Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы модуляции работы ионотропных рецепторов ацетилхолина и АТФ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы модуляции работы ионотропных рецепторов ацетилхолина и АТФ"

На правах рукописи

СКОРИНКИН Андрей Иванович

МЕХАНИЗМЫ МОДУЛЯЦИИ РАБОТЫ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНА И АТФ

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

111111ЙII11111111111

□03 16552"?

._______)

Пущино — 2008

Работа выпо таена в Казанском государственном университете им В И Ульянова-

Ленина (лаб биофизики, зав лаб д ф -м н , ст н с Котов Н В )

и в Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН

(лаб биофизики синаптических процессов,

зав лаб чл -корр РАН, д м н, профессор Е Е Никольский)

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор Р А Гиниатуллин

Официальные оппоненты

Доктор физико-математических наук К Б Асланиди Доктор биологических наук С С Колесников Доктор биологических наук Д Б Тихонов

Ведущее учреждение - Казанский физико-технический институт КазНЦ РАН

Защита состоится "19" марта 2008 г в "15" часов на заседании специализированного совета Д 002 093 01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, г Пущино, Московская область, ул Институтская, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан

2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

НФ Ланина.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Исследование механизмов модуляции процесса межклеточной передачи электрических сигналов в нервной системе представляет собой одну из актуальных проблем современной нейрофизиологии Без глубокого изучения этих механизмов невозможно понять фундаментальные свойства синаптической пластичности в нервной системе и оказать целенаправленное воздействие на синаптическую передачу

Постсинаптическая мембрана, содержащая ионотропные рецепторы для разных нейротрансмиттеров, представляет собой одну из мишеней для действия эндогенных и экзогенных синаптических модуляторов На постсинаптическом уровне синаптическая пластичность определяется состоянием рецепторно-канальных комплексов, кинетика активации которых выделяющимся из нервного окончания медиатором определяет амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа Физиологически активные соединения, многие из которых применяются в клинической практике, могут модифицировать состояние рецепторно-канального комплекса посредством разных механизмов воздействия как на сам комплекс, так и на его липидное окружение (Changeux et al, 1998, Ralevic and Burnstock, 1998, Quick and Lester, 2002, North, 2002) Понимание молекулярных механизмов взаимодействия физиологически активных соединений с рецепторно-канальными комплексами посгсинаптической мембраны необходимо для более эффективного прогнозирования последствий действия этих соединений на состояние синаптической передачи при различных режимах работы нервно-мышечного аппарата.

Модуляция синаптической передачи на постсинаптическом уровне в физиологических условиях или ее нарушение при патологических процессах в нервной системе может реализоваться за счет нескольких принципиально разных механизмов Главными постсинаптическими ингибиторными механизмами, относительно хорошо изученными на примере рецепторов, активируемых глутаматом, ГАМК или ацетилхолином, являются блокада активного центра рецептора или его ионного канала, десенситизация и аллостерическая модуляция (Гиниатуллин, Магазаник, 1998, Colquhoun, 1998, Tikhonov, Magazanik, 1998, Quick, Lester, 2002, North, 2002, 2004, Zhorov, Tikhonov, 2004, Changeux, Edelstein, 2005) Тем не менее, даже для этих давно и хорошо изученных рецепторов молекулярные механизмы процессов блокады, десенситизации и аллостерической модуляции во многом остаются недостаточно исследованными Наиболее же слабо изученной является модуляция относительно недавно открытых ионотропных рецепторов, активируемых внеклеточным АТФ (Ralevic, Burnstock, 1998)

Несмотря на известное деление антагонистов рецепторов на «конкурентные» и «неконкурентные», а агентов, взаимодействующих с ионным каналом - на блокаторы открытого и закрытого ионного канала, не существует общепризнанной всеохватывающей классификации антагонистов Ситуация усложняется тем, что многие антагонисты одновременно проявляют черты блокаторов разных типов, взаимодействуя, по-видимому, с различными сайтами одного рецептора (Colquhoun, 1981) Мало изучены так называемые блокаторы открытого канала ловушечного типа, способные оставаться в ионном канале при его закрытии (Lingle, 1983, Gurney, Rang, 1984) В первых кинетических моделях ловушечного механизма блокады (Lingle, 1983, Blanpied et ai, 1997) предполагалось, что

рецептор с находящимся в канале блокатором имеет такую же аффинность к агонисту и динамику открытия-закрытия канала, как и рецептор без блокатора Но позднее появились работы (Dilmore, Johnson, 1998, Gimatullin et al, 2000), указывающие на возможное изменение свойств рецептора в блокированном состоянии

К настоящему времени описаны три принципиальные модели процесса десенситизации ионотропных рецепторов циклическая (Katz, Thesleff, 1957, Auerbach, Akk, 1998, Dudel, Heckmann, 1999), дивергентная (Jones, Westbrook, 1995, Jones et al, 1998) и последовательная (Rettinger, Schmalzing, 2003) Во многих случаях основания для выбора между этими моделями неясны, поскольку не установлены принципиальные различия и ограничения этих моделей Кроме того, используются схемы десенситизации, включающие в себя черты сразу нескольких моделей (Burkat et al, 2001, Dilger, 2002, Elenes, Auerbach, 2002; Robert, Howe, 2003, Celentano, Hawkes, 2004), что еще более затрудняет анализ механизмов

Известно, что некоторые модучяторы ионных каналов осуществляют свой эффект через липидную фазу клеточной мембраны (Trudeil, Bertaccini, 2002) Можно ожидать, что такой модулятор может специфически блокировать ионный канал или аллостерически модулировать работу рецептора через липид-зависимый центр связывания или неспецифически менять свойства самой мембраны (Bouzat, Barrantes, 1996, Anas, 1998, 1999) Характерным свойством этой группы веществ, действующих через липидную фазу, во многих случаях является медленная обратимость их эффекта (Anderson, 1993, Kukita, Mitaku, 1993, На, Fryer, 1997) Раскрытие механизмов, обусловливающих длительную модуляцию постсинаптических токов, актуально как для фундаментальной нейрофизиологии, так и для практической медицины, так как даст основания для целенаправленного поиска фармакологических препаратов, обеспечивающих надежное повышение или понижение эффективности синаптической передачи за счет влияния на кинетику и чувствительность постсинаптических рецепторов

Поскольку одним из ведущих механизмов обеспечения синаптической пластичности на постсинаптическом уровне является модуляция амплитудно-временных характеристик постсинаптических ответов, которая определяется параметрами активации рецепторно-канальных комплексов хеморецептивной мембраны, то для эффективной оценки изменения пластических свойств синаптического контакта при действии различных физиологически активных веществ необходима разработка алгоритма, позволяющего по определенным признакам классифицировать ингибиторы постсинаптического типа действия как блокаторы, ускорители десенситизаии или аллостерические модуляторы Для разработки такого алгоритма необходимо сопоставить экспериментальные и модельные параметры активации рецепторно-канальных комплексов при действии ряда веществ, применяемых в клинической практике и обладающих постсинаптическими эффектами

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования является выяснение механизмов ингибирования ионотропных рецепторов, активируемых ацетилхолином и АТФ

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи

1 Исследование эффектов применяемых в клинической практике веществ

мекамиламина, хлоргексидина, демифосфона и иных производных 1 1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного и нейронального (а3р4) типов

2 Исследование механизма действия ионов водорода на функционирование ионотропных рецепторов АТФ

3 Исследование механизмов десенситизации ионотропных рецепторов АТФ

4 Создание кинетических моделей, описывающих функцию рецепторов, активируемых ацетилхолином и АТФ, и механизмы действия постсинаптических ингибиторов разного типа

5 Разработка алгоритма, позволяющего выявить молекулярный механизм действия ингибиторов постсинаптического типа (конкурентный антагонист, неконкурентный антагонист, блокатор «ловушечного» типа, аллостерический модулятор)

Научная новизна. Впервые проведен комплексный (экспериментальный и модельный) анализ различных механизмов ингибирования ионотропных холинорецепторов и рецепторов АТФ и разработана концепция различения механизмов депрессии трансмембранных токов Кроме того, впервые получен ряд более частных научных результатов Так, впервые получены экспериментальные доказательства того, что наличие блокатора в закрытом канале холинорецептора меняет динамику открытия-закрытия этого канала Показано, что ингибиторная равновесная константа для каналоблокаторов зависит от концентрации агониста, что ранее не учитывалось при сравнении их действия Впервые показан двойной -каналоблокирующий и аллостерический - механизм действия ряда модуляторов холинорецепторов Впервые установлено, что повышение ионами водорода аффинности ионотропных Р2Х2 рецепторов АТФ может приводить к разнонаправленным эффектам - активирующему или ингибирующему, в зависимости от действующей концентрации агониста. Предложен молекулярный механизм этих эффектов, заключающийся в наличии агонистзависимого инактивированного состояния у Р2Х2 рецепторов, придающего специфические свойства этому подтипу рецепторов Показано, что подпороговые концентрации АТФ, не вызывающие активации рецепторов, способны прямо переводить ионотропные рецепторы АТФ подтипа Р2Х3 в десенситизированное состояние Впервые показано, что скорость восстановления этих рецепторов после десенситизации зависит от типа и концентрации вызвавшего десенситизацию агониста

Научно-практическая ценность. Основное значение проведенного исследования состоит в получении набора экспериментальных критериев, позволяющих различить механизмы ингибирующего действия биологически активных веществ на синаптическую передачу Известно, что ингибиторные эффекты с разным механизмом действия часто бывают сходны и необходимо найти экспериментальные условия, при которых различия в механизмах могли бы проявиться Так, для всех веществ, взаимодействующих с открытым ионным каналом, характерна зависимость скорости и степени их действия от частоты открывания каналов Такая зависимость от активации отсутствует у аллостерических модуляторов, взаимодействующих с местами связывания на внешней части рецепторно-канального комплекса, их эффект зависит только от

времени действия вещеегва и может развиваться даже в отсутствие агониста, то есть при закрытых ионных каналах На развитие эффекта аллостерических модуляторов и его ослабление при отмывании вещества также не влияет изменение концентрации агониста, которое сильно влияет на развитие эффекта блокаторов каналов и его ослабление при отмывании Блокаторы каналов ловушечного типа не отмываются в отсутствие агониста, т е без открывания блокированных каналов Проверка эффектов в указанных экспериментальных условиях вместе с анализом времени спада вызываемых агонистом ионных токов позволяют однозначно различить механизмы ингибирующего действия веществ на синаптическую передачу

Некоторые положения работы представляют практический интерес В частности, получены доказательства того, что часто используемый для оценки действия блокаторов параметр - ингибиторная равновесная константа - зависит от концентрации применяемого для получения трансмембранных токов агониста Эта зависимость может быть использована для более тонкой характеристики влияния блокаторов на процесс синаптической передачи Способность низких концентраций агониста переводить Р2Х3 рецепторы в десенситизированное состояние может быть использована для разработки аналгетиков нового типа, особенно важных при хронических болях, в патогенез которых вовлечен этот подтип АТФ рецепторов При сопоставлении механизмов веществ, применяемых в клинической практике (мекамиламина, хлоргексидина, демифосфона) установлено, что они являются блокаторами холинорецепторного комплекса с разными механизмами действия, включающими медленное блокирование открытого ионного канала, блокирование канала по «ловушечному» типу и аллостреческую модуляцию рецепторно-канального комплекса

Полученные данные о влиянии физиологически активных веществ на кинетику работы рецепторно-канальных комплексов, приводящем к изменению амплитудно-временных параметров многоквантового постсинаптического ответа, могут служить основанием для целенаправленного поиска и синтеза лекарственных препаратов Особенно перспективными представляются медленно отмывающиеся ингибиторы, способные накапливаться в синапсе и оказывать на него пролонгированное ингибиторное действие

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на конференциях КГУ (Казань, 1999 - 2006), КИББ КазНЦ РАН (Казань, 2003 - 2006), V, VI, VII и IX Всероссийских школах молодых ученых по актуальным проблемам нейробиологии (Казань, 1998, 1999, 2000, 2005), V и VI Всероссийских научных симпозиумах «Растущий организм Адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2000, 2002), XI, XII и XIII Всероссийских конференциях по структуре и динамике молекулярных систем (Москва-Казань-Йошкар-Ола, 2004, 2005, 2006), IV Международной конференции по математическому моделированию (Москва, 2000), Международной конференции по синаптической передаче (Рим, 2000), Международной школе по синаптической передаче (Киев, 2000), Международной конференции по синаптогенезу (Вена, 2003), Международной конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Брюссель, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XVIII, XIX и XX Съездах Всероссийского Физиологического Общества им ИП Павлова (Казань, 2001, Екатеринбург, 2004, Москва 2007)

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 280 с, содержит 80 рис, 18 таблиц и состоит из описания использованных в работе материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных и модельных данных, обсуждения результатов работы и выводов Список цитированной литературы содержит 314 наименований

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на изолированном нервно-мышечном препарате (седалищный нерв - портняжная мышца) лягушек Rana ridibunda и Rana temporaria, на хромаффиных клетках надпочечников крыс, клетках феохромоцитомы крыс PC 12, сенсорных нейронах крыс и мыщей и культуральных мышечных клетках крыс С2С12 по стандартным методикам, подробно описанным я литератур© (Волкова и др„ 1975, Magazanik et al, 1984, Giniatullin et al„ 1996, 1999; Lorenzon й al, 1997, Sokolova et al, 2001) При работе на нервно-мышечном препарате использовался двухэлектродный метод фиксации потенциала, при работе на изолированных клетках - одноэлектродный метод фиксации потенциала Регистрация и последующее измерение параметров трансмембранных токов осуществлялись с помощью АЦП и компьютерных программ

Для описания реакций взаимодействия ацетилхолина с холинорецепторами использовалась следующая кинетическая схема (Colquhoun, Hawkes, 1977)

R + A¿>AR + AOA2ROA2R°, (1)

lí 4 a

константы скоростей реакций для холинорецепторов мышечного и нейронального (a3ß4) типов, взятые из работ (Mathie et al, 1991, Maconochie, Knight, 1992, Bennett et al, 1997, Stiles et al, 1999), приведены в Таб 1

Константа скорости закрытия канала холинорецептора является потенциалзависимой и вычисляется по формуле <x(V) = <x(0)ev/H, где V -мембранный потенциал в мВ, Н - константа потенциалзависимости (Н = 156 мВ, Mathie et al, 1990, Maconochie, Knight, 1992), в Таб 1 приведено значение а(-70 мВ)

Таблица 1 Константы скоростей реакций для холинорецепторов разных типов

к+ 2 ' к2, а,

ммоль"1 MC 1 мс'1 ммоль1 мс"1 мс"1 MC мс1

мышечный тип 160 18 80 36 36 7 17

нейрональный тип (а3р4) 40 8 42 20 4 84 0 46 0 03

Для описания реакций взаимодействия АТФ с Р2Х рецепторами использовалась аналогичная (1) кинетическая схема, но с тремя (Nicke et al, 1998) местами посадки агониста

i; 1-2 р R + AoAR + AoA,R + AoA,R<^A,R°

ir i.

(2)

Что касается величин констант скоростей реакций, то они пока неизвестны и находились в результате математического моделирования экспериментальных данных Для одного из подтипов рецепторов АТФ - Р2Х2 - была использована кинетическая схема из (Ding, Sachs, 1999) с двумя открытыми состояниями

к, t2 к, ^ai

R + А AR + А о- A,R + А A,R A,R (3)

^ A,R° g2

На основании любой кинетической схемы можно составить пользуясь законом действующих масс, систему обыкновенных дифференциальных уравнений вида (Chretien, Chauvet, 1998)

Pit), (4)

где P(t) - вектор вероятностей существования рецептора в разных состояниях, Q -матрица переходов между состояниями Ввиду сохранения общего кочичества рецепторов на мембране ]TP(t) = l и количество уравнений в системе (4) должно быть на одно меньше, чем число возможных состояний рецептора Системы вида (4) решались численно оптимизированным методом Рунге-Кутта 8 порядка (Baker et al, 1996) с помощью самостоятельно написанной на языке «Паскаль» программы Для сравнения экспериментальных результатов с модельными обычно пользуются предположением, что в каждый момент времени величина тока через мембрану при фиксированном потенциале на ней пропорциональна вероятности нахождения рецептора в состоянии с открытым каналом

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние мекаммламина на функционирование никотиновых холннорецепторов.

Мекамиламин - М-2,3,3-тетраметилбихлор [2 2 1] гептан-2-амин - является известным антагонистом некоторых типов нейрональных холинорецепторов (Ascher et al, 1979, Fieber, Adams, 1991, Nooney et al, 1992) Мекамиламин в концентрации 20 мкмоль уменьшал амплитуду токов концевой пластинки (ТКП) в изолированном нервномышечном препарате лягушек до 28±2 % от контрольных значений, а постоянную времени спада (т) до 57±4 % (п = 8, Р < 0 05, Рис 1 ) Этот эффект оказался слабообратимым, поскольку даже через 40 минут отмывания вещества нормальным физиологическим раствором амплитуда и постоянная времени спада ТКП восстанавливались лишь частично (Рис 1)

Аппроксимация экспериментальной зависимости амплитуды ТКП от концентрации мекамиламина уравнением Хилла позволила определить концентрацию полумаксимального действия мекамиламина 1С50, эта величина при мембранном потенциале -70 мВ оказалась равна 7 8 мкмоль Но поскольку эффект мекамиламина сильно зависит от мембранного потенциала, 1С50 также зависит от потенциала, что позволяет, аппроксимируя экспериментальные данные уравнением Вудхол (5), найти относительную глубину 5 сайта связывания мекамиламина в канале холинорецептора мышечного типа у холоднокровных Найденная таким образом величина 6 оказалась равна 0 37 (от электрического поля канала), а зависимость IC50(V) при комнатной температуре (Т = 295 °К) выражается формулой

037V

IC5„(V) = 21 6 е25«5, (5)

где 1С50 выражается в мкмоль при V в мВ.

А

контроль

мекамиламин

100 НА

Б

мекамиламин 20 мкмоль

ч: ' Ег

£ 100 -

£ <

40 60

Время, мин

Рис. !. Действие мекамиламина в концентрации 20 мкмоль на ТКП. А. Образцы ТКП до подачи мекамиламина, через 40 минут действия мекамиламина и через 40 минут отмывания вещества (слева направо). Б. Изменения амплитуды и постоянной времени спада ТКП (х) в ходе типичного эксперимента.

Для проверки зависимости эффекта от потенциала и активации каналов на фоне действия мекамиламина в концентрации 20 мкмоль (через 30-40 минут после начала подачи) после очередной стимуляции нерва мембрану быстро деполяризовали до -20 мВ на 2 минуты, затем мембранный потенциал возвращали к нормальному уровню -70 мВ. Если во время деполяризации стимуляция нерва продолж&тась (с периодичностью 3 раза в минуту или 10 раз в секунду), то амплитуды ТКП после возврата к потенциалу -70 мВ оказывались достоверно больше амплитуд ТКП перед деполяризацией; этот эффект исчезал за 6-8 сигналов. Если во время деполяризации стимуляция нерва прекращалась, то амплитуды ТКП после возврата к потенциалу -70 мВ достоверно не изменялись (Таб. 2). Надо отметить, что в отсутствие мекамиламина амплитуды ТКП не изменялись при обоих вариантах деполяризации.

Для объяснения наблюдаемых эффектов были использованы следующие три модели.

Модель 1. Блок открытого канала - простейшая модель взаимодействия антагониста сИХР, он описывается следующей кинетической схемой:

к; к; р к; Я + А АЯ + А А2Я А2К° + В А2ЯВ , (6)

к Г к; « к;

где В - блокатор, кь+ и к(,* - константы скорости блокирования и деблокирования соответственно, А2КВ - состояние рецептора с заблокированным каналом. В этой

модели можно воспроизвести требуемый уровень уменьшения амплитуд и постоянных времени спада ТКП под действием мекамиламина в концентрации 20 мкмоль и даже восстановление амплитуд в результате деполяризации при редкой стимуляции (последнее — за счет потенциалзависимости константы кь ), но в двух других критериях проявляется сильная зависимость этой схемы от частоты (Таб 2)

Модель 2 Известно, что некоторые блокаторы способны оставаться внутри ионного канала при его закрытии (Lmgle, 1983, Gurney, Rang, 1984) то есть попадают в своеобразную ловушку, и для их выхода канал должен опять открыться Можно предположить, что нахождение блокатора внутри канала не меняет свойств рецептора, такая схема может быть представлена следующим образом

k , I • (J

R + AR + А 4-» A,R А 2 R ° + В

к, к " а

к J к * р

RB + А <-> ARB + А AjRB ^ А 2 R ° В

к, к, о

(7)

где все константы в нижнем ряду (со штрихом) равны соответствующим им константам в верхнем ряду (без штриха) RB, ARB и A2RB - состояния рецептора с блокатором, находящимся внутри закрытого канала, A2R°B - состояние рецептора с открытым заблокированным каналом В этой модели можно воспроизвести четыре из пяти основных критериев, но данная модель не позволила воспроизвести установившийся уровень постоянных времени спада ТКП под действием мекамиламина в концентрации 20 мкмоль - в модели величины постоянных времени спада в этой ситуации оказались равны контрольным Этот результат показывает, что «симметричная» ловушечная схема может применяться для объяснения действия вещества только если оно уменьшает амплитуду ТКП, не изменяя его постоянной времени спада

Модель 3 В литературе имеются сведения о том, что нахождение блокатора внутри закрытого канала может изменить кинетику взаимодействия рецептора с агонистом и/или кинетику открытия-закрытия канала (Dilmore, Johnson, 1998) В этом случае можно применить ту же схему (7), но некоторые константы в нижнем ряду (со штрихом) могут быть не равны соответствующим им константам в верхнем ряду (без штриха) «Асимметричная» ловушечная схема при кь - 3 2 мс"1 (Н = 27 5 мВ), к£ =300 ммоль"1 мс"1 воспроизводит все пять основных характеристик действия мекамиламина (Таб 2) Хотя для этой схемы в установившемся режиме средний обмен между верхней и нижней частями (за время между двумя активациями рецепторов) также отсутствует, в силу неравенства кинетики этих частей "заполнение" состояний A2R0 и A2R°B происходит несинхронно и возможны обменные потоки между этими состояниями (сумма этих потоков за одну активацию должна быть равна нулю) Требуемое замедление перехода из RB в A2R°B и ускорение обратного перехода произведено в модели за счет увеличения а' по сравнению с а от 1 7 мс"' до 4 5 мс"1

Таблица 2. Сравнение экспериментальных и модельных характеристик действия мекамиламина в концентрации 20 мкмоль

Установившаяся амплитуда ТКП

Установившаяся постоянная

времени спада ТКП

Восстановление амплитуд ТКП. Без < стимуляции*

Восстановление амплитуд ТКП. Стимуляция Зраза в

Восстановление амплитуд ТКП. Стимуляция 10 раз в

минуту........секунду

% к контролю ; % к амплитуде ТКП до деполяризации

Эксперимент * 28±2 5 7 ±4 1±3 134±5 131±5

Модель 1 28 58 149 131 -99

Модель 2 28 100 0 131 131

Модель 3 29 57 0 132 131

во всех трех случаях мембрану деполяризовали от -70 мВ до -20 мВ. ** п = 8.

Аналогичные по протоколам экспериментальные исследования действия мекамиламина на параметры токов, вызываемых аппликациями никотина в хромаффинных клетках крыс (содержащих ионотропные холинорецепторы нейронального типа а3(34), дали качественно такие же результаты, отличия заключались лишь в величинах 1С50 (0.34 мкмоль) и 5 (0.72). Кроме того, было исследовано действие мекамиламина на параметры токов, вызываемых аппликациями ацетилхолина в мышечных клетках крыс на фазе миотубулы (содержащих ионотропные холинорецепторы типа сца^уб), где также были получены качественно аналогичные результаты, отличия заключались лишь в величине 1С50 (8.1 мкмоль) и меньшей скорости возврата амплитуд токов к стационарному уровню после сочетания активации рецепторов с деполяризацией клеточной мембраны. Все характеристики действия мекамиламина в обоих указанных объектах воспроизводились «асимметричной» ловушечной схемой блокады открытых каналов.

Влияние производных 1,1-диметил-З-оксобутил-фосфоновой кислоты на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного типа.

Общая структура эфиров 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты следующая:

О

СИ,

011

СНз— С — СН2 — С -(Ю)

(8)

I 11\

СН, О ОЯ

где Л = Н для самой кислоты, СН3 для диметилового эфира (Димефосфона), С2Н5

11

для диэтилового эфира, С3Н7 для дипропилового эфира, С4Н9 для дибутилового эфира. Определение коэффициентов распределения (К), рассчитанных как соотношение концентрации соединений в октанольной и водной фазе, показало, что К = 1 09±0 09, 8 64±0 34, 89 36±5 13, >1000 для диметилового, диэтилового, дипропилового и дибутилового эфиров соответственно

В Таб 3 приведены сводные данные о влиянии исследованных эфиров на амплитуду и время спада ТКП и мТКП в нервно-мышечном соединении лягушки Все соединения вызывали концентрационнозависимое угнетение амплитуды и изменение времени спада ТКП и мТКП, что указывает на определенное сходство в механизме их действий Однако на фоне применения диметилового эфира в концентрации 100 и 500 мкмоль наблюдалась двухфазность спада ТКП, чего не наблюдалось при использовании других эфиров Эффекты диметилового эфира отмывались на 66±4% (п = 10) в течение 20 минут, но с увеличением длины молекулы в гомологическом ряду отмывание эффектов затруднялось Так при обработке нервно-мышечного препарата дибутиловым эфиром отмывка за 30 минут составила 45+5% (п = 6)

Таблица 3 Влияние производных 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты на основные характеристики ТКП и мТКП (достоверные эффекты выделены жирным шрифтом)

Соединения Концентрация, мкмоль Изменение амплитуды ТКП, % Изменение постоянной времени спада ТКП, % Изменение амплитуды мТКП, % Изменение постоянной времени спада мТКП, %

Диметиловый эфир 10 -7±5 100 -25±3 500 -32±5 -8±14/+41±11 -27±15/+90±20 -35±14/+125±23 -2±6 -25±7 -40±7 -0±4/+39±10 -12±9/+83±14 -25±9/+117±28

Диэтиловый эфир 10 0±7 100 -23±6 500 -39±8 0±6 -15±8 -20±9 0±8 -9±5 -16±7 0±7 -10±4 -16±9

Дипропиловый эфир 10 -10±7 % 100 -30±9 % 500 -47±10 % 0±8 % -21±7 % -34±11 % -6±8 % -15±8 % -30±9 % 0±9 % -17±9 % -26±12 %

Дибутиловый эфир 10 -14±9 % 100 -34±8 % 500 -56±13 % -3±8 % -19±7 % -39±9 % -11 ±5 % -26±10 % -51 ±9 % 0±7 % -17±7% -30±11 %

* Для диметилового эфира в колонке «Изменение постоянной времени спада» указано изменение постоянной времени спада быстрой/медленной компоненты ** При фиксации мембранного потенциала на уровне -45 мВ средняя амплитуда ТКП в контроле составила 93 7+3 нА (п = 6), средняя амплитуда мТКП в контроле составила 1 5+0 3 нА (п = 8)

В контроле постоянная времени спада токов экспоненциально зависела от мембранного потенциала, а на фоне диэтилового дипропилового и дибутилового

12

эфиров не зависела от изменений мембранного потенциала Такие изменения в характере потенциалзависимости постоянной времени спада ТКП и неполная отмывка их эффектов не характерны для действия электрически нейтральных блокаторов открытого ионного канала медленного типа (Хазипов и др, 1990, 0§<1еп е1 а1, 1981) Подобные эффекты могут быть вызваны не прямым каналоблокирующим, а возможным аллостерическим действием веществ на холинорецепторы (измененяющим кинетику работы самих каналов) со стороны пограничного липидного слоя после частичного растворения эфиров в постсинаптической мембране Именно действие через липидную мембрану может объяснить изменение характера блока ионного канала в гомологическом ряду производных 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты, тк с ростом длины углеводородного радикала и, соответственно, с увеличением липофильности соединений увеличивается производимый ими эффект

Для различения механизмов действия исследуемых эфиров было проведено несколько дополнительных серий экспериментов, в которых сравнивались эффекты наименее липофильного диметилового и наиболее липофильного дибутилового эфиров Прежде всего, было проверено влияние повышения частоты активации рецепторов на эффект указанных двух эфиров В контроле при частоте стимуляции 60 имп/с в пачке из 20 сигналов наблюдалась потенциация с повышением амплитуды 2-5 сигналов, затем переходившая в депрессию В среднем амплитуда 20-го сигнала была на 9±3% меньше амплитуды первого сигнала (п = 4) На фоне аппликации диметилового эфира в концентрации 100 мкмоль (после полного развития эффекта, то есть через 20-30 минут действия вещества) также наблюдалась первоначальная потенциация с переходом в депрессию, амплитуда 20-го сигнала была в среднем на 16±4% меньше амплитуды первого (п = 5) На фоне аппликации дибутилового эфира в концентрации 100 мкмоль амплитуда 20-го сигнала была в среднем на 65±5% меньше амплитуды первого (п = 4)

Для вьиснения вопроса о месте локализации эффектов исследовалось развитие эффектов диметилового и дибутилового эфиров в концентрации 100 мкмоль при редкой - один раз в две минуты - активации рецепторов, то есть практически в отсутствие открытых каналов Эффект диметилового эфира при редкой активации рецепторов развивается существенно медленнее (Рис 2А), в то время как эффект дибутилового эфира в этой ситуации развивается почти так же, как при обычной стимуляции три раза в минуту (Рис 2Б) Данные о степени развития эффектов соединений при отключении стимуляции (и, следовательно, существенном уменьшении частоты открытия ионных каналов холинорецепторов) говорят о том, что часть эффектов соединений обуславливается их действием на синаптическую мембрану, а часть - напрямую через открытые ионные каналы, т к при включении стимуляции развитие эффектов значительно ускоряется в первые минуты

Как показали проведенные исследования, действие эфиров 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты развивается в отсутствие открытых каналов, но в то же время их эффект зависит и от частоты активации каналов Значит, механизм их действия должен быть, по крайней мере, двухкомпонентным, но при этом они не могут быть конкурентными блокаторами или блокаторами закрытого канала ввиду сильного влияния на постоянную времени спада мТКП и слабой отмывки (Акави, Коке1зи, 1986, КгатрП е! а!, 2000) Можно предположить, что первым компонентом механизма действия исследуемых эфиров является независящая от

наличия открытых каналов аллостерическая модуляция, а вторым - блокада открытого канала:

к1 кг Р(М) к,,

Я + А АЯ + А А2Я ^ А2Я° + В«- А2ЯВ , (9)

к, к2 а Ьь

где В - эфир в функции блокатора открытого канала, М - тот же эфир, действующий как аллостеричеекий модулятор.

5 <

с; с

5

<

й

100 мкмоль

дибутипового

эфира

N

10 20 Время,мин

10 20 Время, мин

Рис. 2. Изменения амплитуды ТКГ1 под действием диметилового (А) и дибутилового (Б) эфиров в концентрации 100 мкмоль. ® — непрерывная стимуляция три раза в минуту, о - от подачи вещества до стрелки стимуляция 1 раз в 2 минуты, далее непрерывная стимуляция три раза в минуту.

Для проверки этой гипотезы и выяснения конкретных значений констант скоростей реакций взаимодействия исследуемых эфироз с рецепторно-канальным комплексом было проведено математическое моделирование кинетики этого взаимодействия. Адекватность модели проверялась 1) воспроизведением в модели экспериментально полученного стационарного уровня изменения амплитуды и постоянной времени спада мТКП при трех концентрациях веществ; 2) воспроизведением в модели экспериментально полученного уровня изменения амплитуды ТКП при высокочастотной (60 имп/с) стимуляции нерва; 3) воспроизведением в модели экспериментально обнаруженного действия дибутилового эфира в отсутствие доступных открытых каналов. Все описанные экспериментальные эффекты были воспроизведены при наборе констант, приведенном в Таб. 4.

Поскольку в модели можно "отключить" по очереди каждый из двух механизмов, был оценен вклад каждого из них в общий эффект. Таб. 5 показывает опережающий рост модулирующих свойств веществ при увеличении длины их эфирных радикалов при активации каналов один раз в 15 секунд. Таким образом, при редкой активации каналов влияние дибутилового эфира определяется в основном его модулирующими свойствами, в то время как у диметилового преобладающими являются блокирующие свойства.

Таблица 4. Влияние производных 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты

на основные характеристики мТКП в модели.

Соединения Концентрация, мкмоль Изменение амплитуды мТКП, % Изменение постоянной времени спада мТКП, % 'о са 'о + " 'л -О ~ § 3 2 'и 2 ' -о

Диметиловый эфир 10 100 500 -2 -19 -47 3 -33/145 -74/169 36,7 29 26 6 1.0

Диэтиловый эфир 10 100 500 -1 -10 -21 -1 -15 -30 36 28 25 0.9 0.2

Дипропиловый эфир 10 100 500 -1 -13 -23 -2 -19 -33 35 24 20 0.5 0.002

Дибутиловый эфир 10 100 -7 -28 -43 -10 -29 -40 29 15 10 0.3 0.001

Таблица 5. Вклады блокады и аллостерической модуляции в результирующий

эффект эфиров на амплитуду модельных ТКП при низкой частоте активации (три раза в минуту).

Эфир Вклад модуляции, % Вклад блокады, %

Диметиловый 18 82

500 мкмоль Диэтиловый 48 52

Дипропиловый 72 28

Дибутиловый 93 7

Влияние хлоргексидина на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного типа.

Известный антисептик хлоргексидин в концентрации 5 мкмоль при редких раздражениях двигательного нерва (3 импульса в минуту) вызывал снижение амплитуды и постоянной времени спада ТКП до 34.2±7.3% и 53.5±3.2% (п = 10) соответственно (Рис. 3). При удалении хлоргексидина после развития его эффекта из омывающего препарат раствора за 50 мин амплитуда ТКП «отмывалась» лишь до 41.7±6.7%от исходного значения, то есть достоверной отмывки не наблюдалось (Рис. 3). Столь медленная «отмывка» в сочетании с нетоксичностью хлоргексидина свидетельствуют о том, что основным механизмом действия этого вещества не могут быть ни конкурентная блокада, ни блокада открытого или закрытого канала. При этом сильное влияние хлоргексидина на постоянную времени спада ТКП также свидетельствует, что он не может быть конкурентным блокатором или блокатором закрытого канала (Акаэи, Кокегви. 1986; КгатрЯ е1 а!., 2000).

А

/V

контроль

хлоргексидин

отмывка

Г

о

-1.5 5

О

20

40 60

Время, мин

80

Рис. 3. Изменение амплитуды и постоянной времени спада ТКП под действием хлоргексидина в концентрации 5 мкмоль при мембранном потенциале -70 мВ. Частота раздражений нерва 3 импульса в минуту. А. ТКП в контроле, на фоне установившегося действия хлоргексидина и через 40 минут отмывки. Б. Изменение амплитуды и постоянной времени спада ТКП в течение эксперимента.

Снижение амплитуды и времени спада ТКП характерно для блокаторов медленного типа, ингибиторов ацетилхолинэстеразы и веществ, ускоряющих десенситизацию. С целью уточнения механизма действия хлоргексидина были проведены эксперименты при стимуляции нерва с частотами от 0.1 до 60 имп/с. В контроле амплитуда двадцатого сигнала в пачке по отношению к первому при частоте стимуляции 0.1 имп/с составляла 94.2±3.3%, при частоте 1 имп/с 95.6±1.8% (везде п = 4). При дальнейшем повышении частоты в пачке наблюдалась потенциация: отношение амплитуды двадцатого сигнала к амплитуде первого при частоте 10 имп/с составило 108.3±7.8 % а при частоте 60 имп/с 119.6±13.1 % (везде п = 4). При перфузии нервно-мышечного препарата раствором с концентрацией хлоргексидина 2 мкмоль во всех случаях в пачках наблюдалась явно выраженная депрессия, усиливающаяся по мере роста частоты стимуляции нерва: отношение амплитуды двадцатого сигнала к амплитуде первого составило 86.7±4.5%, 72.2±4.3%, 57.1±2.8%, 31.4±34.2% при частоте стимуляции соответственно 0.1, 1, 10 и 60 имп/с (везде п = 4).

Поскольку снижение амплитуды сигналов в пачке при ритмической стимуляции является типичным признаком действия, в частности, ингибиторов холинэстеразы, в следующей серии экспериментов мы проверяли возможное действие хлоргексидина на функционально активную синаптическую ацетилхолинэстеразу. Для этого была проведена серия экспериментов с использованием ингибитора ацетилхолинэстеразы - армина. В контрольных условиях армин в концентрации 5 мкмоль, достаточной для ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы, не вызывал увеличения амплитуды ТКП, но увеличивал постоянную времени спада на 325.6+29.8% (п = 4). При использовании хлоргексидина в концентрации 2 мкмоль на фоне действия армина амплитуда двадцатого сигнала в пачке по отношению к первому при частоте стимуляции 0.1 имп/с равнялась 82.3±9.1%, при частоте 1 имп/с 82.6±6.7%, при частоте 10 имп/с

60Jt8 9 % (для всех экспериментов п = 4) Этот результат не отличался достоверно от действия хлоргексидина на фоне активной холинэстеразы Поскольку величина депрессии при ингибировании ацетилхолинэстеразы достоверно не менялась, хлоргексидин не является веществом, ускоряющим десенситизацию

Важным показателем является также потенциалзависимость эффекта, которая позволяет пролить свет на механизм действия вещества Проведенные исследования показали, что депрессия в пачках не зависит от приложенного потенциала Так депрессия ритмической стимуляции в пачке при -70 мВ составила 57 1±2 8%, при -100 мВ 62 9±7 9%, при +30 мВ 62 7±5 9% (везде л = 4)

Характерный для блокаторов ловушечного типа феномен разблокирования при сочетании деполяризации клеточной мембраны с активацией рецепторов наблюдался и при действии хлоргексидина на никотиновые холинорецепторы мышечного типа Эксперименты проводили после 30-40 минут действия вещества, то есть после выхода параметров ТКП на стационарный уровень Сочетание деполяризации клеточной мембраны с продолжающимися раздражениями нерва вызывало частичное разблокирование каналов, хотя одна лишь деполяризация без раздражений нерва не приводила к эффекту разблокирования, указывая на принципиальное значение сочетания двух стимулов Следовательно, в нормальной физиологической ситуации, когда каждое раздражение нерва вызывает деполяризацию постсинаптической мембраны и, как правило, возникновение на ней потенциала действия, описанный эффект будет значительно снижать эффективность ингибирующего действия хлоргексидина Величина разблокирования, оцениваемая по увеличению первого сигнала после возврата к нормальному мембранному потенциалу по сравнению с последним сигналом перед деполяризацией при деполяризации от -70 мВ до -20 мВ и при концентрации хлоргексидина 5 мкмоль, была равна 124 4±13 6 % (п = 4) Надо отметить, что в отличие от случая с аналогичным эффектом частичного разблокирования для блокатора ловушечного типа мекамиламина, для хлоргексидина эффект разблокирования сохранялся длительное время (около 5 мин) после возврата к нормальному потенциалу мембраны

Были также проведены эксперименты, в которых хлоргексидин подавался на фоне предварительной активации рецепторов карбахолином, причем в этом случае эффект хлоргексидина развивался быстрее Это говорит в пользу того, что хлоргексидин относится к блокаторам открытого канала В действии хлоргексидина наблюдаются многие признаки, характерные для блокаторов открытого канала, но одним из основных свойств последних является быстрая отмывка, чего в случае с хлоргексидином не наблюдается Медленная отмывка характерна для блокаторов открытого канала с ловушечным механизмом действия, но для них отмывка резко ускоряется экзогенным агонистом, чего также не наблюдается в случае хлоргексидина Трудно предположить, что нетоксичное, широко применяемое лекарственное вещество может необратимо связываться с ионным каналом, поэтому была выдвинута гипотеза о том, что амфифильный хлоргескидин может оказывать аллостерическое воздействие на рецепторно-канальный комплекс, предварительно растворяясь в окружающей его липидной мембране, выход из которой назад в водную фазу в этом случае будет затруднен То есть хлоргексидин обладает сложным механизмом действия, первым компонентом которого является аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса растворенным в его липидном окружении веществом, а

вторым - блокада открытог о канала

Для косвенной проверки этой гипотезы были проведены эксперименты в которых хлоргексидин в концентрации 10 мкмоль подавался на фоне установившихся параметров ТКП на время, которое необходимо для того, чтобы развился его эффект, однако при этом стимуляция нерва отключалась Если бы хлоргексидин является блокатором открытого канала, то никакого значительного снижения параметров в этом случае не было бы, так как не было активации рецепторов, а следовательно - и каналов в открытом состоянии Однако в результате экспериментов было получено снижение амплитуды до 54 4±1 5%, а времени спада до 62 2±10 4%, причем после включения стимуляции параметры снижались до тех же значений, что и в экспериментах без отключения стимуляции Для сравнения, при непрерывной стимуляции хлрогексидин в этой же концентрации снижал эти параметры до 34±7% и 53±2 9%, то есть в отсутствие стимуляции эффект хлоргексидина развивался на 70-80% от его значения при стимуляции нерва

Таким образом, влияние хлоргексидина на амплитудно-временные характеристики может быть интерпретировано с использованием схемы, сочетающей механизм блокирования открытого ионного канала с механизмом аллостерической модуляции

К, k, р кь

R + А ^ AR+A AjR A2R° + B ^ A2R°B

к к; « к,

+ М +М +М +М -1-М

bm,ibpl bm2$bp2 bffl3jbp, ьтдьр4 bm5$bp5 (l0) к, к |> к;

RM + А ^ ARM + А ^ A2RM A2R°M + В A2R°MB

к," к; а к„

где В - хлоргексидин в функции блокатора открытого канала, М - хлоргексидин, действующий как аплостерический модулятор При подборе значений кинетических констант для оценки адекватности модели экспериментальным данным были использованы следующие критерии 1) зависимость изменения амплитуды и постоянной времени спада от концентрации вещества, 2) 70%-е снижение амплитуды хлоргексидином в отсутствие открытых каналов, 3) кинетика изменения амплитуды во время частотной стимуляции Математическое моделирование на основе схемы (10) показало, что все описанные экспериментальные эффекты воспроизводятся при наборе констант, приведенном в Таблице 6

Таблица 6 Значения констант скоростей реакций, использованные для моделирования кинетики ионотропных холинорецепторов мышечного типа.

k|+ 1/ммоль мс 160 к|+', 1/ммоль мс 130

кГ 1/мс 18 к Г' 1/мс 20

к2+, 1/ммоль мс 80 к2+\ 1/ммоль мс 65

к2. 1/мс 36 к21 /мс 40

Р, 1/мс 36 7 Р\ 1/мс 12

а, 1/мс 1 7(Н= ¡56 мВ) а', 1/мс 3 4 (Н = 156 мВ)

кь, 1/ммоль МС 0 08 кь', 1/ммоль мс 0 09

Шь> 1/мс 0 03 rtl(,', 1/мс 0 03

bml, 1/мс 0 00002 bD), 1/ммоль мс 0 0000083

bm4, 1/мс 0 00002 Ь„4, l/ммоль мс 0 0000083

bm5, 1/мс 0 00002 bn5, 1/ммоль мс 0 0000083

Для потенциалзависимых констант приведены значения при -70 мВ

Исследование механизма влияния рН на функционирование P2Xj.

На Рис, 4А и Б приведены записанные в одной клетке типичные ответы клеток PC 12 на двухсекундные аппликации АТФ в двух концентрациях при двух уровнях рН, Видно, что при низкой концентрации АТФ (10 мкмоль) переход от рН 7 4 к рН 6,0 вызывает существенное увеличение возникающего тока (Рис, 4А§ и Ба) Совсем иная ситуация наблюдается при высокой концентрации АТФ (1 ммоль) При нормальной кислотности среды (рН = 7 4) ток, вызываемый высокой концентрацией АТФ, медленно спадает, переход от рН 7 4 к рН 6 0 при высокой концентрации АТФ не только вызывает уменьшение амплитуды тока (на 23±3%, п = 6), но и существенно меняет его форму (Рис 4А6 и Бб) Возникает очевидный спад тока (постоянная времени спада 740±50 мс, п = 9), причем ток спадает до уровня, составляющего 54±2% (п = 9) от амплитудного значения Кроме того, в момент прекращения аппликации АТФ возникает кратковременное восстановление тока (12 на Рис 4Б6), величина которого составляет 88±7% (п = 9) от амплитуды тока Важно отметить необходимость высокой концентрации и АТФ и ионов водорода для возникновения этого феномена, при низкой концентрации АТФ никакое закисление среды не может вызвать восстановление тока, и, соответственно, при низкой концентрации ионов водорода никакая концентрация АТФ также не способна сделать это

На Рис 4В приведена зависимость амплитуд токов от концентрации апплицируемого АТФ при двух значениях рН (за 100 % принята амплитуда тока, вызываемого аппликацией АТФ в концентрации 1 ммоль при рН = 7 4) Результаты говорят о том что кроме повышения сродства рецепторов к АТФ закисление также инициирует какой-то процесс инактивации, гораздо менее чувствительный к АТФ, чем процесс открытия каналов Таким процессом инактивации могла бы быть блокада открытых каналов ионами водорода (Stoop, Quayle, 1998), в этом случае процесс инактивации должен быть сильно потенциалзависимым Однако изменение рН от 7 4 до 6 0 не меняет потенциалзависимость амплитуд токов (Рис 4Г) Кроме того, специально проведенные эксперименты показали, что изменения мембранного потенциала в диапазоне от -100 до +30 мВ не изменяют ни уровень, до которого спадает ток при действии АТФ, ни постоянную времени этого спада, ни величину восстановления тока, что противоречит гипотезе о блокаде открытых каналов положительно заряженными ионами водорода.

При моделировании в качестве основных критериев соответствия модели были приняты форма токов, увеличение амплитуд токов, вызываемых аппликацией АТФ в концентрации 10 мкмоль, при закислении среды и уменьшение амплитуд токов, вызываемых аппликацией АТФ в концентрации I ммоль, при закислении среды (сопровождаемое в последнем случае появлением кратковременного восстановления тока по окончании аппликации)

А

10 мкмоль АТФ pH 7.4

1 ммоль АТФ pH 7.4

100 ЛА j 2 о

10 мкмоль АТФ pH 6.0

1 ммоль АТФ pH 6.0

>г

в

мембранный потенциал, мВ

-100 -50 О 50

/

pH 7.4

0.1 1 10 100 1000 [АТФ], мкмоль

-100 га

■ pH 7 4 pH 6.0 (I,)

Рис. 4. Модуляция вызываемых двухсекундной аппликацией АТФ токов изменением pH внеклеточной среды. А. Типичные токи, возникающие при pH = 7.4 в ответ на аппликацию АТФ в концентрации 10 мкмоль (а) и I ммоль (б). Б. Типичные токи, возникающие при pH = 6.0 в ответ на аппликацию АТФ в концентрации 10 мкмоль (а) и 1 ммоль (б). Токи на А и Б записаны в одной клетке. В. Зависимости амплитуд токов от концентрации апплицируемого АТФ при pH = 7.4 и 6.0. Г. Зависимости амплитуд токов, вызываемых аппликацией АТФ в концентрации 1 ммоль при pH = 7.4 и 6.0, от мембранного потенциала. Для обеих зависимостей амплитуда тока при -70 мВ принималась за 100%. Для В и Г п = 6.

В исследовании, проведенном Дингом и Саксом (Ding, Sachs, 1999) на Р2Хг, экспрессированных в клетки НЕК, была предложена следующая схема кинетики взаимодействия рецепторов с АТФ:

к<",7, <-7

В. к12 кЯ Ик,4

CiV"- * с, с, - ь с,

кз?

(П)

где С - Р2Хг с закрытым ионным каналом, О - Р2Х2 с открытым каналом, А -АТФ, возле переходов указаны соответствующие им константы скоростей реакций Однако полученные с помощью этой модели токи растут и спадают гораздо быстрее экспериментальных, не имеют спада во время действия АТФ и никак не зависят от кислотности среды

В работе (Ьш й а1, 1996) для случая присоединения к белку двух ионов водорода предложена следующая формула, описывающая зависимость константы скорости реакции от концентрации ионов водорода

к ^аЖХ±ЛЖЬ1 „„

" [н+г+е [н+]+1' ( }

где [Н+] - концентрация ионов водорода, ее, Р, у, б, е - эмпирические константы Потенциация при закислении среды токов, вызываемый АТФ в концентрации 10 мкмоль, позволяет предположить, что величины констант к]2, к2з и к34 растут при росте концентрации ионов водорода Спад при закислени среды токов во время аппликации АТФ в концентрации 10 мкмоль позволяет предположить, что величины констант к57 и к67 также растут при росте концентрации ионов водорода

В случае зависимости констант к57 и к67 от концентрации ионов водорода в кислой среде токи действительно имеют спад во время действия АТФ и кратковременное восстановление по окончании его действия Однако восстановление тока в данной модели исчезает, если оставить неизменной кислотность среды после окончания действия АТФ Экспериментальная проверка показала, что в действительности сохранение кислой среды по окончании действия АТФ не вызывает исчезновения феномена кратковременного восстановления тока, хотя и несколько ослабляет его Если при отмывке физиологическим раствором с рН = 7 4 величина восстановления тока (в % к величине тока в конце аппликации АТФ) составляла 87±18 %, то при отмывке физиологическим раствором с рН = 60 она составляла 54±9 % (везде п = 5)

Поскольку экспериментальные результаты показали, что возникновение восстановления тока требует как кислой среды, так и высокой концентрации АТФ, естественно было предположить, что шаг инактивации рецепторов с открытым каналом является не только рН-зависимым, но и агонистзависимым Это предположение приводит к следующей кинетической схеме

С2 ^^ С3 "к54> Д75 кб, С7 <13>

0к,2 Щьз Шкз4

с2 Сз К54 г-т- к

к2, к32 к4з г^^'

ы - к76

Данная модель при предложенном Дингом и Саксом наборе констант качественно воспроизводит экспериментальные данные, хотя форма тока и не соответствует эксперименту В связи с этим был найден новый, оптимизированный набор констант (Таблицы 7 и 8), при использовании которого модель (13) хорошо воспроизводит также и форму токов Разумеется, по кинетической схеме невозможно определить конкретный механизм инактивации открытых каналов агонистом Можно лишь утверждать, что это не простая блокада открытого канала, так как этот процесс является потенциалнезависимым и к тому же отрицательно заряженный АТФ вряд ли может войти в катионный канал

Таблица 7 Коэффициенты, использованные в модели (13)

Константа Ки к43 1*45 к54 ^46 кб4 к75 к76

Величина 20 40 60 20 40 5 14 0 005 82

Величины констант выражены в с"'

Таблица 8 Коэффициенты, использованные в формуле (12) для воспроизведения зависимости констант к1г, к2з, к14, к57 и к67

от кислотности среды

Константа а Р Г д е

к12 28437 5 3250 1497 75 2 575

к23 16562 5 2500 876 75 2 575

кз4 237500 12500 260 62 5 20

к57 0 00625 0 1 0 043 0 0625 1 5

к«7 79 375 25 5 3 0 00313 05

Величины констант выражены в ммдль"1 с1 для концентрации ионов водорода в мкмоль

Моделирование позволяет показать различную роль двух открытых состояний в потенциации токов и в возникновении восстановления тока При рН = 7 4 оба открытых состояния концентрационнозависимо участвуют в создании тока, хотя вклад состояния 05 несколько больше При рН = 6 0 при высокой концентрации АТФ вначале ток течет преимущественно через О5, а восстановление тока по окончании действия агониста обеспечивается преимущественно состоянием 06 То есть в последнем случае наблюдается как бы движение «по кольцу» С4 - 05 - С7 - 06 - С4 Это и позволяет получить на модели примерно одинаковую кинетику начального роста и спада тока и его позднейшего восстановления - при одном открытом состоянии кинетика восстановления и финального спада получается в модели при любых константах существенно медленнее, чем кинетика первоначального роста и спада тока

Исследование процесса десенситизации Р2Хз

На Рис 5А показаны типичные токи, вызываемые в сенсорных нейронах крыс двухсекундными аппликациями четырех агонистов Р2Х3 2-те8АТФ, АТФ, а,р-шеАТФ и р,у-теАТФ (все агонисты в концентрации 1 мкмоль) Для всех агонистов токи в ходе аппликации спадают к нулю, что свидетельствует о быстрой и полной десенситизации На Рис 5Б показаны зависимости доза-эффект для всех четырех агонистов По эффективности действия агонисты распределились следующим образом 2-теБАТФ (ЕС50 = 0 29±0 1 мкмоль) > АТФ (ЕС50 = 1 5±0 1 мкмоль) > а,р-теАТФ (ЕС50 = 1 8±0 2 мкмоль) > Р,у-теАТФ (ЕСМ = 18±2 6 мкмоль) Постоянные времени спада токов, показывающие скорость перехода рецепторов в десенситизированное состояние, при концентрации агонистов 10 мкмоль были одинаковы для 2-теБАТФ, АТФ и а,р-шеАТФ (0 06±0 01 с, 0 06±0 01 с и 0 06±0 02 с соответственно), но втрое больше для Р,у-тсАТФ При понижении концентрации постоянные времени спада токов росли для всех агонистов, хотя и в

разной степени (Рис. 5В).

[агонист], мкмоль

Рис. 5. Действие четырех агонистов на Р2Х3 сенсорных нейронов. А. Образцы токовых ответов на двухсекундные аппликации АТФ, а,Р-теАТФ, 2-шеБАТФ и |5,7-шеАТФ (все в концентрации 10 мкмоль, записи сделаны в одном нейроне). Б. Зависимость амплитуд токовых ответов (в % от максимальной для каждого агониста) от концентрации апплицируемого на 2 с агониста (п = 5-НО). В. Зависимость постоянной времени спада токов т от концентрации апплицируемого на 2 с агониста (п = 5-=-12).

Скорость процесса восстановления Р2Х3 после десенситизации оказалась зависящей от того, какой именно агонист вызвал десенситизацию (Рис. 6А), хотя сама десенситизация во всех случаях была полной. Наиболее быстрым было восстановление после действия р,у-шеА ГФ (время восстановления амплитуды тока до 50% от контроля 0.32+0.03 минуты, п = 5), наиболее медленным - после действия 2-те8АТФ (время восстановления амплитуды тока до 50% от контроля 3.22±0.07 минуты, п = 7). Обращает на себя внимание явная сигмоидность процесса восстановления Р2Х3 после десенситизации. тогда как согласно классическим представлениям этот процесс является экспоненциальным (Ка1?., ТЬеэЫТ. 1957).

23

А

Б

Рис. 6. А. Восстановление Р2Х3 после десенситизации, вызванной действием различных агонистов. На графике представлена зависимость амплитуды тока, вызванного второй 2-секундной аппликацией агониста, от времени, прошедшего с момента первой аппликации (в % от амплитуды тока, вызванного первой аппликацией). Агонисты применялись в эквиэффективных концентрациях: 1 мкмоль для 2-те8АТФ, 10 мкмоль для АТФ и а,|3-теАТФ, 100 мкмоль для (3^-шеАТФ (п = 4+10). Б. Зависимость десенситизации, вызываемой 90-секундной аппликацией агониста, от его концентрации (п = 4+7).

Феномен, называемый высокоаффинной десенситизацией, впервые был описан для холинорецепторов мышечного типа (Ка1г, ТЬеэкГГ, 1957) и позднее показан для других типов холинорецепторов (см. вЫаЫНп е1 а1., 2005). Суть этого феномена заключается в том, что длительная аппликация агониста в сверхнизкой, не вызывающей возникновения тока, концентрации приводит к уменьшению токового ответа на последующие аппликации агониста в нормальной концентрации. Для исследования данного феномена на Р2Х3 был использован следующий протокол: вначале подавалась 2-секундная аппликация АТФ в концентрации 10 мкмоль, через 6 минут отмывки на 90 с подавался исследуемый агонист в наномолярной концентрации и сразу по его окончании - вторая 2-секундная аппликация АТФ в концентрации 10 мкмоль. На Рис. 6Б показана для всех четырех агонистов зависимость десенситизации, вызываемой 90-секундной аппликацией агониста, от его концентрации. Из рисунка видно, что максимальной способностью к стимуляции высокоаффинной десенситизации обладает 2-ше8АТФ (1С50 = 0.43 нмоль), далее идут АТФ (1С50= 2.7 нмоль), а,р-теАТФ (1С50 = 17 нмоль) и шеАТФ (1С50 = 310 нмоль).

Таким образом, способность агониста к высокоаффинной десенситизации прямо кореллируег с эффективностью действия агонистов (см. Рис. 5Б) и обратно кореллирует со скоростью восстановления рецепторов после вызванной этими агонистами классической десенситизации (см. Рис. 6). Это означает, что процессы активации, восстановления и высокоаффинной десенситизации Р2Х3 не являются независимыми.

Поскольку до сих пор модели кинетики Р2Х3 не были описаны в литературе, вначале было необходимо выбрать модель, которая смогла бы адекватно описать быструю акгивацию Р2Х3. их быстрый и полный переход в десенситизированное

24

состояние и последующее медленное сигмоидальное восстановление На сегодня известны три принципиальные схемы последовательная (использованная, например, для описания Р2ХЬ Rettinger, Schmalzing, 2003), бифуркационная (использованная для описания рецепторов ГАМК, Jones, Westbrook, 1996), циклическая (предложенная исходно для холинорецепторов. Katz, Thesleff, 1957) Для проверки принципиальной возможности каждой из схем воспроизвести экспериментальные данные были использованы два главных критерия быстрая полная десенситизация при действии агониста и медленное сигмоидальное восстановление Проведенное исследование показало, что ни последовательная, ни бифуркационная схемы не способны воспроизвести одновременно быструю полную десенситизацию рецепторов при действии агониста И медленно? сигмоидальное восстановление В итоге, с учетом возможности перехода рецепторов в десенситизированное состояние минуя открытое, была применена следующая схема кинетики переходов

R < |rl dl.f

щ kl щ

|г2 d2w

12

k2 - > A2R

фгЗ

0 «Г 0

D -> AD

13

k3

-> A3R <e

Л

nl

n2

d3 ^ m2

—> A2D

d4

m3

14

•г4

n3

■> A3D < n4

k4

—> A3R° /Nr5

m4 —>A3Df

(14)

Далее было необходимо найти значения констант скоростей реакций, при которых модель могла бы воспроизвести для всех агонистов 1) зависимости доза-эффект, 2) зависимости постоянных времени спада токов от концентрации агониста, 3) зависимости восстановления после десенситизации от времени, 4) эффект высокоаффинной десенситизации (включая эффекты ранней и поздней подачи агониста) В Таб 9 приведены наборы значений констант скоростей реакций для всех агонистов, которые позволили получить в модели наилучшее воспроизведение всех перечисленных экспериментальных эффектов На Рис 7 показано воспроизведение экспериментальных данных моделью кинетики Р2Х3 с применением приведенного в Таб 9 набора кинетических констант Хорошее соответствие модельных данных экспериментальным свидетельствует о том, что данная модель адекватно описывает кинетику взаимодействия Р2Х3 с агонистами и их десенситизацию

Таблица 9 Значения констант скоростей реакций, использованные для моделирования кинетики Р2Х3

константа АТФ а,Э-шеАТФ Э,у-теАТФ 2-meSATO

kl 120000 36000 30000 1200000

П 20 8 110 50

k2 80000 24000 20000 800000

12 40 16 220 100

k3 40000 12000 10000 400000

13 60 24 330 150

к4 70 65 65 70

14 1 1 1 1

ш1 24000 3000 300 24000

п1 0 0085 0019 0 1 0 007

гп2 16000 2000 200 16000

п2 0017 0 038 02 0 014

тЗ 8000 1000 100 8000

пЗ 0 0255 0 057 03 0 021

т4 0 00001 000001 0 00001 0 00001

п4 1 1 1 1

с11 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

г1 2.5 25 2.5 25

й2 02 0.12 1 06

т2 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

63 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

гЗ 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

64 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

г4 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

с15 23 20 20 23

г5 0 00001 0 00001 0 00001 0 00001

Величины констант выражены в ммоль*1 с"1 (к1, к2, кЗ, ш1, т2, шЗ) или в с"1

Из кинетической схемы понятно, что прежде чем перейти из состояния А3В° в состояние Я рецепторы должны пройти ряд промежуточных состояний (А30, А20, АО, Б), которые играют роль своеобразного функционального буфера. И именно временное накопление рецепторов в этих состояниях притормаживает восстановление на начальном этапе и делает его сигмоидальным Выраженность этой сигмоидальности зависит от скорости прохождения рецепторов через промежуточные состояния

Модельный анализ экспериментально проверяемых критериев различения механизмов ингибирования трансмембранных токов.

Существует множество веществ, способных ингибировать постсинаптические токи В данной работе рассмотрены только те из них, которые имеют чисто постсинаптическое действие, то есть не изменяют выброса агониста из пресинаптического нервного окончания Однако сам факт ингибирования тока недостаточен для понимания механизма действия вещества, нужно определить какие-то дополнительные особенности его действия по специфическому влиянию на характеристики постсинаптического тока. Основные характеристики постсинаптического тока - его амплитуда, постоянная времени спада заднего фронта (т) и время роста переднего фронта от 10% до 90% максимума Была сделана попытка с помощью математического моделирования кинетики взаимодействия веществ с рецепторно-канальными комплексами выделить набор критериев, позволяющий однозначно классифицировать механизм действия ингибирующих постсинаптические токи веществ Пока не были рассмотрены довольно редкие блокаторы закрытого канала, остальные же вещества классифицируются в следующие три группы

в

1 10 100 агонист, мкмоль

-АТФ

■ ■ ■ • а,|(-ШвАТФ

ч---р,у-теАТФ

\-----2-meSATO

агонист, мкмоль

100.

. 75. га о

§ 50.

Г

¡ а,

та

0.

-АТР

---(Vf-meATP

■ ■ • ■ cc.fl-meATP -----2-meSATP

О 2 4 6 8 10 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

время, мин 90 с агонист, нмоль

Рис. 7. Воспроизведение экспериментальных данных моделью кинетики Р2Х3. А. Модельные зависимости доза-эффект (на вставке показан пример модельного тока). Б. Модельные зависимости постоянных времени спада вызванных 2-секундной аппликацией агониста токов от концентрации агониста. В. Модельное восстановление Р2Х3 после десенситизации 2-секундными аппликациями разных агонистов (агонисгы применялись в эквиэффективных концентрациях: 1 мкмоль для 2-meSAT<3>, 10 мкмоль для АТФ и а,(5-теАТФ, 100 мкмоль для p,g-meAT®). Г. Модельная зависимость десенситизации, вызываемой 90-секундной аппликацией агониста, от его концентрации.

Блокаторы. Это вещества, так или иначе препятствующие открытию ионного канала. В свою очередь могут быть разделены на три подгруппы.

Конкурентные блокаторы. Вещества, способные связываться с посадочными сайтами агониста и препятствовать тем самым его посадке и последующему открытию канала.

Блокаторы открытого канала. Вещества, способные входить в открытый канал и «затыкать» его. Различают «быстрые», «медленные» и «средние» блокаторы открытого канала. У «медленных» скорость перехода из блокированного в открытое состояние гораздо ниже скорости перехода из открытого в закрытое состояние, у «быстрых» - выше, у «средних» - примерно такая же.

Блокаторы открытого канала ловушечного типа. Вещества, способные не только входить в открытый канал и «затыкать» его, но и оставаться в канале при его закрытии. Различают «ловушечные» блокаторы не влияющие на кинетику работы рецептора при нахождении внутри закрытого канала и меняющие ее; среди

последних можно выделить ускоряющие закрытие канала и замедляющие его

Аллостерические модуляторы Это вещества, способные взаимодействовать с рецептором и менять его способность взаимодействовать с агонистом и открывать канал Можно различить аллостерические модуляторы ускоряющие закрытие канала и замедляющие его В последнем случае для ингибирования тока модулятор должен также понижать чувствительность рецептора к агонисту

Ускорители десенситизации Это вещества, способные взаимодействовать с рецептором и повышать его способность переходить в десенситизированное состояние, в котором канал не может открыться вне зависимости от присоединения агониста Механизм действия этих веществ неясен, предполагается, что вещество-модулятор ускоряет все имеющиеся в кинетической схеме переходы рецептора в десенситизированное состояние

Проведенное математическое моделирование позволило показать что все перечисленные механизмы имеют свои характерные особенности в отношении влияния на основные характеристики постсинаптических токов Приведенный на Рис 8 алгоритм позволяет однозначно классифицировать ингибирующее постсинаптический ток вещество по механизму его действия (невозможно различить лишь блокаторы открытых каналов медленного типа и ускорители десенситизации) Следует отметить, что данный алгоритм не противоречит известным способам различения ингибиторов - например, различению конкурентных и неконкурентных блокаторов по характерным сдвигам зависимости доза-эффект (Stephenson, 1956, Colquhoun, 1987, 1998) Однако этот способ позволяет отличить только один тип блокаторов - конкурентные, кроме того, зависимость доза-эффект может быть получена только при работе с изолированной клеткой, когда есть возможность менять концентрацию действующего на рецепторы агониста, но невозможно получить эту зависимость при исследовании синаптической передачи

Первый шаг применения алгоритма - проверка влияния исследуемого ингибитора на постоянную времени спада постсинаптических токов Если спад становится двухфазным, то исследуемое вещество является блокатором открытого канала среднего типа Если в ходе развития эффекта спад токов временно ускоряется, а затем происходит возвращение к обычной скорости спада, то исследуемое вещество является блокатором ловушечного типа, не меняющим кинетику работы рецептора при нахождении внутри канала Если постоянная времени спада токов увеличивается, то следует проверить, от чего зависит развитие и отмывка эффекта вещества - от времени его воздействия/отмывки (независимо от активации каналов) или от количества активаций каналов (независимо от времени между активациями) Если и развитие и отмывка эффекта зависят только от количества активаций каналов, то исследуемое вещество является блокатором ловушечного типа, замедляющим закрытие канала Если и развитие и отмывка эффекта зависят только от времени, то исследуемое вещество является аллостерическим модулятором, замедляющим закрытие канала Если развитие эффекта зависит от количества активаций каналов, а отмывка эффекта зависит от времени, то исследуемое вещество является блокатором открытого канала быстрого типа

Если постоянная времени спада токов уменьшается то следует проверить изменение эффекта при повышении частоты активации каналов Если эффект усилится, то исследуемое вещество является блокатором открытого канала

медленного типа или ускорителем десенситизации Если эффект не изменится, то следует проверить, от чего зависит развитие и отмывка эффекта вещества - от времени его воздействия/отмывки или от количества активаций каналов Если и развитие и отмывка эффекта зависят только от количества активаций каналов, то исследуемое вещество является блокатором ловушечного типа, ускоряющим закрытие канала Если и развитие и отмывка эффекта зависят только от времени, то можно проверить изменение эффекта при ингибировании разрушающего агонист в синаптической щели фермента — если эффект ослабевает, то исследуемое вещество является аллостерическим модулятором, ускоряющим закрытие канала, если эффект усиливается, то исследуемое вещество является конкурентным блокатором (в случае конкурентного блокатора укорочение спада токов является незначительным)

Амплитуда

Постоянная времени спада

Изменение эффекта при повышении частоты активации

Зависимость

развития/отмывки в N / п/1 эффекта от

Изменение эффекта при ингибировании АХЭ

Блокдтор открытого камала быстрого типа. Блокатор ловушечного типа га медля к> щи й закрытие канала Аллостеричес-кнй модулятор замедляющий закрытие канала Блокатор лов> шечного ТИП8 ускоряющий закрытие канала

Аллосгерическнк

модулятор

ускоряющий

закрытие

каняля_

Рис 8 Алгоритм классификации ингибирующих постсинаптический ток веществ по механизму их действия Условные обозначения | — уменьшение параметра, | - увеличение параметра, - отсутствие эффекта, У - усиление эффекта, О - ослабление эффекта, Т - зависит от времени действия, п - зависит от числа активаций означает возникновение двухфазного спада с большей и меньшей постоянной, чем в контроле, > - означает временное уменьшение постоянной времени спада с поме дующим ее восстановлением до контрольного значения

Следует отметить, что некоторые модуляторы имеют еще и не отмеченные в Рис 8 особенности действия, а также то, что эффект некоторых веществ может сочетать в себе несколько механизмов действия

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количество веществ, способных модулировать работу лиганд-управляемых

29

ионных каналов, очень велико Это связано с громадным разнообразием как типов и подтипов самих каналов, так и механизмов воздействия на них биологически активных веществ Даже если ограничиться рассмотрением только веществ, ингибирующих постсинаптические токи, то это могут быть и блокаторы разных типов, и аллостерические модуляторы, и ускорители десенситизации Важной разновидностью блокирования каналов является блок ловущечного типа, присущий многим широко используемым химическим соединениям, но требующий для своего выявления сочетания деполяризации и активации канала То есть самого факта уменьшения амплитуд агонист-индуцированных токов под действием какого-то вещества недостаточно для определения механизма его действия,

В данной работе используемые для различения механизмов действия веществ модельные расчеты велись параллельно с классическими электрофизиологическими исследованиями, что нашло свое отражение в построении диссертации Новые экспериментальные данные учитывались при моделировании, так же как модельные результаты служили для разработки новых экспериментальных протоколов Результаты расчетов нигде не использовались как окончательное доказательство, предсказания моделей всегда сопоставлялись с разнообразными экспериментальными данными и только существенное совпадение служило основанием для представления модели в качестве научной гипотезы Все модели строились с конкретными целями, для объяснения парадоксов, обнаруженных в экспериментах За счет такого сочетания в исследовании обоих объектов, никотинового холинорецептора и рецептора АТФ, был достигнут существенный прогресс

Было показано, что ганглиоблокатор мекамиламин вызывает блок ионных каналов мышечного ацетилхолинового рецептора в миотубулах крысы (1С50 = 8 1 мкмоль при -70 мВ) и в нервно-мышечном соединении лягушки (1С50 = 7 7 мкмоль при -70 мВ) Деполяризация постсинаптической мембраны в сочетании с активацией холинорецепторов экзогенным или эндогенным ацетилхолином вызывает частичное разблокирование каналов, указывая на блок каналов ловушечного типа Ловушечный тип блокады с большей аффинностью (1С50 = 0 34 мкмоль при -70 мВ) наблюдается при действии мекамиламина на нейрональные холинорецепторы хромаффинных клеток, что свидетельствует об общем типе блокирования этим агентом никотиновых холинорецепторов разного типа Расчет глубины зоны связывания мекамиламина в ионном канале выявил более глубокое ее расположение у нейрональных рецепторов (5 = 0 72) чем у мышечных (5 = 0 37), что свидетельствует о разном расположении структурных детерминант, определяющих блокирующий эффект мекамиламина Математическое моделирование подтвердило, что потенциалзависимые блокирующие эффекты мекамиламина объясняются его способностью оставаться в ионном канале холинорецептора при закрытии канала, который в этом случае закрывается быстрее, чем ионный канал без блокатора

В нервно-мышечном соединении лягушки четыре эфира 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты с растущей липофидьностью вызывают уменьшение амплитуды и длительности токов концевой пластинки Эти ингибиторные эффекты возрастают по мере роста липофильности соединений, что свидетельствует об аллостерическом действии эфиров на холинорецептор со стороны пограничного липидного слоя Данные соединения проявляют также каналоблокирующие свойства, но не способны блокировать открытый ионный

канал по ловушечному типу По мере роста липофильности эфиров возрастает вклад аллостерического механизма действия в общий ингибиторный эффект и замедляется кинетика блокирования открытого канала.

Антибактериальный агент хлоргексидин вызывает уменьшение амплитуды (1С}о = 47 мкмоль при -70 мВ) и постоянной времени спада токов концевой пластинки лягушки Ингибиторный эффект хлоргексидина возрастает при повышении частоты раздражений двигательного нерва. На фоне развившегося эффекта хлоргексидина деполяризация постсинаптической мембраны в сочетании со стимуляцией нерва вызывает частичное разблокирование ионных каналов холинорецептора Математическое моделирование привело к заключению о наличии двойного - аллостерического и каналоблокирующего — эффекта хлоргексидина

Закисление среды (рН <6 4) вызывает противоположно направленные изменения ответов ионотропных Р2Х2 рецепторов клеток феохромоцитомы крыс на аппликацию низких или высоких концентраций АТФ При концентрации АТФ < 100 мкмоль наблюдается потенциация, а при АТФ > 1 ммоль - депрессия токов Депрессия сочетается со вторичной волной тока на прекращение аппликации АТФ Анализ кинетики показал, что как потенциация, так и депрессия сопровождаются усилением сродства Р2Х2 рецепторов к АТФ Поэтому при действии высоких концентраций агониста потенциирующий эффект АТФ сменяется инактивацией Р2Х2 рецепторов, выход из которой через открытое состояние канала вызывает вторичный токовый ответ

Аппликация АТФ или его синтетических аналогов а,Р-теАТФ, р,у-теА'ГФ и 2тпе8-АТФ на сенсорные нейроны крыс и мышей, экспрессирующих Р2Х3 рецепторы, вызывает токи, быстро десенситизирующиеся в присутствии агониста Восстановление Р2Х3 рецепторов после десенситизации является медленным процессом, зависимым от природы агониста Феномен агонисг-зависимой десенситизации воспроизводится при использовании кольцевой кинетической модели, предполагающей различное сродство десенситизированных рецепторов к разным агонистам Процесс восстановления Р2Х3 рецепторов после десенситизации имеет сигмоидальную зависимость от времени, что объясняется наличием нескольких промежуточных состояний рецептора на пути восстановления Математическое моделирование показало, что именно эти промежуточные состояния лимитируют скорость восстановления рецепторов и обеспечивают сигмоидальную форму восстановления Аппликация на сенсорные нейроны крысы подпороговых наномолярных концентраций АТФ вызывает развитие высокоаффинной десенситизации Механизм высокоаффинной десенситизации состоит из двух компонентов прямого перехода рецепторов в десенситизированное состояние из состояния с закрытым каналом и торможения восстановления за счет высокоаффинного связывания агониста с десенситизированными рецепторами Высокоаффинная десенситизация может снижать чувствительность ноцицептивных сенсорных нейронов к эндогенным пуринам - медиаторам боли

В ходе изучения механизма действия конкретных веществ на лиганд-управляемые ионные каналы были получены также результаты, имеющие принципиальное теоретическое значение - принципы различения механизмов действия ингибиторов лиганд-управляемых ионных каналов Точное определение механизма (или - в некоторых случаях - механизмов) действия вещества имеет как

большое фундаментальное, так и важное прикладное значение С одной стороны именно точное знание механизма действия вещества позволяет использовать это вещество как инструмент исследования лиганд-управляемых ионных каналов С друой стороны, точное знание механизма действия лекарственного вещества позволяет предсказать все возможные последствия его применения в различных ситуациях Таким образом, наряду с углублением фундаментальных научных знаний о строении, механизмах функционирования и путях регуляции работы ионных каналов, полученные выводы могут быть использованы при тестировании новых препаратов для медицинской практики

ВЫВОДЫ

1 Проведен систематический анализ молекулярных механизмов действия вызывающих депрессию постсинаптического тока веществ, некоторые из которых (мекамиламин, димефосфон, хлоргексидин) применяются в клинической практике Показано, что депрессия постсинаптического тока вследствие ингибирования ионотропных холинорецепторов и рецепторов АТФ реализуется путем усиления их десенситизации или рН-зависимой инактивации, аллостерической модуляцией через сайты, доступные из водной или липидной фазы, конкурентной блокадой или блокадой ионных каналов

2 Анализ кинетической схемы, разработанной на основе полученных экспериментальных данных, показал, что мекамиламин является блокатором ловушечного типа ионных каналов холинорецепторов и способен ускорять закрытие канала при нахождении внутри него

3 Сопоставление экспериментальных данных и результатов математического моделирования показало, что в основе угнетающего постсинаптического действия эфиров 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты и хлоргексидина лежит двойной механизм, включающий аплостерическое и каналоблокирующее действие на ионотропные холинорецепторы

4 Сопоставление экспериментальных и модельных данных позволило показать, что двойной - потенциируюший и ингибирующий - эффект рН на Р2Х2 объясняется повышением сродства рецепторов к АТФ во всех местах его присоединения

5 Сопоставление экспериментальных данных и результатов математического моделирования показало, что особенности эффектов агонистов пуриновых рецепторов Р2Х3 типа (чувствительность к агонисту, скорость восстановления после десенситизации, высокоаффинная десенситизация) обусловлены в основном разной скоростью их диссоциации от рецептора

6 Математическое моделирование кинетики взаимодействия рецепторов с агонистами и ингибиторами показало, что каждый из исследованных механизмов ингибирования (конкурентная блокада, каналоблокада, аллостерическая модуляция, ускорение десенсетизации) имеет свои характерные особенности в отношении влияния на основные характеристики постсинаптических токов Для однозначной классификации ингибирующих постсинаптический ток веществ по молекулярному механизму их действия необходимо учитывать направление и величину изменения под действием ингибитора постоянной времени спада агонист-индуцированных токов, зависимость развития изменений и скорости отмывки эффекта вещества от длительности его воздействия количества активаций и частоты активации рецепторов, наличие и условия возникновения ситуаций

временного восстановления рецепторов

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи в журналах

1 Котов, Н В Моделирование кальцийзависимых ферментативных реакций / Н В Котов, А И. Скоринкин, Е К Костылева // Журнал физической химии - 1995,Т 69-№8-С 1438-1444

2 Скоринкин, А И Моделирование двух волн ответа АТФ-рецепторов клеток феохромоцитомы на скачок концентрации агониста / А И Скоринкин, Р.А Гиниатуллин Н Биофизика,- 2000,- Т 45 - № 2,- С 293-298.

3 Gmiatulhn, R.A Rapid relief of block by mecamylarome of neuronal nicotinic acetylcholine receptors of rat chromaffin cells in vitro An electrophysiological and modeling study / R A Gimatullin, E M Sokolova, S Di Angelantomo, A. Skorinkin, M V Talantova, A Nistri // Molec Pharm - 2000 - V 58 - № 4 - P 778-787

4 Пряжников, E Г Механизмы действия димефосфона на синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении / Е Г Пряжников, А.И. Скоринкин, Р С Гараев, Р А Гиниатуллин // Нейрофизиология / Neurophysiology - 2002 - Т 34 - № 5 - С 635-641

5 Хабибуллина, Н К Модулирующее действие серотонина на нервно-мышечную передачу лягушки / НК Хабибуллина, А В Шакирзянова, А.И. Скоринкин, Р А Афзалов, Р А Гиниатуллин // Бюлл эксп биол мед - 2002 - Т. 134 - № 7 - С 12-15

6 Skorinkin, A Bimodal action of protons on ATP currents of rat PC12 cells / A Skorinkin, A Nistri, R Gmiatulhn// J Gen Physiol - 2003 - V 122-№ 1 - P 33-44

7 Sokolova, E Agonist-dependence of recovery from desensitization of P2X3 receptors provides a novel and sensitive approach for their rapid up or downregulation / E Sokolova, A. Skorinkin, E Fabretti, L Masten, A Nistri, R Gimatullin // Brit J Pharm-2004-V 141-№6-P 1048-1058

8 Fabbro, A Quantal release of ATP from clusters of PC 12 cells / A Fabbro, A. Skonnkm, M Grandolfo, A Nistri, R Gimatullin // J Physiol - 2004 - V 560 - № 2 - P 505-517

9 Скоринкин, А И Реконструкция динамики изменения концентрации ацетилхолина в синаптической щели при одноквантовом сигнале / А И Скоринкин, А Р Шайхутдинова // Биофизика - 2004 - Т 49 - № 5 - С 872-876

10 Скоринкин, А И Ловушечный тип блокирования мышечных никотиновых холинорецепторов мекамиламином / А И Скоринкин, К Б Остроумов, А Р Шайхутдинова, Р А Гиниатуллин // Доклады Академии Наук - 2004 - Т 399 - № 6 -С 843-845

11 Скоринкин, А И Зависимость концентрации полумаксимального действия блокатора открытых каналов от концентрации агониста / А И Скоринкин, Н В Валеев, А Р Шайхутдинова // Биофизика - 2005 - Т 50 - № 2 - С 281-288

12 Пряжников, ЕГ Механизмы действия производных 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты на синаптическую передачу в нервно-мышечном соединении / Е Г Пряжников, А.И. Скоринкин, Р С Гараев, Р А Гиниатуллин, А О Визель, Л И Щукина // Бюлл эксп биол мед - 2005 - Т. 139 - № 4 - С 432435

13 Шайхутдинова, АР Механизмы модуляции работы рецепторно-канального комплекса хлоргексидином /АР Шайхутдинова, Е Е Никольский,

Р А Гиниатуллин, А И. Скоринкин // Доклады Академии Наук - 2005 - Т 402 - № 3 - С 427-429

14 Скоринкин, А И Действие ганглиоблокатора мекамиламина на мышечные ионотропные холинорецепторы крыс / А И Скоринкин // Нейрофизиология / Neurophysiology - 2005 - Т 37 - № 3 - С 217-222

15 Sundukova, М V Inhibition of water transport across cell membranes by dimephosphon I M V Sundukova, A R Mutma, A.I. Skormkin 11 MRSej - 2006 - Vol 8.- № 1 - P 6-9

16, Sokolova, E Experimental and modeling studies of desensitization pf P2X3 receptors / E Sokolova, A. Skormkin, I Moiseev, A Agrachev, A Nistn, R Giniatullm // Molec, Pharm - 2006 - Vol. 70 - № 1 - P, 373-382

17 Ostroumov, К Modeling study of mecamylamine block of muscle type acetylcholine receptors / К Ostroumov, A Shaikhutdinova, A. Skormkin // Eur Biophys J - 2007 - in press [Epub ahead of print 2007 Oct 16]

Статьи в сборниках.

1 Скоринкин, А И Модельное определение изменения концентрации ацетилхолина в синаптической щели / А И Скоринкин // Компьютерное и математическое моделирование в естественных и технических науках Вып 1 -Тамбов изд-во ТГУ, 2001 - С 20-22

2 Остроумов, К Б Моделирование действия верапамила на ацетилхолиновые рецепторы нервно-мышечного синапса лягушки / КБ Остроумов, Э Р Шарифуллина, А.И. Скоринкин // Компьютерное и математическое моделирование в естественных и технических науках Вып 18 - Тамбов изд-во ТГУ, 2002 -С 12

3 Скоринкин, А И Критерии различения механизмов ингибирования постсинаптических токов / А И Скоринкин, Р А Гиниатуллин // Структура и динамика молекулярных систем Сборник статей Выпуск XI Часть II - 2004 - С 180-183

4 Шайхутдинова, А Р Механизмы модуляции работы рецепторно-канального комплекса хлоргексидином биглюконатом /АР Шайхутдинова, Е Е Никольский, Р А Гиниатуллин, А.И. Скоринкин // Структура и динамика молекулярных систем Сборник статей Выпуск XI Часть II - 2004 - С 195-198

5 Стробыкина, О С Изучение методом ИК-спектроскопи мембранотропного действия хлоргексидина биглюконата /ОС Стробыкина, Д А Файзуллин, А.И. Скоринкин // Структура и динамика молекулярных систем Сборник статей Выпуск XII Часть II - 2005 - С 229-232

6 Абдуллин, А Р Исследование механизма различного влияния блокатора открытых каналов на параметры токов, вызванных высокой и низкой концентрациями агониста /АР Абдуллин, А.И. Скоринкин // Структура и динамика молекулярных систем Сборник статей Выпуск XIII - 2006 - С 3-6

7 Скоринкин, А И Исследование протон-активируемых ионных каналов клеток PC 12 / А И Скоринкин, А Р Шайхутдинова, А Нистри, РА Гиниатуллин// Структура и динамика молекулярных систем Сборник статей Выпуск XIII - 2006 -С 249-252

8 Сундукова, М В ЯМР-исследование водной проницаемости мембран эритроцитов / М В Сундукова, А Р Мутина, А.И. Скоринкин // Структура и динамика молекулярных систем Сборник статей Выпуск XIII - 2006 - С 285-288

Тезисы основных докладов.

1 Скоринкин, А И Моделирование постсинапгических процессов / А И Скоринкин // Актуальные проблемы нейробиологии V Всероссийская школа молодых ученых Тезисы пленарных докладов и стендовых сообщений - Казань КГМУ, 1998 - С 58-59

2 Остроумов, К Б Оценка вероятности связывания блокатора в открытом канале / КБ Остроумов, А.И. Скоринкин // Актуальные проблемы нейробиологии VI Всероссийская школа молодых ученых Тезисы пленарных докладов и стендовых сообщений - Казань КГМУ - 1999 - С 95-96

3 Скоринкин, А И Влияние мекамиламина на скорость открывания ионного канала / А И Скоринкин, К Б Остроумов // Растущий организм Адаптация к физической и умственной нагрузке Тезисы V Всероссийского симпозиума и школы семинара молодых ученых и учителей - Казань Унипресс, 2000 - С 130131

4 Скоринкин, А И Зависимость амплитуды установившихся ответов от концентрации агониста и блокатора при последовательной кинетике активации и блокирования / А И Скоринкин // Четвертая международная конференция по математическому моделированию Тезисы докладов - Москва Издательство «Станкин», 2000 - С 102

5 Скоринкин, А И Реконструкция динамики изменения концентрации ацетилхолина в синаптической щели при одноквантовом сигнале / А И Скоринкин // Четвертая международная конференция по математическому моделированию Тезисы докладов - Москва Издательство «Станкин», 2000 - С 103

6 Skorinkin, A Computer modeling of ACh time-course m synaptic cleft / N Valeyev, A Skorinkin, R Gimatullm // Eur Bioph J - 2000 - V 29 - № 4-5 - P 350

7 Ostroumov, К В Qualitative analysis of action of mecamylamme on neuronal acetylcholine receptors (nAChRs) on sciatic nerve-sartorius muscle preparation of the frog / KB Ostroumov, A.I. Skorinkin, RA Gimatullm // Актуальные проблемы нейробиологии VII Всероссийская школа молодых учёных Тезисы пленарных докладов и стендовых сообщений - Казань КГМУ, 2000 - С 78

8 Sokolova, ЕМ How can mecamylamme block nicotinic receptors' / EM Sokolova, R A Gimatullm, S Di Angelantonio, M V Talantova, A.I. Skorinkin, A. Nistn//Synaptic transmission 100 years after L Luciani - Rome, 2000 - P 109-110

9 Skorinkin, A1 Computational modelling of mecamylamme action on neuronal nicotinic receptors / AI Skorinkin, R A Gmiatullin // Нейрофизиология / Neurophysiology - 2000 - T 32 - № 3 - С 231

10 Skorinkin, A I Modelling of two-waves ATP-mduced currents / A I Skorinkin, R A Gimatullm, К В Ostroumov // Нейрофизиология / Neurophysiology - 2000 - Т. 32 - № 3 - С 265

11 Остроумов, К Б Моделирование действия АТФ на Р2Х рецепторы клеток РС12 /КБ Остроумов, А.И. Скоринкин, Р А Гиниатуллин // XVIII Съезд физиологического общества им ИП Павлова Тез докл-2001-C 182

12 Скоринкин, А И Сравнение трех возможных схем блокирования открытого канала / А И Скоринкин // XVIII Съезд физиологического общества им И П Павлова Тез докл - 2001 - С 226

13 Шайхутдинова, А Р Влияние хлоргексидина на функциональное состояние периферического нервно-мышечного аппарата / АР Шайхутдинова, А.И. Скоринкин, Е Е Никольский, Р А Гиниатуллин // Растущий организм Адаптация

к физической и умственной нагрузке Тезисы VI Всероссийского научного симпозиума - 2002 - С 176-177

14 Priazhnikov, EG The regularities of blocking of acetylcholine receptor ion channel by oxaphospholene derivatives /EG Priazhnikov, A.I. Skorinkin, R S Garaev, R A Giniatullin // International symposium "Synaptogenesis", Vienna, 5-7 July 2003, P 29

15 Priazhnikov, EG The blocking of acetylcholine leceptor ion channel by oxaphospholene derivatives /EG Priazhnikov, R A Giniatullin, A.I. Skorinkin // EJB -2003 - V 270 - Supplement 1 - P 223

16 Skorinkme, A Bimodal action of protons on ATP currents of rat PC12 cells / A Skonnkine, A Nistri, R Giniatullin //EJB - 2003 - V 270 - Supplement 1 - P 225

17 Скоринкин, А И Модуляция коротких токов, индуцированных АТФ, протонами и ионами цинка / А И Скоринкин, А Нистри, Р А Гиниатуллин П III Съезд биофизиков России Тезисы докладов Том I - 2004 - С 289-290

18 Шайхутдинова, АР Моделирование процесса взаимодействия хлоргексидина биглюконата с постсинаптическими никотиновыми холинорецепторами /АР Шайхутдинова, А.И. Скоринкин, Е Е Никольский // III Съезд биофизиков России Тезисы докладов Том I - 2004 - С 304-305

19 Скоринкин, А И Критерии различения механизмов ингибирования постсинаптических токов / А И Скоринкин, Р А Гиниатуллин // III Съезд биофизиков России Тезисы докладов Том I - 2004 - С 378-379

20 Пряжников, Е Г Двойной механизм блокады никотинового холинорецептора производными 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты / Е Г Пряжников, А И. Скоринкин, Р С Гараев, Р А Гиниатуллин, А О Визель, ЛИ Щукина//Рос физиол журн им ИМ Сеченова - 2004 - Т 90 - № 8 - С 219

21 Скоринкин, А И Действие ганглиоблокатора мекамиламина на нервномышечную передачу теплокровных / А И Скоринкин, А Нистри, Р А Гиниатуллин // Рос физиол журн им И М Сеченова - 2004 - Т 90 - № 8 - С 280

22 Соколова, Е М Агонистзависимое восстановление после десенситизации Р2ХЗ рецепторов сенсорных нейронов /ЕМ Соколова, А.И. Скоринкин, И Е Моисеев, А А Аграчев, А Нистри, РА Гиниатуллин // Рос. физиол журн им И М Сеченова - 2004 - Т 90 - № 8 - С 281

23 Шайхутдинова, А Р Механизм модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином биглюконахом / АР Шайхутдинова, А.И. Скоринкин, Е Е Никольский // Рос физиол журн им И М Сеченова - 2004 - Т 90 - № 8 - С 287

24 Скоринкин, А И Механизмы ингибирования постсинаптических токов / А И Скоринкин // Актуальные проблемы нейробиологии Тезисы лекций - Казань КГМУ - 2005 - С 14-16

25 Скоринкин, А И Механизмы модуляции ионотропных рецепторов ацетилхолина и АТФ / А И Скоринкин // XX Съезд физиологического общества им ИП Павлова Тез докл - 2007 - С 417.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского государственного университета Тираж 100 экз Заказ 36/2

420008, ул Профессора Нужина, 1/37 тел 231-53-59,292-65-60

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Скоринкин, Андрей Иванович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Типология лиганд-управляемых ионных каналов

2.2. Ионотропные холинорецепторы

2.3. Ионотропные рецепторы АТФ.

2.4. Антагонисты ионотропных рецепторов. Типы антагонистов. Блокаторы.

2.5. Аллостерическая модуляция работы лиганд-управляемых ионных каналов.

2.6. Десенситизация ионотропных рецепторов

2.7. Математическое моделирование работы ионотропных рецепторов.

2.7.1. Дифференциальные модели

2.7.1.1. Дифференциальные модели, не учитывающие диффузию.

2.7.1.1.1. Математическое моделирование статических состояний.

2.7.1.1.2. Математическое моделирование динамики переходов рецепторов из состояния в состояние

2.7.1.2. Дифференциальные модели в частных производных, учитывающие диффузию.

2.7.2. Математическое моделирование молекулярной динамики

2.7.3. Возможности и ограничения существующих моделей

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования.

3.1.1. Нервно-мышечное соединение холоднокровных

3.1.2. Хромаффинные клетки

3.1.3. Клетки феохромоцитомы РС12.

3.1.4. Сенсорные нейроны крыс.

3.1.5. Мышечные клетки крыс С2С

3.2. Системы перфузии и растворы

3.3. Электрофизиологические исследования

3.3.1. Внутриклеточная регистрация токов концевой пластинки

3.3.2. Внутриклеточная регистрация токов изолированных клеток

3.4. Обработка экспериментальных результатов

3.4.1. Статистическая обработка экспериментальных результатов

3.4.2. Аппроксимация зависимостей доза-эффект

3.4.3. Анализ глубины места связывания блокатора в канале.

3.5. Моделирование кинетики функционирования ионотропных рецепторов.

3.5.1. Кинетическая модель ионотропного холинорецептора

3.5.2. Реконструкция динамики изменения концентрации ацетилхолина в синаптической щели.

3.5.3. Зональный выброс ацетилхолина

3.5.4. Подача растворов.

3.5.5. Математические модели рецепторов АТФ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Исследование механизмов модуляции работы ионотропных холинорецепторов.

4.1.1. Исследование механизмов модуляции работы ионотропных холинорецепторов мышечного типа у холоднокровных.

4.1.1.1. Влияние мекамиламина на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного типа.

4.1.1.1.1. Экспериментальное исследование

4.1.1.1.2. Модельное исследование.

4.1.1.2. Влияние производных 1,1-диметил-З-оксобутил-фосфоновой кислоты на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного типа.

4.1.1.2.1. Экспериментальное исследование

4.1.1.2.2. Модельное исследование.

4.1.1.3. Влияние хлоргексидина на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного типа.

4.1.1.3.1. Экспериментальное исследование

4.1.1.3.2. Модельное исследование.

4.1.2. Влияние мекамиламина на функционирование никотиновых холинорецепторов нейронального типа.

4.1.2.1. Экспериментальное исследование.

4.1.2.2. Модельное исследование.

4.1.3. Влияние мекамиламина на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного типа у теплокровных

4.1.3.1. Экспериментальное исследование.

4.1.3.2. Модельное исследование.

4.2. Исследование механизмов модуляции работы ионотропных рецепторов АТФ

4.2.1. Исследование механизма влияния рН на функционирование

4.2.1.1. Экспериментальное исследование.

4.2.1.2. Модельное исследование.

4.2.2. Исследование процесса десенситизации Р2Хз

4.2.2.1. Экспериментальное исследование.

4.2.2.2. Модельное исследование.

4.3. Модельный анализ экспериментально проверяемых критериев различения механизмов ингибирования трансмембранных токов

4.3.1. Особенности ингибирующего действия конкурентных блокаторов.

4.3.2. Особенности ингибирующего действия блокаторов открытого канала.

4.3.2.1. Быстрые блокаторы открытого канала.

4.3.2.2. Медленные блокаторы открытого канала.

4.3.2.3. Средние блокаторы открытого канала.

4.3.3. Особенности ингибирующего действия блокаторов открытого канала с ловушечным механизмом.

4.3.3.1. Блокаторы открытого канала с ловушечным механизмом, не меняющие кинетику работы канала

4.3.3.2. Блокаторы открытого канала с ловушечным механизмом, ускоряющие закрытие канала

4.3.3.3. Блокаторы открытого канала с ловушечным механизмом, замедляющие закрытие канала.

4.3.4. Особенности ингибирующего действия аллостерических модуляторов

4.3.4.1. Аллостерические модуляторы, ускоряющие возврат из открытого состояния в свободное

4.3.4.2. Аллостерические модуляторы, замедляющие возврат из открытого состояния в свободное

4.3.5. Особенности ингибирующего действия ускорителей десенситизации

4.3.5.1. Последовательная схема десенситизации.

4.3.5.2. Бифуркационная схема десенситизации

4.3.5.3. Циклическая схема десенситизации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы модуляции работы ионотропных рецепторов ацетилхолина и АТФ"

Актуальность исследования. Исследование механизмов модуляции процесса межклеточной передачи электрических сигналов в нервной системе представляет собой одну из актуальных проблем современной нейрофизиологии. Без глубокого изучения этих механизмов невозможно понять фундаментальные свойства синаптической пластичности в нервной системе и оказать целенаправленное воздействие на синаптическую передачу.

Постсинаптическая мембрана, содержащая ионотропные рецепторы для разных нейротрансмиттеров, представляет собой одну из мишеней для действия эндогенных и экзогенных синаптических модуляторов. На постсинаптическом уровне синаптическая пластичность определяется состоянием рецепторно-канальных комплексов, кинетика активации которых выделяющимся из нервного окончания медиатором определяет амплитудно-временные параметры, постсинаптического ответа (Colquhoun, 1981). Физиологически активные соединения, многие из которых применяются в клинической практике, могут модифицировать состояние рецепторно-канального комплекса посредством разных механизмов воздействия как на сам комплекс, так и на его липидное окружение (Changeux et al., 1998; Ralevic and Burnstock, 1998; Quick and Lester, 2002; North, 2002). Понимание молекулярных механизмов взаимодействия физиологически активных соединений с рецепторно-канальными комплексами постсинаптической мембраны необходимо для более эффективного прогнозирования последствий действия этих соединений на состояние синаптической передачи при различных режимах работы нервно-мышечного аппарата.

Модуляция синаптической передачи на постсинаптическом уровне в физиологических условиях или ее нарушение при патологических процессах в нервной системе может реализоваться за счет нескольких принципиально разных механизмов. Главными постсинаптическими ингибиторными механизмами, относительно хорошо изученными на примере рецепторов, активируемых глутаматом, ГАМК или ацетилхолином, являются блокада активного центра рецептора или его ионного канала, десенситизация и аллостерическая модуляция (Гиниатуллин, Магазаник, 1998; Colquhoun, 1998; Tikhonov, Magazanik, 1998; Quick, Lester, 2002; North, 2002, 2004; Zhorov, Tikhonov, 2004; Changeux, Edelstein, 2005). Тем не менее, даже для этих давно и хорошо изученных рецепторов молекулярные механизмы процессов блокады, десенситизации и аллостерической модуляции во многом остаются недостаточно исследованными. Наиболее же слабо изученной является модуляция относительно недавно открытых (Ralevic, Burnstock, 1998) ионотропных рецепторов, активируемых внеклеточным АТФ.

Несмотря на известное деление антагонистов рецепторов на «конкурентные» и «неконкурентные», а агентов, взаимодействующих с ионным каналом - на блокаторы открытого и закрытого ионного канала, не существует общепризнанной всеохватывающей классификации антагонистов. Ситуация усложняется тем, что многие антагонисты одновременно проявляют черты блокаторов разных типов, взаимодействуя, по-видимому, с различными сайтами одного рецептора (Colquhoun, 1981). Мало изучены так называемые блокаторы открытого канала ловушечного типа, способные оставаться в ионном канале при его закрытии (Lingle, 1983; Gurney, Rang, 1984). В первых кинетических моделях ловушечного механизма блокады (Lingle, 1983; Blanpied et al., 1997) предполагалось, что рецептор с находящимся в канале блокатором имеет такую же аффинность к агонисту и динамику открытия-закрытия канала, как и рецептор без блокатора. Но позднее появились работы (Dilmore, Johnson, 1998; Giniatullin et al., 2000), указывающие на возможное изменение свойств рецептора в блокированном состоянии.

К настоящему времени описаны три принципиальные модели процесса десенситизации ионотропных рецепторов: циклическая (Katz, Thesleff, 1957; Auerbach, Akk, 1998; Dudel, Heckmann, 1999), дивергентная (Jones, Westbrook, 1995; Jones et al., 1998) и последовательная (Rettinger, Schmalzing,

2003). Во многих случаях основания для выбора между этими моделями неясны, поскольку не установлены принципиальные различия и ограничения этих моделей. Кроме того, используются схемы десенситизации, включающие в себя черты сразу нескольких моделей (Burkat et al., 2001; Dilger, 2002; Elenes, Auerbach, 2002; Robert, Howe, 2003; Celentano, Hawkes,

2004), что еще более затрудняет анализ механизмов.

Известно, что некоторые модуляторы ионных каналов осуществляют свой эффект через липидную фазу клеточной мембраны (Trudeil, Bertaccini, 2002). Можно ожидать, что такой модулятор может специфически блокировать ионный канал или аллостерически модулировать работу рецептора через липид-зависимый центр связывания или неспецифически менять свойства самой мембраны (Bouzat, Barrantes, 1996; Arias, 1998; 1999). Характерным свойством этой группы веществ, действующих через липидную фазу, во многих случаях является медленная обратимость их эффекта (Anderson, 1993; Kukita, Mitaku, 1993; На, Fryer, 1997). Раскрытие механизмов, обусловливающих длительную модуляцию постсинаптических токов, актуально как для фундаментальной нейрофизиологии, так и для практической медицины, так как даст основания для целенаправленного поиска фармакологических препаратов, обеспечивающих надежное повышение или понижение эффективности синаптической передачи за счет влияния на кинетику и чувствительность постсинаптических рецепторов.

Поскольку одним из ведущих механизмов обеспечения синаптической пластичности на постсинаптическом уровне является модуляция амплитудно-временных характеристик постсинаптических ответов, которая определяется параметрами активации рецепторно-канальных комплексов хеморецептивной мембраны, то для эффективной оценки изменения пластических свойств синаптического контакта при действии различных физиологически активных веществ необходима разработка алгоритма, позволяющего по определенным признакам классифицировать ингибиторы постсинаптического типа действия как блокаторы, ускорители десенситизаии или аллостерические модуляторы. Для разработки такого алгоритма необходимо сопоставить экспериментальные и модельные параметры активации рецепторно-канальных комплексов при действии ряда веществ, применяемых в клинической практике и обладающих постсинаптическими эффектами.

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования является выяснение механизмов ингибирования ионотропных рецепторов, активируемых ацетилхолином и АТФ.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследование эффектов применяемых в клинической практике веществ мекамиламина, хлоргексидина, демифосфона и иных производных 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты на функционирование никотиновых холинорецепторов мышечного и нейронального (СС3Р4) типов.

2. Исследование механизма действия ионов водорода на функционирование ионотропных рецепторов АТФ.

3. Исследование механизмов десенситизации ионотропных рецепторов

АТФ.

4. Создание кинетических моделей, описывающих функцию рецепторов, активируемых ацетилхолином и АТФ, и механизмы действия постсинаптических ингибиторов разного типа.

5. Разработка алгоритма, позволяющего выявить молекулярный механизм действия ингибиторов постсинаптического типа (конкурентный антагонист, неконкурентный антагонист, блокатор «ловушечного» типа, аллостерический модулятор).

Научная новизна. Впервые проведен комплексный (экспериментальный и модельный) анализ различных механизмов ингибирования ионотропных холинорецепторов и рецепторов АТФ и разработана концепция различения механизмов депрессии трансмембранных токов. Кроме того, впервые получен ряд более частных научных результатов.

Так, впервые получены экспериментальные доказательства того, что наличие блокатора в закрытом канале холинорецептора меняет динамику открытия-закрытия этого канала. Показано, что ингибиторная равновесная константа для каналоблокаторов зависит от концентрации агониста, что ранее не учитывалось при сравнении их действия. Впервые показан двойной — каналоблокирующий и аллостерический — механизм действия ряда модуляторов холинорецепторов. Впервые установлено, что повышение ионами водорода аффинности ионотропных Р2Х2 рецепторов АТФ может приводить к разнонаправленным эффектам — активирующему или ингибирующему, в зависимости от действующей концентрации агониста. Предложен молекулярный механизм этих эффектов, заключающийся в наличии агонистзависимого инактивированного состояния у Р2Х2 рецепторов, придающего специфические свойства этому подтипу рецепторов. Показано, что подпороговые концентрации АТФ, не вызывающие активации рецепторов, способны прямо переводить ионотропные рецепторы АТФ подтипа Р2Х3 в десенситизированное состояние. Впервые показано, что скорость восстановления этих рецепторов после десенситизации зависит от типа и концентрации вызвавшего десенситизацию агониста.

Научно-практическая ценность. Основное значение проведенного исследования состоит в получении набора экспериментальных критериев, позволяющих различить механизмы ингибирующего действия биологически активных веществ на синаптическую передачу. Известно, что ингибиторные эффекты с разным механизмом действия часто бывают сходны и необходимо найти экспериментальные условия, при которых различия в механизмах могли бы проявиться. Так, для всех веществ, взаимодействующих с открытым ионным каналом, характерна зависимость скорости и степени их действия от частоты открывания каналов. Такая зависимость от активации отсутствует у аллостерических модуляторов, взаимодействующих с местами связывания на внешней части рецепторно-канального комплекса, их эффект зависит только от времени действия вещества и может развиваться даже в отсутствие агониста, то есть при закрытых ионных каналах. На развитие эффекта аллостерических модуляторов и его ослабление при отмывании вещества также не влияет изменение концентрации агониста, которое сильно влияет на развитие эффекта блокаторов каналов и его ослабление при отмывании. Б локаторы каналов ловушечного типа не отмываются в отсутствие агониста, т.е. без открывания блокированных каналов. Проверка эффектов в указанных экспериментальных условиях вместе с анализом времени спада вызываемых агонистом ионных токов позволяют однозначно различить механизмы ингибирующего действия веществ на синаптическую передачу.

Некоторые положения работы представляют практический интерес. В частности, получены доказательства того, что часто используемый для оценки действия блокаторов параметр - ингибиторная равновесная константа - зависит от концентрации применяемого для получения трансмембранных токов агониста. Эта зависимость может быть использована для более тонкой характеристики влияния блокаторов на процесс синаптической передачи. Способность низких концентраций агониста переводить Р2Хз рецепторы в десенситизированное состояние может быть использована для разработки аналгетиков нового типа, особенно важных при хронических болях, в патогенез которых вовлечен этот подтип АТФ рецепторов. При сопоставлении механизмов веществ, применяемых в клинической практике (мекамиламина, хлоргексидина, демифосфона) установлено, что они являются блокаторами холинорецепторного комплекса с разными механизмами действия, включающими медленное блокирование открытого ионного канала, блокирование канала по «ловушечному» типу и аллостреческую модуляцию рецепторно-канального комплекса.

Полученные данные о влиянии физиологически активных веществ на кинетику работы рецепторно-канальных комплексов, приводящем к изменению амплитудно-временных параметров многоквантового постсинаптического ответа, могут служить основанием для целенаправленного поиска и синтеза лекарственных препаратов. Особенно перспективными представляются медленно отмывающиеся ингибиторы, способные накапливаться в синапсе и оказывать на него пролонгированное ингибиторное действие.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на конференциях КГУ (Казань, 1999 - 2006); КИББ КазНЦ РАН (Казань, 2003 -2006); V, VI, VII и IX Всероссийских школах молодых ученых по актуальным проблемам нейробиологии (Казань, 1998, 1999, 2000, 2005); V и VI Всероссийских научных симпозиумах «Растущий организм: Адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2000, 2002); XI, XII и XIII Всероссийских конференциях по структуре и динамике молекулярных систем (Москва-Казань-Йошкар-Ола, 2004, 2005, 2006); IV Международной конференции по математическому моделированию (Москва, 2000); Международной конференции по синаптической передаче (Рим, 2000); Международной школе по синаптической передаче (Киев, 2000); Международной конференции по синаптогенезу (Вена, 2003); Международной конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Брюссель, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); XVIII, XIX и XX Съездах Всероссийского Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004; Москва 2007).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Скоринкин, Андрей Иванович

6. ВЫВОДЫ

1. Проведен систематический анализ молекулярных механизмов действия вызывающих депрессию постсинаптического тока веществ, некоторые из которых (мекамиламин, димефосфон, хлоргексидин) применяются в клинической практике. Показано, что депрессия постсинаптического тока вследствие ингибирования ионотропных холинорецепторов и рецепторов АТФ реализуется путем усиления их десенситизации или рН-зависимой инактивации, аллостерической модуляцией через сайты, доступные из водной или липидной фазы, конкурентной блокадой или блокадой ионных каналов.

2. Анализ кинетической схемы, разработанной на основе полученных экспериментальных данных, показал, что мекамиламин является блокатором ловушечного типа ионных каналов холинорецепторов и способен ускорять закрытие канала при нахождении внутри него.

3. Сопоставление экспериментальных данных и результатов математического моделирования показало, что в основе угнетающего постсинаптического действия эфиров 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты и хлоргексидина лежит двойной механизм, включающий аллостерическое и каналоблокирующее действие на ионотропные холинорецепторы.

4. Сопоставление экспериментальных и модельных данных позволило показать, что двойной - потенциирующий и ингибирующий - эффект рН на Р2Х2 объясняется повышением сродства рецепторов к АТФ во всех местах его присоединения.

5. Сопоставление экспериментальных данных и результатов математического моделирования показало, что особенности эффектов агонистов пуриновых рецепторов Р2ХЗ типа (чувствительность к агонисту, скорость восстановления после десенситизации, высокоаффинная десенситизация) обусловлены в основном разной скоростью их диссоциации от рецептора.

6. Математическое моделирование кинетики взаимодействия рецепторов с агонистами и ингибиторами показало, что каждый из исследованных механизмов ингибирования (конкурентная блокада, каналоблокада, аллостерическая модуляция, ускорение десенсетизации) имеет свои характерные особенности в отношении влияния на основные характеристики постсинаптических токов. Для однозначной классификации ингибирующих постсинаптический ток веществ по молекулярному механизму их действия необходимо учитывать: направление и величину изменения под действием ингибитора постоянной времени спада агонист-индуцированных токов; зависимость развития изменений и скорости отмывки эффекта вещества от длительности его воздействия, количества активаций и частоты активации рецепторов; наличие и условия возникновения ситуаций временного восстановления рецепторов.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количество веществ, способных модулировать работу лиганд-управляемых ионных каналов, очень велико. Это связано с громадным разнообразием как типов и подтипов самих каналов, так и механизмов воздействия на них биологически активных веществ. Даже если ограничиться рассмотрением только веществ, ингибирующих постсинаптические токи, то это могут быть и блокаторы разных типов, и аллостерические модуляторы, и ускорители десенситизации. Важной разновидностью блокирования каналов является блок ловушечного типа, присущий многим широко используемым химическим соединениям, но требующий для своего выявления сочетания деполяризации и активации канала. То есть самого факта уменьшения амплитуд агонист-индуцированных токов под действием какого-то вещества недостаточно для определения механизма его действия.

В данной работе используемые для различения механизмов действия веществ модельные расчеты велись параллельно с классическими электрофизиологическими исследованиями, что нашло свое отражение в построении диссертации. Новые экспериментальные данные учитывались при моделировании, так же как модельные результаты служили для разработки новых экспериментальных протоколов. Результаты расчетов нигде не использовались как окончательное доказательство, предсказания моделей всегда сопоставлялись с разнообразными экспериментальными данными и только существенное совпадение служило основанием для представления модели в качестве научной гипотезы. Все модели строились с конкретными целями, для объяснения парадоксов, обнаруженных в экспериментах. За счет такого сочетания в исследовании обоих объектов, никотинового холинорецептора и рецептора АТФ, был достигнут существенный прогресс.

Было показано, что ганглиоблокатор мекамиламин вызывает блок ионных каналов мышечного ацетилхолинового рецептора в миотубулах крысы (Ю50 — 8.1 мкмоль при -70 мВ) и в нервно-мышечном соединении лягушки (1С50 - 7.7 мкмоль при -70 мВ). Деполяризация постсинаптической мембраны в сочетании с активацией холинорецепторов экзогенным или эндогенным ацетилхолином вызывает частичное разблокирование каналов, указывая на блок каналов ловушечного типа. Ловушечный тип блокады с большей аффинностью (ГС50 — 0.34 мкмоль при -70 мВ) наблюдается также при действии мекамиламина на нейрональные холинорецепторы хромаффинных клеток, что свидетельствует об общем типе блокирования этим агентом никотиновых холинорецепторов разного типа. Расчет глубины зоны связывания мекамиламина в ионном канале выявил более глубокое ее расположение у нейрональных рецепторов (8 = 0.72) чем у мышечных (8 = 0.37), что свидетельствует о разном расположении структурных детерминант, определяющих блокирующий эффект мекамиламина. Математическое моделирование подтвердило, что потенциалзависимые блокирующие эффекты мекамиламина объясняются его способностью оставаться в ионном канале холинорецептора при закрытии канала, который в этом случае закрывается быстрее, чем ионный канал без блокатора.

В нервно-мышечном соединении лягушки четыре эфира 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты с растущей липофильностью вызывают уменьшение амплитуды и длительности токов концевой пластинки. Эти ингибиторные эффекты возрастают по мере роста липофильности соединений, что свидетельствует об аллостерическом действии эфиров на холинорецептор со стороны пограничного липидного слоя. Данные соединения проявляют также каналоблокирующие свойства, но не способны блокировать открытый ионный канал по ловушечному типу. По мере роста липофильности эфиров возрастает вклад аллостерического механизма действия в общий ингибиторный эффект и замедляется кинетика блокирования открытого канала.

Антибактериальный агент хлоргексидин вызывает уменьшение амплитуды (1С50 = 4.7 мкмоль при -70 мВ) и постоянной времени спада токов концевой пластинки лягушки. Ингибиторный эффект хлоргексидина возрастает при повышении частоты раздражений двигательного нерва. На фоне развившегося эффекта хлоргексидина деполяризация постсинаптической мембраны в сочетании со стимуляцией нерва вызывает частичное разблокирование ионных каналов холинорецептора. Математическое моделирование привело к заключению о наличии двойного - аллостерического и каналоблокирующего - эффекта хлоргексидина.

Закисление среды (рН < 6.4) вызывает противоположно направленные изменения ответов ионотропных Р2Х2 рецепторов клеток феохромоцитомы крыс на аппликацию низких или высоких концентраций АТФ. При концентрации АТФ <100 мкмоль наблюдается потенциация, а при АТФ > 1 ммоль — депрессия токов. Депрессия сочетается со вторичной волной тока на прекращение аппликации АТФ. Анализ кинетики показал, что как потенциация, так и депрессия, сопровождаются усилением сродства Р2Х2 рецепторов к АТФ. Поэтому при действии высоких концентрациях агониста, потенциирующий эффект АТФ сменяется инактивацией Р2Х2 рецепторов, выход из которой через открытое состояние канала вызывает вторичный токовый ответ.

Аппликация АТФ или его синтетических аналогов а,$-теАТФ, |3,у-шеАТФ и 2те8-АТФ на сенсорные нейроны крыс и мышей, экспрессирующих Р2Х3 рецепторы, вызывает токи, быстро десенситизирующиеся в присутствии агониста. Восстановление Р2Х3 рецепторов после десенситизации, является медленным процессом, зависимым от природы агониста. Феномен агонист-зависимой десенситизации воспроизводится при использовании кольцевой кинетической модели, предполагающей различное сродство десенситизированных рецепторов к разным агонистам. Процесс восстановления Р2Х3 рецепторов после десенситизации имеет сигмоидальную зависимость от времени, что объясняется наличием нескольких промежуточных состояний рецептора на пути восстановления. Математическое моделирование показало, что эти промежуточные состояния лимитируют скорость восстановления рецепторов и обеспечивают сигмоидальную форму восстановления.

Аппликация на сенсорные нейроны крысы подпороговых наномолярных концентраций АТФ вызывает развитие высокоаффинной десенситизации. Механизм высокоаффинной десенситизации состоит из двух компонентов: прямого перехода рецепторов в десенситизированное состояние из состояния с закрытым каналом и торможения восстановления за счет высокоаффинного связывания агониста с десенситизированными рецепторами. Высокоаффинная десенситизация может снижать чувствительность ноцицептивных сенсорных нейронов к эндогенным пуринам — медиаторам боли.

В ходе изучения механизма действия конкретных веществ на лиганд-управляемые ионные каналы были получены также результаты, имеющие принципиальное теоретическое значение — принципы различения механизмов действия ингибиторов лиганд-управляемых ионных каналов. Точное определение механизма (или — в некоторых случаях — механизмов) действия вещества имеет как большое фундаментальное, так и важное прикладное значение. С одной стороны, именно точное знание механизма действия вещества позволяет использовать это вещество как инструмент исследования лиганд-управляемых ионных каналов. С другой стороны, точное знание механизма действия лекарственного вещества позволяет предсказать все возможные последствия его применения в различных ситуациях. Таким образом, наряду с углублением фундаментальных научных знаний о строении, механизмах функционирования и путях регуляции работы ионных каналов, полученные выводы могут быть использованы при тестировании новых препаратов для медицинской практики.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Скоринкин, Андрей Иванович, Пущино

1. Арбузов, Б.А. О некоторых реакциях фосфорсодержащих гетероциклов / Б.А. Арбузов, А.О. Визель, K.M. Ивановская // Химия гетероциклических соединений.- Рига, 1967.- С. 1130.

2. Волкова, И.Н. Блокирование потенциалов действия и сокращения скелетной мышцы лягушки поперечным рассечением / И.Н. Волкова, Е.Е. Никольский, Г.И. Полетаев // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 1975.- Т. 6.- С. 1433-1436.

3. Гараев, P.C. К вопросу о токсичности и антихолинэстеразной активности некоторых продуктов превращений оксофосфаленов / P.C. Гараев, И.А. Студенцова // Современные методы исследования в клинике и эксперименте: Труды КГМИ.- Казань, 19696.- С. 410-413.

4. Гиниатуллин P.A. Постсинаптические эффекты субстанции Р в нервно-мышечном синапсе лягушки / P.A. Гиниатуллин, A.JI. Зефиров, Л.Г. Магазаник, С.Ф. Ощепкова//Нейрофизиология.- 1991.- Т. 23.- С. 436-441.

5. Гиниатуллин, P.A. Влияние димефосфона на динамику внутриклеточного кальция / P.A. Гиниатуллин, P.P. Гиниатуллина, Е.М. Соколова и др. // Казан, мед. журн.- 2001.- № 2.- С. 132-135.

6. Гиниатуллин, P.A. Играет ли физиологическую роль десенситизация холинорецепторов в нервно-мышечном синапсе? / P.A. Гиниатуллин, Л.Г.

7. Магазаник// Российский физиологический журнал.- 1998.- Т. 84.- С. 3-14.

8. Зиганшина, JI.E. Механизмы действия димефосфона / JT.E. Зиганшина, И.А. Студенцова, А.У. Зиганшин // Клин, и эксперим. Фармакология.- 1992.- № 2.- С. 87-95.

9. Корниш-Боуден, Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден.- М.: Мир, 1979,- 280 с.

10. Магазаник, Л.Г. Влияние некоторых мембранных стабилизаторов на функцию нервно-мышечного синапса / Л.Г. Магазаник // Физиол. журн. СССР.-1971.- Т. 57.- С. 1313-1321.

11. Магазаник, Л.Г. Влияние симпатомиметических аминов на десенситизацию постсинаптической мышечной мембраны к действию ацетилхолина / Л.Г. Магазаник // Физиол. журн. СССР.- 1969.- Т. 55.- С. 11471155.

12. Магазаник, Л.Г. Математическое моделирование факторов, определяющих временной ход миниатюрных постсинаптических токов в мышцах лягушки / Л.Г. Магазаник, В.А. Снетков, Н.Р. Нигматуллин, Е.Е. Никольский // Доклады АН СССР.- 1986.- Т. 296.- С. 733-737.

13. Магазаник, Л.Г. О механизме действия SKF-525A на нервно-мышечный синапс / Л.Г. Магазаник // Бюл. эксперим. биол. мед.- 1970.- Т. 81.-С. 10-13.

14. Пудовик, А.Н. Присоединение диалкилфосфористых кислот к a,ß-непредельным кетонам алифатического ряда / А.Н. Пудовик // Журн. общ. химии.- 1957.-№8.-С. 1371-1377.

15. Святкина, О.Б. Патогенетическое значение структурно-функциональных изменений мембран иммунокомпетентных клеток ивозможности их коррекции при атопической бронхиальной астме у детей / О.Б. Святкина // Автореф. дис. . д-ра мед. Наук.- Москва, 1987.

16. Скоринкин, А.И. Критерии различения механизмов ингибирования постсинаптических токов / А.И. Скоринкин, Р.А. Гиниатуллин // Структура и динамика молекулярных систем: Сборник статей.- 2004.- Выпуск XI.- Часть II.-С. 180-183.

17. Снетков, В.А. Моделирование действия блокаторов ионных каналов на постсинаптические токи / В.А. Снетков, Н.Р. Нигматуллин, Е.Е. Никольский, Л.Г. Магазаник//Нейрофизиология.- 1989.- Т. 21.- С. 476-484.

18. Студенцова, И. А. Гипотермическое действие некоторых фосфорорганических соединений / И.А. Студенцова, Р.С. Гараев // Фармакология и токсикология.- 1970.- № 2.- С. 227-230.

19. Студенцова, И.А. Изучение антиацидотической активности димефосфона / И.А. Студенцова, И.В. Заиконникова, А.О. Визель, Р.С. Гараев // Казан, мед. журн.- 1989.- № 2.- С. 118-120.

20. Уткин, Ю.Н. Альфа-нейротоксины и альфа-конотоксины блокаторы никотинового холинорецептора / Ю.Н. Уткин, И.Е. Кашеверов, В.И. Цетлин // Биоорг. Химия.- 1999.- Т. 25.- № 11.- С. 805-810.

21. Хазипов, Р.Н. Закономерности блокирования ионного канала холинорецептора производными оксафосфоланола / Р.Н. Хазипов, Х.С. Хамитов, Р.А. Гиниатуллин, Р.С. Гараев // Биол. мембраны.- 1990.- Т. 7.- С. 1001-1007.

22. Adair, G.S. The hemoglobin system. VI. The oxygen dissociation curve of hemoglobin / G.S. Adair // J. Biol. Chem.- 1925.- V. 63.- P. 529-545.

23. Adams, B.A. Temperature and synaptic efficacy in frog skeletal muscle /

24. B.A. Adams // J. Physiol.- 1989.- V. 408.- P. 443-455.

25. Adams, P.R. A model for the procaine end-plate current / P.R. Adams // J. Physiol.- 1975.- V. 246.- P. 61-63.

26. Akasu, T. 5-Hydroxytryptamine decreases the sensitivity of nicotinic acetylcholine receptor in bull-frog sympathetic ganglion cells / T. Akasu, K. Koketsu // J. Physiol.- 1986.- V. 380.- P. 93-109.

27. Akasu, T. Substance P modulates the sensitivity of the nicotinic receptor in amphibian cholinergic transmission / T. Akasu, M. Kojima, K. Koketsu // Br. J. Pharmacol.- 1983.-V. 80.-P. 123-131.

28. Albuquerque, A.A. Role of mast cell- and non-mast cell-derived inflammatory mediators in immunologic induction of synaptic plasticity / A.A. Albuquerque, J.H. Leal-Cardoso, D. Weinreich // Braz. J. Med. Biol. Res.- 1997.- V. 30.-№ 7.-P. 909-912.

29. Allosteric modulation and accelerated resensitization of human P2X3 receptors by cibacron blue / K. Alexander, W. Niforatos, B. Bianchi et al. // JPET.-1999.-V. 291.- P. 1135-1142.

30. Anderson, G.P. Formoterol: Pharmacology, molecular basis of agonism,and mechanism of long duration of a highly potent and selective beta 2-adrenoceptor agonist bronchodilator / G.P. Anderson // Life Sci.- 1993,- V. 52.- № 26.- P. 21452160.

31. Anglister, L. Acetylcholinesterase density and turnover number at frog neuromuscular junctions, with modeling of their role in synaptic function / L. Anglister, J.R. Stiles, M.M. Salpeter // Neuron.- 1994.- V. 12.- P. 783-794.

32. Aprison, M.H. Comparison of binding mechanisms at cholinergic, serotonergic, glycinergic and GABAergic receptors / M.H. Aprison, E. Galvez-Ruano, K.B. Lipkowitz // J. Neurosci. Res.- 1996,- V. 43.- N 2.- P. 127-136.

33. Arias, H.R. Agonist self-inhibitory binding site of the nicotinic acetylcholine receptor: Mini review / H.R. Arias // J. Neurosci. Research.- 1996.- V. 44.- P. 97-105.

34. Arias, H.R. Binding sites for exogenous and endogenous non-competitive inhibitors of the nicotinic acetylcholine receptor / H.R. Arias // Biochim. Biophys. Acta .- 1998a.- V. 1376.- P. 173-220.

35. Arias, H.R. Noncompetitive inhibition of nicotinic acetylcholine receptors by endogenous molecules / H.R. Arias // J. Neurosci. Research.- 1998b.- V. 52.- P. 369-379.

36. Arias, H.R. Role of local anesthetics on both cholinergic and serotonergic ionotropic receptors / H.R. Arias // Neurosci. Biobehav. Rev.- 1999.- V. 23.- P. 817843.

37. Ascher, P. Studies on the mechanism of action of acetylcholine antagonists on rat parasympathetic ganglion cells / P. Ascher, W.A. Large, H.P. Rang // J. Physiol.- 1979,- V. 295.- P. 139-170.

38. Auerbach, A. Desensitization of mouse nicotinic acetylcholine receptorchannels: A two-gate mechanism / A. Auerbach, G. Akk // J. Gen. Physiol.- 1998.- V. 112.-P. 181-197.

39. Baker, T.S. Continuous approximation with embedded Runge-Kutta methods / T.S. Baker, J.R. Dormand, J.P. Gilmore, P.J. Prince // Appl. Numl. Math.-1996,- V. 22.- P. 51-62.

40. Bambrick, L. Neurotoxins in the study of neural regulation of membrane proteins in skeletal muscle / L. Bambrick, T. Gordon // J. Pharmacol. Toxicol. Methods.- 1994.- V. 32.- № 3.- P. 129-138.

41. Barford, D The allosteric transition of glycogen phosphorylase / D. Barford, L.N. Johnson//Nature.- 1989.- V. 340.- P. 609-616.

42. Bartol, T.M. Monte Carlo simulation of miniature endplate current generation in the vertebrate neuromuscular junction / T.M. Bartol Jr, B.R. Land, E.E. Salpeter, M.M. Salpeter//Biophys. J.- 1991.- V. 59,- P. 1290-1307.

43. Beam, K.G. A voltage-clamp study of the effect of two lidocaine derivatives on the time course of the end-plate currents / K.G. Beam // J. Physiol.-1976,-V. 252.- P. 279-300.

44. Bennett, M.R. Synaptic transmission at visualized sympathetic boutons: Stochastic interaction between acetylcholine and its receptors / M.R. Bennett, L. Farnell, W.G. Gibson, N.A. Lavidis // Biophys. J.- 1997.- V. 72.- P. 1595-1606.

45. Paradoxical allosteric effects of competitive inhibitors on neuronal alpha7 nicotinic receptor mutants / S. Bertrand, A. Devillers-Thiery, E. Palma et al. // Neuroreport.- 1997.- V. 8.- № 16.- P. 3591-3596.

46. Black, J.W. Operational models of pharmacological agonism / J.W. Black, P. Leff// Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 1983.- V. 220.- P. 141-162.

47. Blackman, J.G. Actions of mecamylamine, dimecamine, pempidine and their two quaternary metho-salts at the neuromuscular junction / J.G. Blackman, C. Ray // Br. J. Pharmacol. Chemother.- 1964.- V. 22.- P. 56-65.

48. Blanpied, T.A. Trapping channel block of NMDA-activated responses by amantadine and memantine / T.A. Blanpied, F.A. Boeckman, E. Aizenman, J.W.

49. Johnson // J. Neurophysiol.- 1997.- V. 77.- P. 309-323.

50. Desensitization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors conferred by N-terminal segments of the b2 subunit / S. Bohler, S. Gay, S. Bertrand et al. // Biochemistry.- 2001.- V. 40.- P. 2066-2074.

51. Boue-Grabot, E. A protein kinase C site highly conserved in P2X subunits controls the desensitization kinetics of P2X(2) ATP-gated channels / E. Boue-Grabot, V. Archambault, P. Seguela // J. Biol. Chem.- 2000.- V. 275.- P. 10190-10195.

52. Bouzat, C. Modulation of muscle nicotinic acetylcholine receptors by the glucocorticoid hydrocortisone: Possible allosteric mechanism of channel blockade /

53. C. Bouzat, F.J. Barrantes // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271, № 42.- P. 25835-25841.

54. Bowie, D. Functional stoichiometry of glutamate receptor desensitization /

55. D. Bowie, G.D. Lange // J. Neurosci.- 2002.- V. 22.- № 9.- P. 3392-3403.

56. Boyd, N.D. Kinetics of binding of H acetylcholine and H carbamylcholine to Torpedo postsynaptic membranes: Slow conformational transitions of the cholinergic receptor / N.D. Boyd, J.B. Cohen // Biochemistry.-1980.-V. 19.-P. 5344-5358.

57. Boyd, N.D. Two distinct kinetic phases of desensitization of acetylcholine receptors of clonal ratPC12 cells / N.D. Boyd//J. Physiol.- 1987.- V. 389.- P. 45-67.

58. Brake, A.J. New structural motif for ligand-gated ion channels defined by an ionotropic ATP receptor /A.J. Brake, M.J. Wagenbach, D. Julius // Nature.- 1994.-V. 371.- P. 519-523.

59. Brammar, W.J. Nicotinic acetylcholine-gated integral receptors-channels /

60. E.C. Conley, W.J. Brammar // The ion channel FactsBook: I: Extracellular ligand-gated channels.- London, San Diego: Academic Press, 1996.- Entry 09.- P. 234-292.

61. Briggs, C.A. Activation and inhibition of the human a7 nicotinicacetylcholine receptor by agonists / C.A. Briggs, D.G. McKenna // Neuropharmacology.- 1998.- Y. 37.- P. 1095-1102.

62. Bruno, W.J. Using independent open-to-closed transitions to simplify aggregated Markov models of ion channel gating kinetics / W.J. Bruno, J. Yang, J.E. Pearson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005.- V. 102.- P. 6326-6331.

63. Buchman, E. A theoretical experimental method to determine the locus of desensitization / E. Buchman, H. Parnas // Bull. Math. Biol.- 1999.- V. 61.- P. 963986.

64. Bufler, J. Open channel and competitive block of the embryonic form of the nicotinic receptor of mouse myotubes by (+)-tubocurarine / J. Bufler, R. Wilhelm, H. Parnas, Ch, Franke, J. Dudel // J. Physiol.- 1996.- V. 495.- P. 83-95.

65. Buisson, B. Open-channel blockers at the human a4b2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor / B. Buisson, D. Bertrand // Mol. Pharmacol.- 1998.- V. 53.- P. 555-563.

66. Burkat, P.M. Dominant gating governing transient GABAA receptor activity: A first latency and Po/o analysis / P.M. Burkat, J. Yang, K.J. Gingrich // J. Neurosci.- 2001.- V. 21.- № 18.- P. 7026-7036.

67. Burnstock, G. Historical review: ATP as a neurotransmitter / G. Burnstock // Trends Pharmacol. Sci.- 2006.- V. 27.- № 3,- P. 166-176.

68. Burnstock, G. Is there a basis for distinguishing two types of P2-purinoceptor? / G. Burnstock, C. Kennedy // Gen. Pharmacol.- 1985.- V. 16.- N 5.- P. 433-440.

69. Burnstock, G. Neural nomenclature / G. Burnstock // Nature.- 1971.- V. 229.- P. 282-283.

70. Burnstock, G. Purinergic nerves and receptors / G. Burnstock // Prog. Biochem. Pharmacol.- 1980.- V. 16.-P. 141-154.

71. Cachelin, A.B. Desensitization of acetylcholine receptor of frog end-plates measured in a vaseline-gap voltage clamp / A.B. Cachelin, D. Colquhoun // J. Physiol.- 1989.- V. 415.- P. 159-188.

72. Celentano, J.J. Use of the covariance matrix in directly fitting kinetic parameters: Application to GABAA receptors / JJ. Celentano, A.G. Hawkes // Biophys. J.- 2004,- V. 87.- P. 276-294.

73. Changeux, J.P. The nicotinic acetylcholine receptor: An allosteric protein prototype of ligand-gated ion channels / J.P. Changeux // Trends Pharmacol. Sci.-1990.- V. 11,-P. 485-492.

74. Brain nicotinic receptors: Structure and regulation, role in learning and reinforcement / J.-P. Changeux, D. Bertrand, P.-J. Corringer et al. // Brain Research Reviews.- 1998.- V. 26.- P. 198-216.

75. Changeux, J. Allosteric mechanisms in normal and pathological nicotinic acetylcholine receptors / J. Changeux, S.J. Edelstein // Curr. Opin. Neurobiol.- 2001 .V. 11.-P. 369-377.

76. Changeux, J.P. Allosteric mechanisms of signal transduction / J.P. Changeux, S.J. Edelstein // Science.- 2005.- V. 308.- № 5727.- P. 1424-1428.

77. Cheng, Y. Relationship between the inhibition constant (Kl) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (150) of an enzymatic reaction / Y. Cheng, W. Prusoff // Biochem. Pharmacol.- 1973.- V. 22.- P. 30993108.

78. Chretien, J.M. An algorithmic method for determining the kinetic system of receptor-channel complex / J.M. Chretien, G.A. Chauvet // Math. Biosci.- 1998.- V. 147.- P. 227-257.

79. Christopoulos, A. Assessing the distribution of parameters in models of ligandreceptor interaction: To log or not to log / A. Christopoulos // Trends Pharmacol. Sci.- 1998.- V. 19.- P. 351-357.

80. Clapham, D.E. Substance P reduces acetylcholine-induced currents inisolated bovine chromaffin cells / D.E. Clapham, E. Neher // J. Physiol.- 1984.- V. 347.- P. 255-277.

81. Clarke, P.B.S. The effects of nicotine on locomotor activity in non-tolerant and tolerant rats / P.B.S. Clarke, R. Kumar // Br. J. Pharmacol.- 1983.- V. 78.- P. 329-337.

82. Clyne, J.D. The role of histidine residues in modulation of the rat P2X(2) purinoceptor by zinc and pH / J.D. Clyne, L.D. LaPointe, R.I. Hume // J. Physiol.-2002.- V. 539.- P. 347-359.

83. Coates, K.M. Thiopental is a competitive inhibitor at the human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor / K.M. Coates, L.E. Mather, R. Johnson, P. Flood // Anesth. Analg.- 2001.- V. 92.- № 4.- P. 930-933.

84. Ligand-gated ion channels: Homology and diversity / V.B. Cockcroft, D.J. Osguthorpe, E.A. Barnard et al. // Mol. Neurobiol.- 1990.- V. 4.- N 3-4.- P. 129-169.

85. Cohen, J.B. Permeability control and desensitization by nicotinic acetylcholine receptors / J.B. Cohen, N.P. Strnad // NATO ASI Series: Molecular mechanisms of desensitization to signal molecules.- Heidelberg: Springer-Verlag, 1987.-V. 116.-P. 257-273.

86. Cohen, L.H. A physiological role for the presynaptic localization of acetylcholinesterase and for its inhibition by excess substrate / L.H. Cohen, P.B. Hagen // Can. J. Physiol. Pharmacol.- 1964.- V. 42.- P. 593-594.

87. Colquhoun, D. Relaxation and fluctuations of membrane currents that flow through drug-operated channels / D. Colquhoun, A.G. Hawkes // Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.- 1977,- V. 199.- P. 231-262.

88. Colquhoun, D. The kinetics of conductance changes at nicotinic receptors of the muscle end-plate and of ganglia / D. Colquhoun // Drug receptors and their effectors.-London: Macmillan, 1981.-P. 107-127.

89. Colquhoun, D. Fast events in single-channel currents activated by acetylcholine annd its analogues at the frog muscle end-plate / D. Colquhoun, B. Sakmann // J. Physiol.- 1985.- V. 369.- P. 501-557.

90. Colquhoun, D. Affinity, efficacy and receptor classification: Is the classical theory still useful? / D. Colquhoun // Perspectives on receptor classification: Receptor biochemistry and methodology: V. 6.- New York: Alan R. Liss, 1987.- P. 103-114.

91. Colquhoun, D. Activation of ion channels in the frog endplate by high concentrations of acetylcholine / D. Colquhoun, D.C. Ogden // J. Physiol.- 1988.- V. 395.-P. 131-159.

92. Colquhoun, D. Desensitization of N-methyl-D-aspartate receptors: A problem of interpretation / D. Colquhoun, A.G. Hawkes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- V. 92, P. 10327-10329.

93. Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: The interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors / D. Colquhoun // Br. J. Pharmacol.- 1998.- V. 125.- P. 924-947.

94. Colquhoun, D. GABA and the single oocyte: Relating binding to gating / D. Colquhoun //Nature neuroscience.- 1999.- V. 2.- P. 201-202.

95. Colquhoun, D. How to impose microscopic reversibility in complex reaction mechanisms / D. Colquhoun, K.A. Dowsland, M. Beato, A.J. Plested // Biophys. J.- 2004.- V. 86.- P. 3510-3518.

96. Conley, E.C. Extracellular ATP-gated receptor-channels / E.C. Conley, W.J. Brammar // The ion channel FactsBook: I: Extracellular ligand-gated channels.-London, San Diego: Academic Press, 1996.- Entry 06,- P. 36-74.

97. Conley, E.C. The ion channel FactsBook: I: Extracellular ligand-gated channels / E.C. Conley, W.J. Brammar // London, San Diego: Academic Press, 1996.- 426 p.

98. Connolly, J. Alpha 4-2 beta 2 and other nicotinic acetylcholine receptor subtypes as target of psychoactive and addictive drugs / J. Connolly, J. Boulter, S.F. Heinemann // Br. J. Pharmacol.- 1992.- V. 105.- P. 657-666.

99. Cook, S.P. A memory for extracellular Ca2+ by speeding recovery of P2X receptors from desensitization / Cook SP, Rodland KD, McCleskey EW. // J. Neurosci.- 1998.- V. 18.- № 22.- P. 9238-9244.

100. Cornish-Bowden, A. Metamodel: A program for modeling and control analysis of metabolic pathways on the IBM PC and compatibles / A. Cornish-Bowden, J.-H.S. Hofmeyr // Comput. Applic. Biosci.- 1991.- V. 7.- P. 89-93.

101. Corringer, P.J. Nicotinic receptors at the amino acid level / P.J. Corringer, N. Le Novere, J.P. Changeux // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.- 2000.- V. 40,- P. 431-458.

102. Crampin, E.J. Mathematical and computational techniques to deduce complex biochemical reaction mechanisms / E.J. Crampina, S. Schnell, P.E. McSharry // Prog. Bioph. Mol. Biol.- 2004.- V. 86.- P. 77-112.

103. Dilmore, J.G. Open channel block alteration of N-methyl-D-aspartic acid receptor gating by an analog of phencyclidine / J.G. Dilmore, J.W. Johnson // Biophys. J.- 1998.-V. 75.-P. 1801-1816.

104. Ding, S. Inactivation of P2X2 purinoceptors by divalent cations / S. Ding,

105. F. Sachs //J. Physiol.- 2000.- V. 522.- P. 199-214.

106. Ding, S. Single channel properties of P2X2 purinoceptors / S. Ding, F. Sachs // J. Gen. Physiol.- 1999.- V. 113.- P. 695-719.

107. Dingledine, R. The glutamate receptor ion channels / R. Dingledine, K. Borges, D. Bowie, S.F. Traynelis // Pharmacol. Rev.- 1999.- V. 51.- P. 7-61.

108. Dionne, V.E. Voltage dependence of agonist effectiveness at the frog neuromuscular junction: Resolution of a paradox / V.E. Dionne, C.F. Stevens // J. Physiol.- 1975.- V. 251.- P. 245-270.

109. Dudel, J. Desensitization reduces amplitudes of quantal end-plate currents after a single preceding end-plate current in mouse muscle / J. Dudel, M. Heckmann // Pflugers Arch. Eur. J. Physiol.- 1999.- V. 437.- P. 569-576.

110. Dunn, P.M. P2X receptors in peripheral neurons / P.M. Dunn, Y. Zhong,

111. G. Burnstock // Prog. Neurobiol.- 2001.- V. 65.- P. 107-134.

112. Edelstein, S.J. A kinetic mechanism for nicotinic acetylcholine receptors based on multiple allosteric transitions / S.J. Edelstein, O. Schaad, E. Henry, D. Bertrand, J.-P. Changeux//Biol. Cybern.- 1996.- V. 75.- P. 361-379.

113. Edelstein, S.J. An allosteric mechanism for the acetylcholine receptor / S.J. Edelstein // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1972.- V. 48.- P. 1160-1165.

114. Egan, T.M. Contribution of calcium ions to P2X channel responses / T.M. Egan, B.S. Khakh // J. Neurosci.- 2004.- V. 24,- P. 3413-3420.

115. Ehlde, M. Mist: A user-friendly metabolic simulator / M. Ehlde, G. Zacchi // Comput. Applic. Biosci.- 1995.- V. 11.- P. 201-207.

116. Ehlert, F.J. Estimation of the affinities of allosteric ligands using radioligand binding and pharmacological null methods / F.J. Ehlert // Mol. Pharmacol.- 1988.-V. 33.-P. 187-194.

117. Elenes, S. Desensitization of diliganded mouse muscle nicotinic acetylcholine receptor channels / S. Elenes, A. Auerbach // J. Physiol.- 2002.- V. 541.-№2.-P. 367-383.

118. Evans, R.J. P2X receptors in autonomic and sensory neurons / R.J. Evans, A. Surprenant // Semin. Neurosci.- 1996,- V. 8.- P. 217-223.

119. Fell, D.A. Metabolic Control Analysis: A survey of its theoretical and experimental development / D.A. Fell // Biochem. J.- 1992.- V. 286.- P. 313-330.

120. Fenster, C.P. Influence of subunit composition on desensitization of neuronal acetylcholine receptors at low concentrations of nicotine / C.P. Fenster, M.F. Rains, B. Noerager, M.W. Quick, R.A. Lester // J. Neurosci.- 1997.- V. 17.- P. 5747-5759.

121. Fieber, L.A. Acetylcholine-evoked currents in cultured neurons dissociated from rat parasympathetic cardiac ganglia / L.A. Fieber, D.J. Adams // J. Physiol.- 1991.- V. 431.- P. 215-237.

122. Filippov, A. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers / A. Filippov, G. Oradd, G. Lindblom // Biophys. J.- 2003.- V. 84.- P. 3079-3086.

123. Franke, Ch. Kinetic constants of the acetylcholine (ACh) receptor reaction deduced from the rise in open probability after steps in ACh concentration / Ch. Franke, H. Hatt, H. Parnas, J. Dudel // Biophys. J.- 1991.- V. 60.- P. 1008-1016.

124. Nomenclature and classification of purinoceptors / B.B. Fredholm, M.P. Abbracchio, G. Burnstock et al. // Pharmacol. Rev.- 1994,- V. 46.- N 2.- P. 143-156.

125. Gaddum, J.H. Introductory address: Part I: Biological aspects: the antagonism of drugs / J.H. Gaddum // Trans. Faraday Soc.- 1943.- V. 39.- P. 323-332.

126. Gage, P.W. Effects of membrane potential, temperature and neostigmine on the conductance change caused by a quantum or acetylcholine at the toad neuromuscular junction / P.W. Gage, R.N. McBurney // J. Physiol.- 1975.- V. 244.-P. 385-407.

127. Galzi, J.L. The multiple phenotypes of allosteric receptor mutants / J.L. Galzi, S.J. Edelstein, J.P. Changeux // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.- V. 93.- P. 1853-1858.

128. Allosteric transitions of the acetylcholine receptor probed at the amino acid level with a photolabile cholinergic ligand / J.L. Galzi, F. Revah, F. Bouet et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- V. 88.- P. 5051-5055.

129. Ghosh, K. Design and models for estimating antagonist potency (pA2, Kd and IC50) following the detection of antagonism observed in the presence of intrinsic activity / K. Ghosh, D. Kowal, L.A. Dawson, R. Tasse // Neuropharm.- 1999.- V. 38.-P. 361-373.

130. Giacobini, E. Cholinesterase inhibitors stabilize Alzheimer disease / E. Giacobini // Neurochem. Res.- 2000.- V.25.- P. 1185-1190.

131. Giniatullin, R. Development of desensitization during repetitive end-plate activity and single end-plate currents in frog muscle / R. Giniatullin, G. Khamitov, R. Khazipov et al. // J. Physiol.- 1989,- V. 412.- P. 113-122.

132. Giniatullin, R. Fading and rebound of currents induced by ATP in PC 12 cells / R. Giniatullin, L. Khiroug, M. Talantova, A. Nistri // Br. J. Pharmacol.- 1996.-V. 119.-P. 1045-1053.

133. Giniatullin, R. Desensitization of nicotinic ACh receptors: shaping cholinergic signaling / R. Giniatullin, A. Nistri, J.L. Yakel // Trends Neurosci.-2005.- V. 28.- P. 371-378.

134. Giovannelli, A. Regulation of acetylcholine receptor desensitization in mouse myotubes by cytosolic cyclic AMP / A. Giovannelli, D. Farini, M.C. Gauzzi, S. Alema, F. Eusebi // Cell. Signal.- 1990.- V. 2.- P. 347-352.

135. Glavinovich, M.I. Postsynaptic potentiation and desensitization of in frog neuromuscular junction / Can. J. Pharmac.- 1988.- V. 66.- P. 624-629.

136. Goryanin, I. Mathematical simulation and analysis of cellular metabolism and regulation / I. Goryanin, T.C. Hodgman, E. Selkov // Bioinformatics.- 1999.- V. 15.-P. 749-758.

137. Grutter, T. Nicotinic receptors in wonderland / T. Grutter, J.P. Changeux // Trends Biochem. Sci.- 2001,- V. 26.- N 8.- P. 459-463.

138. Gurney, A.M. The channel-blocking action of methonium compounds on rat submandibular ganglion cells / A.M. Gurney, H.P. Rang // Br. J. Pharmacol.-1984.- V. 82.- P. 623-642.

139. Gyermek, L. Methods for the examination of ganglion-blocking activity / L. Gyermek // Pharmacology of Ganglionic Transmission.- Berlin: Springer Verlag, 1980.-P. 63-122.

140. Ha, T.N. Inhibitory effects of (+/-)-propranolol on excitation-contraction coupling in isolated soleus muscles of the rat / T.N. Ha, M.W. Fryer // Br. J. Pharmacol.- 1997.- V. 122.- № 3.- P. 463-468.

141. Hall, G.H. Changes in body temperature produced by cholinomimetic substances injected into the cerebral ventricles of unanesthetized cats / G.H. Hall // Br. J. Pharmacol.- 1972.- V. 44.- P. 634-641.

142. Hartzell, H.C. Post-synaptic potentiation: Interaction between quanta of acetylcholine at the skeletal neuromuscular synapse / H.C. Hartzell, S.W. Kuffler, D. Yoshikami // J. Physiol.- 1975.- V. 251.- P. 427-463.

143. Haseltine, E.L. Approximate simulation of coupled fast and slow reactions for stochastic chemical kinetics / E.L. Haseltine, J.B. Rawlings // J. Chem. Phys.-2002.-V. 117.-P. 6959-6969.

144. Heidmann, T. Fast kinetic studies on the allosteric interactions between acetylcholine receptor and local anesthetic binding sites / T. Heidmann, J.P. Changeux // Eur. J. Biochem.- 1979.- V. 94.- P. 281-296.

145. Higgins, L.S. A desensitized form of neuronal acetylcholine receptor detected by 3H-nicotine binding on bovine adrenal chromaffin cells / L.S. Higgins, D.K. Berg // J. Neurosci.- 1988.- V. 8.- P. 1436-1446.

146. Hill, A.V. The possible effects of the aggregation of the molecules ofhaemoglobin on its oxygen dissociation curve / A.V. Hill // J. Physiol.- 1910.- V.40.-P. IV-VII.

147. Hogg, R.C. Nicotinic acetylcholine receptors: From structure to brain function / R.C. Hogg, M. Raggenbass, D. Bertrand // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol.-2003.-V. 147.-P. 1-46.

148. Hollins, B. Heterologous expression of a P2X-purinoceptor in rat chromaffin cells detects vesicular ATP release / B. Hollins, S.R. Ikeda // J. Neurophysiol.- 1997.- V. 78.- P. 3069-3076.

149. Ifiine, C.K. Rectification of acetylcholine-elicited currents in PC 12 pheochromocytoma cells / C.K. Ifime, J.H. Steinbach // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1990.- V. 87.- N 12.- P. 4794-4798.

150. Ifiine, C.K. Voltage dependent block by magnesium of neuronal nicotinic acetylcholine receptor channels in rat phaechromocytoma cells / C.K. Ifiine, J.H. Steinbach//J. Physiol.- 1991.- V. 443.- P. 683-701.

151. Jackson, M.B. Kinetics of unliganded acetylcholine receptor channel / M.B. Jackson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.- V. 81.- P. 3901-3904.

152. Jackson, M.B. Ligand-gated channel: Postsynaptic receptors and drug targets / M.B. Jackson // Adv. Neurol.- 1999.- V. 79.- P. 511-524.

153. Jackson, M.B. Spontaneous openings of the acetylcholine receptorchannel / M.B. Jackson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- V. 81.- P. 3901-3904.

154. Spontaneous and agonist-induced openings of an acetylcholine receptor channel composed of bovine muscle alpha-, beta- and delta-subunits / M.B. Jackson, K. Imoto, M. Mishina et al. // Pflugers Arch. Eur. J. Physiol.- 1990.- V. 417.- P. 129135.

155. Johnson, R.G. Proton pumps and chemiosmotic coupling as a generalized mechanism for neurotransmitter and hormone transport / R.G. Johnson // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1987.- V. 493.- P. 162-177.

156. Jonas, P. AMPA-type glutamate receptors-nonselective cation channels mediating fast excitatory transmission in the CNS / P. Jonas // EXS.- 1993.- V. 66.-P. 61-76.

157. Jones, M.V. Defining affinity with the GABAA receptor / M.V. Jones, Y. Sahara, J.A. Dzubay, G.L. Westbrook// J. Neurosci.- 1998.- V. 18,- P. 8590-8604.

158. Jones, M.V. Desensitized states prolong GABAA channel responses to brief agonist pulses / M.V. Jones, G.L. Westbrook // Neuron.- 1995.- V. 15.- P. 181191.

159. Jones, M.V. The impact of receptor desensitization on fast synaptic transmission / M.V. Jones, G.L. Westbrook // Trends Neurosci.- 1996.- V. 19.- № 3.-P. 96-101.

160. Karlin, A. On the application of 'a plausible model' of allosteric proteins to the receptor for acetylcholine / A. Karlin // J. Theoret. Biol.- 1967.- V. 16.- P. 306320.

161. Katz, B. A study of the "desensitization" produced by acetilcholine at the motor end-plate / B. Katz, S. Thesleff// J. Physiol.- 1957.- V. 138.- P. 63-80.

162. Katz, B. The binding of acetylcholine to receptors and its removal from the synaptic cleft / B. Katz, R. Miledi // J. Physiol.- 1973.- V. 231.- P. 549-574.

163. Kell, D.B. Metabolic control analysis: theory and practice / D.B. Kell, H.V. Westerhoff // Mixed and multiple substrates and feedstocks.- Konstanz: Hartung-Gorre, 1990.-P.107- 119.

164. Kenakin, T. Allosteric modulators: The new generation of receptor antagonist / T. Kenakin // Mol. Interv.- 2004.- V. 4,- P. 222-229.

165. Kenakin, T.P. Pharmacologic analysis of drug-receptor interaction.- New York: Raven Press, 1997.- 491 p.

166. Kenakin, T.P. Quantitation in receptor pharmacology / T.P. Kenakin // Receptors Channels.- 2001.- V. 7.- P. 371-385.

167. Khakh, B.S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses / B.S. Khakh //Nat. Rev. Neurosci.- 2001.- V. 2.- N 3.- P. 165-174.

168. International Union of Pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits /B.S. Khakh, G. Bumstock, C. Kennedy et al. // Pharmacol. Rev.- 2001.- V. 53.- P. 107-118.

169. Khiroug, L. Functional mapping and Ca2C regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons / L. Khiroug, R. Giniatullin, R.C. Klein, D. Fayuk, J.L. Yakel // J. Neurosci.- 2003.- V. 23.- P. 90249031.

170. Kim, M. Molecular assembly of the extracellular domain of P2X2, an ATP-gated ion channel / M. Kim, O.J. Yoo, S. Choe // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997.- V. 240.- P. 618-622.

171. King, B.F. A role for calcineurin in the desensitization of the P2X3 receptor / B.F. King, C.C. Chen, A.N. Akopian, G. Burnstock, J.N. Wood // Neuroreport.- 1997.- V. 8.-P. 1099-1102.

172. King, B.F. Effects of extracellular pH on agonism and antagonism at a recombinant P2X2 receptor / B.F. King, S.S. Wildman, L.E. Ziganshina, J. Pintor, G. Burnstock // Br. J. Pharmacol.- 1997.- V. 121.-P. 1445-1453.

173. Klein, R.M. Effects of the lurcher mutation on GluRl desensitization andactivation kinetics / R.M. Klein, J.R. Howe // J. Neurosci.- 2004,- V. 24.- P. 49414951.

174. Kloda, A. Adenosine triphosphate acts as both a competitive antagonist and a positive allosteric modulator at recombinant N-Methyl-D-aspartate receptors / A. Kloda, J.D. Clements, R.J. Lewis, D.J. Adams // Mol. Pharmacol.- 2004.- V. 65.-P. 1386-1396.

175. Koshelev S.G. Blockade of open NMDA channel by tetrabutylammonium, 9-aminoacridine and tacrine preventa channels closing anddesensitization / S.G. Koshelev, B.I. Khodorov // Membr. Cell. Biol.- 1995.- V. 9.- P. 93-109.

176. Krampfl, K. Pentobarbital has curare-like effects on adult-type nicotinic acetylcholine receptor channel currents / K. Krampfl, F. Schlesinger, R. Dengler, J. Bufler // Anesth. Analg.- 2000.- V. 90,- P. 970-974.

177. Activation and modulation of ligand-gated ion channels / J. Krusek, I. Dittert, T. Hendrych et al. // Physiol. Res.- 2004.- V. 53.- Suppl. 1.- P. S103-S113.

178. Kukita, F. Kinetic analysis of the denaturation process by alcohols of sodium channels in squid giant axon / F. Kukita, S. Mitaku // J. Physiol.- 1993.- V. 463.- P. 523-543.

179. Land, B.R. Diffusion and binding constants for acetylcholine derived from the falling phase of miniature endplate currents / B.R. Land, V.W. Harris, E.E. Salpeter, M.M. Salpeter//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984,- V. 81,- P. 1594-1598.

180. Land, B.R. Kinetic parameters for acetylcholine interaction in intact neuromuscular junction / B.R. Land, E.E. Salpeter, M.M. Salpeter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1981.- V. 78.-P. 7200-7204.

181. Lester, H.A. Role of voltage-sensitive receptors in nicotinic transmission / H.A. Lester, D.D. Koblin, R.E. Sheridan // Biophys. J.- 1978,- V. 21.- P. 181-194.

182. Lewis, RJ. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters / R.J. Lewis // IUBMB Life.- 2004.- V. 56.- № 2.- P. 8993.

183. Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons / C. Lewis, S. Neidhart, C. Holy et al. // Nature (Lond.).- 1995.- V. 377.- P. 432-435.

184. Langmuir, I. The constitution and fundamental properties of solids and liquids /1. Langmuir // J. Am. Chem. Soc.- 1916,- V. 38.- P. 2221-2295.

185. Li, C. Enhancement of ATP-activated current by protons in dorsal root ganglion neurons / C. Li, R.W. Peoples, F.F. Weight // Pflugers Arch.- 1997.- V. 433.- P. 446-454.

186. Lingle, C. Different types of blockade of crustacean acetylcholine-induced currents / C. Lingle // J. Physiol.- 1983.- V. 339.- P. 419-437.

187. Lipton, P. Ischemic cell death in brain neurons / P. Lipton // Physiol. Rev.- 1999,- V. 79.- P. 1431-1568.

188. Liu, S-Q.J. Effects of external pH substrate binding and on the inward chloride translocation rate constant of band 3 / S-Q.J. Liu, F-Y. Law, P.A. Knauf // J. Gen. Physiol.- 1996.- V. 107.- P. 271-291.

189. Lowenick, C.V. Open channel and competitive block of nicotinic receptors by pancuronium and atracurium / C.V. Lowenick, K. Krampfl, H. Schneck, E. Kochs, J. Bufler // Eur. J. Pharmacol.- 2001.- V. 413.- P. 31-35.

190. International union of pharmacology: XX: Current status of the nomenclature for nicotinic acetylcholine receptors and their subunits / R.J. Lukas, J.-P. Changeux, N. Le Novere et al.//Pharm. Rev.- 1999.- V. 51.-N2.-P. 397-401.

191. Lutz, P.L. Mechanisms for anoxic survival in the vertebrate brain / P.L. Lutz // Annu. Rev. Physiol.- 1992.- V. 54.- P. 601-618.

192. Maconochie, D J. A study of bovine adrenal chromaffin nicotinic receptor using patch clamp and concentration-jump techniques / D.J. Maconochie, D.E. Knight // J. Physiol.- 1992.- V. 454.- P. 129-153.

193. Maelicke, A. Allosteric modulation of nicotinic receptors as a treatment strategy for Alzheimer's disease / A. Maelicke // Dement. Geriatr. Cogn. Disord.-2000.- Suppl. l.-P. 11-18.

194. Magazanik, L.G. Effect of the desensitization-potentiating agent SKF-525a on frog end-plate currents / L.G. Magazanik, E. Nikolsky, F. Vyskocil // Eur. J. Pharmacol.- 1982.-V. 80.-P. 115-119.

195. Magazanik, L.G. End-plate currents evoked by paired stimuli in frog muscle fibers / L.G. Magazanik, E.E. Nikolsky, R.A. Giniatullin // Pfluegers Arch.-1984.- V. 401.-P. 185-192.

196. Magazanik, L.G. Changes in the time course of miniature end-plate currents induced by bath applied acetylcholine / L.G. Magazanik, V.A. Snetkov, R.A. Giniatullin, R.N. Khazipov //Neurosci. Let.- 1990.- V. 13.- P. 281-285.

197. Magazanik, L.G. Dependence of acetylcholine desensitization on the membrane potential of frog muscle fiber and on the ionic changes in the medium / L.G. Magazanik, F. Vyskocil //J. Physiol.- 1970.- V. 210.- P. 507-518.

198. Magazanik, L.G. Desensitization at the neuromuscular junction / L.G. Magazanik, F. Vyskocil // Motor innervation of muscle.- London, New York, San Francisco: Academic Press, 1976.-P. 151-176.

199. Magazanik, L.G. The effect of temperature on desensitization kinetics at the post-synaptic membrane of the frog muscle fibre / L.G. Magazanik, F. Vyskocil // J. Physiol.- 1975.- V. 249.- P. 285-300.

200. Magleby, K.L. A study of desensitization of acetylcholine receptors using nerve-released transmitter in the frog / K.L. Magleby, B.S. Palotta // J. Physiol.-1981.- V. 316.- P. 225-250.

201. Magleby, K.L. A quantitative description of end-plate currents / K.L. Magleby, C.F. Stevens // J. Physiol.- 1972.- V. 223.- P. 173-197.

202. Mansner, R. Nicotine induced tremor and antidiuresis and brain nicotine levels in the rat / R. Mansner, M.J. Mattila // Med. Biol.- 1975.- V. 53.- P. 169-176.

203. Manthey, A.A. The effect of calcium on the desensitization of membrane receptors at the neuromuscular junction / A.A. Manthey // J. Gen. Physiol.- 1966.- V. 49.- P. 963-976.

204. Mathie, A. Rectification of currents activated by nicotinic acetylcholine receptors in rat sympathetic ganglion neurons / A. Mathie, D. Colquhoun, S.G. Cull-Candy // J. Physiol.- 1990.- V. 427.- P. 625-655.

205. Mathie, A. Conductance and kinetic properties of single nicotinic acetylcholine receptor channels in rat sympathetic neurones / A. Mathie, S.G. Cull-Candy, D. Colquhoun // J. Physiol.- 1991.- V. 439.- P. 717-750.

206. Matsson, L. Response theory for non-stationary ligand-receptor interaction and a solution to the growth signal firing problem / L. Matsson // J. Theor. Biol.- 1996.-V. 180.-P. 93-104.

207. Matthews-Bellinger, J. Distribution of acetylcholine receptors at frog neuromuscular junctions with a discussion of some physiological implications / J. Matthews-Bellinger, M.M. Salpeter // J. Physiol.- 1978.- V. 279.- P. 197-213.

208. Meltzer, L.T. Investigations on the CNS sites of action of the discriminative stimulus effects of arecoline and nicotine / L.T. Meltzer, J.A. Rosecrans // Pharmacol. Biochem. Behav.- 1981.- V. 15,- P. 21-26.

209. Mendes, P. Biochemistry by numbers: Simulation of biochemical pathways with Gepasi / P. Mendes // Trends Biochem. Sci.- 1997.- V. 22.- P. 361363.

210. Mendes, P. GEPASI: A software package for modelling the dynamics, steady states and control of biochemical and other systems / P. Mendes // Comput. Appl. Biosci.- 1993.- V. 9.- P. 563-571.

211. Meyer, E.L. Agonist regulation of rat a3b4 nicotinic acetylcholine receptors stably expressed in human embryonic kidney 293 cells / E.L. Meyer, Y. Xiao, K.J. Kellar // Mol. Pharmacol.- 2001.- V. 60.- P. 568-576.

212. Middleton, P. Forskolin increases the rate of acetylcholine receptor desensitization at rat soleus endplates /P. Middleton, F. Jaramillo, S.M. Schuetze //

213. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.- V. 83.- P. 4967-4971.

214. Mike, A. Choline and acetylcholine have similar kinetic properties of activation and desensitization on the a7 nicotinic receptors in rat hippocampal neurons / A. Mike, N.G. Castro, E.X. Albuquerque // Brain Res.- 2000.- V. 882.- P. 155-168.

215. Miles, K. Regulation of nicotinic acetylcholine receptor phosphorylation in rat myotubes by forskolin and cAMP / K. Miles, D.T. Anthony, L.L. Rubin, P. Greengard, R.L. Huganir//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1987.- V. 84.- P. 6591-6595.

216. Monod, J. Allosteric proteins and cellular control systems / J. Monod, J.P. Changeux, F. Jacob // J. Mol. Biol.- 1963.- V. 6.- P. 306-329.

217. Monod, J. On the nature of allosteric transitions: a plausible model / J. Monod, J. Wyman, J.P. Changeux / J. Mol. Biol.- 1965.- V. 12.- P. 88-118.

218. Moraru, I.I. The Virtual Cell: An integrated modeling environment for experimental and computational cell biology / I.I. Moraru, J.C. Schaff, B.M. Slepchenko, L.M. Loew // Ann. NY Acad. Sci.- 2002.- V. 971.- P. 595-596.

219. Morton-Firth, C.J. Predicting temporal fluctuations in an intracellular signaling pathway / C.J. Morton-Firth, D. Bray // J. Theor. Biol.- 1998.- V. 192.- P. 117-128.

220. Mukhtasimova, N. Initial coupling of binding to gating mediated by conserved residues in the muscle nicotinic receptor / N. Mukhtasimova, C. Free, S.M. Sine // J. Gen. Physiol.- 2005,- V. 126.- P. 23-39.

221. Nakazawa, K. Block by calcium of ATP-activated channels in pheochromocytoma cells / K. Nakazawa, P. Hess // J. Gen. Physiol.- 1993.- V. 101.-P. 377-392.

222. Naves, L.A. Repetitive nerve stimulation decreases the acetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction / L.A. Naves, W. Van der Kloot // J. Physiol.- 2001.- V. 532.- P. 637-647.

223. Neher, E. Local anesthetics transiently block currents through single acetylcholine-receptor channels / E. Neher, J.H. Steinbach // J. Physiol.- 1978.- V.277.-P. 153-176.

224. Nelson, M.E. Single channel properties of human a3 AChRs: Impact of b2, b4 and a5 subunits / M.E. Nelson, J. Lindstrom // J. Physiol.- 1999.- V. 516.- P. 657-678.

225. Neubig, R.R. Conformations of Torpedo acetylcholine receptor associated with ion transport and desensitization / R.R. Neubig, J.B. Cohen // Biochemistry.-1982.- V. 21.-P. 3460-3467.

226. P2Xi and P2X3 receptors form stable trimers: A novel structural motif of ligand-gated ion channels / A. Nicke, H.G. Baumert, J. Rettinger et al. // EMBO J.-1998.- V. 17.-P. 3016-3028.

227. Nooney, J.M. A patch clamp study of the nicotinic acetylcholine receptor of bovine adrenomedullary chromaffin cells in culture / J.M. Nooney, J.A. Peters, J.J. Lambert // J. Physiol.- 1992.- V. 455.- P. 503-527.

228. North, R.A. Molecular physiology of P2X receptors / R.A. North // Physiol. Rev.- 2002.- V. 82.- P. 1013-1067.

229. North, R.A. Nucleotide receptors / R.A. North, E.A. Barnard // Curr. Opin. Neurobiol.- 1997.- V. 7.- N 3.- P. 346-357.

230. North, R.A. P2X receptors: A third major class of ligand-gated ion channels / R.A. North// Ciba Found. Symp.- 1996.- V. 198.- P. 91-105.

231. Le Novere, N. The ligand gated ion channel database: An example of a sequence database in neuroscience / N. Le Novere, J.P. Changeux // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 2001.- V. 356.- N 1412.- P. 1121-1130.

232. Le Novere, N. Improved secondary structure predictions for a nicotinic receptor subunit: incorporation of solvent accessibility and experimental data into a two-dimensional representation / N. Le Novere, P.J. Corringer, J.P. Changeux //

233. Biophys. J.- 1999.- V. 76.- P. 2329-2345.

234. Ogden, D.C. Block of the ACh-activated ion channels by an uncharged local anaesthetic / D.C. Ogden, S.A. Siegelbaum, D. Colquhoun // Nature.- 1981.- V. 289.- P. 596-598.

235. Onsager, L. Reciprocal relations in irreversible processes / L. Onsager // Phys. Rev.- 1931.- V. 237.- P. 405-426; V. 238,- P. 2265-2279.

236. Pankratov, Y. Ionotropic P2X purinoreceptors mediate synaptic transmission in rat pyramidal neurones of layer II/III of somato-sensory cortex / Y. Pankratov, U. Lalo, O. Krishtal, A. Verkhratsky // J. Physiol.- 2002.- V. 542.- P. 529536.

237. Papke, R.L. Comparative pharmacology of rat and human a7 nAChR conducted with net charge analysis / R.L. Papke, J.K. Porter Papke // Br. J. Pharmacol.- 2002.- V. 137.- P. 49-61.

238. Paradiso, K.G. Nicotine is highly effective at producing desensitization of rat alpha4beta2 neuronal nicotinic receptors / K.G. Paradiso, J.H. Steinbach // J. Physiol.- 2003.- V. 553.- № 3.- P. 857-871.

239. Parker, J.C. Interactions of atropine with heterologously expressed and native a3 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors / J.C. Parker, D. Sarkar, M.W. Quick, R.A.J. Lester // Br. J. Pharm.- 2003.- V. 138.- P. 801-810.

240. Parnas H. Sequential model to describe the nicotinic synaptic current / H. Parnas, M. Flashner, M.E. Spira 11 Biophys. J.- 1989.- V. 55.- P. 875-884.

241. Patneau, D.K. Kinetic analysis of interactions between kainate and AMPA: Evidence for activation of a single receptor in mouse hippocampal neurons / D.K. Patneau, M.L. Mayer //Neuron.- 1991.- V. 6.- № 5.- P. 785-798.

242. Pawson, P.A. Quantitative freeze-fracture analysis of the frog neuromuscular junction synapse: I. Naturally occurring variability in active zone structure / P.A. Pawson, A.D. Grinnell, B. Wolowske // J. Neurocytol.- 1998.- V. 27.-P. 361-377.

243. Perutz, M.F. Mechanisms of cooperativity and allosteric regulation inproteins / M.F. Perutz // Quart. Rev. Biophys.- 1989.- V. 22,- P. 139-236.

244. Pratt, E.B. Use-dependent inhibition of P2X3 receptors by nanomolar agonist / E.B. Pratt, T.S. Brink, P. Bergson, M.M. Voigt, S.P. Cook // J. Neurosci.-2005.- V. 25.- P. 7359-7365.

245. Pugh, J.R. GABAA receptor kinetics in the cerebellar nuclei: Evidence for detection of transmitter from distant release sites / J.R. Pugh, I.M. Raman // Biophys. J.- 2005.- V. 88.- P. 1740-1754.

246. Quick, M.W. Desensitization of neuronal nicotinic receptors / M.W. Quick, R.A.J. Lester // J. Neurobiol.- 2002,- V. 53.- P. 457-478.

247. Ralevic, V. Receptors for purines and pyrimidines / V. Ralevic, G. Burnstock// Pharmacol. Rev.- 1998.- V. 50.- № 3.- P. 413-492.

248. Raman, I.M. The mechanism of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor desensitization after removal of glutamate / I.M. Raman, L.O. Trussell // Biophys. J.- 1995.- V. 68.- № 1.- P. 137-146.

249. Ratner, E. Evaluation of the number of agonist molecules needed to activate a ligand-gated channel from the current rising phase / E. Ratner, O. Tour, H. Parnas // Biophysical Journal.- 2000.- V. 78.- P. 731-745.

250. Reitstetter, R. Dependence of nicotinic acetylcholine receptor recovery from desensitization on the duration of agonist exposure / R. Reitstetter, R.J. Lukas, R. Gruener// J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1999.- V. 289.- P. 656-660.

251. Rettinger, J. Activation and desensitization of the recombinant P2X1 receptor at nanomolar ATP concentrations / J. Rettinger, G. Schmalzing // J. Gen. Physiol.- 2003.- V. 121.- № 5.- P. 451-461.

252. Calcium-dependent effect of the thymic polypeptide thymopoietin on the desensitization of the nicotinic acetylcholine receptor / F. Revah, C Mulle., C. Pinset et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1987.- V. 84.- P. 3477-3481.

253. Robert, A. How AMPA receptor desensitization depends on receptor occupancy / A. Robert, J.R. Howe // J. Neurosci.- 2003.- V. 23.- № 3.- P. 847-858.

254. Robertson, S.J. Characterization of a P2X-purinoceptor in culturedneurons of the rat dorsal root ganglia / S J. Robertson, M.G. Rae, E.G. Rowan, C. Kennedy //Br. J. Pharmacol.- 1996.- V. 118.- P. 951-956.

255. Roed, A. Effects of chlorhexidine on the isolated rat phrenic nerve-diaphragm preparation / A. Roed // Pharmacol. Toxicol.- 1994.- V. 74.- P. 10-16.

256. Romanelli, M.N. Cholinergic nicotinic receptors: Competitive ligands, allosteric modulators, and their potential applications / M.N. Romanelli, F. Gualtieri // Medicinal Research Reviews.- 2003.- V. 23.- N 4.- P. 393-426.

257. Rosenberry, T.L. Quantitative simulation of endplate currents at neuromuscular junctions based on the reaction of acetylcholine with acetylcholine receptor and acetylcholinesterase / T.L. Rosenberry // Biophys. J.- 1979.- V. 26.- P. 263-289.

258. Sakmann, B. Single acetylcholine-activated channels show burst kinetics in presence of desensitizing concentrations of agonist / B. Sakmann, J. Patlak, E. Neher //Nature.- 1980.- V. 286.- P. 71-73.

259. Sauro, H.M. SCAMP: A general-purpose simulator and metabolic control analysis program / H.M. Sauro // CABIOS.- 1993.- V. 9.- P. 441-450.

260. Sauro, H.M. SCAMP: A metabolic simulator and control analysis program / H. M. Sauro, D.A. Fell // Mathl. Comput. Modelling.- 1991.- V. 15.- P. 1528.

261. Schaff, J.C. Physiological modeling with virtual cell framework / J.C. Schaff, B.M. Slepchenko, L.M. Loew // Methods Enzymol.- 2000.- V. 321.- P. 1-23.

262. Schild, H.O. pAx and competitive drug antagonism / H.O. Schild // Br. J. Pharmacol.- 1949.- V. 4,- P. 277-280.

263. Schild, H.O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism / H.O. Schild // Br. J. Pharmacol.- 1947.- V. 2.- P. 189-206.

264. Schirmer, T. Structural basis of the allosteric behavior of phosphofructokinase / T. Schirmer, P.R. Evans // Nature.- 1990.- V. 343.- P. 140145.

265. Schnell, S. A fast method to estimate kinetic constants for enzymeinhibitors / S. Schnell, C. Mendoza // Acta Biotheor.- 2001V. 49.- P. 109-113.

266. Schnell, S. Enzyme kinetics of multiple alternative substrates / S. Schnell, C. Mendoza // J. Math. Chem.- 2000.- V. 27.- P. 155-170.

267. Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: A nicotinic cation channel highly permeable to calcium / P. Seguela, J. Wadiche, K. Dineley-Miller et al. // J. Neurosci.- 1993.- V. 13.- N 2.- P. 596-604.

268. Shen, W.X. Mecamylamine selectively blocks nicotinic receptors on vasomotor sympathetic C neurons / W.X. Shen, J.P. Horn // Brain Res.- 1998.- V. 788.-P. 118-124.

269. Skok, V.I. Nicotinic acetylcholine receptors in autonomic ganglia / V.I. Skok // Auton. Neurosci.- 2002.- V. 97.- № 1.- P. 1-11.

270. Skorinkin, A. Bimodal action of protons on ATP currents of rat PC 12 cells / A. Skorinkin, A. Nistri, R. Giniatullin // J. Gen. Physiol.- 2003.- V. 122.- № 1 .P. 33-44.

271. Slepchenko, B.M. Computational cell biology: Spatiotemporal simulation of cellular events / B.M. Slepchenko, J.C. Schaff, J.H. Carson, L.M. Loew // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.- 2002.- V. 31.- P. 423-441.

272. Slepchenko, B.M. Quantitative cell biology with the Virtual Cell / B.M. Slepchenko, J.C. Schaff, I. Macara, L.M Loew. // Trends Cell. Biol.- 2003.- V. 13.-P. 570-576.

273. Sobolevsky, A.I. Quantitative analysis of tetrapentylammonium-induced blockade of open NMDA-channels / A.I. Sobolevsky // Biophys. J.- 2000.- V. 79.- P. 1324-1335.

274. Sobolevsky A. Two blocking sites of amino-adamante derivatives in open NMDA channels / A. Sobolevsky, S. Koshelev // Biophys. J.- 1998.- V. 74.- P. 13051309.

275. Sobolevsky, A.I. Probing of NMDA channels with fast blockers / A.I. Sobolevsky, S.G. Koshelev, B.I. Khodorov // J. Neurosci.- 1999.- V. 19.- P. 1061110626.

276. Sobolevsky, A.I. The trapping block of NMDA receptor channels in acutely isolated rat hippocampal neurons / A.I. Sobolevsky, M.V. Yelshansky // J. Physiol.- 2000.- V. 526.- P. 493-506.

277. Spitzmaul, G. The noncompetitive inhibitor quinacrine modifies the desensitization kinetics of muscle acetylcholine receptors / G. Spitzmaul, J.P. Dilger, C. Bouzat // Mol. Pharmacol.- 2001.- V. 60,- P. 235-243.

278. Stephenson, R.P. A modification of receptor theory / R.P. Stephenson // Br. J. Pharmacol. Chemother.- 1956.- V. 11.- P. 379-393.

279. Stitzer, M. Effects of nicotine on fixed interval behavior and modification by cholinergic antagonists / M. Stitzer, J. Morison, E. Domino // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1970.- V. 171.-P. 165-177.

280. Stoop, R. Fading and rebound of P2X2 currents at millimolar ATP concentrations caused by low pH / R. Stoop, J.M. Quayle // Br. J. Pharmacol.- 1998.-V. 125.-P. 235-237.

281. Stoop, R. Different sensitivities to pH of ATP-induced currents at four cloned P2X receptors / R. Stoop, A. Surprenant, R.A. North // J. Neurophysiol.-1997.-V. 78.- P. 1837-1840.

282. Contribution of individual subunits to the multimeric P2X2 receptor: Estimates based on methanethiosulfonate block at T336C / R. Stoop, S. Thomas, F. Rassendren et al. //Mol. Pharmacol.- 1999.- V. 56.- P. 973-981.

283. Taylor, P. Molecular basis of pharmacologic selectivity / P. Taylor, P.A. Insel // Principles of drug actions: The basis of pharmacology.- New York: Churchill Livingstone, 1990,- P. 1-102.

284. Thesleff, S. Motor end-plate "desensitization" by repetitive nerve stimuli / S. Thesleff// J. Physiol.- 1959.- V. 148.- P. 659-664.

285. Tikhonov, D.B. Voltage dependence of open channel blockade: onset and offset rates / D.B. Tikhonov, L.G. Magazanik // J. Membr. Biol.- 1998.- V. 161.- № 1.- P. 1-8.

286. Torres, G.E. Hetero-oligomeric assembly of P2X receptor subunits: Specificities exist with regard to possible partners / G.E. Torres, T.M. Egan, M.M. Voigt // J. Biol. Chem.- 1999.- V. 274.- N 10.- P. 6653-6659.

287. Tour, O. On the mechanism of desensitization in quisqualate-type glutamate channels / O. Tour, H. Paraas, I. Parnas // J. Neurophysiol.- 2000.- V. 84.-P. 1-10.

288. Toyoshima, C. Ion channel of acetylcholine receptor reconstructed from images of postsynaptic membranes / C. Toyoshima, N. Unwin // Nature.- 1988.- V. 336.- P. 247-250.

289. Tripathi, H.L. Nicotine-induced antinociception in rats and mice: Correlation with nicotine brain levels / H.L. Tripathi, B.R. Martin, M.D. Aceto // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1982.- V. 221.- P. 91-96.

290. Trudell, J.R. Molecular modelling of specific and non-specific anaesthetic interactions: Review / J.R. Trudell, E. Bertaccini // Br. J. Anaesth.- 2002.- V. 89.- № l.-P. 32-40.

291. Tsetlin, V.I. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications / V.I. Tsetlin, F. Hucho // FEBS Lett.- 2004.- V. 557.- № 1-3.- P. 9-13.

292. Uings, I.J. Cell receptors and cell signaling / I J. Uings, S.N. Farrow // J. Clin. Pathol. Mol. Pathol.- 2000.- V. 53.- P. 295-299.

293. Unwin, N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution / N. Unwin //

294. J. Mol. Biol.- 1993.- V. 229.- P. 1101-1124.

295. Varanda, W.A. The acetylcholine receptor of the neuromuscular junction recognizes mecamylamine as a noncompetitive antagonist / W.A. Varanda, Y. Aracava, S.M. Sherby et al. // Mol. Pharmacol.- 1985.- V. 28.- P. 128-137.

296. Calcium modulation and high calcium permeability of neuronal nicotinic acetylcholine receptors / S. Vernino, M. Amador, C.W. Luetje et al. // Neuron.-1992.- V. 8.-N l.-P. 127-134.

297. Voit, E.O. Computational analysis of biochemical systems: A practical guide for biochemists and molecular biologists / E.O. Voit // Cambridge: Cambridge University Press, 2000.- 556 p.

298. Vorobjev, V.S. Modulation of ATP-induced currents by zinc in acutely isolated hypothalamic neurons of the rat / V.S. Vorobjev, I.N. Sharonova, O.A. Sergeeva, H.L. Haas // Brit. J. Pharm.- 2003.- V. 139.- P. 919-926.

299. Immunohistochemical study of the P2X2 and P2X3 receptor subunits in rat and monkey sensory neurons and their central terminals / L. Vulchanova, M.S. Riedl, S.J. Shuster et al. //Neuropharm.- 1997.- V. 36.- P. 1229-1242.

300. Wagoner, P.K. Modulation of acetylcholine receptor desensitization by forskolin is independent of cAMP / P.K. Wagoner, B.S. Pallotta // Science.- 1988.- V. 240.-P. 1655-1657.

301. Wathey, J.C. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses / J.C. Wathey, M.M. Nass, H.A. Lester//Biophys. J.- 1979.- V. 27.- P. 145164.

302. Waud, D.R. Analysis of dose-response curves / D.R. Waud // Methods in Pharmacology: Smooth Muscle: V. 3.- New York: Plenum Press, 1975.- P. 471-506.

303. Werner, P. Domains of P2X receptors involved in desensitization /P. Werner, E.P. Seward, G.N. Buell, R.A. North // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.-V. 93.-P. 15485-15490.

304. Woodhull, A. Ionic blockage of sodium channels in nerve / A. Woodhull // J. Gen. Physiol.- 1973.- V. 61.- P. 687-708.

305. Wu, K.M. An analysis of nicotinic and opioid processes in the medulla oblongata and nucleus ambiguous of the dog / K.M. Wu, W.R. Martin // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1983.- V. 227.- P. 302-307.

306. Xiao, Y. Rat a3/(34 subtype of neuronal nicotinic acetylcholine receptor stably expressed in a transfected cell line: Pharmacology of ligand binding and function / Y. Xiao, E.L. Meyer, J.M. Thompson et al. // Mol. Pharmacol.- 1998.- V. 54.-P. 322-333.

307. Yuzaki, M. New insights into the structure and function of glutamate receptors: The orphan receptor delta2 reveals its family's secrets / M. Yuzaki // Keio J. Med.- 2003,- V. 52.- N 2.- P. 92-99.

308. Zhorov, B.S. Potassium, sodium, calcium and glutamate-gated channels: pore architecture and ligand action /B.S. Zhorov, D.B. Tikhonov // J. Neurochem.-2004.- V. 88,- № 4.- P. 782-799.

309. Zhu, B.T. Rational design of receptor partial agonists and possible mechanisms of receptor partial activation: A theory / B.T. Zhu // J. Theor. Biol.-1996.-V. 181.- P. 273-291.3LB1

310. Экспериментальные данные, представленные в разделе 4.1.1.1., частично получены совместно с К.Б. Остроумовым.

311. Экспериментальные данные, представленные в разделе 4.1.1.2., получены совместно с Е.Г. Пряжниковым.

312. Экспериментальные данные, представленные в разделе 4.1.1.3., получены совместно с А.Р. Шайхутдиновой.

313. Экспериментальные данные, представленные в разделе 4.1.2., получены совместно с Е.М. Соколовой и М.В. Талантовой.

314. Экспериментальные данные, представленные в разделе 4.2., частично получены совместно с Е.М. Соколовой.

315. Модельные данные, представленные в разделе 4.2.2., частично получены совместно с A.A. Аграчевым и И.В. Моисеевым.5р/