Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы генерации кальциевых сигналов в гранулярных нейронах мозжечка мышей и их изменения в постнатальном онтогенезе

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Механизмы генерации кальциевых сигналов в гранулярных нейронах мозжечка мышей и их изменения в постнатальном онтогенезе"

г;, од

• їла ..Національна академія наук України 1 І НОрАстіігу*г фізіології ім. О. О. Богомольця

ВОЙТЕНКО Нана Володимирівна

На правах рукопису

МЕХАНІЗМИ ГЕНЕРАЦІЇ КАЛЬЦІЄВИХ СИГНАЛІВ У ГРАНУЛЯРНИХ НЕЙРОНАХ МОЗОЧКА МИШЕЙ ТА ЇХ ЗМІНИ В ПОСТНАТАЛЬНОМУ ОНТОГЕНЕЗІ

03.00.05 — біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ 1995

Дисертацією є рукоппс.

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи (завідуючий — академік П. Г. Костюк) Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Наукові керівники: академік КОСТЮК П. Г., доктор медичних наук ВЕРХРАТСЬКИЙ А. Н.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук ЗИМА В. Л., кандидат біологічних наук ЦИНДРЕНКО А. Я.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України.

Захист відбудеться «-^^-» ---- 199^ р.

0-/..Ч год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:

252024 Київ 24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий «

Ж» ^_^*^й9Эгроку

Учений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОКОТИ Актуальність проблеми. Внутріклітинний кальцій розглядається в сучасній фізіології як однії із найбільш універсальних регуляторів клітинних функцій, іони кальцію забезпечують передачу сигналів від структур плазматичної мембрани до внутріклітинних механізмів, запускаючи ряд важливих цитоплазматичних процесів, які лежать в основі клітинного збудження, пластичності, скорочення, секреції, метаболічних процесів та регуляції генетичного апарату. Регуляція внутріклітинної концентрації кальцію відзначаються функціональною активністю багатьох структур як плазматичної мембрани, так і внутріклітинній органел.

Основними шляхами, що забезпечують зростання цитоплазматичної концентрації кальцію в нервових клітинах, є кальцісві канали плазматичної мембрани та внутріклітинні кальцієві депо. Основні параметри цих систем вже вивчені досить детально, однак ще неясними лишаються деякі аспекти їх довготривалої регуляції, взаємозв'язки і зміни в ході онтогенезу. Виходячи з цього аналіз систем, що підповідають за регуляцію внутріклітинного кальцієвого гомеостазу, та їхніх змін у процесі росту та розвитку без сумніву становить науковий інтерес.

Мета дослідження полягала у вивченні механізмів генерації внутріклітинних кальцієвих сигналів у нервових клітинах зрізів мозочка. Основні завдання ; 1. Розробити методику неінвазивного вимірювання концентрації іонизованого кальцію в цитоплазмі нейронів мозочка; 2. Дослідити основні механізми підвищення концентрації кальцію в цитоплазмі гранулярних нейронів мозочка; 3. Дослідити зміни механізмів генерації кальцієвих сигналів в гранулярних нейронах в постнатальному онтогенезі.

Наукова новизна роботі’.. Були описані процеси входу кальцію крізь потенціал-керовані кальцієві канали плазматичної мембрани в результаті деполяризації гранулярних нейронів мозочка. Вивчались властивості кофеїн-чутливих та П’з-чутливих внутріклітинних кальцієвих депо в гранулярних нейронах. Вперше були описані зміни функціонування Нечутливих кальцієвих депо в процесі розвитку нервових клітин і охарактеризовані зміни в роботі механізмів підтримання внутріклітинні)!

концентрації кальцію, які вимикають у процесі старіння.

Практична цінність роботи полягає у виявленні онтогенетичних особливостей стану кальцій-регулюючих систем нервових клітин, що може мати значення для корекції порушень функціонального стану нервової системи в процесі розвитку і старіння.

Апробація роботи. Результати роботи булі подані на конгресі Міжнародного Союзу з фізіологичних наук (Глазго, 1993); на І конгресі Європейської Федерації фізіологичних наук (Маастрихт, 1995); на науковій сесії до 100-річчя створення кафедри фізіології Львівського медінституту (Львів, 1995) та на засіданні спеціалізованої ради Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Об'єм та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів, обговорення, 8 висновків та списку літератури з 174 найменувань. Робота викладена на 116 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 16 рисунками та однією таблицею. Результати роботи подані у 8 друкованих працях у провідних міжнародних журналах.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ Підготовка препарату. Дослідження проводились на гранулярних нейронах в тонких зрізах мозочка, виділених із мозку мишей лінії СВА різних вікових груші: новонароджених (6 днів), дорослих (1 місяць) і старих (ЗО місяців). Після декапітації мозок занурювали в холодний соляний розчин (0 - 4°С) і виділяли з нього мозочок. Процедура від початку декапітації до виділення мозочка тривала не більше 60 -90 секунд. Потім мозочок приклеювали поліакріламідним клеєм до підложки мікротому (Campden, Campden Instrument LTD, U.K.); камера вібротому заливалась холодним соляним розчином. Зрізи нарізувались сагітально товщиною 150 -200 мкм; швидкість подачі леза - І см/с з частотою 11 Гц. Після приготування зрізи клали в розчин, постійно пробулькуваний карбогеном (5% COj + 95% Oj). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи відмивались в постійно оксигенованому розчині 20 хвилин при кімнатнііі температурі.

Фарбування зрізів флуоресцентним барвником. Для завантаження зонда зрізи інкубували в розчині Тіроде, який містив естерифіковану, незаряджену форму барвника Фура-2/АМ в концентрації 5 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиді з доданням детерге/гту Плуроник Р-127 (0.02%). В такій формі барвник проходить в клітину, потім ендогенними естеразами ефірні групи відокремлюються, зонд стає зарядженим і залишити клітину не може. Фарбування проводилось 20 хвилин при температурі+35°С. Концентрація зонда в клітині визначалась, шляхом титрування пофарбованих клітин розчином барвника, який додавався у внутрішньоклітинний розчин. Визначена таким способом концентрація зонда в клітині була в діапазоні 30-70 мкмоль/л.

Важливим параметром для коректного визначенім [Са2+]і в клітині є фонова флуоресценція, яка складається із автофлуоресценції клітини і сигналу від навколоклітннних тканин. Нескомпенсований сигнал може суттєво викривляти істинне значення |Са3+]г Для її визначення клітини, пофарбовані проникаючим аналогом барвника, після проведення досліджень були діалізовані, при цьому внутріпіпетковии розчин не містив зонда. Паралельно з визначенням потенціалу спокою внутріклітинне середовище з барвником вимивалось розчином, який не містив зонда. Після 10 хвилин перфузії визначали рівень фонової флуоресценції, який використовувався при розрахунках істинного значення |Са2+);. • ■

Структура експериментальної установки для двохвильового вимірювання концентрації іонів кальцію зображена на рис. 1. Основними елементами її є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп, детектор, модуль попередньої обробки сигналів і комп'ютер. Детально структура експериментальної установки викладена у відповідних статтях.

Розчини та зміна розчинів. При роботі зі зрізами усі розчини готувались на базі розчину Тіроде такого складу (в ммоль/л): №С1 - 125, КС1 - 5.4, \1gCl - 1, СаСІ2 - 2.5, КаНСОз - 26, КН2РО4 - 1.6, глюкоза - 10, постійно пробулькуваний газовою сумішшю 95% О2 + 5% С02 (pH = 7.4). Безкальцієвий розчин готувався еквімолярною заміною СаС12 на ІУ^СІї та додаванням 1 ммоль/л ЕСТА, розчини з підвищеним вмістом калію або кофеїну - заміною №СІ на відповідну кількість КСІ або кофеїну.

З

Внутріпіпетковий розчин містив (у ммоль/л) : КС1 -140, - 1, ЕОТА

- 1, НЕРЕБ-ЫаОН - 10 <рН=7.4).

Зміна розчинів проводилась протоком, швидкість якого регулювалась від 10 до 20 мл/хв. Об’єм експериментальної камери дорівнював 0.5мл. Всі експерименти були проведені при кімнатній температурі (22-24°С).

' о>зу

кадьціймстрическая

система

ртупт

дашіа

система смснн фклыров

fuc.J. Принципова схема експериментальної установки&ія двахшиышого вимірювання концентрації іонів кальцію.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ Визначення хситтєспроможиості гранулярних нейронів у зрізах мозочка проводили перед початком дослідження гомеостазу кальцію шляхом визначення мембранного потенціалу методом patch-clamp. Конфігурація whole-cell в режимі фіксації струму з внутрішньопіпеточним розчином, який містив 130 ммоль/л КС1, дозволяла досліджувати основні функціональні властивості нейронів: мембранний потенціал спокою (МП) і здатність генерувати потенціали дії (ПД). Суттєвої різниці у МП у новонароджених і дорослих тварин знайдено не було. Дані, які були отримані на зрізах мозочка дорослих і старих тварин, показані на рис.2. Як видно з рисунку, МП гранулярних нейронів розподіляється навколо двох стабільних рівнів - -55+-60 мВ і -35+-40 мП. Гранулярні нейрони з біліли негативним МП, ніж -55мВ, були златні генерувати II/! у відповідь на деполяризацію мембрани, в той час як нейрони г МП близько -35мВ продукугали тільки пасивні електротонічні відлови'. Ми вважали, що нейрони з дєполяризованою мембраною являють (. бпопуляцію клітин, якимось чином пошкоджених під час процедури в -ділення, тому в наші

експерименти по вивченню гомеостазу кальцію були взяті тільки клітини з МП більш негативним, ніж -55мВ.

201

N

10

Дорослі

—|

0 -60 -50 -40 -30

Мембранний потенціал (мВ)

20

N

10

Старі

-70 -60 -50 -40 -30

Мембранний потенціал (мВ)

Рис.2. Розподіл значень мембранного потенціалу гранулярних нейронів у зрізах мозочка дорослих та старих мишей.

- ч

Зіставлення Са2+ сигналів у гранулярних нейронах новонароджених і дорослих тварин

Вхід іонів Са2У крізь потенціал-керовані канали. В стані спокою концентрація цитозольного кальцію в гранулярних нейронах мозочка знаходиться в районі 30-80 нмоль/л як у новонароджених, так і у дорослих тварин; середнє значення [Са2+]| для новонароджених мишей було 61 ±11 нмоль/л і 58±15 нмоль/л для дорослих. Для вивчення змін [Са2+]і . в гранулярних нейронах ми використовували т.з. “калієву деполяризацію”. Для цього нормальний зовнішньоклітипний розчин замінювали на розчин, який містив підвищену концентрацію іонів калію. Аплікація гіперкалієвого розчину, який містить 50 ммоль/л К+, викликала швидкий ріст ІСа2+]| у нейронах (рис.З) з середньою амплітудою 440±64 нмоль/л для новонароджених і 590±86 нмоль/л для дорослих тварин. Калієва Деполяризація в умовах відсутності іоніп Са2+ у зовнішньоклітинному розчині була нездатна викликати будь-які зміни (Са2+)і в усіх досліджених нейронах. Аналогічна . деполяризація блокувалась додаванням у зовнішньоклітинний розчин 100 мкмоль/л органічного блокатора кальцієвих каналів верапамілу. Базуючись на наведених даних, можна гадати, що збільшення |Са2+)і, індуковане

деполяризацією, відбувається за рахунок трансмембранного входу іонів Са2+ крізь потенціал-керовачі кальцієві канали.

Для того щоб з’ясувати потенціал-залежність (Са2*"]; транзієнтів, ми послідовно аплікували зовнішньоклітинні розчини, які містили зростаючі концентрації іонів калію. На рнс.4А показана концентраційна залежність [Са2+]і транзієнтів, викликаних калієвою деполяризацією. Дані отримані на одній клітині. Із рисунка видно, що навіть невелика деполяризація, викликана прикладанням 10 ммоль/л К+, викликає |Са2+)і транзієнт відносно великої амплітуди. Інкубація зрізу в розчині, якій містив Імкмоль/л ТТХ, підвищувала поріг. К+-індукованої зміни |Са2+|, до 20 ммоль/л зовнішньоклітинного КС1 (рис.4В). Це говорить ! ро те, що для активації готенціал-керованнх Са2+ каналів необхідно сильніше деполярнзувати мембрану, ніж для порога генерації потенціалів дії.

Для з’ясування відносного вкладу різних типів потенціал-керованих Са2+ каналів в генерацію [Са2+]| транзієнтів ми вико, ніс говували ряд фармакологічнії.': блокаторів різних типів Са2+ каналів. Іони нікелю (50 мкмоль/л) використовувались як блокатор низькопорогових Са2+ каналів (Т-типу). №2+ ефективно пригнічував амплітуду |Єа2+], транзієнтів, викликаних помірною деполярн »ацією (20 ммоль/л К+), але ніяк не впливав на відповіді, викликані 50 ммоль/л К+ (рис.4С). Відповіді, викликані сильною деполяризацією (50 ммоль/л !£+), пригнічувались на 40%-50% блокатором високопоропшіх Са2н каналів (Ь-типу)-верапамілом. Амплітуда К+-індуковапих [Са2+1, транзієнтів пригнічувалась на 30%-40% також специфічним блокатором Ы-типу Са2+ каналів— ы-коноюксином О'/ІА (o)-CgTX). На рис.40 показана концентрацііїна залежність блокування |Са2+]і транзієнтів, викликаних калієвою деполяризацією. Приведені дані говорять про те, що підвищення [Са-!+||, викликане деполяризацією, виникає іа рахунок активації низькопорогових і декількох типів високопороговпх Сд-+ каї ілів. Кофеін-чутливі депо і кальцій-індуковане звільнення :-аіьцію. Аплікація 3040 ммоль/л кофеїну на зрізи мозочка викликалі збільшення |Са2+|, в гранулирних нейронах (рис.5А). Звичайно амиліті ". кофеїн-індукованого

40 -1

ОСа

Рис. 3. Підвищення /Саі'}і, вимикане деполяризацією 50ммаїь/л КСІ,

А

«00 ч !

ї

М

С

400

«оо - “• і /1 /І ! ■ ■ ЇГ ■ Л

^ииУУч * - - • * - КСІ 60 • 60 • 1 . ^хЛ^. і---

ю го зз 4* бо

і**мттх

гок*ттх гок*ттх»м

60 к *

ТТХ ♦

У*г

|к*1. <тМ)

Рис.4. Кальцієві трапжшпи, вимикані аплікацією розчинів КСІ А: зі зростаючими концентраціями у контролі; В: те ж у присутності / мкмоль/л 7ТХ; С: зверху - 20 ммоль/л КСІ у контролі, і ТТХ та з АУ’ (50 мкмаїь/л); знизу - 50 мнаїь/л КСІ з ПX, Мі2' та верапа.иіюм (ЗО мкмоль/л); /) - концентраційна залежність ампіітуд кальцієвих триншнтів у контролі (п~11); з 7ТХ (л-10); з ТТХ та №і}'(п-}0); з ТТХ та н'-('^7Х (І мк.иаіь/л) (п~9). Вказана середня похибка середньої величини.

|Са2Ч, транзіємту збільшувалась після калієвої деполяризації і зменшувалась при послідовних аплікаціях кофеїну. Такс зменшення, певно, свідчить про виснаження кальцієвих запасників цих нейронів. Для того що§ відновити амплітуду кальцієвих викидів у відповідь на прикладення кофеїну, було необхідно спочатку заповнити ці запасники, що досягалось підвищенням [Са2+], за допомогою калієвої деполяризації. Середні амплітуди кофеїнових відповідей (виміряні через 60 с після калієвої деполяризації) складали 87±37 нмоль/л для новонароджених і 54±11 нмоль/л для дорослих. Порогова концентрація кофеїну, здатна змінити [Са2+];, була 10 ммоль/л, що суттєво вище порогових концентрацій для інших типів нейронів ссавців. Кофсі,. продовжував викликані збільшення [Са2+1; ь умовах відсутності іонів кальцію у зовнішньоклітшшому середовищі, що дозволяє стверджу вати, що ці кофеїн-індуковамі [Са2+], транзіиіги є результатом звільнення кальцію з внутрішньоклітинних запасників. Більш того, блокада 8Ь!<СА-насосів ЕР тапсигаргіном повністю і необоротно пригнічувала кофеїн-індуковані |Са2<], транзієнти в гранулярних нейронах (рис 5В). При цьому тапенгаргін ніяк не впливав па базальний рівень [Са2+]1;

Далі нами була здійснена спроба виявиш існування кальцій-індукованого звільнення кальцію (СІСІ^) в гранулярних нейронах мозочка. Для ■шзначення внеску СІСІІ в [Са2ч|, транзієнти, викликані деполяризацією, ми порівнювали відповіді на киїіеву деполяризацію в контролі після спустошення кальцієвих депо ЕР кофеїном та в присутності порогової концентрації кофеїну. При цьому припускалось, що низькі концентрації кофеїну повинні зменшувати поріг активації каналів ЕР і, таким чином, полетіти розпиток СІСЯ, а спустошення кальцієвих депо від запасів іоніюваного Са2<~ повинно запобігати розвитку Са2*-індукованого шшільнепня Са21- і зменшувати амплітуду К+-іпдуковано-ч гіідвіщепня |Са2*|і Однак амплітуди |Са2+|, транзитів в тр, випадках

практично не відрізнялись одна від одною в нейронах обох вікових груп (рис 6). Інкубація зрізів з ріанодпном (ЮОмки о.іь/л) на протяіі 10 міи.іпн також, як і блокада насосів ЕР іанспгарі > лом, не впливала на н.ір:і\кірн К'-індукованих |Са-'*|, траїкієніів (рис.51!;.

f

і

50 К

ЗО

caffeine

50 К caffeine

І БО я

50 К caffeine

lhapsJgarffin

Рис. 5. Кофеїн - індуковані [Са2*]І тратієнти у гранулярних нейронах мозочка.

А: Приклади ІСа2*}( транжнтів, які були викликані аплікацією ЗО ммоль/л кофеїну, в нейронах новонароджених (Р6, зверху) та дорослих (РЗО, внизу) мишей.

. В: інгібування кофеїн - індукованих / Са2*]( тр шзієнтів тапсигаргіном. Зріз мозочка дорослої миші інкубузався на протязі 5х«ил. в розчині, який містив 500 нмоль/л тапсигаргіну. '

25 К

25 К

40 caf 25 К W caf 25 К +10 cat

Рис.6. Відсутність впливу спустошення кофеїн ^чутливих внутріклітинних Са2* депо па амплітуди А" -індукованих транжнтів

А: X' -індуковані [Са2*}1 трапзіснти, які були виміряні па нейроні дорослої миші в контролі, після спустошення Са2* депо аплікацією 40 ммоль/л кофеїну і в присутності 10 ммоль/л коф/сїну.

В: ко*рсїн-індуктанс підвищення JCo1^fl в контролі і одразу після аплікації 25 ммоль/л КСі. .

40 caf

Огже, з вищенаведених даних випливає, що фармакологічна модуляція внутріклітинних Са2+ депо не здатна суттєво змінити параметри [Са2+|і транзієнтів, що активуються при деполяризації. Отримані дані дозволяють також припустити відсутність С1СІІ в гранулярних нейронах мозочка мишей (принаймні в діапазоні зміни [Са2+1і від 300 до 500 нмоль/л). Необхідно зауважити, що усі експерименти були проведені при кімнатній температурі.

Лгоніст-іидукована зміна [Са1+]і . Зовнішньоклітшша аплікація 100 мкмоль/л глутамату викликала збільшення [Са2+], в нейронах новонароджених і дорослих тварин. Амплітуда глутамат-індукованого |Са24 1і транзієнту значно змінювалась під клітини до клітини і була в діапазоні 100-600 нмоль/л для обох вікових груп. Суттєва різниця в глугамат-індукованннх Са2+ відповідях у нейронах новонароджених і дорослих тварин спостерігалась в експериментах, проведених у безкальцієвих зовнішньоклітинних розчинах. Більшість гранулярних нейронів новонароджених мишей зберігали здатність генерувати глутамат-акгивоване підвищення [Са2+\{ після 2 хвилин інкубації зрізу в безкальцієвому розчині. Інкубація ж зрізів мозочка дорослих тварин в безкальцієвому розчині повністю пригнічувала глутамат-індуковані |Са2Ч; транзієнти в усіх тестованих гранулярних нейронах. Дані експериментів показані на рис.7.

Відомо, що глутаматні рецептори можуть брати участь в генерації кальцієвих сигналів ' як завдяки входу іонів Са2+ крізь гілазмалему (іонотропні ОІиЯї), так і внаслідок активації вивільнення іонів Са2+ з ІР3-чутливнх кальцієвих депо ЕР (метаботропні вІиЯ.1;). Базую пісь на наших спостереженнях, ми . припустили, що дані механізми можуть бути по-різному представлені в гранулярних нейронах на різних стадіях розвитку. Для з'ясування цього питання ми вимірювали [Са2+]( транзієнти, шо були викликані аплікаціями різноманітних агоністів глутаматних рецепторів. Трппс-АСРО. В наших експериментах прикладення транс-АСРО (100-50()мкмоль/л) не викликало підвищення |Сп2+); в нейронах зрізів мозочка. А'внквашп (£>Л/\ Аплікація 10 мкмоль/л ОА викликала суттєве ішішицсннн |Са2 *■ |, п усіх досліджених нейронах як новонароджених, так

100 иМ Clu

100 цМ Clu 0 Ca

Рис. 7. Глутамат-індуковапе підвищення (Са3*^ в гранулярних нейронах мозочка мишей різних вікових груп.

Реєстрація (Са2'}{ сигналів у відповідь на аплікацію 100 мкмоль/л глутамату в нейронах новонароджених (А) та дорослих (В) мишей у контролі та в безкальцісвому розчині.

300 -

k ~Ss І Ґ'

і

50- ..fm .

Оиіз

Quia

TlX+NkVer

•

Quta

Quia

' t Quia t Qui3 30 К 30 :< «==■•==

D TIX fNiVer

200

25 К ОСа 25 К 0 Са 25 К

Рис. 8. Коіскаалат-іпдуковані (Са*Ч транзіснтн а гранулярних нейронах миич'й різних вікових груп,

А, В: фА-іпдуковані (Са3*]і транзіснтн в нейронах новонароджених (А) та дорослих тварин (В) а контролі та після інгібування потенціал-заяежного входу іонів Са2* (після інкубації зрізів з 1 мкмоль/л ТГХ, 50 мкмоль/л ЛУ;* і }00 мкмоль/л acpana.ui.iy}.

С,й: (ЇА-індуковані ( Сап/(трпизіснти в нейронах новонароджених (С) та дорОыих тварин (О) в контролі та піс.гя 2 хв. інкубації зрізів в бсзкальцісвоиу розчині.

і дорослих тварин (рнс.8). Відомо, що під впливом ОА вхід іонів Са2* в цитоплазму може відбуватися крізь ліганд-керовамі та потенціал-керовані Са2+ канали плазмалемй, а також крізь ІР3-керовані Са2+ канали ЕР. Для того щоб розділити ці процеси, ми аплікуиали С?А після обробки зрізів ГІ Х, №2+ і верапамілом. Блокада потенціал-залежного входу іонів Са2* зменшувала амплітуду ОА-індукованннх відповідей на ЗІ±11% в нейронах новонароджених мишей і тільки на 11±9% в нейронах дорослих тварин (рпс.8А,В). Для того щоб виділити можливий внесок вивільнення іонів Са2+ із внутріклітинних депо в генерацію (}А-інду кованих |Са2+], транзієнтів, ми аплікували цей агоніст у безкальцієвому розчині. Як показано на рис.8С,І), прикладанни (}А після видалення іонів Са2+ викликало збільшення |Са2+)і тільки в нейронах новонароджених мишей. В нейронах же дорослих тварнн аплікація ОА в безкальцієвому розчині ніяк не впливала на концентрацію вільного кальцію в цитоплазмі.

Співставленім С»2+ сигналів у гранулярних нейронах мозочка дорослих і

старих тварин

Збільшення [Са2*]і спокою з пізньому онтогенезі. В стані спокою рівень внутріклітинного кальцію в гранулярних нейронах старих мишей був достовірно вище, ніж в нейронах дорослих тварин. Середнє значення |Са2+|, в цитоплазмі нейронів дорослих мишей в стані спокою становило 60115 нмоль/л, а в клітинах старих мишей дорівнювало 107±12 нмоль/л (рис.9).

Старечі зміни Са2' відповідей при деполяришції. Збільшення |Са2+|і у відповідь на калієву деполяризацію в гранулярних нейронах дорослих мишей відбувалось суттєво швидше і досягало більших значень, ніж в клітинах старих тварин (рис. 10,11). Максимальне збільшення цитоплазматичної концентрації кальцію під час деполяризації становило З5140 нмоль/л в нейронах дорослих тварин і тільки 57±26 нмоль/л в нейронах старих мишей. Стала часу збільшення сигналів становила 5±4 с для дорослих і І0±6 с для старих тварнн. Відновлення |Са2+], до початкового рівня також було суттєво повільніше в клітинах старих іііарин п порівнянні і дорослими. У дорослих тварин відновлення |Са2 + |; після лсіт/імрм іапії мало моноекспонспцішіті характер зі сталою часу

4J вс со lea

Базальний рівень (Са3,|,(пМ) Базальниіі рівень [Са^І^пМ)

Рис. 9. Розподіл базального рівня (Саі'}1 а грану.іярних нейронах мозочка дорос.іих та старих тварин

г*

ї

Дорослі

і

Старі

ї

^ w.

Чч

□ Дорослі ^ С гарі

Рис 10 /CuJ'/t mpan3itnmu, викликані ku.ulhoh) ()епо.ічризацин> в нейронах дорослих та старих тварин

Puc.il. Середні значення auruimyrt (Ca>'Jl трапзіснтів.які fiy.tu ьик.шкаш ' деполяризацию 25 н,\/ КСІ і 40 и\і КС! Показано стандартне eithu игпня

ІЗ

12±6 c. У старій же тварин процес відновлення [Ca2+Jj до базального рівня був більш складним: в усіх випадках ми спостерігали другу, повільнішу експоненту в релаксації |Са2+];. Стала часу двохекспцненційної функції, що описує відновлення кальцієвої концентрації до початкового рівня, у старих тварин становила 9±5 с для швіїдкої та 53±23 с для повільної компоненти. Із одержаних даних видно, що сповільнення відновлення [Ca2+ji концентрації в нейронах старих тварин відбувається внаслідок зміни у них роботи механізмів, відповідних за процес виводу з цитоплазми надлишкових іонів кальцію. Одним з таких механізмів можуть бути кофеїн-чугливі депо ЕР.

Зміни кофеїн-актииованих [Са2+]і піршиісшпів. Аплікація 30-40 ммоль/л кофеїну викликала швидкий ріст [Са2+]| в нейронах як дорослих, так і старих мишей (рис. 12). Видалення іонів кальцію з зовнішньоклітинного розчину ніяк не впливало на ІСа2*], транзіецТн, індуковані кофеїном. В нейронах обох вікових груп прикладання 100 нмоль/л тапсигаргіну на протязі 5 хвилин повністю і необоротно блокувало кофеїн-індуковані (Са2+1і транзієнти.

Однак було виявлено, що амплітуди кофеїн-індукованих [Ca2+]j транзіснтів суттєво менші у нейронах старих мишей (рис.14). Середня амплітуда кофеїн-активованих [Са2+], транзієнтів становила 76±27 нмоль/л у нейронах дорослих і 25±10 нмоль/л у нейронах старих тварин, у нейронах старих тварин деполяризація ніяк не змінювала амплітуди кофеїн-індукованих [Са2+]| транзієнтів (рис. 15). Це може означати, що у нейронах старих тварин внутріклітинні депо уже не можуть приймати активну участь у видаленні зайвих іонів Са2+ із цитоплазми після періоду клітинної активності.

ОБГОВОРЕННЯ

В даній роботі було виконано пряме дослідження основних механізмів внутріклітинної кальцієвої ешналізації у гранулярних невронах in situ. Для вимірювання концентрації іонізованого кальцію був разроблений неінвазивний метод завантаження нейронів мембранчпроникною формою барвника fura-2/AM.

ГЧ

■ ял

\

ЗО тМ кофеїну Дорослі

кофеїн КСІ

кофеїн

ї

ЗО тМ кофеїну

Л

Старі

кофеїн КСі кофеїн

Рис. 12 А: Кофеїп-індуковане вивільнення кальцію в нейронах дорослих та старих тварин. В: Потенціал-залсжне заповнення внутріклітинних кофеін-чупиивих депо

Таблиця 1. Параметри (Са2+]і гомеостазу у нейронах дорослих та старих мишей.

Параметр Дорослі Старі Р

Рівень спокою (Са^ + Іі (пМ) 60±15 <п=1бЗ) І07±І2 (п=129) <0.01

Амплітуди підвищення [Са2+|і при деполяризації (25 тМ К+) Д|Са2+]| (пМ) 353± 140 (п=39) 57±26 (п=4І) <0.01

Сталі часу зростання [Са2+|| транзіипів, викликаних деполяризацією (25 тМ К+); їд,, (я) 5±4 (и=39) 10±6 (п=4І) <0.05

Ст;ші часу спаду |Са^ + Іі після деполяризації (25 тМ К+); (гес (ї) І2±б (а=39) швидка: 9±5 повільна: 53І23 (м=41) ~<0 (і5

Амплітуди кофеїн-індукованого піднишення |Са2+||; д|Сд2+|і (пМ) 76±27 (п=27) 25±10 (п=23)

Підвищення [Са2+]і, викликане калієвою деполяризацією, у гранулярних нейронах мозочка відбувається за рахунок активації декількох типів потенціал-керованих Са2+-каналів плазмалеми. Використовуючи різні фармакологічні агенти, ми показали, що при невеликих деполяризаціях трансмембранний вхід. іонів кальцію в цитоплазму відбувається крізь низьколорогові Са2+-канали (Т-типу), які інгібуються іонами нікелю.

При сильній деполяризації іони Са2+ входять в цитоплазму крізь

писокопорогові Са2+-каналн. Частина іонів Са2+ при сильній деполяризації потрапляють до клітини крізь ш-С£ТХ-чутливі Са2+-канали. Блокуючий ефект о-С^ГХ на |Са2+|і транзієнти мав частково відвертаємніі характер, що вказує на вклад активації як ІЧ-тилу Са2+ каналів (які необоротно блокуються l£>-CgTX), так і И-типу

високопорогових Са2+ каналів, які зворотньо блокуються ш-С$ТХ. Онтогенетичний розвиток мозочка не вносить значних змін у властивості механізмів підвищення |Са2+|і під час деполяризації.

Більшість гранулярних нейронів відповідала на аплікацію кофеїну підвищенням |Са2+]і. Це підвищення не змінювалось при видаленні іонів Са2*' із зовнішньоклітинного розчину. На відміну від інших нервових клітин для визволення іонів Са2+ із цих запасників була необхідна більш висока концентрація кофеїну (30-40 ммоль/л).

Не зважаючи на наявність в гранулярних нейронах мозочка СІСЯ-

залежних Са2+ депо, ми не виявили участі СІСК в генерації |Са2+];

трапзіснтів, які були індуковані деполяризацією. Можна припустити, що в цих нейронах необхідна більша кількість іонів Са2+ для активації СІСІІ в порівнянні з тим, що ми спостерігали в даному дослідженні. Функціональна активність СІСЯ може також контролюватися іншими вториншімі посередниками, наприклад цАДФ-рибозою (Оаііопе А., 1993). Аплікація глугамату викликала великі |Са2+1і транзієнти в гранулярних нейронах у зрізах мозочка. Ці відповіді мали складну природу: вони були рсіультатом входу іонів кальцію крізь потенціал-керовані Са2+-канали і пхолоч Са2* крізь Са24-проникні ОиКх. Блокада входу Са2+ крізь поіенпіхі-керопані канали зменшувала амплітуду |Са2+|( транзієнтів, які Оу.тн викликані ілутаматом та його аналогами. Однак суттєва кількість

іонів кальцію була все ще здатна увійти до клітини, відображаючи наявність Са2+ провідності іонотропних GluRs.

В процесі вивчення дії глутамату на гранулярні нейроні! мозочка міі виявили суттєву різницю в кгльцієвііі сигналізації в клітинах новонароджених і дорослих тварин. Виявилось, шо після видалення іонів Са2+ із омиваючого розчину глутамат викликав підвішенії» |Са2+], тільки в нейронах новонароджених мишей, з чого можна зробити висновок, що вікові зміни в гранулярних нейронах виражаються у відсутності mGluRs-індукованого визволення іонів Са2+ з ІР^-чутливих Са2+ депо ЕР. Вивчаючи природу участі mGluRs в генерації ICa3+jj сигналів в гранулярних нейронах мозочка новонароджених мишей, ми виявили, що транс-ACPD не здатна викликати визволення Са2+ із депо. Квісквалат же в наших експериментах ефективно підвищував [Са2+), навіть у відсутності іонів Са2+ в омиваючому розчині. З цього ми зробили висновок, шо в гранулярних нейронах новонароджених мишей експресовані mGluRsI чи inGluRsS ізоформи, які селективно чутливі до QA та не чутливі до 'фанс-ACPD (ТаііаЬе,г/.я/.,1992).

У нашему дослідженні проведено також пряме вимірювання вільної [Са2+]і в нейронах старих мишей in situ. Ми показали, що в’кові зміни нейронів пов'язані із значними змінами кальцієвого гомеостазу.

В табл.І наведені основні параметри гомеостазу кальцію в нейронах дорослих і старих мишей. Дані зміни можуть бути наслідком зменшення здатності ЕР, мітохондрій або інших внутріклітинних Са2+ депо захватуаатн кальцій або пошкожд еиші при старінні систем, які відповідають за викачку кальцію із клітини або, нарешті, комбінації обох процесів.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що потенціал-залежне підвищення |Са2^ в гранулярних нейронах мозочка мишей відбувається шляхом входу іонів Ca2t крізь низькопорогові та декілька типів високопорогових Са2*-каналів плазмалемн.

2. Гранулярні нейрони новонароджених, дорослих і старих тварин експресують кофеїн-чутливі Са^-депо,

3. Глутамат викликає високоамплітудні |Ca2+]j транзієнти в нейронах. Глутамат-активованс підвищення (Са2'ь]і є результатом входу іонів Са2+ крізь Са2+-проникні каїїали глугаматних рецепторів та крізь потенціал-керовані Са2+-канали плазмалеми.

4. У гранулярних нейронах мозочка новонароджених мишей експресуються метаботропні глутаматні рецептори, які селективно чутливі до квісквалагу і нечутливі до транс-ACPD (inGluRsl та mGluRsS ізоформи). Нейрони дорослих же мишей демонструють відсутність mGluRs-індукованого вивільнення іонів Са2+ із ІРз-чутливих депо ЕР.

5. Було показано достовірне збільшення рівня [Са2+)і в нейронах старих тварин в порівнянні з нейронами молодих і дорослих тварин.

6. В нейронах старих мишей зменшуються амплітуди Са2+ сигналів і уповільнюється відновлення |Ca2+]j після деполяризації нейронів.

7. В нейронах старих тварин зменшуються амплітуди кофеїн-залежного визволення кальцію. Зменшується також акумуляція іонів Са2+ ендоплазматичним ретикулумом нейронів старих тварин.

8. Результати цього дослідження показали, що до кальцієвої сигналізації в гранулярних нейронах мозочка залучені різні механізми: потенціап-керовані Са2+ канали плазмалеми, іонотропні та метаботропні глутаматні рецептори, внутріклітинні кофеїн- і ІРз-чутливі Са2+-депо. Зміни функціонування механізмів, які беруть участь у забезпеченні внутріклітинного кальцієвого гомеостазу пов'язані з онтогенетичним розвитком нейронів. ■

Перелік робіт, опублікованих по темі дисертації

1. S.Kirischuk, A.SIimigol, N.Voitenko et al. (1993) Caffeine-sensitive

intracellular calcium stores in cultured rat hippocampal and neocortical

neurones // Pflugcrs Archiv European Journal of Physiology, v.422, Supplement

1. pR25.

2. A.SIimigol, S.Kirischuk, N.Voitenko et al. (1993) The properties of

intrnccllular calcium stores in cultured rat hippocampal and neocortical

neurones // Proceedings of XXXII Congress of the International Union of Physiological Sciences, August I - 6, Glasgow, p. 115 (54,18/P).

3. Kirischuk S.I., Voitcnko N.V., Ketteninann H.O. and Verkhratsky A.N.

(1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in Cerebellar Bergman glial cells //Neurophysiology v.26, 417-419. ■

4. S.Kirischuk, N.Voitenko, T.Moller, H.Kettenmann and A.Verkhratsky (1995)

ATP-induced cytoplasmic calcium mobilization in bergman glial cells // J. Neuroscience v.l5, 8234-8248. <

5. S.Kirischuk, N.Voilenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1995) Calcium

signalling in granule neurones studied in cerebellar sliccs 11 Cell Calcium v.13, 464-476 .

6. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1995) Age-associated changes of citoplasmic calcium homeostasis in cerebellar granule neurones in situ: investigation on thin cerebellar slices. // Experimental Gerontology (submitted)

7. N.Voitenko, S.Kirischuk, A.Kulik, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slice': // Pflugers Arcliiv European Journal of Physiology, v.430, Supplement 4, R124.

8. Voitenko N., Kirischuk S., Verkhratsky A. (1995) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar granule neurones in situ. // Експериментальна та клінічна фізіологія, збірник наукових праць до 100-річчя кафедри фізіології Львівського медичного університету, р.357.

Abstract. The cytoplasmic free calcium concentration (|Ca2+]j) was studied in fura-2/AM loaded granule neurones in acutely prepared cerebellar slices isolated from neonatal (6 days old), adult (30 days) and old (30 months) CBA mice. Bath application of elevated (10-50 mM) KCl-containing cxtracelluloY solutions evoked (Ca2+]j rise which was dependent on extracellular Ca2+. The K+-induced |Ca2+]j elevation was inhibited to different extends by verapamil, nickel and w-conotoxin suggesting the coexpression of different subtypes of plasmalemmal voltage-gated Ctfi+ channels. Bath application of caffeine (10 -40 mM) elevated |Ca2+]j by release of Ca2+ from intracellular stores. Caffeine-induced [Ca2+]j elevation was inhibited by 100 mM ryanodine and 500 nM thapsigargin. Depletion of internal Ca2+ stores by caffeine, or blockade ol

Ca2+ release channels by ryanodine, did not affect depolarization-induced |Ca2+]j transients, suggesting negligible involvement of Ca^+'-induced Ca2+ release in [Ca2+]j signal generation following cell depolarization. External application of 100 inM glutamate, but not /ra/is-ACPD (100 - 500 mM) evoked [Ca2+]j elevation. Part of glutamate-triggered [Ca^+]j transients in neurones from neonatal mice was due to rebase (presumably via inositol-( 1,4,5)-

trisphosphate-sensitive mechanisms) from internal Ca2+ stores. In adult animals glutamate-triggered [Ca2+], elevation was .exclusively associated with plasmalemmal Ca^+ influx via both voltage-gated and glutamate-gated channels. The resting [Ca2+]j was significantly higher in bL.iile cerebellar granule neurones, being on average 60 ± 15 nM (n = 163) in adult and 107 ± 12 nM (n = 129) in old neurones. The depolarization-induced [Ca2+)j transients were markedly altered in old neurones as compared .vitfi adult ones: their amplitude decreased about 5 times, the rate of rise was prolonged about 2 times and tiie complete recovery to the resting level after the end of depolarization took about 5 times more time. The amplitude' of calcium release from caffeine/Ca2+-sensitive endoplasmic reticulum calcium stores also become significantly smaller in old neurones (the amplitudes of lCa2+]j transients evoked by 30 mM caffeine were 75 ± 27 nM (n = 29) in adult and 25 ± 10 nM (n = 23) in old neurones respectively). We conclude that neuronal ageing is associated with prominent changes in the mechanisms responsible for |Ca2+]j legulution. These changes presumably include lowering of plasmalemmal Ca2+ influx and slowing down of extrusion from the cytoplasm.

Аннотация. Показано, что потенциал-з;шисимос повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция в гг зпулнр! i>.x нейронах мозжечка мышей опосредовано входом ионсв кальция через нткоиороговые и несколько типов высокопороговых у.’льциевых каналов плпматеммы. Гранулярные нейроны мозжечка новор >жденнмх, взрослых

и стдрых животных зкспрссспруюк кофспп-чупстпптельные Са2+ депо. Глутамат вызывает высокоамплитудные Са2+ транзиенты в гранулярныл перронах. Глутамат-актнвируемое повышение цитоплазматического кальция является результатом входа ионов кальция через Са2+-проницаемые каналы глутаматных рецепторов и через потенциал-управляемые кальциевые каналы плазмалеммы. В гранулярных нейронах мозжечка новорожденных мышей экспрессируются метабо-тропные глутаматпые рецепторы, селективно чувствительные к квисквалату и не чувствительные к транс-АСРО (т01и1?з1 или т01и1?з5 изоформы). Нейроны же взрослых мышей демонстрируют отсутствие глутамат-индуцированного освобождения ионов Са2+ из 1Р3-чувствительных внутриклеточных кальциезых депо. Показано достоверное увеличение уровня цитоплазматического кальция в покоящихся нейронах старых животных по сравнению с нейронами новорожденных и взрослых мышеи. В нейронах старых животных уменьшаются амплитуды Са2+ сигналов и замедляется восстановление внутриклеточной концентрации кальция после деполяризации. В нейронах старых животных уменьшаются амплитуды кофеин-завиенмого освобождения кальция. Уменьшается также аккумуляция ионов Са2~ зпдоплазматическим ретику-лумом гранулярных нейронов старых животных по сравнению с нейронами новорожденных и взрослых мышей. Результаты данного исследования показали, что в кальциевой сигнализации в гранулярных нейронах мозжечка задействованы различные механизмы, а именно: потенциал-управляемые Са2+ каналы плазмалеммы, ионотропные и метаботроп-иые глутаматные рецепторы, внутриклеточные кофеин- и 1Р;>-чувствительные Са2+ депо. Изменения функционирования механизмов, участвующих в обеспечении внутриклеточного кальциевого гомеостаза, связаны с онтогенетическим развитием нейронов.

Підп. до друку 19.10.95. Формат 60X84/16. Папір для розмнож, апар. Офс. друк. Ум. друк. арк. 1,28. Ум. фарбо-иідб. і ,39. Обл.-вид. арк. 0,87. Тираж 100 прим. Зам. 787.

Редакціппо-видаїшичий відділ з поліграфічною дільницею Інституту кібернетики імені В. М. Глушкова ПАН України 252022 Київ 22, проспект Академіка Глушкова, 40