Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль нейроспецифических белков (антигенов) в механизмах нейрональной пластичности развивающегося и взрослого мозга

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль нейроспецифических белков (антигенов) в механизмах нейрональной пластичности развивающегося и взрослого мозга"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ш. М.В.Ломоносова БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

РГБ ОЛ

На правах рукописи

ЕЛЬНИКОМ Светлана Геннадьевна

РОЛЬ НЕЙРОСПЕЩЮИЧЕСКЙХ БЕЛКОВ (АНТИГЕНОВ) В МЕХАНИЗМАХ НЕЙРОНАЛЬНОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ И ВЗРОСЛОГО МОЗГА

03.00.13 - физиология человека и ¡квотных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа вшолнена в лаборатории центральных механизмов регуляции и управления Института медицинской и биологической кибернетики СО РАМН.

Научный руководитель -

кандидат биологических наук

М.В.Старостина

Официальные оппонента:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН

Л.И.Корочкин

Р.Н.Глебов

Ведущая организация -

Институт нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАН (Москва)

на заседании Специализированного совета д иоа.иа.аь в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Подписано в печать 23.12.94 г. Яеч. л. 1.0 Заказ N ■

Формат оумаги бОх Тираж 100 экз.

Типография СО РАКИ, ГЭЭ4 г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеш. Выяснение механизмов пластичности нервных клеток, лежащей в основе нормального функционирования мозга, является одной из центральных проблем современной нейробиологии. Это базовое свойство нервной системы играет важную роль как в адаптивном поведении животных и человека, так и при нарушении функций мозга (Котляр, 1986).

Пластичность ШС наиболее выражена у развивающихся животных. В ходе развития происходит удлинение дендритов и аксонов, активная перестройка их разветвленных окончаний и образование синапсов. Эти процессы являются основными этапами дифференцировки нейронов и ведут к установлению функционально зрелых нервных связей. Те ке события (рост аксонов, синаптогенез) определяют успех или неудачу нервной регенерации, а также могут лежать в основе некоторых форм синапти-ческой пластичности взрослого мозга, одной из которых является длительная посттетаническая потенциация - широко известная модель для изучения клеточных и молекулярных механизмов обучения и памяти (Теу1ег, В1Бсеппа, 1987; Маи,Шез, 1989). В связи с этим изучение нейрональной пластичности развивающегося мозга может способствовать пониманию механизмов этого явления во взрослом мозге. Данное положение подтверждается Ьдной из моделей памяти, в которой проводится аналогия между процессами, контролирующими дифференцировку клеток, и механизмами, ответственными за приобретение долговременной памяти (вое1ег еЪ а1., 1986).

Значительное внимание при исследовании молекулярных основ функционирования развивашейся и взрослой нервной системы уделяется нейроспецифическим белкам (Штарк, 1985; Березин, Велик, 1990). Это связано с тем, что белки, являясь объектом многообразных форм регуляции, в свою очередь выполняют различные регуляторные функции и играют таким образом важную роль в морфофизиологических процессах. В последнее время появилось большое количество исследований, посвященных выяснению функций нейроспецифических белков в молекулярных механизмах пластичности взрослого мозгз. Эти работы касаются как изучения роли отдельных белков (например, белка Б-ЮО (Громов и др., 1991; Нуйеп ег а!.. 1977)), так и новых идей

Э

о том, что в основе нейрональной пластичности лекат такие общие свойства структуры белка, как его подвижность, существование дискретных конформационных состояний и разнообразных видов супрамолекулярной белковой организации (Friedrich, 1990).

Имеющиеся в настоящее время данные позволяют предположить, что существенную роль в пластичности развивающегося мозга играют нейроспецифические белки-маркеры • отдельных клеточных типов, молекулы клеточной адгезии, факторы роста нервных волокон (Березин, Велик, 1990; Davies, 1988; Rutishauser, Jessel, 1988; Linnemann,- ßock., 1989). Таким образом, исследование маркеров отдельных клеточных типов нервой ткани и специфических образований нейронов (аксонов, дендритов, синапсов) позволяет не только изучить процессы дифференцировки и специализации клеток в онтогенезе, но и •приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования зрелых клеток.

Одним из методов, позволяющих решить эту задачу, является гибридомная биотехнология. Так, применение монокло-нальных антител (МКА) позволило идентифицировать антигены клеточкой поверхности, экспрессия которых была ограничена по времени и/или регионально (McKay, Hockfleli, 1982; Moskal, Schaffner, 1986; Yamamoto et al., 1986; Stalnler, Gilbert, 1989). С помощью МКА удалось также выявить антигены нейрональной поверхности, играющие важную роль в межклеточных взаимодействиях, процессах роста аксонов и синаптогенеза (Alcantara et al., 1992; Merkourl, Matsas, 1992; Wallis et al., 1992; Murakami et al., 1993).

Несмотря на значительное количество появившихся в последнее время подобных исследований, роль выявляемых молекул в пластичности развивающегося" и взрослого мозга . остается малоизученной: в большинстве работ отсутствуют данные о периодах появления этих белков в онтогенезе, практически не используются возможности МКА для изучения их функций (например, путем модификации или блокада функции белка в культуре ткани или физиологическом эксперименте), а заключение о функции белков чаще всего делается на основании электронно-микроскопических исследований об их локализации в пре-

или постсиналтических структурах или данных об их физико-химических свойствах (например, способности к связыванию с ионами кальция или принадлежности к классу гликопротеинов, опосредующих межклеточные взаимодействия). В настоящее время известны лишь единичные работы, . в которых изучено участие молекул, специфичных для определенных периодов онтогенеза, в функционировании взрослого мозга (Stanton et al., 1987).

Таким образом, представляется актуальным комплексное исследование, в котором обнаружение новых молекул, вовлечен-нных в процессы дайеренцировки нейронов, сочеталось бы с изучением их возможной роли в механизмах пластичности взрослого мозга.

В связи с этим целью работы явилось исследование участия нейроспецифических белков (антигенов) в механизмах нейрональной пластичности развивающегося и взрослого мозга крыс с использованием моноклональных антител, позволяющих идентифицировать новые молекулы, вовлеченные в эти процессы.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задач:!:

1. Получить банк гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам развивающегося гиппокампа крысы, специфичным для ранних этапов постнагального онтогенеза.

2. Установить локализацию выявляемых моноклональнкми антителами антигенов в головном мозге крысы.

3. Изучить изменение локализации обнаруживаемых макромолекул в раннем постнатальном онтогенезе.

4. Исследовать влияние моноклональных антител на развитие гиппокампа в органотипической культуре.

5. Определить возможное участие данных нейроспецифичес-ких белков в механизмах пластичности взрослого мозга.

Основные положения, выносимне на защиту:

1. Метод гибридомной биотехнологии и иммунизация животных с использованием циклофосфамида позволяют обнаружить белки (антигены) нервной ткани, специфичные для ранних этапов постнатального онтогенеза.

2. Экспрессия антигенов, выявляемых МКА 3G7-F8 и 6С4-С2, характеризуется высокой региональной и клеточной специфичностью.

3. Представлены доказательства участия белка, обнаруживаемого МКА 3G7-F8, в механизмах пластичности развиващего-ся и взрослого мозга.

Научная новизна работы. Впервые проведенная иммунизация развивающимся гишюкампом крысы с последувдими инъекциями циклофосфамида позволила получить банк гибридом, продуцирующих МКА к "минорным" антигенам развивающегося мозга. С помодъю полученных МКА были обнаружены новые белки (антигены), специфичные для определенных типов нейронов и ранних этапов постнатального онтогенеза нервной ткани. Изучены особенности локализации обнаруженных антигенов в головном мозге крысы в процессе раннего постнатального онтогенеза. Установлено, что МКА 3G7-F8 оказывают влияние на развитие гиппокам-па In vitro. На модели длительной посттетанической потенциа-цш показано, что белки, специфичные для развивавшегося мозга, могут принимать участие в механизмах пластичности взрослого мозга.

Теоретическое и практическое значение. Полученные МКА могут быть использованы для типирования определенных групп клеток в процессе постнатального развития мозга. Результаты, свидетельствующие о влиянии МКА на развитие органотипической культуры гиппокампа, имеют существенное значение для определения роли макромолекул в функционировании нервной ткани. Представлены и обобщены сведения о роли нейроспецифических белков в механизмах гласгичности развивающегося и взрослого мозга. Совокупность полученных в работе данных подтверждает представление об общности механизмов нейрональной пластичности развивающегося и взрослого мозга.

Таким образом,-данная работа позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования нервной ткани и может представлять интерес для исследователей, работающих в области нейрофизиологии и нейрохимии. Полученные МКА могут быть использованы в клинической практике для обнаружения выявляемых ими антигенов в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных с патологией центральной нервной системы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I съезде иммунологов России (Новосибирск,

ft

1992); международном симпозиуме "Физиолого-биогимические основы жизнедеятельности мозга" (Санкт-Петербург, 1994); межинститутском семинаре Института медицинской и биологической кибернетики СО РАМН, Института физиологии СО РАМН и Конструкторско-технологического' института вычислительной техники СО РАН, Новосибирск.

. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы (29 -отечественных и 286 - иностранных источников). Работа содержит 3 таблицы и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и метода исследований. Для иммунизации использовали 8-12-недельных самок мышей инбредной линии BALB/c. Иммунизацию проводили внутрибрюшинно с применением циклофос-фамида в концентрации 100 мкг/г веса животного (Matthew, Sandrock, 198Т).

Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам развивающегося гишгокампа крысы, проводили по методу Келера и Мильстейна (Kolller, Milstein, 1975).

Для скрининга гибридом использовали метод иммунофермен-тного дот-анализа на нитроцеллюлозных фильтрах (Hawkes et' al., 1982). ' '

Определение класса и подкласса антител проводили непрямым иммуноферментным твердофазным методом, используя набор антител к различным классам иммуноглобулинов мыши, -конъюгированных с пероксидазой хрена (Serva, Германия).

Определение тканеспецифичности полученных моноклональ-ных антител проводили методом иммуноферментного дот-анализа, используя в качестве антигена водорастворимую фракцию белков, выделенных из различных тканей и органов 5-дневных крысят: тимуса, селезенки, бедренной мышцы, сердца, печени, почки, легких, мозжечка и гилпокампа. Концентрацию белка в

образцах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Анализ белков, выявляемых ыоноклональными антителами, осуществляли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (1яэши11, 1970).

Электрофоре тический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозную мембрану проводили по методу Тоубина и др. (Towbln et al., 19Т9).

Для проведения иммуногистохимического анализа использовали парафиновые горизонтальные срезы головного мозга крыс порода Wistar разных возрастов (19-й день эмбрионального развития, 0, 5, 14 и 21 день после рождения, .60-90 дней -взрослые животные), фиксированных в растворе Карнуа.

Для приготовления органотипической культуры использовали поперечные срезы гиппокампа крыс породы Wistar 3-4-го дня постнатальной жизни (60 кивотных). Через 6, 8, 9, II, 12 и 15 дней после начала культивирования in vitro препараты органотипической культуры гиппокампа фиксировали в 10% нейтральном формалине и окрашивали по методу Бодиана для нервных волокон (Cahwller, 1988).

Площадь зоны роста подсчитывали на фиксированных препаратах культуры гиппокампа разных сроков развития с помощью стандартной морфометрической сетки, вмонтированной в окуляр микроскопа "Orthoplan" (Германия), при увеличении 63. Показатели площади зоны роста в контрольной и опытной группах сравнивали между собой, применяя непараметрический критерий Уайта (W-критерий).

"Разрывы"'а зоне роста подсчитывали в процентах на I поле зрения, площадь которого при увеличении 400 составляла 20,25хЮ4 мга.г. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Исследование влияния моноклональных антител на индукцию длительной посттетанической потенциации (ДПТП) проводили в переживающих срезах гиппокампа взрослых крыс породи Wistar (60 животных), используя систему синаптических связей "гранулярные клетки зубчатой извилины - пирамидные нейроны области САЗ". Эксперименты проводили по методике Ямамото (Yaiiamoto, Sawacla, 1981 ) с некоторыми модификациями.

Статистическую обработку данных проводили с использова-

нием г-критерия Стыодента, границы доверительных интервалов оценивали для уровня достоверности 95%.

Результаты исследования и их обсуждение

I. Получение и характеристика моноклональных антител

Длительная иммунизация животных с использованием цикло-фосфамвда позволяет увеличить специфичность иммунного ответа, но в то же время существенно снижает "выход" гибридомных клонов.

Получено 104 клона, 69 из которых давали положительную иммуноферментную реакцию в дот-анализе. Дальнейший скрининг полученных гибридом выявил 10 клонов, супэрнатанты которых давали стабильное иммуногистохимическое окрашивание определенных типов клеток на горизонтальных срезах головного мозга крыс 5-го дня постнатального развития. На основании иммуно-гистохимической реакции все позитивные клоны были разделены на 2 группы. Различия в этих группах лучше всего представлены двумя линиями моноклональных антител - 307-Р8 и 6С4-С2, которые подвергались дальнейшим исследованиям.

Определение характеристик данных МКА показало, ~ что ЗС7-Р8 относится к субклассу ^ С2а, 6С4-С2 - 03.

МКА ЗС7-Р8 и 5С4-С2 специфически реагировали только с антигенами нервной ткани и не взаимодействовали с антигенами тимуса, селезенки, мышцы, сердца, печени, почек и легких 5-дневных крысят, что говорит о тканеспецифичности выявляемых антигенов.

В гомогенатах мозжечка 21-дневных крыс и гиппокампа 5-дневных крыс МКА ЗС7-РЗ обнаруживали белок с молекулярным весом 128 кДа, а МКА 6С4-С2 - белок с молекулярным весом 134 кДа.

2. Иммуногистохимический анализ распределения антигена,

выявляемого !ЖА ЗС7-ге

В гиппокачпе крысы слабая иммунопероксидазная реакция была отме-сена на 19-й лень эмбрионального развития (наиболее рано изученная стзгия:. ГЖА ЗС7-Г8 окрашивали пирамидные клетки ашонова рога и начальные сегменты их отростков.

3 гиппокампе новсрохкшшх крыс иммунопероксидазное

окрашивание наблюдалось в гранулярном и полиморфном слоях зубчатой извилины, пирамидном и лучистом слоях аммонова рога, а таете в субикулшеь МКА Зй7-Р8 окрашивали тела пирамидных клеток и нерааветвленные часта стволов их апикальных дендритов, тела гранулярных клеток и начальные сегменты их отростков, а также цитоплазму некоторых нейронов в хилусе.

На 5-й день постнатального развития характер окрашивания сохранялся. Однако можно было заметить более интенсивную иммунопероксвдазную реакции во внешней части гранулярного слоя, граничащей с молекулярным слоем зубчатой извилины.

К третьей неделе постнатального онтогенеза паттерн окрашивания существенно изменялся. На 14-й- день отмечалось значительное снижение интенсивности иммунопероксидазтай реакции в гранулярном слое, ,в то время как в пирамидном и полиморфном слоях окраска сохранялась. МКА Зй7-Р8 окрашивали цитоплазму и мембрану тел пирамидных нейронов, а тага® их апикальные дендрита. Интенсивное окрашивание наблюдалось- в телах крупных нейронов хилуса, где красились клеточные мембраны, прилежащая к ним цитоплазма и начальные сегмента отростков этих клеток. На 21-й день постнатального развития отмечалось интенсивное иммунопероксидазное окрашивание в нейрошле, в то время как в гранулярном слое зубчатой извилины оно полностью исчезало. В гиппокампе взрослых крыс сохранялся паттерн иммунопероксидазного окрашивания, наблюдаемый на 21-й день постнатального онтогенеза.

В мозжечке крысы клетки Пуркннье были единственными клеточными элементами, которые выявлялись ыоноклональяыми антителами ЗС7-Г8 в течение всего раннего постнатального развития. У новорожденных крысят в ганглиозном слое клеток Пуркинье обнаруживалось слабое диффузное окрашивание.

На 5-й день отмечалась ярко выраженная иммуноперокси-дазная реакция. Окрашивание главным образом было связано с цитоплазмой развивающихся нейронов, обнаруживая изредка вновь образованные дендриты.

На 14-й день МКА 3!57-Р8 интенсивно окрашивали тела клеток Пуркинье с ашкально ориентированными первичными дендритами и тонкими ответвлениями на их верхуиках; наружный и внутренний зернистые слои оставались шмунонегатиЕными.

К 21-му дню посгватального онтогенеза характер окрапш-Еаяия клеток Пуркинье не изменялся. Интенсивная иммуноперо-ксидазная реакция, отмечалась в молекулярном слез, который, расширяясь, достигает внешней границы извилин мозжечка. Отдельные клеточные тела, расположенные в молекулярном слое и относящиеся, вероятно, к корзинчатнм и/или звездчатым, клеткам, не окрашивалась. В мозжечке взрослых крыс сохранялся паттерн иммунопероксидазного окрашивания, наблюдаемый на 21-й день постнатального онтогенеза.

- В контроле на срезах головного мозга, крыс всех исследованных возрастов иимуюпераксидазная реакция отсутствовала. В других отделах головного мозга окрашивания антителами ЗС7-18 отмечено не было.

Таким осразом, динамика изменений локализации антигена ЗС7-Г8 в мозжечке и гиппокампе крысы в раннем постнатальном онтогенезе позволяет сделать предшжзжение, что первоначально синтезируемый в теле и дендритах нейрона антиген постепенно перемещается на мембрану клетки, где. Еероятно, осуществляет свои функции. Эти функции могут быть связаны с процессами дифференщфовкж клеток, а именно с категорией -"достижение мшена", которая характеризует тенденцию нейронов, давать направленные отростки и избирательно формировать связи с определенными клетками, и категорией "стабилизация", которая включает в себя ряд факторов, необходимых для образования устойчивых синаптических контактов (Г1зЬиап, 1984). Преимущественная локализация антигена 307-Р8 в телах и дендритах пирамидных нейронов гиппокаша и клеток Пуркинье' мозжечка говорит а постствзптическсй рслл этого антигена в механизмах сигнальной транедукши.

3. Кимунсгистохимяческий анализ распределения антигена, выявляемого 1НД 6С4-С2

В гиппокампе новорожденных крыс ишунопероксидазное окрашивание наблюдалось в гранулярном и полиморфном слоях зубчатой изеилиеы, пирамидном и лучистом слоях аммонова рога, а также в субикулше. МКА. 6С4-С2 реагировали с телами пирамидных нейронов и проксимальными частями их апикальных дендритов Есех полей зшсноез рога, с телами и начальными

сегментами отростков гранулярных клеток.

На 5-й день постнатального развития характер окрашивания сохранялся. Однако можно было заметить отсутствие имму-нопероксидазной реакции во внутренней части гранулярного слоя, граничащей с полиморфным слоем зубчатой извилины, и усиление окрашивания нейропиля.

На 14-й день после ровдения отмечалось значительное снижение интенсивности иммунопероксидазной реакции в гранулярном и пирамидном слоях и сохранение ее в нейропиле. МКА 6С4-С2 окрашивали только мембрану тел пирамидных и гранулярных нейронов. К концу 3-й недели постнатального онтогенеза паттерн окрашивания существенно не изменялся и оставался таковым на срезах головного мозга взрослых крыс.

В течение всего срока раннего постнатального развития и у взрослых животных 6С4-С2-иммунопероксидазная реакция была выявлена в клетках заднего коленчатого тела, причем наибольшая интенсивность этой реакции отмечалась на 5-а день постнатального онтогенеза. МКА 6С4-С2 окрашивали тела и начальные сегменты отростков нейронов Colliculus posterior.

В мозжечке крысы МКА 6С4-С2 выявляли тела и дендриты клеток Пуркинье в течение всего периода раннего постнатального онтогенеза. Так, на 5-й день после рождения иммуноперо-ксидазная реакция былз отмечена в цитоплазме тел и образующихся деццритах клеток Пуркинье. На 14-й день постнатального развития МКА 6С4-С2 выявляли антиген, расположенный на мембране клеток Пуркинье и в растущем молекулярном слое, который к 21-му дн;о достигал внешней границы извилин мозжечка. Наружный и внутренний зернистые слои оставались иммунонегативными б течение всего раннего постнатального онтогенеза. На срезах, головного мозга взрослых крыс данный паттерн иммуногистохимического окрашивания сохранялся.

В контроле на срезах головного мозга крыс всех исследованных возрастов иммунопероксидазная реакция отсутствовала. В других отделах головного мозга окрашивания антителами 6С4-С2 отмечено не было.

Таким образом, паттерн окрашивания моноклональными антителами 6С4-С2 отличался высокой региональной и клеточной специфичностью. Экспрессия антигена, выявляемого этими МКА,

совпадала до времени с основными этапами дафференцировки нейронов.

4. Влияние МКА 3G7-F8 на развитие органотипической культуры пшпокампа крыс

При оценке эффекта моноклоналышх антител 3G7-F8 на развитие органотипической культуры гиппокампа было отмечено, что чистый Ig3 линии 3G7-F8 в концентрации 5 мкг/мл вызывает увеличение площади зоны роста, начиная с 6-го дня культивирования In vitro. После 10-го дня культивирования различия становились статистически достоверными (Р<0,05). Площадь зоны роста в препаратах опытной группы была примерно в 1,2-1,5 раза больше, чем в контроле (табл. I). В культурах гиппокампа, йЬддврживаешх в стандартной культуральноЯ среде, и среде, содержащей неиМмунный иммуноглобулин в концентрации 5 мкг/мл, различий показателей площадей зон роста не выявлено.

Таблица I

Влияние МКА 3G7-F8 на формирование зоны роста в культурах гиппокампа

Срок культивирования (да)

зоны роста ! в опыте ! -(с МКА) !

Шющадь С»)

"разрывов" в зоне роста** контроль ! опыт (с МКА)

6 142,28*5,21

9 152,23±12,04 0,26*0,21

11 138,77*8,34 0,27i0,09

12 128,28i14>51 0,26*0,15 15 137,05i7,90 0,46t0,16

1,02±0,30 1,24t0,18 P<0,001 1,33±0,29

P<0,05 1,28-0,32 P<0,05

* Площадь гоны роста, рассчитанная а процентах по отношению к контролю в парных наблюдениях.

Площадь "разрывов", рассчитанная в процентах на I поле зрения при увеличении 400

Нарушений прикрепления эксплантатов к субстрату, роста и пучкования нейритов в контрольной и опытной грушах замечено не Сило.

Начиная с 9-го дня In vitro, в зоне роста, окружающей эксплантаты, подвергнутые действию МКА 3G7-F8, наблюдали образование "разрывов" (пустот, не заполненных клеточными телами и отростками, при сохранении коллагеновой подложки), которые выявлялись на протяжении всего последующего срока культивирования гшшокампа (табл. I).

Таким образом, МКА 3G7-F8 оказывали влияние на развитие органотипической культуры гипшкаша крысы, вызывая увеличение зоны роста и образование в ней "разрывов". Сопоставляя эти данные с результатами иммуногистихимического исследования локализации антигена, выявляемого МКА 3G7-F8 в течение постнатального онтогенеза, а также учитывая, что астроциты наиболее многочисленны в полиморфном слое зубчатой извилины (Ibata, 1968), можно предположить, что МКА 3G7-F8 блокируют функционально значимую антигенную детерминанту на поверхности нейронов и их отростков, и астроциты, в норме контактирующие с телами и отростками нейронов, мигрируют в зону роста.

5. Влияние ЫКА 3G7-F8 на индукцию длительной посттетанической потенциации в срезах гиппокампа взрослых крыс

Исследование электрофизиологических эффектов МКА на характеристики популяционного спайка обнаружило, что МКА 3G7-F8 не оказывают существенного влияния на изменение амплитуды и лагентности популяционного спайка (табл. 2).

Амплитуда популяционного спайка через 20"минут после добавления в среду МКА 3G7-F8 существенно не отличалась от таковой в контрольной среде (102,9*13,9% и 80,Ы1,9% соответственно; Р>0,05). Различия по латентности популяционного спайка в контроле и опыте также были не достоверны (116,8*15,9% и 123,1±4,ЭХ соответственно; Р>0,05).

После кратковременной высокочастотной стимуляции мшистых волокон экстраклеточная регистрация ответа в поле САЗ обнаружила специфическое влияние МКА 3G7-F8 на изменение

амплитуда популяционного спайка (табл. 3).

Через 10 минут после кратковременной высокочастотной стимуляции мшистых волокон амплитуда популяционного спайка в среде, содержащей МКА 307~?8, отличалась от таковой в контрольной среде и была существенно ниже .(118,9*13,5% и 155,4*15,7% соответственно; Р<0,05). Через 30 минут после тетанизации' эта различия сохранялись (Ю1,3±П ,9% и I55.2i2I.7S соответственно; Р<0,05).

Таблица 2

Влияние МКА 2С7-Г8 на амплитуду и латентность популяционного спайка

Среда с ГО-сопИ ! Среда с МКА 307-Р8

амплитуда ! латентность ! амплитуда ! латентность

{%) ! (Ж) ! (%) ! (%)

92,7+12,4 106,5±19,6 112,7*11,6 107,2*5,2

84,2±16,9 И9,1±14,7 107,0*15,8 107,6*9,4

80,1±П ,9 116,8*15,9 102,9*13,9 123,1*4,9

Время (мин)

I 10 20

Таблица 3

Влияние МКА 307-Р8 на индукцию длительной посттетанической потенциацш

Время (мин)

Среда с РО-сопсИ

Среда с МКА 307-58

амплитуда ! п-спайка ! (%) ! -----------г.

латентность п-спайка

(%)

!

л! амплитуда I латентность ! п-спайка ! п-спайка ! {%) ! (%)

I 10 20 30

141,2*33,0 155,4*15,7 152,6*26,2 155,2*21,7

108,5*10,8 101,2*12,1 96,6*11,9 92,3*14,3

118,1*5,6 118,9*13,5" 103,6*5,5*

86,1*10,7 95,4*14,0 106,3*13,3 101,3*11,9* 100,7*15,4

Различия между опытной и контрольной группой достоверны (Р<0,05)

Таким образом, МКА 307-28 не оказывают влияния на изменение амплитуды и латентноети популяционного спайка

непотенциированных входов, тогда как присутствие в среде МКА ЗС7-Р8 во время тетанической стимуляции мшистых волокон блокирует индукцию ДПТП в юле САЗ гиппокампа крыс.

Сопоставляя результаты электрофизиологического эксперимента с данными по локализации антигена в гиппокамле крыс, мохно предположить, что действие антител ЗС7-Г8 обусловлено "функциональной блокадой" антигена, расположенного на поверхности апикальных дендритов пирамидных нейронов гиппокампа.

Принимая во внимание сказанное выше, следует, что ней-роспецифические белки, участвующие в процессах дифференте-ровки нейронов, играют важную роль и в функциональной активности клеток взрослого животного, что подтверждает гипотезу об общности молекулярных механизмов нейрональной пластичности в развивающемся и взрослом мозге (Сое1ег et а1., 1986).

ВЫВОДЫ

• I. Получен банк гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам развивающегося гиппокампа крыс.

2. Идентифицировано два ранее неизвестных нейроспецифи-ческих антигена, выявляемых на ранних этапах постнатального онтогенеза.

3. Оба антигена обладают клеточной специфичностью и могут служить маркерами нейронов: антиген - клетки Пуркинье мозжечка и пирамидные нейроны пгппокампз; антиген 6С4-С2 - клетки Пуркинье мозжечка, пирамидные нейроны гиппокампа, нейр'оны заднего коленчатого тела.

4. Показано, что экспрессия идентифицированных антигенов в гиппокамле и мозжечке совпадает по времени с основными этапами даф$еренцировки этих структур. Бост и диЗференшгоов-ка дендритов сопровождается поступлением в них антигенов из сомы клетки.

5. Обнаружено существенное влияние МКА Зй7-Р8 на развитие органотипической культуры гиппокампа, выражающееся в увеличении площади зоны роста и образовании в ней разрывов за счет усиленной пролиферации и миграции йстроцитоЕ. Данный э$фект может быть обусловлен блокадой функциональных сайтов на теле и отростках пирамидных нейронов, модифицирующей их