фоне заблокированных каналов, действие в отсутствии активации каналов) было показано, что хлоргексидин имеет механизм действия, состоящий из двух компонентов -аллостеричсской модуляции рецепторно-канального комплекса и блокирования открытого канала; причем аллостерическая модуляция дает больший вклад в общий эффект вещества Важным нам представляется факт медленной "отмывки" эффекта хлоргексидина, означающий, что вещество может накапливаться в синапсе и оказывать на него пролонгированное ингибирующее воздействие При этом хлоргексидин не является ни токсином, ни блокатором ловушечного типа Учитывая структуру и химические свойства x;iopi ексидипа, можно предполагать, что слабая обратимость эффектов связана с его способностью растворяться в мембранных липидах и оказывать модулирующее действие, поскольку в этом случае обратный выход из лигшда в водную фазу будет сильно затруднен Эта гипотеза представляется нам перспективной, поскольку в случае её справедливости есть основание говорить о существовании неисследованного пока класса вещее гв, способных оказывать пролонгированное воздействие на синаи гаческую передачу - липидрастворимых аллостерических модуляторах.

Полученные данные свидетельствуют также о том, что блокированные хлоргексидином ионные каналы мышечною холинорецептора способны частично разблокироваться при сочетании действия агониста и деполяризации мембраны Это позволяет утверждать, что в нормальных физиологических условиях т vivo, когда потенциал мембраны не фиксирован, ингибирующий эффект исследованного вещества будет гораздо слабее; причем проявляться это ослабление эффекта будет избирательно в акгивно работающих мышцах, где за активацией мышечных холинорецепторов следует деполяризация клеточной мембраны до +20 - +50 мВ на несколько мс. Из этого, в частности, следует, что нельзя напрямую переносить экспериментальные данные для

потенциалзависимых модуля юров. полученные т vitro в ус ювиях фиксации потенциала, на нормальные физиоло! ические условия

Важно, что хлоргексидин имеет весьма низкую токсичность, ei о ЛД50 превышает 10 >/ KI и при этом он способен оказывать длительное угнетающее воадействис на нервномышечную передачу Это позво иет рассматривать его как потенциальное лекарственное средство, способное устранять избыточное тоническое напряжение скелетных мышц

ВЫВОДЫ

1 В условиях низкочастотной стимуляции нерва (0 05 ипм/с) хлорюксидин вьнывает зависимое от концентрации снижение амплитуды (1Сад сос!авило 4 57 мкмоль/л при мембранном потенциаге -70 мВ) и постоянной времени спада вызванных постсинаптических токов

2 Повышение частоты раздражения приводит к увеличению степени депрессии амплитуд ТКП При этом ингибирование ацештхолинэстеразы не увеличивает степень депрессии, что не согласуется с предположением об >скорспии хлоргексидином десенсишзации холинорецепторов

3 На фоне развившеюся эффекта хлоргексидина деполяризация постсинаптической мембраны в сочетании со стимуляцией нерва вызывает быстро развивающееся (к 3 - 5 сигналу) частичное разблокирование каналов; в отсутствие стимуляции это1 эффект не наблюдайся Однако в отличие от случаев с известными блокаторами ловушечною типа эффект частичного разблокирования для хлоргексидина сохраняется затем длительное время (около 5 мин)

4 Активация рецепторов экзогенным агонистом (карбахолином) при низкочастотной стимуляции нерва вьнывает небольшое ускорение развития эффекта хлоргексидина и последующей частичной "отмывки", но не изменяет величин эффектов, что не согласуется с предположением о блокировании хлоргексидином открытою ионно! о канала по ловушечному типу.

5 В отсутствии открытых каналов мышечных холинорецепторов хлоргексидин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно снижает амплитуду ТКП на 46%, что составляе1 70% от эффекта в нормальных условиях Эффект хторгсксидина в полной мере сохраняется при предварительной бтокаде канатов холинорецентора атропином Эти факты свидетельствуют о том, что основным механизмом действия хлор! ексидина является не блокада каналов, а аллостсрическая моду.шция рецепторно-канального комплекса.

6 Математическое моделирование позволило показать, что все указанные эффекты можно объясни п, двухкомпонентным механи шом действия хлоргексидина Хлоргексидин является аллостерическим модулятором холинорецепторов мышечного типа, он в 1.4 раза снижает сродство холипорецептора к ai онисту и в 5 раз снижает вероятность нахождения канала в открытом состоянии В то же время продемонстрировано, что хлоргексидин способен также блокировать открытый ионный канал холинорецептора с константой скорости блокирования 0.08-0 09 mM''-мс"1 и константой скорости разблокирования 0.03 мс~\ то есть является и аллостерическим модулятором и блокатором открытого канала медленного типа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Шайхутдинова, А Р Влияние хлоргексидина на функциональное состояние периферического нервно-чышечно! о аппарата / А.Р Шайхутдинова. Е F, Никольский, Р.А Гиниатуллин // Растущий организм- Адаптация к физической и умственной нагрузке' Сб.тезисов - Казань, 2002,- С. 172.

2. Шайхутдинова, А.Р Влияние хлоргексидина на параметры нервно-мьппечной передачи хладнокровных животных / А.Р Шайхутдинова // Биология - наука XXI века: Сб тезисов - Пущино, 2002,- С. 56.

3. Шайхутдинова. А.Р Модулирующее действие хлоргексидина на нервно-мышечную передачу в синапсе лягушки / А.Р. Шайхутдинова // Биоло1ия - наука XXI века' Сб. тезисов,- Пущино, 2003.- С 47-48

4 Shaikhutdinova, A.R. Postsynaptic blocking action of Chlorhexidine at the neuromuscular junetion / A.R. Shaikhutdinova, A.I. Skorinkin, R A. Oiniatullin // Abstr Symp "Neuron Differentiation and Plasticity -Regulation by intracellular Signals" - Moscow - Russia, 2003.- P. 67

5. Шайхутдинова, А.Р. Хлоргексидин как модулятор синаптической передачи / А.Р Шайхутдинова // Материалы международных чтений посвященных 100-летию со дня рождения члена-корреспондента АН СССР, академика АН АрмССР Э.А Асратяна. Сб.науч.тр.- Москва, 2003.- С. 235.

6. Шайхутдинова, А.Р. Особенности влияния хлоргексидина биглюконата на никотиновые холинорецепторы концевой пластинки / АР. Шайхутдинова, А И Скоринкин, Е.Е. Никольский // Биология - наука XXI века: Сб. тезисов - Пущино, 2004 -С. 98.

7. Шайхутдинова, А Р Моделирование процесса взаимодействия хлоргексидина биглюконата с постсинаптическими никотиновыми холинорецепторами / АР

Шайхутдинова, А И. Скоринкин, Е.Е. Никольский // III Съезд биофизиков России: Сб. тезисов,- Воронеж, 2004 - Т 1.- С. 304-305.

8. Шайхутдинова, А Р Особенности механизма действия хлоргексидина биглюконата на мышечный рецепторно-канальный комплекс / АР. Шайхутдинова, А.И Скоринкин, ЕЕ Никольский // Растущий организм: адаптация к учебной и физической нагрузке: Сб тезисов,- Набережные Челны, 2004.- С. 97-99

9. Шайхутдинова, А Р Механизм модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином биглюконатом / А Р. Шайхутдинова, А И. Скоринкин, Е Е. Никольский // Рос. физиол. журн. им И М Сеченова - 2004 - Т 90 - № 8 -С. 287.

10. Shaikhutdinova, A.R. The possible mechanism of action chlorhexidme on receptor-channel complex of a muscle ACh-receptor / A.R. Shaikhutdinova // International workshop in cell physiology.- S.-Peterburg.- 2004.- P. 59.

11. Скоринкин А И Реконструкция динамики изменения концентрации ацетилхолина в синаптической щели при одноквантовом сигнале / А.И Скоринкин, А.Р. Шайхутдинова // Биофизика,- 2004,- Т. 49,- № 5.- С. 872-876.

12. Скоринкин А.И. Ловушечный тип блокирования мышечных никотиновых холинорецепторов мекамиламином / А.И. Скоринкин, К Б. Остроумов, А.Р. Шайхутдинова, Р.А. Гиниатуллин // Доклады Академии Наук - 2004.- Т. 399.- № 6,- С. 843-845.

13 Шайхутдинова, А.Р Механизмы модуляции рабош рецепторно-канального комплекса хлоргексидином биглюконатом / А.Р Шайхутдинова, Е.Е. Никольский, Р.А. Гиниатуллин, А.И Скоринкин // XI Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем»: Сборник статей- Выпуск XI: Часть II.- 2004,- С. 195-198.

14. Скоринкин А И Зависимость концентрации полумаксимального действия блокатора открытых каналов от концентрации агониста / А И Скоринкин, Н.В. Валеев, А.Р. Шайхутдинова//Биофизика,-2005,-Т 50,- №2,- С 281-288.

15 Шайхутдинова, А.Р. Механизмы модуляции работы рецепторно-канального комплекса хлоргексидином биглюконатом / А Р Шайхутдинова, F..E. Никольский, Р.А Гиниатуллин, А И. Скоринкин // Доклады Академии Наук,- 2005 - Т. 402.- № 3.- С. 433442.

»1114 7

РНБ Русский фонд

2006-4 6294

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г Казань, уч Журналистов, 1/16, оф207 Тел 72-74-59, 41-76-41, 41-76-51 Лицензия ПД№7-0215 от 01 11 01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 23 05 2005 г Уел п.п1,25 Заказ № К-2938 Тираж 100 экз Формат 60x841/16 Бумага офсетная Печать - ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шайхутдинова, Асия Равильевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность исследования.

1.2. Цель и основные задачи исследования.

1.3.Положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна.

1.5. Научно-практическая ценность.

1.6. Апробация работы.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Никотиновый холинорецептор.

2.2. Субъединичный состав холинорецептора.

2.3. Структурные компоненты нАХР.

2.4. Строение канала ацетилхолинового рецептора.

2.5. Функциональные свойства нАХР.

2.6. Вещества, модулирующие работу нАХР.

2.6.1. Конкурентные лиганды.

2.6.2. Неконкурентные лиганды.

2.6.2.1. Экзогенные и эндогенные НКИ.

2.6.2.2. Фармакологические свойства НКИ.

2.6.2.3. Места связывания НКИ и потенциалзависимость их действия.

2.6.3. Аллостерические модуляторы.

2.6.4. Вещества имеющие двойной механизм действия.

2.7. Использование методов математического моделирования при изучении механизмов постсинаптического электрогенеза

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объект исследования.

3.2. Ванночка и система перфузии.

3.3. Растворы.

3.4. Электрофизиологические исследования.

3.5. Статистическая обработка и анализ.

3.6. Компьютерное моделирование.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Исследование влияния хлоргексидина на нАХР.

4.1.1 .Влияние хлоргексидина на ТКП.

4.1.2. Влияние хлоргексидина на квантовый состав ТКП.

4.1.3. Влияние хлоргексидина на ТКП в режиме ритмической стимуляции.

4.1.4. Эффект частичного разблокирования рецепторно-канального комплекса.

4.1.5. Частичное разблокирование рецепторов с помощью предварительной активации карбахолином.

4.1.6. Потенциалзависимость действия хлоргексидина.

4.1.7. Исследование внеканального действия хлоргексидина.

4.2. Математическое моделирование.

4.2.1. Реконструкция динамики изменения концентрации ацетилхолина в синаптической щели при одноквантовом сигнале.

4.2.2. Моделирование взаимодействия хлоргексидина с нАХР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином"

1.1. Актуальность исследования

В нервно-мышечном соединении постсинаптические токи, возникающие в ответ на нервный импульс, могут угнетаться биологически активными веществами, имеющими различные механизмы действия. Как правило, самого факта влияния вещества на параметры постсинаптического тока недостаточно для определения конкретного механизма. Ситуация осложняется еще и тем, что многие биологически активные вещества обладают сразу целым спектром механизмов действия (Со1циЬоип, 1981; Яа1еУ1С, ВипкЮск, 1998; СЫосНш ег а1., 2001).

Прежде всего, вещества, уменьшающие амплитуду постсинаптических токов, могут действовать или на процесс выброса агониста из нервного окончания, или непосредственно на постсинаптические рецепторы, или сочетать оба этих действия. Одним из подходов к решению вопроса о пре-или постсинаптическом механизме действия вещества является исследование его влияния на постсинаптические токи, возникающие при вызванном и спонтанном квантовом освобождении медиатора. Спонтанная квантовая секреция агониста является довольно стабильным процессом и сравнение действия вещества на спонтанные и вызванные постсинаптические токи позволяет судить о соотношении его пре- и постсинаптических эффектов.

Если говорить о веществах, уменьшающих амплитуду постсинаптических токов за счет влияния непосредственно на постсинаптические рецепторно-канальные холинорецепторы, то их можно разделить на три класса: блокаторы, аллостерические модуляторы и ускорители десенситизации (Cockroft et al., 1990; Conley, Brammar, 1996; Changeux et al., 1998; Arias, 1998; Jackson, 1999; Krusek et al., 2004). Блокаторы можно подразделить на конкурентные, занимающие на рецепторе посадочные места для агониста и тем мешающие его посадке и последующему открытию канала, и неконкурентные, взаимодействующие с ионным каналом (Colquhoun, 1981). Неконкурентные блокаторы делят на три подгруппы - блокаторы закрытого канала, блокаторы открытого канала и блокаторы открытого канала ловушечногф типа, которые впервые были описаны для глутаматных рецепторов (Lingle, 1983; Gurney, Rang, 1984). Различают медленные, быстрые и средние блокаторы открытого канала; медленные ускоряют спад постсинаптических токов, быстрые - замедляют, средние делают его двухфазным. Аллостерические модуляторы взаимодействуют со специфическими участками рецепторно-канального комплекса и меняют кинетику его работы; ускорители десенситизации повышают вероятность перехода рецепторно-канального комплекса в десенситизированное непроводящее состояние, являясь фактически специализированной разновидностью аллостерических модуляторов.

Большой интерес с практической и теоретической точки зрения представляют вещества, способные оказывать длительное ингибирующее воздействие на синаптическую передачу (такого рода воздействие необходимо при некоторых заболеваниях), однако сейчас известно немного таких веществ. Блокаторы ловушечного типа могут длительное время оставаться в закрытом канале ионотропного рецептора, но только в отсутствие агониста, то есть в неактивном синапсе (Blanpied et al., 1997; Giniatullin et al., 2000). Длительное воздействие на ионотропные рецепторы могут оказывать некоторые токсины (Уткин и др., 1999; Bambrick, Gordon, 1994; Tsetlin, Hucho, 2004; Lewis, 2004), но их эффект обусловлен необратимостью связывания с рецептором или каналом, что сильно ограничивает возможности их применения и делает их веществами, опасными для жизни. Вещества же безопасные и способные при этом оказывать длительное воздействие на активно работающий синапс до сих пор известны не были.

Ранее были получены данные о слабообратимом ингибирующем действии нетоксичного и широко применяемого в клинической практике амфифильного антисептика хлоргексидина на постсинаптические токи в нервно-мышечном соединении (Соколова и др., 1998). Однако точный механизм и особенности действия этого вещества до сих пор не были исследованы и представляют собой актуальную, теоретически и практически значимую задачу. Для полного понимания механизма взаимодействия молекулы хлоргексидина и рецепторно-канального комплекса наряду с электрофизиологическими экспериментами необходимо было также провести модельные исследования, которые способны детально прояснить поэтапное развитие экспериментально наблюдаемых эффектов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шайхутдинова, Асия Равильевна

ВЫВОДЫ

1. В условиях низкочастотной стимуляции нерва (0.05 ипм/с) хлоргексидин вызывает зависимое от концентрации снижение амплитуды (1С50 составило 4.57 мкмоль/л при мембранном потенциале -70 мВ) и постоянной времени спада вызванных постсинаптических токов.

2. Повышение частоты раздражения приводит к увеличению степени депрессии амплитуд ТКП. При этом ингибирование ацетилхолинэстеразы не увеличивает степень депрессии, что не согласуется с предположением об ускорении хлоргексидином десенситизации холинорецепторов.

3. На фоне развившегося эффекта хлоргексидина деполяризация постсинаптической мембраны в сочетании со стимуляцией нерва вызывает быстро развивающееся (к 3 - 5 сигналу) частичное разблокирование каналов; в отсутствие стимуляции этот эффект не наблюдается. Однако в отличие от случаев с известными блокаторами ловушечного типа эффект частичного разблокирования для хлоргексидина сохраняется затем длительное время (около 5 мин).

4. Активация рецепторов экзогенным агонистом (карбахолином) при низкочастотной стимуляции нерва вызывает небольшое ускорение развития эффекта хлоргексидина и последующей частичной "отмывки", но не изменяет величин эффектов, что не согласуется с предположением о блокировании хлоргексидином открытого ионного канала по ловушечному типу.

5. В отсутствии открытых каналов мышечных холинорецепторов хлоргексидин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно снижает амплитуду ТКП на 46%, что составляет 70% от эффекта в нормальных условиях. Эффект хлоргексидина в полной мере сохраняется при предварительной блокаде каналов холинорецептора атропином. Эти факты свидетельствуют о том, что основным механизмом действия хлоргексидина является не блокада каналов, а аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса.

6. Математическое моделирование позволило показать, что все указанные эффекты можно объяснить двухкомпонентным механизмом действия хлоргексидина. Хлоргексидин является аллостерическим модулятором холинорецепторов мышечного типа, он в 1.4 раза снижает сродство холинорецептора к агонисту и в 5 раз снижает вероятность нахождения канала в открытом состоянии. В то же время продемонстрировано, что хлоргексидин способен также блокировать открытый ионный канал холинорецептора с константой скорости блокирования 0.08-0.09 ммоль'^мс"1 и константой скорости разблокирования 0.03 мс"1, то есть является и аллостерическим модулятором и блокатором открытого канала медленного типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование посвящено изучению хлоргексидина на амплитудно-временные параметры ТКП и объяснению механизма его действия. По основным эффектам своего действия на амплитуду и постоянную времени спада постсинаптических токов в условиях редкого раздражения, это вещество может быть отнесено к неконкурентным блокаторам медленного типа, однако более подробное исследование показало, что хлоргексидин не может быть только блокатором открытого канала. Отличия в механизме действия хлоргексидина проявляются в его способности влиять на рецепторно-канальные комплексы, даже когда их ионные каналы закрыты или заблокированы

С учетом предложенного набора тестов (высокочастотная стимуляция, действие на фоне заблокированных каналов, действие в отсутствии активации каналов) было показано, что хлоргексидин имеет механизм действия, состоящий из двух компонентов - аллостерической модуляции рецепторно-канального комплекса и блокирования открытого канала; причем аллостерическая модуляция дает больший вклад в общий эффект вещества. Важным нам представляется факт медленной "отмывки" эффекта хлоргексидина, означающий, что вещество может накапливаться в синапсе и оказывать на него пролонгированное ингибирующее воздействие. При этом хлоргексидин не является ни токсином, ни блокатором ловушечного типа. Учитывая структуру и химические свойства хлоргексидина, можно предполагать, что слабая обратимость эффектов связана с его способностью растворяться в мембранных липидах и оказывать модулирующее действие, поскольку в этом случае обратный выход из липида в водную фазу будет сильно затруднен. Эта гипотеза представляется нам перспективной, поскольку в случае её справедливости есть основание говорить о существовании неисследованного пока класса веществ, способных оказывать пролонгированное воздействие на синаптическую передачу — липидрастворимых аллостерических модуляторах.

Полученные данные свидетельствуют также о том, что блокированные хлоргексидином ионные каналы мышечного холинорецептора способны частично разблокироваться при сочетании действия агониста и деполяризации мембраны. Это позволяет утверждать, что в нормальных физиологических условиях in vivo, когда потенциал мембраны не фиксирован, ингибирующий эффект исследованного вещества будет гораздо слабее; причем проявляться это ослабление эффекта будет избирательно в активно работающих мышцах, где за активацией мышечных холинорецепторов следует деполяризация клеточной мембраны до +20 +50 мВ на несколько мс. Из этого, в частности, следует, что нельзя напрямую переносить экспериментальные данные для потенциалзависимых модуляторов, полученные in vitro в условиях фиксации потенциала, на нормальные физиологические условия.

Важно, что хлоргексидин имеет весьма низкую токсичность, его ЛД50 превышает 10 г/ кг и при этом он способен оказывать длительное угнетающее воздействие на нервномышечную передачу. Это позволяет рассматривать его как потенциальное лекарственное средство, способное устранять избыточное тоническое напряжение скелетных мышц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шайхутдинова, Асия Равильевна, Казань

1. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами / В.Г. Артюхов, М.А Наквасина.- Воронеж: Издательство Воронежского государственного университета.- 2000.- 296 С.

2. Волкова И.Н. Блокирование потенциалов действия и сокращения скелетной мышцы лягушки поперечным рассечением / И.Н. Волкова, Е.Е. Никольский, Г.И. Полетаев // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 1975.- Т. 6 (9).-С. 1433-1436.

3. Катц Б. Нерв, мышца и синапс / Б. Катц М.: Мир, 1969, 256 С.

4. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Э.М. Корниш-Боуден Мир, 1979, 280 С.

5. Варфоломеева С.Д. Биокинетика: практический курс / С.Д. Варфоломеева, К.Г. Гуревич М: ФАИР-ПРЕСС- 1999, 720 С.

6. Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана / Л.Г. Магазаник, H.A. Дорофеева, В.В. Лаврентьева, и др. // Биологические мембраны 2001.- №19 - С. 14-23.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский -Харьков. 2000, 453 С.

8. Скок В.И. Нейрональные холинорецепторы / В.И. Скок, A.A. Селянко, В.А. Деркач М.: Наука.- 1987.- С. 343.

9. Моделирование действия блокаторов ионных каналов напостсинаптические токи / В.А. Снетков, Н.Р. Нигматуллин, Е.Е. Никольский, и др. // Нейрофизиологи.- 1989.- Т.21.- С. 476-484.

10. Возможный механизм связывания блокаторов пентаметиленбисаммониевого ряда в ионном канале мышечного никотинового холинорецептора / Д.Б. Тихонов, H.H. Потапьева, В.Е. Гмиро, и др. // Биологические мембраны.- 1996.- №13 С. 185-195.

11. Тихонов Д.Б. Исследование строения и механизмов блокады ионных каналов никотиновых холинорецепторов и глутаматных рецепторов: Автореф. дис. док. биол. наук: 03.00.02 / Д.Б. Тихонов; СПбГУ, С-Пб., 2004.- 42 стр.

12. Уткин, Ю.Н. Альфа-нейротоксины и альфа-конотоксины — блокаторы никотинового холинорецептора / Ю.Н. Уткин, И.Е. Кашеверов, В.И. Цетлин // Биоорг. Химия.- 1999.- Т. 25.- С. 805-810.

13. Модулирующее действие серотонина на нервно-мышечную передачу лягушки / Н.К. Хабибуллина, A.B. Шакирзянова, А.И. Скоринкин, и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2002.- Т. 134,- С. 12-15.

14. Adams P.R. End-plate channel opening and the kinetics of quinacrine (mepacrine) block/ P.R. Adams, A. Feltz // J Physiol.- 1980 Sep.- Vol. 306.- P. 283-306.

15. Adams P.R. Pharmacological inhibition of the M-current/ Adams P.R., Brown D.A., Constanti A. // J. Physiol.- 1982.- Vol. 332.- P. 223-262.

16. Adams B.A. Temperature and synaptic efficacy in frog sceletal muscle / B.A. Adams // J. Physiol.(London).- 1989.- Vol. 408.- P. 443-455.

17. Albuquerque A.A. Role of mast cell- and non-mast cell-derived inflammatory mediators in immunologic induction of synaptic plasticity / A.A. Albuquerque, J.H. Leal-Cardoso, D. Weinreich // Braz J Med Biol Res.- 1997.-Vol. 30(7).- P. 909-912.

18. New autonomic and sensory neuropathy with loss of adrenergic sympathetic function and sensory neuropeptides. / P. Anand, P. Rudge, C.J. Mathias et al. // Lancet.- 1991.-Vol. 337(8752).- P. 1253-1254.

19. Andreasen T.J. Inhibition of ion permeability control properties of acetylcholine receptor from Torpedo californica by long-chain fatty acids / T.J. Andreasen, M.G. McNamee // Biochemistry.- 1980.- Vol. 19(20).- P. 4719-4726.

20. Anglister L. Acetylcholinesterase density and turnover number at frog neuromuscular junctions, with modeling of their role in synaptic function / L. Anglister, J.R. Stiles, M.M. Salpeter // Neuron.- 1994.- Vol. 12.- P. 783-794.

21. Arias H.R. Agonist self-inhibitory binding site of the nicotinic acetylcholine receptor / H.R. Arias // J Neurosci Res.- 1996.- Vol. 44(2).- P. 97105.

22. Arias H.R. Luminal and non-luminal non-competitive inhibitor binding sites on the nicotinic acetylcholine receptor / H.R. Arias // Mol Membr Biol.- 1996.- Vol. 13(1).- P. 1-17.

23. Arias H.R. Topology of ligand binding sites on the nicotinic acetylcholine receptor / H.R. Arias // Brain research reviews— 1997.- Vol. 25 — P.131 191.

24. Arias H.R. Binding sites for exogenous and endogenous non-competetive inhibitors of the nicotinic acetylholine receptors / H.R. Arias // Biochimica et biophysica acta 1998 - Vol. 1376 - P. 173-220.

25. Arias H.R. Role of local anesthetics on both cholinergic and serotoninergic ionotropic receptors / H.R. Arias // Neuroscience and Biobehavioral reviews.- 1999.-Vol. 23.- P. 817-843.

26. Auerbach A. Desensitization of mouse nicotinic acetylcholine receptorchannels: A two-gate mechanism / A. Auerbach, G. Akk // J. Gen. Physiol.- 1998. Vol.34.- P. 181-197.

27. Bambrick L.L. Neurotoxins in the study of neural regulation of membrane proteins in skeletal muscle / L.L. Bambrick, T. Gordon // J Pharmacol Toxicol Methods.- 1994.- Vol. 32(3).-P. 129-38.

28. Monte-Carlo simulation of miniature endplate current generation in the vertebrate neuromuscular junction / T.M. Bartol, B.R. Land, E.E. Salpeter, M.M. Salpeter//Biophys J.- 1991.-Vol. 59.- P. 1290-1307.

29. Benoit P. Voltage dependencies of the effects of chlorpromazine on the nicotinic receptor channel from mouse muscle cell line So 18 / P. Benoit, J.P. Changeux // Neurosci Lett.- 1993.- Vol. 160(1).-P. 81-84.

30. Pharmacological properties of ureido-acetamides, new potent and selective non-peptide CCKB/gastrin receptor antagonists / P. Bertrand, G.A. Bohme, C. Durieux et al. // Eur J Pharmacol.- 199.- Vol. 262(3).- P.233-245.

31. Structure-activity relationship and site of binding of polyamine derivatives at the nicotinic acetylcholine receptor / M.G. Bixel, M. Krauss, Y. Liu et al. // European Journal of Biochemistry 2001.- Vol. 267 - P. 110 - 120.

32. Trapping channel block of NMDA-activated responses by amantadine and memantine / T.A. Blanpied, F.A. Boeckman, E. Aizenman, Johnson J.W. // J. Neurophysiol 1997.-Vol. 77.-P. 309-323.

33. Blount P. Molecular basis of the two nonequivalent ligand binding sites of the muscle nicotinic acetylcholine receptor / P. Blount, J.P. Merlie // Neuron.- 1989,-Vol. 3.- P. 349-357.

34. Bouzat C. Modulation of muscle nicotinic acetylcholine receptors by the glucocorticoid hydrocortisone. Possible allosteric mechanism of channel blockade / C. Bouzat, F.J. Barrantes // J Biol Chem.- 1996.- Vol. 271(42).- P. 25835-25841.

35. Bradley R.J. Postsynaptic effects of ethanol at the frog neuromuscular junction / R.J. Bradley, K. Pepper, R. Sterz // Nature.- 1980.- Vol. 284.- P. 60 -62.

36. Bradley R.J. The effects of alcohols and diols at the nicotinic acetylcholine receptor / R.J Bradley., R. Sterz, K. Pepper // Brain research — 1984.-Vol. 295.-P. 101 112

37. Brammar W.J. Induction and repression of pseudomonas aeruginosa amidase / W.J. Brammar, P.H. Clarke // J Gen Microbiol.- 1964.- Vol. 37.- P. 307-319.

38. Brammar, W.J. Nicotinic acetylcholine-gated integral receptors-channels / E.C. Conley, W.J. Brammar // The ion channel FactsBook: I: Extracellular ligand-gated channels.- London, San Diego: Academic Press.- 1996.-Entry 09.- P. 234-292.

39. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors / K. Brejc, W.J. van Dijk, Klaassen R.V. et al. // Nature.- 2001.- Vol. 411(6835).- P. 269-276.

40. Brier T. Allosteric and steric interactions of polyamines and polyamine-contaning toxins with nicotinic acetylcholine receptors / T. Brier, I.R.

41. Mellor, P.N. Usherwood // Perspectives in molecular toxinology.- 2002 P. 281 — 297.

42. Architucture of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor ion channel at the binding site of bis-ammonium blockers / N.B. Brovtsyna, D.B. Tikhonov, O.B. Gorbunova et al. // Journal of membrane biology 1996 - Vol. 152.-P. 77-87.

43. Open channel and competetitive block of the embryonic form of the nicotinic receptor of mouse myotubes by (+)-tubocurarine / J. Bufler, R. Wilhelm, H. Pamas et al. //J. Physiol. (London).- 1996.- Vol. 495.1.- P. 83-95.

44. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors on bovine chromaffin cells: cloning, expression, and genomic organization of receptor subunits / A. Campos-Caro, F.I. Smillie, E. Domínguez del Toro et al. // J Neurochem.- 1997 — Vol. 68(2).- P. 488-97.

45. Carlson C.G. The effect of temperature on the amplitude distributions of miniature endplate potentials in the mouse diaphragm / C.G. Carlson, M.E. Kriebel, C.G. Muniak//Neuroscience.- 1982.- Vol. 10.- P. 2537-2549.

46. Garcia-Colunga J. Effects of serotonergic agents on neuronal nicotinic acetylcholine receptors / J. Garcia-Colunga, R. Miledi // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1995.- Vol. 92(7).- P. 2919-2923.

47. Garcia-Colunga J. Serotonergic modulation of muscle acetylcholine receptors of different subunit composition / J. Garcia-Colunga, R. Miledi // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1996.- Vol. 93(9).- P. 3990-3994.

48. Catteral W. Local anesthetics / W. Catteral, K. Mackie // Goodmanand Gilman's the pharmacological basis of therapeutics 1996 - P331-347.

49. Allosteric properties of the acetylcholine receptor protein from Torpedo marmorata / J.P. Changeux, Bon F, J. Cartaud et al. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol.- 1983.- Vol.48.- P. 35-52.

50. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement / J.P. Changeux, D. Bertrand, P.J. Corringer et al. // Brain Research Reviews.- 1998.- Vol. 26.- P. 198-216.

51. The noncompetitive blocker (3)H.chlorpromazine labels segment M2 but not segment Ml of the nicotinic acetylcholine receptor alpha-subunit / J. Giraudat, J. Gali, F. Revah et al. // FEBS Lett.- 1989.- Vol. 253(1-2).- P. 190-198.

52. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors on bovine chromaffin cells: Cloning, expression and genomic organization of receptor subunits / J. Chapuli, J.M. Juiz, F. Sala et al. // J Neurochem.- 1997.- Vol. 234.-P. 488-497.

53. Cherki-Vakil R. The difference in shape of spontaneous and uniquantal evoked synaptic potentials in frog muscle / R. Cherki-Vakil, S. Ginsburg, H. Meiri // J. Physiol. (London).- 1995.- Vol. 482.3.- P. 641-650.

54. Blockade and activation of the human neuronal nicotinic acetylcholine receptors by atracurium and laudanosine / F. Chiodini, E. Charpantier, D. Muller et al. // Anesthesiology.- 2001.- Vol. 94(4).- P. 643-651.

55. Chretien J.M. An algorithmic method for determining the kinetic system of receptor-channel complex / J.M. Chretien, G.A Chauvet // Math. Biosci.-1998.- Vol. 147.- P. 227-257.

56. Nucleotide and deduced amino acid sequences of Torpedo californica acetylcholine receptor gamma subunit / T. Claudio, M. Ballivet, J. Patrick, S. Heinemann// Proc Natl Acad Sci U S A.- 1983.- Vol. 80(4).- P. 1111-1115.

57. Ligand gated ion channels: Homology and diversity / V.B. Cockcroft, D.J. Osguthorpe, E.A. Barnard et al. // Mol. Neurobiol.- 1990.- V. 4.- N 3-4.-P. 129-169.

58. Colquhoun D. Relaxation and fluctuations of membrane currents that flow through drug-operated channels / D. Colquhoun, A.G. Hawkes // Proc R Soc LondBBiol Sc.- 1977.- Vol. 199(1135).-P. 231-262.

59. Colquhoun D. Relaxation and fluctuations of membrane currents that flow through drug-operated channels / D. Colquhoun, A.G. Hawkes // Proc R Soc Lond B Biol Sci.- 1981.- P. 231-262.

60. Conley, E.C. The ion channel FactsBook: I: Extracellular ligand-gated channels / E.C. Conley, W.J. Brammar // London, San Diego: Academic Press, 1996.- 426 p.

61. The nicotinic acetylcholine receptor: structure and autoimmune pathology / B.M. Conti-Tronconi, K.E. McLane, M.A. Raftery et al. // Crit Rev Biochem Mol Biol.- 1994.- Vol. 29(2).- P. 69-123.

62. Nicotinic receptor function: new perspectives from knockout mice / M. Cordero-Erausquin, L.M. Marubio, R. Klink, J.P. Changeux // Trends Pharmacol Sci.- 2000.- Vol. 21(6).- P. 211-217.

63. Corringer PJ. Nicotinic receptors at the amino acid level / Corringer P.J., Le Novere N., Changeux J.P. // Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000 - Vol. 40.- P. 431-458.

64. Costa E. The allosteric modulation of GABAa receptors: seventeen years of research / E. Costa // Neuropsychopharmacology- 1991.- Vol. 4 — P. 225 -235.

65. Coates K.M. Thiopental is a competitive inhibitor at the human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor / K.M. Coates, L.E. Mather, R. Johnson, P. Flood // Anesth Analg.- 2001 Apr.- Vol. 92(4).- P. 930-933.

66. Dale H.H. The action of certain esters and ethers of choline, and their relation to muscarine / H.H. Dale // J. Pharmacol. Exp. Ther- 1914.- Vol. 6.- P. 147-190.

67. Daniels S. Effects of general anaesthetics on ligand-gated ion channels / S. Daniels, E.B. Smith // British Journal of Anatomy 1993.- Vol. 71.- P. 59

68. Effects of ethanol on ACh receptor channels / J.P. Dilger, Y. Liu, J.F. Roper, R.J. Bradley // Biophys. Journal.- 1994.- Vol. 66.- P. 49-67.

69. Mechanisms of barbiturate inhibition of acetylcholine receptor channels / J.P. Dilger, R. Boguslavsky, M. Barann et al. // Journal of general physiology.- 1997.-Vol. 109.-P. 401-414.

70. Block of Quantal end-plate currents of mouse muscle by physostigmine and procaine / J. Dudel, M. Schramm, C. Franke et al. // The American physiological society 1999 - Vol. 22 - P.2386 - 2397.

71. Dwyer T.M. The rising phase of the miniature endplate current at the frog neuromuscular junction / T.M. Dwyer // Biochimica et Biophysica Acta.-1981.- Vol. 646.- P. 51-60.

72. Ellena J.F. Lipid-protein interactions in reconstituted membranes containing acetylcholine receptor / J.F. Ellena, M.A. Blazing, M.G. McNamee // Biochemistry.- 1983.-Vol. 22(24).-P. 5523-5535.

73. Fan P. Procaine impairs the function of the 5-HT3 receptor-ion channel complex in rat sensory ganglion neurons / P. Fan, F.F. Weight // Neuropsychopharmacology.- 1994-Vol. 33-P. 1573-1579.

74. Forman S.A. A discrete site for general anaesthetics on a postsynaptic receptor / S.A. Forman, K.W. Miller, G. Yellen // Molecular pharmacology — 1995.- Vol. 48.- P. 574 581.

75. Forman S.A. Novel modulation of a nicotinic receptor channel mutant reveals that the open state is stabilized by ethanol / S.A. Forman, Q. Zhou // Molecular pharmacology.- 1999.- Vol. 55.- P. 102 108.

76. Friboulet A. Reaction-diffusion coupling in a structured system: application to the quantitative simulation of endplate currents / A. Friboulet, D. Thomas//JTheorBiol.- 1993 Feb 21-Vol. 160(4)-P. 441-455.

77. Gage P.W. Effects of membrane potential, temperature and neostigmine on the conductance change caused by a quantum of acetylcholine at the toad neuromuscular junction / P.W. Gage, R.N. McBurney // J.Physiol. (London).- 1975.- Vol. 244.- P. 385-407.

78. Identification of calcium binding sites that regulate potentiation of a neuronal nicotinic acetylcholine receptor / J.L. Galzi, S. Bertrand, P.J. Corringer et al. // EMBO J.- 1996.-Vol. 15(21).-P. 5824-5832.

79. Garcia-Colunga J. Effects of serotonergic agents on neuronal nicotinic acetylcholine receptors / J. Garcia-Colunga, R. Miledi // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1995.- Vol. 92(7).- P. 2919-2923.

80. Garcia-Colunga J. Serotonergic modulation of muscle acetylcholine receptors of different subunit composition / J. Garcia-Colunga, R. Miledi // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996.- Vol. 93(9).- P. 3990-3994.

81. Anesthetics noncompetetively inhibit nicotinic acetylcholine receptorfunction / C.L. Gentry, C. Krishnan, C. Eisenhower et al. // Soc. Neurosci. Abstr-2000.- Vol. 26.- P. 377.

82. Gentry C.L. Local anesthtics noncompetetively inhibit function of four distinct nicotinic acetylholine receptor subtypes / C.L. Gentry, R.J Lukas // The journal of pharmacology and experimental therapeutics 2001.- Vol. 299.- P. 1038-1048.

83. The noncompetitive blocker (3)H.chlorpromazine labels segment M2 but not segment Ml of the nicotinic acetylcholine receptor alpha-subunit / J. Giraudat, J. Gali, F. Revah et al. // FEBS Lett.- 1989 Aug 14.- Vol. 253(1-2).-P.190-198.

84. Transmembrane topology of acetylcholine receptor subunits probed with photoreactive phospholipids / J. Giraudat, C. Montecucco, R. Bisson, J.P. Changeux//Biochemistry.- 1985.-Vol. 24(13).-P. 3121-3127.

85. Goldstein A. Principles of Drug Action / A. Goldstein, L. Aronov, S.M. Kalman // The Basis of Pharmacology- P. 194.

86. Gotti C. Human neuronal nicotinic receptors / C. Gotti, D. Fornasari, F. Clementi // Prog Neurobiol.- 1997. Vol. 53(2).- P. 199-237.

87. Grutter T. Nicotinic receptors in wonderland / T. Grutter, J.P. Changeux // Trends Biochem Sci.- 2001.-Vol. 26(8).-P. 459-63.

88. Molecular mechanisms of inhibition of nicotinic acetylcholine receptors by tricyclic antidepressants / F. Gumilar, H.R. Arias, G. Spitzmaul, C. Bouzat // Neuropharmacology 2003- Vol. 45 - P. 964 - 976.

89. Gurney A.M. The channel-blocking action of methonium compounds on rat submandibular ganglion cells / A.M. Gurney, H.P. Rang // Br J Pharmacol.-P. 623-642.

90. Ellena J.F. Lipid-protein interactions in reconstituted membranes containing acetylcholine receptor / J.F. Ellena, M.A. Blazing, M.G. McNamee // Biochemistry.- 1983.- Vol. 22(24).- P. 5523-5535.

91. Ifune C.K. Regulation of sodium currents and acetylcholine responses in PC12 cells / C.K. Ifune, J.H. Steinbach // Brain Res.- 1990.- Vol. 506(2).- P. 243-248.

92. Hartman D.S. Coexpression of two distinct muscle acetylcholine receptor alfa-subunits during development / D.S. Hartman, T. Claudio // Nature.-1990.- Vol. 343.- P. 372-375.

93. Hartzell H.C. Post-synaptic potentiation: interaction between quanta of acetylcholine at the skeletal neuromuscular synapse / H.C. Hartzell, S.W. Kuffler, D. Yoshikami // J. Physiol. (London).- 1975.- Vol. 251.- P. 427-463.

94. Heidmann T. Fast kinetic studies on the allosteric interactions between acetylcholine receptor and local anesthetic binding sites / T. Heidmann, J.P. Changeux // Eur J Biochem.- 1979.- Vol. 94(1).- P. 281-96.

95. Heidmann T. Multiple sites of action for noncompetitive blockers on acetylcholine receptor rich membrane fragments from torpedo marmorata / T. Heidmann, R.E. Oswald, J.P. Changeux // Biochemistry.- 1983.- Vol. 22(13).- P. 3112-3127.

96. Racial differences in tumor grade among women with endometrial cancer / H.A. Hill, R.J. Coates, H. Austin et al. // Gynecol Oncol 1995.- Vol. 56(2).-P. 154-163.

97. Functional modulation of the nicotinic acetylcholine receptor by tyrosine phosphorylation / J.F. Hopfield, D.W. Tank, P. Greengard, R.L. Huganir // Nature.- 1988.-Vol. 336(6200).-P. 677-80.

98. Hucho F. The ion channel of the nicotinic acetylcholine receptor is formed by the homologous helices M II of the receptor subunits / F. Hucho, W. Oberthur, F. Lottspeich // FEBS Lett.- 1986.- Vol. 205(1).- P. 137-142.

99. Hucho F. The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor / F. Hucho, V.I. Tsetlin, J. Machold // Eur J Biochem.- 1996.-Vol. 239(3).-P. 539-557.

100. Hucho F. The nicotinic acetylcholine receptor and its ion channel / F. Hucho // Eur J Biochem.- 1986.- Vol. 158(2).- P. 211 -226.

101. Ifune C.K. Rectification of acetylcholine-elicited currents in PC12 pheochromocytoma cells / C.K. Ifune, J.H. Steinbach // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1990.-Vol. 87(12).-P. 4794-4798.

102. Imoto T. Stabilization of protein / T. Imoto // Cell Mol Life Sci.-1997.- Vol.53(3).- P. 215-223.

103. Jackson W.A. The big C: cancer cures or quackery? / W.A. Jackson // Pharm Hist (Lond).- 1999.- Vol. 29(1).- P. 8-15.

104. Chronic steroid sulfatase inhibition by (p-O-sulfamoyl)-N-tetradecanoyl tyramine increases dehydroepiandrosterone sulfate in whole brain / D.A. Johnson, M.E. Rhodes, R.L. Boni, P.K. Li // Life Sci.- 1997 Vol. 61(24).-P 355-359.

105. Reconstitution of the nicotinic acetylcholine receptor using a lipid substitution technique / O.T. Jones, J.H. Eubanks, J.P. Earnest, M.G. McNamee // Biochim Biophys Acta.- 1988.-Vol. 944(3).-P. 359-366.

106. Comments on brief intervention of alcohol problems: a review of a review / H. Jonson, U. Hermansson, S. Ronnberg et al. // Addiction.- 1995. Vol. 90(8).-P. 1118-1121.

107. Karlin A. Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and their cousins / A. Karlin, M.H. Akabas // Neuron.-1995.- Vol. 15.- P. 1231-1244.

108. Katz B. The binding of acetylcholine to receptors and its removal from the synaptic cleft / B. Katz, R. Miledi // J.Physiol. (London).- 1973.- Vol. 231.- P. 549-574.

109. Katz B. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate / B. Katz, S. Thesleff// J. Physiol.- 1958.- Vol. 138.- P. 6380.

110. Khanin R. Diffusion cannot govern the discharge of neurotransmitter in fast synapses / R. Khanin, H. Parnas, L. Segel // Biophys. J.- 1994.- Vol. 67.- P. 966-972.

111. Khanin R. A mechanism for discharge of charged excitatory neurotransmitter/R. Khanin, H. Parnas, L. Segel //Biophys. J.- 1997.- Vol. 72.- P. 507-521.

112. Kistler J. Structure and function of an acetylcholine receptor/ J. Kistler, R.M. Stroud, M.W. Klymkowsky et al. // Biophys J.- 1982.- Vol. 37(1).-P. 371-383.

113. Kordas M. An attempt at an analysis of the factors determining the time course of the end-plate current. II. Temperature / M. Kordas // J.Physiol. (London).- 1972.- Vol. 224.- P.333-348.

114. Krusec J. Allostery and cooperativity in the interaction of drugs with ionic channel receptors / J. Krusec // Physiol Res.- 2004.- Vol. 53(6).- P. 569-579.

115. Activation and modulation of ligand-gated ion channels / J. Krusek, I. Dittert, T. Hendrych et al. // Physiol Res.- 2004.- Vol. 53.- P. 103-113.

116. Kuffler S.W. The number of transmitter molecules in a quantum: an estimate from iontophoretic application of acetylcholine at the neuromuscular synapse / S.W. Kuffler, D. Yoshikami // J.Physiol. (London).- 1975.- Vol. 251.- P. 465-482.

117. Diffusion and binding constants for acetylcholine derived from the falling phase of miniature endplate currents / B.R. Land, V.W. Harris, E.E. Salpeter, M.M. Salpeter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- Vol. 81.- P. 15941598.

118. Le Dain A.C. Kinetics of (+)-tubocurarine blockade at the neuromuscular junction / A.C. Le Dain, B.W. R.O. Madsen, Edeson // BR. J. Pharmacol.- 1991.-Vol. 103.- P. 1607-1613.

119. Le Novere N. The Ligand Gated Ion Channel Database / N. Le Novere, J.P. Changeux // Nucleic Acids Res.- 1999.- Vol. 27(1).- P. 340-342.

120. Lester H.A. Postsynaptic action of cobra toxin at the myoneural junction / H.A. Lester//Nature.- 1970.-Vol. 227(5259).- 727-728.

121. Lewis R.J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters / R.J. Lewis // IUBMB Life.- 2004.- Vol. 56.-N2.- P. 89-93.

122. Lingle C. Different types of blockade of crustacean acetylcholine-induced currents / C. Lingle // J Physiol (Lond).- 1983. Vol.34.- P. 419-437.

123. Open channel and competitive block of nicotinic receptors by pancuronium and atracurium / C.V. Lowenick, K. Krampfl, H. Schneck et al. // Eur J Pharmacol.- 2001.- Vol. 413(1).- P. 31-35.

124. Noncompetitive agonism at nicotinic acetylcholine receptors; functional significance for CNS signal transduction / A. Maelicke, A. Schrattenholz, A. Storch et al. // J Recept Signal Transduct Res.- 1995.- Vol. 15(1-4).- P. 333-353.

125. Magleby K.L. A quantitative description of endplate currents / K.L. Magleby, C.F. Stevens //J. Physiol.- 1972.- Vol. 223.- P. 173-197.

126. Neher E. The charge carried by single-channel currents of rat cultured muscle cells in the presence of local anesthetics / E. Neher //J Physiol (Lond).— P. 663-678.

127. Neher E. Local anesthetics transiently block currents through single acetylcholine-receptor channels / E. Neher, J.H. Steinbach // J Physiol.- 1978-Vol. 277-P. 153-176.

128. Ogden D.C. Block of ACh-activated ion channels by an uncharged local anaesthetic / D.C. Ogden, S.A. Siegelbaum, D. Colquhoun // Nature.- 1981.-V. 289.- P. 596-598.

129. Ortells M.O. A mixed helix-beta-sheet model of the transmembrane region of the nicotinic acetylcholine receptor / M.O. Ortells, G.G. Lunt // Protein Eng.- 1996.- Vol. 9(1).- P. 51-59.

130. Quastel D.M. Modification of motor nerve terminal excitability by alkanols and volatile anaesthetics / D.M. Quastel, D.A. Saint // British Journal of Pharmacology.- 1992.- Vol. 88.- P. 747-756.

131. Steroid inhibition of rat neuronal nicotinic alpha4beta2 receptors expressed in HEK 293 cells / K. Paradiso, K. Sabey, A.S. Evers et al. // Mol Pharmacol.- 2000.- Vol. 58(2).- P. 341-351.

132. Pascual J.M. State-dependent accessibility and electrostatic potential in the channel of the acetylcholine receptor / J.M. Pascual, A. Karlin //J Gen Physiol.- 1998.-P. 717-739.

133. Binding properties of a neurotoxin from the venom of the green mamba, Dendroaspis viridis / J. Patrick, W.B. Stallcup, M. Zavanelli, P. Ravdin // J Biol Chem.- 1980.-Vol. 255(2).-P. 526-533.

134. Philips H.C. The prevention of chronic pain and disability: a preliminary investigation / H.C. Philips, L. Grant, J. Berkowitz // Behav Res Ther.- 1991.-Vol. 29(5).- P. 443-450.

135. Romanelli M.N. Cholinergic nicotinic receptors: competitive ligands, allosteric modulators, and their potential applications / M.N. Romanelli, F. Gualtieri // Med Res Rev.- 2003.- Vol. 23(4).- P. 393-426.

136. Rosenberry T.L. Quantitative simulation of endplate currents at neuromuscular junctions based on the reaction of acetylcholine with acetylcholine receptor and acetylcholinesterase / T.L. Rosenberry // Biophys.J.- 1979,- Vol. 26.1. P. 263-29

137. Competetive and open channel block of recombinant nAChR channels by different antibiotics / F. Schlesinger, K. Krampfl, G. Haeseler et al. // Neuromusculardisoders.-2004.-Vol. 14-P. 307-312.

138. Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium / P. Seguela, J. Wadiche, K. Dineley-Miller et al. // J Neurosci.- 1993.- Vol. 13(2).- P. 596-604.

139. Smith G.B. Functional domains of GAB A A receptors / G.B. Smith, R.W. Olsen//Trends Pharmacol Sci.- 1995.-Vol. 16(5).-P. 162-168.

140. Stallcup W.B. Substance P enhances cholinergic receptor desensitization in a clonal nerve cell line / W.B. Stallcup, J. Patrick // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1980.- Vol. 77(1).- P. 634-638.

141. Stephenson F. The GABAA receptors / F. Stephenson // Biochem J.-1995.- Vol.310.- P. 1-9.

142. Ralevic V. Receptors for purines and pyrimidines / V. Ralevic, G. Burnstock// Pharmacol Rev.- 1998.- Vol. 50(3).- P. 413-492.

143. Functional effects of periodic tryptophan substitutions in the alpha M4 transmembrane domain of the Torpedo californica nicotinic acetylcholine receptor / S. Tamamizu, G.R. Guzman, J. Santiago et al. // Biochemistry.- 2000 — Vol.39(16).- P. 4666-4673.

144. Tikhonov D.B. Modeling noncompetitive antagonism of a nicotinic acetylcholine receptor / D.B. Tikhonov, I.R. Mellor, P.N. Usherwood // Biophysical Journal-2004.- Vol. 87.- P. 159-170.

145. Toyoshima C. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction / C. Toyoshima,N. Unwin//J Cell Biol.- 1990.- Vol. 111.-P. 2623-2635.

146. Tsetlin V.I. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications / V.I. Tsetlin, F. Hucho // FEBS Lett.- 2004.-Vol. 557(1-3).- P. 9-13.

147. Activation of the nicotinic acetylcholine receptor involves a switch in conformation of the alpha subunits / N. Unwin, A. Miyazawa, J. Li, Y. Fujiyoshi // J Mol Biol.- 2002.-Vol. 319(5).- P. 1165-1176.

148. Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution / N. Unwin //J Mol Biol.- 1993.- Vol. 229(4).- P. 1101-1124.

149. Valera S. Progesterone modulates a neuronal nicotinic acetylcholine receptor / 'S. Valera, M. Ballivet, D. Bertrand//Proc Natl Acad Sci U S A.- 1992-Vol. 89(20).-P. 9949-9953.

150. Calcium modulation and high calcium permeability of neuronal nicotinic acetylcholine receptors / S. Vernino, M. Amador, C.W. Luetje et al. // Neuron.- 1992.-Vol. 8(1).-P. 127-134.

151. Childhood NHL in Switzerland: incidence and survival of 120 study and 42 non-study patients / H.P. Wagner, I. Dingeldein-Bettler, W. Berchthold et al. // Med Pediatr Oncol.- 1995.- Vol. 24(5).- P. 281-286.

152. Wathey J.C. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses / J.C. Wathey, M.M. Nass, H.A. Lester // Biophys J.- 1979.- Vol. 27(1)— P. 145-164.

153. Wilson G.G. The location of the gate in the acetylcholine receptor channel / G.G. Wilson, A. Karlin //Neuron.- 1998.- Vol. 20(6).- P. 1269-1281.

154. Wu G. A hydrophobic inhibitor of the nicotinic acetylcholine receptor acts on the resting state / G. Wu, D.E. Raines, K.W. Miller // Biochemistry.- 1994.-Vol. 33(51).-P. 15375-15381.

155. Yost C.S. Inhibition of the nicotinic acetylcholine receptor by barbiturates and by procaine: do they act a different sites? / C.S. Yost, B.A. Dodson // Cell Mol. Neurobiology.- 1993.- Vol. 13.- P. 159 172.

Информация о работе

Шайхутдинова, Асия Равильевна
кандидата биологических наук
Казань, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Механизмы модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы