Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ЭМИ дециметрового диапазона на хеморецепторные структуры

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние ЭМИ дециметрового диапазона на хеморецепторные структуры"

РГВ ^ 1 5 МАИ 1993ос

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

на правах рукописи

Филиппова Татьяна Михайловна

УДК 577.35:537.868

ВЛИЯНИЕ ЭМИ ДЕЦИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА НА ХЕМОРЕЦЕПТОРНЫЕ

СТРУКТУРЫ

Специальность 03. 00.02 "Биофизика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

Новоселов В. И. ,

кандидат физико-математических наук Алексеев С. И.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук Бецкий О. В. , кандидат биологических наук Штемлер В.Н.

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Защита состоится 7 апреля 1993г. в часов на заседании

Специализированного ученого совета по биофизике Д.003.10.02 при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН по адресу 117865, г. Москва ГСП-7, ул. Бутлерова, 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии.

Автореферат разослан 1993г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

. '1с-0-€ С/ -7 е..

Лебедева Н. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

_Актуальность^ Электромагнитный фон Земли является важнейшим экологическим фактором, сопутствующим зарождению и развитию всего живого (Вернадский, 1926). В процессе эволюции все элементы биосферы выработали адаптационные механизмы к определенному уровню этого фактора. За последние десятилетия электромагнитный фон Земли глобально повысился в связи с широким применением во всех сферах жизни разнообразных средств и систем, использующих электромагнитное излучение (ЭМИ) различного спектра частот. Адаптационные возможности биологических объектов за такой сравнительно короткий промежуток времени не изменились. Поэтому возникают вопросы о возможном неблагоприятном воздействии "рукотворных" электромагнитных полей (ЭМП) на живую природу и принятии защитно-охранительных мер. Для их решения необходимо знание механизмов биологического действия ЭМИ.

Наибольшую потенциальную опасность для биологических объектов представляет излучение дециметрового диапазона. Его длины волн соизмеримы с линейными размерами животных и человека, что приводит к резонансному и, следовательно, повышенному поглощению объектом энергии излучения.

Центральная нервная и эндокринная системы организма, реагируя на изменения внешней среды и поддерживая гомеостаз, обеспечивают его выживание. Не удивительно, что именно эти жизненноважные системы наиболее чувствительны к воздействию ЭМИ (Пресман, 1968; Холодов, 1982; Ас1еу, 1988, 1989). Так как их функционирование зиждется на хеморецепции, хеморецепторные структуры должны неизбежно вовлекаться в реакцию организма на излучение. Однако хеморецепторы, как таковые, привлекли внимание специалистов электромагнитобиологии только в последнее десятилетие, и результаты, накопленные в этой области исследований, носят лишь феноменологический характер.

Известно, что по способу функционирования в клетке хеморецепторы подразделяются на два типа - ионотропные ,и метаботропные. Ионотропные рецепторы посредством конформационных изменений при связывании лиганда регулируют проницаемость мембран для ионов. Метаботропные рецепторы после связывания лиганда активируют систему вторичных посредников, которая, в свою очередь, регулирует не только ионную проницаемость мембран, но также энергию метаболизма и биосинтез белка в клетке. Поскольку структура и функция взаимно определяют друг друга, каждый тип

рецепторов имеет свои структурные особенности. Вопрос о влиянии ЭМИ на различные типы хеморецепторов до сих пор не затрагивался.

Задачей настоящей работы явилось исследование влияния ЭИИ дециметрового диапазона на различные хеморецепторные структуры крысы с целью выяснения неханизна биологического действия излучения.

Исследовано влияние ЭМИ децинетрового диапазона (900 МГц) на различные типы хеморецепторов in vitro. Показано, что в условиях термостатирования ЭМИ оказывает влияние на рецепторы метаботропного типа - обонятельный и 0-адренэргичес-кий. и, напротив, не влияет на глутанатный рецептор, относящийся к рецепторам ионотропного типа. По-видимому, такая закономерность действия поля обусловлена структурными особенностями рецепторов .

Установлено, что уменьшение связывания стимула метаботропными рецепторами в процессе облучения вызвано выходом рецепторных белков из некбран в раствор - их "вымыванием". На основании экспериментальных данных сделано заключение, что тепловое действие ЭИИ не является первичным механизмом "вымывания". Выход рецепторных белков в раствор может быть обусловлен ферментативным механизмом перекисного окисления липидов мембран в области локализации рецепторных систем. Предлагаемая модель допускает ориентационный эффект ЭМП.

Высказано предположение, что рецепторы нетаботропного типа в совокупности с мембраной, которая служит "сценой действия", могут быть первичными мишенями, воспринимающими воздействие излучения, и ответственны за формирование эффектов ЭМИ на клеточном уровне.

но-практкческая__Ценность.. Результаты работы вносят

вклад в понимание механизмов биологического действия ЭМИ, необходимое для научного обоснования как защитно-охранительных мер, так и методов, применяемых в медицинской практике.

_Апробация__работьь Материалы диссертации опубликованы в 9 работах, список которых приведен в конце автореферата. По результатам работы получено авторское свидетельство на изобретение N138354. основные результаты исследований были доложены на симпозиуме с участием ученых стран СЭВ "Механизмы биологического действия электромагнитных излучений" (Пущино, 1987), научной конференции ИБК РАН (Пущино, 1992), семинаре Тенплского Университета (Филадельфия, США, 1992) и представлены на первом мировом конгрессе "Электричество и магнетизм в биологии и медицине" (Флорида, США, 1992).

Структура__и__обьем__£иссертации^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы (гл.1), описания объектов и нетодов исследований (гл. 2), изложения собственных экспериментальных данных (гл. 3), обсуждения результатов (гл. 4), заключения, выводов и списка цитированной литературы (179 наименований). Работа изложена на 125 страницах, включает 13 рисунков и 6 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Исследовано три хеморецептора крысы.

1.Глутаматный - главный возбуждающий рецептор ЦНС, интеро-рецептор ионотропного типа. Подобно другим лиганд - управляемым рецепторам, образует пору, регулируемую конфьрмаиионной перестройкой белка при связывании стимула (Neher, 1988; Betz, 1990; Boulter, 1990; Sakimura et al, 1990).

2. 0-адренэргический - важнейший регулятор эндокринной системы, также интерорецептор, но метаботропног о типа. Представляет собой мембранный комплекс, включающий лиганд - связывающую субьединицу (64 кЛ), G^ регуляторный белок, аденилатциклазную систему, ионный канал (Neher, 1988; Lefkowitz et al, 1984, 1985; Kobilka et al, 1988; Strader et al, 1989).

3.Обонятельный - метаботропный экстерорецептор. Рецепторная клетка - биполярный нейрон с двуня отростками - периферическим и центральным. Периферический отросток несет пучок жгутиков, в мембранах которых локализован комплекс рецепторных колекул. Гликопротеид (для крысы) с М. в. 88 кД - др88 - запах связывающий белок; др55 - специфический обонятельный G-белок, в процессе трансдукции сигнала принимают участие, по-видимому, две системы вторичных посредников: аденилатцкклазная и инозитолтри-фосфатов. Обнаруженные ионные каналы - катионнные (Расе, 1985; Lancet, Face, 1987; Boekhoff et al, 1990; Новоселов, 1991).

Для облучения использовались 4 типа препаратов: обонятельная выстилка, мембранная фракция гомогенатов тканей (суспензия мембран), солюбилизированные молекулы рецепторов, липосомы из фосфатидилхолина. Специфическое связывание определяли с помощью меченого лиганда, неспецифическое - в присутствии 10 М немеченого лиганда (Новоселов, 1979). Связывание в необдуманном образце принимали за контроль, в облученном - выражали в процентах от контроля. Специфические камфор-связывающие белки определяли методом афинной хроматографии с использованием специфических иммуноглобулинов (igG) (Новоселов, 1987). Все

процедуры проводились при температуре 4°С.

Источником ЭМИ служил лабораторный генератор, изготовленный на базе ЬМЗ-551В. Стеклянные ячейки для облучения препаратов имели рубашки для термостатирования. Температура во время облучения - 4°С - строго поддерживалась с помощью термостата. Удельная поглощаемая мощность (УПМ) оценивалась с помощью термистора по скорости подъема температуры в центре образца, где условия рассасывания тепла наименее благоприятны, при выключенном термостатировании (Уилл, Кинн, 1983) и расчитывалась по формуле: УПМ - 4200 ДТ/Ъ [Вт/кг], где ДТ - прирост температуры (°С) за время 1 (сек). УПМ варьировалась от О до 18 Вт/кг.

Использовались стандартные методики, применяемые в исследованиях рецепции. Препарат готовили непосредственно перед опытом. Контрольный и облучаемый образец выдерживали в идентичных условиях. Облучение обычно проводили в течение 15 - 20 минут при 4°С (стандартная методика), строгом контроле температуры и осторожном перемешивании маленькой стеклянной мешалкой для устранения возможной температурной неоднородности. Через 30 мин после облучения проводили эксперименты по связыванию, спектро-фотометрирование образцов или ультраструктурный анализ выстилки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

з

_Деиствие__ЭМИ___на___?вязувание__Н;камфоры___рбонятельными_

РРУРГТРР!^1*!?-. элементами^ в отсутствии облучения специфическое

з

связывание Н-камфоры обонятельными рецепторными элементами было аналогично описанному ранее (Еезепко et а1, 1979). Облучение мембранной фракции в течение первых 15 минут приводит к существенному падению связывания. Эффект облучения значительно возрастает с уменьшением концентрации препарата по белку.

з

Связывание Н-камфоры мембранной фракцией нелинейно зависит от УПМ облучающего поля (Рис. 1). Так как для теплового действия микроволн характерна линейная зависимость от мощности, этот результат, демонстрируя нетермогенный эффект излучения, вызывает особый интерес.

При облучении тритоновых экстрактов мембранной фракции, содержащих растворенные компоненты мембран и солюбилизированные рецепторные элементы, эффект не наблюдается - специфическое связывание остается неизменным. От частоты модуляции величина эффекта не зависит. На неспецифическое связывание ЭМИ влияния не оказывает (Рис.2).

й

¥

п

Ряс. фракцией

1.

5 10

УПМ, Вт/кг Специфическое связывание

1 5

Н-камфоры неибранной

ткани обонятельного эпителия как функция удельной

поглощаемой мощности. 0,9 ГГц, 1 мг/мл, 15 мин.

100 р

VI 80

Э

о

ж гэ

60

40

20

10"* 10"*

10"

10

10"

П-4

Н

10 10"

К0НЦЕНТРАЦИЯ НЕМЕЧЕНОЙ КАМФОРЫ, з

Н-камфоры как функция

концентрации

Рис. 2. Связывание "Н-камфоры как немеченого лиганда. о - без облучения, 0,9 ГГц, 1 Вт/кг, 15 мин. Концентрация 3Н-камфоры 5х10~10 М.

- при облучении:

_ Влияние___ЭМИ____!Ч?--__Ф1'?£Я!!РР!РР?§н?§____Г?У1???1?РГР_*___

§;5£Р91??РГ?Э?Р?РГР-Р?Ц?П1РРР?:. Результаты измерений специфжчес-

\

з

кого связывания Н-глутамата мембранами клеток гиппокампа и

3 3

Н-дигидроальпренолола (Н -ЛГАП) мембранами клеток печени новорожденных крыс до и после облучения показывают, что связывание з

Н-глутамата под действием ЭМИ не меняется, а в случае (3-адренорецептора наблюдается существенное уменьшение связывания соответствующего агониста. Такин образом. ЭМИ не оказывает воздействия на процесс связывания лиганда глутаматным рецептором, относящимся к рецепторам ионотропного типа, и уменьшает специфическое связывание лиганда р-адренорецептором, функционирующим через систему вторичных посредников, как и обонятельный рецептор.

Обнаружоние__ вухода_ _рецепторных_ _ элементов_ _ из_ _ мембран_ в_ _ раствор. Одной из возможных причин уменьшения связывания может быть уменьшение количества мест связывания на мембране. Эту гипотезу легко проверить, сравнив супернатанты облученной и необлученной мембранных фракций. Однако данные спектрофото-метрических исследований и ЗОБ-электрофореза достоверной разницы между супернатантами облученной и контрольной мембранной фракции обонятельного эпителия не выявляют (Рис. ЗА).

' "д " ~В Рис 3. А. 80г - гель

; а Ъ в Ъ электрофорез супернатан-

.»* . ! тов контрольной (а) и

облученной ' (Ь) мембранной фракций; О,9 ГГц, 1 мг/мл, 15 мин. В. Бог-гель электрофорез специфических канфор -: 67" — связывающих белков, вы-

деленных методом афинной хроматографии: а - без

.„ __ _ ВР 55 ^ .

— <■■ облучения, Ь - после об-

лучения. Молекулярные массы калибровочных стан лартных белков показаны слева. Справа - субьеди-ницы камфор-связывающих белков - др 88 и др 55.

92К _

| 8Р 88

29К -

С учетом того, что рецепторные белки составляют 0, 1 У, от суммарного белка мембран и эффект поля специфичен именно к ним,

были проведены более тонкие исследования супернатантов облученной и контрольной мембранной фракции измерением связывания ими меченого лиганда. Только в супернатанте облученной мембранной фракции обонятельного эпителия наблюдалось связывание (Рис.4),

' I

I 2

О

о

10

33

с §

о

га Е-|

а

а

Рис. 4. Хроматограмма супернатантов необлучен-ной(») и облученной (о) мембранных фракций ткани обонятельного эпителия после инкубирования с

3

Н-камфорой. 0,9 ГГц,

1 мг/мл, 15 мин.

1 2 3 4 5

НОМЕР ФРАКЦИИ

что свидетельствует о наличии в нем рецепторных молекул, перешедших во время облучения из мембран в раствор. Выход рецепторных элементов из мембран в раствор был подтвержден иммунохимическими исследованиями. Субъединицы специфических камфор - связывающих белков присутствуют только в супернатанте облученной мембранной фракции, как видно из рисунка ЗВ.

3

Уменьшение связывания Н -ДГАП мембранами клеток, содержащими /3-адренорецептор, также обусловлено выходом рецепторных структур

3

в раствор под действием ЭМИ. Данные по ' связыванию Н-ДГАП супернатантами, полученными до и после действия ЭМИ

3

демонстрируют, что существенное связывание Н -ДГАП наблюдается только в супернатанте облученной мембранной фракции. Это связывание специфично, т. к. ингибируется блокатором р-адренорецепторов обзиданом, и обусловлено наличием в растворе рецепторных структур. Таким образом, действие ЭКИ на мембраны клеток печени новорожденных крыс приводит к частичному выходу /3-адренорецепторов в раствор.

- к*рлррода_ - ?_________91?*?

. ¡<!!!<РР§Р??- . . обонятельными___рецепторными___структурами^ Выход

рецепторных элементов из мембран в раствор иожет быть обусловлен частичной деструкцией нембран под действием ЭМИ. Одной из возможных причин разрушения некбран является процесс переписного окисления липидов (ПОЛ) - широко распространенный свободно -радикальный процесс, постоянно происходящий в той или иной нере в различных мембранных структурах с участием кислорода (Владимиров, Арчаков, 1972)■ Предположение о возможности его активации под действием ЭМИ радиочастотного диапазона получило экспериментальное подтверждение в двух работах: ОиЬгше1 (1959) методом ЭПР обнаружил образование свободных радикалов в хрусталике глаза; Плесков и др. (1990) показали нарастание концентрации продукта ПОЛ - малонового диальдегхда (МДА) при облучении липопротеидов в течение 5 часов. Ускорение процесса ПОЛ наблюдалось также и под влиянием миллиметровых волн (Шаров и др, 1963). Можно было предполагать наличие ПОЛ и в условиях наших экспериментов. Так как ПОЛ связано с потреблением кислорода, и его влияние на процесс очевидно, логическим продолжением работы явилась проверка влияния концентрации 02 в облучаемой суспензии .на взаимодействие микроволн с рецепторными структурами. Оказалось, что с ростом концентрации кислорода в облучаемой суспензии эффект ЭМИ значительно возрастает (Табл.1). Роль 02 в развитии эффекта микроволн позволяет предполагать наличие окислительного процесса, возможно, с участием свободных радикалов. Это предположение подтверждается экспериментами с использованием антиоксидантов. в отсутствии ингибитора свободно - радикальных реакций дитиотреитола (ДТТ) суммарный эффект никроволн и кислорода достигает максимального значения, добавка 1 мМ ДТТ несколько снижает эффект, а 15 мм ДТТ полностью его устраняют. Другой активный синтетический антиоксидант ионол

3

также полностью нивелирует влияние ЭМИ на связывание Н-камфоры обонятельным рецептором.

Таблица 1. Влияние кислорода на специфическое

3

связывание Н-камфоры обонятельным рецептором при облучении (0,9 ГГц, 1 Вт/кг, 15 нин, 1 мг/нл).

Концентрация 02 (%) Связывание (X)

О 100 * 11

21 60 ± 7, 5

96 20 1 2

- Поиск?- . иР9РХ!Я Р5_ . !?§Р®>??91?9ГР_ . P1ÎÏP5® - 5SPÏS9 5- -спеиррфотрмвтричвскив__исслвдрвания^ Лля прямого подтверждения гипотезы " об активации ПОЛ при облучении представляется целесообразным прямое измерение количества конечного продукта ПОЛ - МДА в мембранной фракции клеток. Эксперименты показали, что мембранная фракция содержит 3,9 пМ НЛА/мг липида в контрольных и облученных образцах, и концентрация его не меняется при облучении суспензий как с различным содержанием кислорода (О, 21, 96 '/.'/.), так и в присутствии антиоксидантов. Только при введении инициаторов ПОЛ количество ИЛА в мембранной фракции возрастает до 327 пМ НЛА/мг липида. Такин образом, мембранная фракция до и

после облучения в различных условиях содержит очень небольшое -- g

3,9 xlO И, но постоянное количество МЛА на мг липида, и лишь прямое инициирование ПОЛ многократно увеличивает его содержание.

Так как в биологических мембранах окислению подвергаются преимущественно полиненасышенные жирные кислоты, при этом появляется система сопряженных двойных связей. Молекулы с двумя сопряженными двойными связями (диеновые конъюгаты (ЛЮ) могут быть обнаружены спектрофотометрически - по появлению нового максимума в спектре поглооения при длине волны 233 пм (Placer, Kyzela, 1968). Однако наличие ДК в облученной суспензии не установлено в очень большом количестве тщательно проведенных с этой целью экспериментов.

3

Связывание^ _ Н;камфоры^ обонятельнык_ рецептором^ в_ _присутствии

PlïPSSf'???гР191Р§§У§1?!5-<ЭЛ1А)_и__ионов__желеэа. известно, что

2+

ионы двухвалентного железа Fe являются катализаторами ПОЛ. Ионы „ 2+

Fe проявляют каталитическую активность, находясь в смеси в

очень маленьких концентрациях, т. е. присутствуя, практически, в

виде примесей. Известно также, что ЭЛТА, являясь мощным

- 2+

хелатирующим агентом, может связывать ионы Fe , выводя их таким

_ о

образом из реакции. ЭЛТА в концентрации 2x10 M полностью

ингибирует процесс ПОЛ, но лишь в том случае, если железо

„ 2+

присутствует в смеси в виде иона Fe , а не в составе гема. Гем

(гемин, цитохром) также может катализировать ПОЛ, но на этот

процесс ЭЛТА не влияет (Wills, 1966). Лля выяснения вопроса об

2+

активации ПОЛ возможными примесями Fe в развитии эффекта

микроволн представлялось целесообразным провести облучение

ненбранной фракции в присутствии ЭЛТА. Эксперименты показали, что

2+

выведение из реакции возможных примесей Fe с помощью ЭЛТА на

3

связывание Н-камфоры обонятельным рецептором не влияет.

Эксперименты с ЭДТА приводят к выводу, что предполагаемый процесс ПОП не катализируется ионами железа. Однако вопроса о ПОЛ, катализируемом геминовым железом, эти эксперименты не снимают.

_ и с с ле£ование_ _ П0Л_ _ на_ _ Mo¿ie льных_ _ с ист емах_ _ I _ _ фосфолипи£ных_ Мембранная фракция обонятельного эпителия является сложной многокомпонентной системой. Мы попытались моделировать изучаемый процесс на более простой системе - фосфолипидных липосомах. Т.к. основным компонентом мембран клеток обонятельного эпителия является лецитин (фосфатидилхолин) (Коуаша, 1971) 34,8'/., липосомы готовили из лецитина. Развитие ПОЛ при облучении липосом регистрировали по образованию диеновых коньюгатов. Эксперименты показали, что ДК при облучении липосом не образуются.

Изменения____в____ультраструктур ной____организации_____ткани.

°брнятельнргр_эпителия^ Исследования эффектов низкоинтенсивной микроволновой радиации на ультраструктурном уровне немногочисленны (Barnes, 1989; Dwivedi, 1989). Их результаты указывают на высокую чувствительность мембран к ЭМИ. Ткань обонятельного эпителия до сих пор не была объектом подобных исследований, хотя представляет собой в этом смысле особый интерес. Обонятельные рецепторы сосредоточены на поверхности мембран клеток, а клетки являются классическими биполярными нейронами, которые постоянно обновляются. Обонятельная выстилка совмещает свойства эпителиальной и нервной ткани. Располагая литературными данными по воздействию ЭМИ на обонятельный анализатор in vivo и собственными результатами in vitro, представлялось целесообразным исследовать промежуточное звено этой цепочки - in situ. Облучение обонятельной выстилки при УПМ-1 Вт/кг в течение 15 мин приводит к деструкции и частичному разрушению как опорных клеток, так и обонятельных нейронов. Излучение большей модности (8 Вт/кг) вызывает слияние мембран жгутиков, содержащих рецепторные элементы; а при увеличении времени экспозиции наблюдается полное, разрушение обонятельных жгутиков и образование паракристаллических структур. Такие деструктивные изменения, наблюдаемые в системе in situ, согласуются как с собственными результатами in vitro, так и с результами по воздействию ЭМИ на обонятельный анализатор in vivo. Они говорят о возможных нарушениях процессов обонятельной рецепции на уровне целого организма при его облучении, что подтверждается литературными данными. (Лобанова, Гордон 1960;

фукалова, 1964).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Исследованные в настоящей работе рецепторы по способу их функционирования в клетке подразделяются на два типа ионотропные и метаботропные. ЭМИ оказывает влияние только на рецепторы второго типа, воздействие микроволн на обонятельный и (3-адренорецепторы вызывает уменьшение специфического связывания, наблюдаемое при облучении суспензии мембранной фракции. При облучении тритоновых экстрактов мембранной фракции специфическое связывание лиганда солюбилизированными рецепторами не ^ меняется. Из этого факта следует, что эффект имеет место только тогда, когда рецепторные элементы являются компонентами нативных мембран. Можно предполагать, что эффект не обусловлен изменением константы связывания лиганда с рецептором. Неспецифическое связывание под действием поля остается неизменным, т. е. эффект микроволн специфичен именно к рецепторным структурам.

Уменьшение связывания стимула рецепторами метаботропного типа обусловлено уменьшением количества центров связывания на мембране вследствие выхода рецепторных структур из мембран в раствор - "вымыванием" рецепторных белков. При микроволновом воздействии субъединицы рецепторного комплекса, ответственные за взаимодействие со стимулом, "вымываются" из мембран в раствор. Для обонятельного рецептора показано, что в раствор переходит лиганд-связывающая гликопротеиновая субъединица др88 и

субъединица др55, относящаяся к специфическим обонятельным в-белкам. При облучении препаратов, содержащих р-адренорецептор, по-видимому, "вымывается" лиганд-связывающая субъединица с М. в. 64кД. возможность "вымывания" мембранных белков в процессе облучения подтверждается экспериментами Либурди (1.1Ьигс1у, 1987) .

После выяснения причины уменьшения специфического связывания для рецепторов метаботропного типа, которая заключается в "вымывании" белков под действием поля, становится более понятным факт отсутствия влияния микроволн на рецепторы первого типа. По-видимому, такая закономерность действия ЭМИ обусловлена структурными особенностями рецепторов. метаботропные рецепторы состоят из нескольких белков, которые можно разделить биохимически. Они могут связываться с эффектором временно или косвенно. Существует гипотеза "плавающего рецептора", подтвержденная экспериментально, согласно которой рецепторы не связываются в постоянные комплексы, а "плавают" в мембрану,

взаимодействуя с различными структурами: транспортными системами, ферментами и т.д. (Хухо, 1990). Ионотропные рецепторы по сравнению с метаботропными являются более простыми мембранными белками. Они имеют собственную эффекторную систему .- в ионном канале она является жестко сцепленным интегральным компонентом трансмембранного белка. С-концы полипептидных цепей глутаматных рецепторов обогащены цистеином; дксульфидные ностики между парами этих аминокислот стабилизируют рецепторы, плотно упакованные в сипаптической мембране (ВеЪг, 1990). Возможно также, что сульфгидрильные группировки в большой концентрации служат естественным антиоксидантом, предохраняющим кембраны, содержащие "канальные" рецепторы, от процессов ПОЛ. По-видимому, именно в силу таких структурных особенностей глутаматные рецепторы не вымываются из мембран в раствор под действием поля.

Полученные в настоящей работе результаты наряду с литературными данными позволяют полагать, что микроволны воздействуют специфически только на рецепторы метаботропного типа. Результатов, противоречащих данному утверждению, в литературе не обнаружено.

"Вымывание" рецепторных белков нелинейно зависит от УПМ облучающего поля. Кроне того, общий подъем температуры облучаемой суспензии составлял не более О, 1°С за все время облучения, что дает возможность говорить о нетепловон воздействии микроволн. Контрольные эксперименты с "обычным" нагревок показали, что уменьшения связывания не происходит. Поскольку повышение температуры в контрольных экспериментах заведомо больше величины ДЬ при облучении, это также дает право утверждать, что эффект поля не вызван интегральнын нагревок.

Поскольку полученные результаты достаточно убедительно демонстрируют нетепловую природу эффекта, тепловые механизмы действия ЭМИ можно исключить из рассмотрения. Существующие "нетепловые" гипотезы о механизмах действия ЭМП не могут объяснить эффект "вымывания". Предположение об интенсивных неханических колебаниях, возникающих под действием импульсно -модулированных полей, которые индуцируют различные конформа-ционные перестройки в мембране (Тигранян, Шорохов, 1985), несостоятельно, поскольку "вымывание" происходит и при облучении немодулированными микроволнами. Теоретические расчеты (вгаЪЪЬо1а еЬ а1, 1982а, 1982; СЫаЪгега еЪ а1, 1984, 1985) для лиганд -рецепторного взаимодействия под влиянием поля приводят к выводам, не соответствующим полученным нами результатам, и,

следовательно, также не могут быть привлечены для объяснения наблюдаемого эффекта.

Процесс "вымывания" рецепторных белков при микроволновом облучении выявляется только при наличии в среде кислорода. Интенсивность его растет с увеличением концентрации в

облучаемой суспензии. Этот результат наряду с тем, что "вымывание" рецепторных элементов ингибируется антиоксидантами, достаточно однозначно указывает на химическую природу эффекта.. На основании этих данных становится понятной зависимость специфического связывания от концентрации мембранной фракции по белку. По-видимому, ингибирование "вымывания" с ростом концентрации мембранной фракции происходит в результате уменьшения эффективной концентрации 02 на единицу массы мембранной фракции и, возможно, увеличения концентрации естественных антиоксидантов. Большая роль кислорода и антиоксидантов в формировании микроволнового эффекта убеждает, что в системе возможны процессы ПОЛ мембран. Однако прямые измерения концентрации продуктов ПОЛ не выявили накопления этих продуктов в ходе облучения. Все это позволяет сделать заключение, что облучение не приводит к достоверно

регистрируемому увеличению продуктов ПОЛ в мембранной фракции. На модельных системах ПОЛ также не обнаружено.

Тем не менее, полученные результаты не снимают полностью вопроса о ПОЛ как о возможном первичном механизме наблюдаемого эффекта. Дело в том, что ПОЛ может носить локальный характер (Orrenius et al, 1964). Инициаторами ПОЛ в биологическом препарате являются как свободные ионы так и железо в

составе гема, которое обычно входит в ферменты окислительно -восстановительных цепей (Владимиров, Арчаков, 1972); более того, гемовое железо в качестве катализатора ПОЛ примерно в 100 раз активнее солей железа (Wills, 1965). Возможность образования радикалов с участием ферментных систем показана теоретически и экспериментально (Владимиров, Арчаков, 1972). Есть данные, что ферменты могут быть инициаторами цепного окисления липидов (Nilsson, 1969a,b). На примере микросом показано, что ПОЛ может происходить в области NABGH-специфичной цепи переноса электронов (Orrenius et al, 1964). Весьма вероятно, что подобные ферментные системы расположены преимущественно в местах локализации рецепторов - для обеспечения энергетики процесса рецепции. Кроме того, не исключено, что и сами рецепторы каким-то образом могут

участвовать в восстановлении кислорода. Иненно локальные процессы ПОЛ способны вызвать деструкцию кембраны в области расположения рецепторов, не изменяя заметно общего содержания продуктов ПОЛ в мембранной фракции препарата. Здесь же следует отметить, что оценка ПОЛ по выходу МДА не является вполне чувствительным методом для определения степени ПОЛ (Владимиров, Арчаков, 1972), а Ж являются промежуточными продуктами и способны претерпевать дальнейшие превращения. Поэтому по результатам измерения продуктов ПОЛ можно судить лишь о макроизменениях в общей массе липидов. Предлагаемая модель предполагает ферментативный путь локальных поцессов ПОЛ, а не путь нефернентативный, который требует наличия солей двухвалентного железа и ингибируется ЭДТА.

По-видимому, по специфичности действия микроволнового поля на мембранные структуры в растворе можно выделить три области: раствор, границу раздела между мембраной и раствором и мембрану, как таковую. Наибольший интерес для нас представляют первые две области, так как в самой мембране величина микроволнового поля значительно меньше внутримембранных полей (<10 В/и). Предположим, что ЭНИ активирует некоторые реакционные центры Э поверхностных белков, способных взаимодействовать с кислородом, т. е. [Э] - £Зо] £ С Е), где [Э^ - их исходная концентрация, а Е -амплитуда электрической компоненты поля. Схематически реакцию с этими центрами можно представить в следующем виде:

к1

02 + Б —— Р к2

где Р - продукт реакции, концентрация которого [Р] пропорциональна количеству "вымывающихся" рецепторных элементов, рассмотрим наиболее вероятный вариант такой реакции. Поскольку, величина эффекта сильно зависит от концентрации 0^, примем, что [Э] находится в избытке. Исходя из кинетической теории для стационарного случая, можно записать : [Р] = [О2] СЭ] (1),

где К^-к^/к^ Подбираем вид функции £ С Е). Наилучшее согласие

теоретической кривой с экспериментальными точками получается,

2

если £(Е)-ехр(аЕ), а не в случаях, когда ЗЕ(Е)-ЬЕ или £(Е)-ЬЕ . После подстановки функции £(Е) выражение (1) преобразуется к виду: [Р] - [02] Ь, где Ь - 1/( 1+ехр (Ео-Е)/0), Р - 1/а и Ео- С/Ш(Ка/[80]).

Каков физический смысл выражения [3]-[8о]ехр(аЕ)? Если выразить а в виде: а - Р Е/кТ, где к - постоянная Больцмана, Т -

температура, P - дипольный момент, Е - амплитуда электрической компоненты поля, то это выражение описывает ориентационный эффект поля для частиц, имеющих постоянный дипольный момент PQ в случае, когда они выстраиваются строго вдоль поля. Тогда SQ будет представлять максимальную концентрацию таких частиц, способных ориентироваться в поле. Расчеты, выполненные исходя из полученного для а значения 15 В/м, показывают, что дипольный

7

момент таких частиц должен составлять около 10 D. Это намного превышает известные значения диполъных моментов простых молекул и белков. Но есть данные, что дипольные моменты некоторых биологических структур могут быть соизмеримы с расчетной величиной 10 D (Исмаилов, 1987). В эксперименте мы использовали кембранную фракцию обонятельной выстилки. К сожалению, данных о ципольном моменте таких структур нет. Поэтому вопрос об эриентациоином эффекте поля остается пока открытым. Тем не менее, отсутствие линейной зависимости эффекта "вымывания" рецепторных элементов от УПМ практически не оставляет других возможных ¡ариантов объяснения первичного механизма действия ЭМИ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знание механизмов действия неконизирующей радиации в целях безопасности биосферы является насущной проблемой сегодняшнего 1ня. В настоящей работе предпринята попытка решения одного из спектов этой проблемы. В работе впервые показано, что в условиях ермостатирования in vitro ЭМИ дециметрового диапазона влияет на еморецепторы метаботропного типа. Результаты исследований бонятельного рецептора в системах in vitro и in situ коррелируют имеющимися литературными данными по влиянию ЭМИ на бонятельный анализатор in vivo - понижением порогов

бонятельной чувствительности при облучении целого организма, меньшение связывания стимула (З-адренорецептором под влиянием икроволн также согласуется с литературными данными о том, что икроволны могут играть роль антагонистов р-аренорецепторов на эовне целого организма. На основании полученных результатов и «тературных данных можно полагать, что такие рецепторы в звокупности с мембраной, которая служит "сценой действия", шлются первичными мишенями, воспринимающими воздействие жроволн. Поскольку эти рецепторы очень широко представлены в >ганизме, не исключено, что в формировании биологических )фектов ЭМИ in vitro имеет место описанный механизм.

выводы.

Исследовано влияние ЭМИ дециметрового диапазона (900 МГц) на различные хеморецепторные структуры крысы. Показано, что :

1. В условиях термостатирования in vitro ЭМИ оказывает влияние на рецепторы метаботропного типа - обонятельный и |3-адренергический и, напротив, не влияет на глутаматный рецептор, относящийся к рецепторам ионотропного типа.

2. Воздействие поля на метаботропные рецепторы вызывает уменьшение специфического связывания рецепторов со стимулом. Двухкратное уменьшение связывания происходит при удельной поглощаемой мощности 1,9 Вт/кг.

3.Ингибирование специфического связывания стимула рецепторами метаботропного типа имеет место только в том случае, когда рецепторные элементы являются компонентами нативных мембран; на связывание лиганда солюбилизированными рецепторныни элементами ЭМИ не влияет.

4. Уменьшение связывания стимула р-адренэргическим и обонятельным рецепторами под действием поля обусловлено уменьшением количества центров связывания на поверхности мембран вследствие выхода рецепторных структур из меибран в окружающий раствор, т. е. "вымыванием" рецепторных белков. Эффект "вымывания" достигает 80У..

5. Интенсивность "вымывания" рецепторных белков из мембран коррелирует с содержанием кислорода в облучаемой суспензии, процесс ингибируется антиоксидантами, что свидетельствует о возможном участии процессов ПОЛ в развитии эффекта микроволн. Однако накопления продуктов перекисного окисления общей массы липидов не обнаружено.

6. Выход рецепторных белков из мембран в раствор достигает насыщения при УПМ 5 Вт/кг и не зависит от частоты модуляции от 1 до 100 Гц. Тепловое действие ЭМИ не является первичным нэханизмом "вымывания". Предлагаемая модель допускает ориентационный эффект микроволнового поля.

7. Облучение интактной обонятельной выстилки (in situ) вызывает изненение ее ультраструктуры. При УПМ 8 ВТ/кг наблюдается слияние мембран жгутиков, несущих рецепторные элементы, что говорит о возможных нарушениях процессов обонятельной рецепции на уровне целого организма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Филиппова Т. М., Новоселов В.И., Быстрова М.Ф., Алексеев С.И. Влияние микроволнового поля на обонятельные рецепторные элементы. Деп. ВИНИТИ N6965-B86, 1986, 12 стр.

2. Филиппова Т.Н., Новоселов В.И., Алексеев С.И. Влияние ЭМИ дециметрового диапазона на рецепторные структуры. Тезисы докладов симпозиума "Механизмы биологического действия электромагнитных излучений". Пущино, ОНТИ ИЦБИ, 1987, стр. 20-21.

3. Алексеев С. И., Большаков М. А.,, Филиппова Т. М. О механизмах действия ЭМИ дециметрового диапазона на нервную клетку. Тезисы докладов симпоз иума "Механизмы биологического действия электромагнитных излучений". Пущино, ОНТИ 1ЩБИ, 1987, стр. 35-36. t

4. Филиппова Т.М., Новоселов В. И., Алексеев С. И. Способ выделения поверхностных рецепторных белков. Авторское свидетельство N1383540, 1987.

5. Philippova Т.М., Novoselov V.I., Bystrova M.F., Alekseev S.I. Microwave effect on camphor binding to rat olfactory epithelium. Bioelectromagnetics, 1988, v. 9, pp. 347-354.

6. Philippova T.M., Popov V.I., Novoselov V.I., Alekseev S.I. Changes in ultrastructures of epithelial tissues by microwaves. Thesis of Int. Congress "Molecular changes by microwaves", Vien, 1990.

7. Alekseev S.I, Philippova T.M, Novoselov V.I. Microwave effect on different types of receptors. Thesis of First Congr. E.B.E.A., Brussels, 1992.

8. Philippova T.M., Popov V.I., Novoselov V.I., Alekseev S.I. Microwave effect on rat receptor system. Thesis of First World Congress "Electricity and Magnetism in Biology and Medicine", Florida, USA, 1992.

9. Philippova T.M., Novoselov V.I., Alekseev S.I. The influence of microwaves on different types of receptors and the role of peroxidation -of lipids on receptor protein shedding. Bioelectromagnetics, 1993, in press.