Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Механизмы формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных"
ии^иБЗ1Ю
На правах рукописи
БОЯРЧУК Екатерина Юрьевна
МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВНУТРЕННЕГО ЦЕНТРОМЕРНОГО ДОМЕНА КИНЕТОХОРА
ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ.
03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 3 МАЙ 2007
Санкт-Петербург 2007
003063110
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург и Национальных институтах здоровья (США)
Научные руководители: кандидат биологических наук
Арнаутов Алексей Михайлович
Национальные институты здоровья, Бетезда, США
доктор биологических наук, академик Никольский Николай Николаевич Институт цитологии РАН,Санкт-Петербург
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор Подгорная Ольга Игоревна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович
Петербургский институт ядерной физики им Б П Константинова РАН, Гатчина
Ведущая организация:
Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербург
Защита состоится «25» мая 2007 года в 15 ч на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу Тихорецкий пр , д 4, 194064, Санкт-Петербург се11Ью@гпа11 су1БрЬ гзя1 ги
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан « » апреля 2007 г
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандита биологических наук / ЕВ Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Разделение генетического материала между дочерними клетками - один из важнейших шагов в ходе клеточного цикла Для осуществления правильной сегрегации хромосом во время митоза в клетке происходят сложнейшие взаимодействия между микротрубочками (МТ) веретена деления и хроматином Хромосомы присоединяются к МТ, растущим с противоположных полюсов митотического веретена, при помощи кинетохоров Кинетохор представляет собой многокомпонентную белковую структуру, которая формируется на центромерном участке каждой сестринской хроматиды Кинетохор может быть условно разделен на 2 субдомена внутренний центромерный домен (ВЦД) и наружный кинетохор (НК) (Cleveland et al, 2003) Компоненты наружного кинетохора участвуют в присоединении микротрубочек к хроматину и генерируют сигнал, блокирующий начало выхода из митоза до тех пор, пока все хромосомы не будут присоединены к митотическому веретену Внутренний центромерный домен состоит из белков, вовлеченных в удержание сестринских хроматид до наступления анафазы и в регуляцию присоединения микротрубочек Основные компоненты ВЦД - транзитный хромосомный комплекс (ТХК, анг, chromosomal passenger complex), кинезин МСАК и комплекс Sgo/PP2a (Shugoshin/фосфатаза РР2а) (Cleveland et al, 2003,Rivera and Losada, 2006) Sgo в комплексе с РР2а блокирует диссоциацию комплекса Когезина в центромерном районе, предохраняя таким образом сестринские хроматиды от преждевременного расхождения Кроме этого, Sgo регулирует динамику МТ веретена деления и стабилизирует кинетохорные МТ ТХК состоит из киназы Aurora В, и белков INCENP, Survivin и Dasra A/Borealin ТХК фосфорилирует гистон НЗ, что является обязательным условием митотической конденсации хромосом, и необходим для инициации сборки кинетохора (Vagnarelh and Earnshaw, 2004) Более того, ТХК регулирует активность киисзина МСАК и, таким образом, участвует в регуляции полимеризации и деполимеризации тубулиновых филаментов и контролирует формирование правильного (амфителического) присоединения МТ веретена деления к кинетохорам (Andrews et al, 2004)
Сборка функционального кинетохора происходит заново в ходе каждого клеточного цикла Считается, что сборка наружного кинетохора происходит в строгом иерархическом порядке, т е связывание одних компонентов регулируется присутствием на кипетохоре других (Vigneron et al, 2004) Несмотря на значительные успехи в изучении строения наружного кинетохора, регуляция формирования ВЦД остается плохо изученной Известно, что во время перехода из профазы в прометафазу ТХК переходит с плеч хромосом в ВЦД (Vagnarelh and Earnshaw, 2004) Механизм, регулирующий этот переход, неизвестен Недавние исследования показали, что локализация белка МСАК во внутреннем центромерном домене зависит от ТХК (Andrews et al, 2004), а накопление в ВЦД белка Sgo регулируется компонентом НК Bubi (Kitajima et al, 2004), но детали регуляции сборки функционального ВЦД не ясны Поиск механизма регуляции сборки внутреннего центромерпого домена и являлся
предметом данной работы
Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение процесса формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи
1 Выбрать модель, позволяющую изучать формирование кннетохоров позвоночных с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований
2 Выявить биохимический путь (пути), который регулирует формирование внутреннего центромерного домена кинетохора
3 Выяснить взаимозависимость формирования внутреннего центромерного домена, наружного кинетохора и митотической конденсации хромосом
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Киназа Bubi контролирует расположение ТХК во внутреннем цептромерном домене кинетохора в прометафазе митоза
2 Киназа Bubi абсолютно необходима для обеспечения связывания белка xSgo с митотическим хроматином
3 ТХК регулирует локализацию белка xSgo во внутреннем цептромерном домене
4 Формирование как внутреннего центромерного домена, так и наружного кинетохора происходит независимо от митотической конденсации хроматина
Научная новизна работы. Впервые показано, что компонент наружного кинетохора - белок Bubi - опосредует расположение ТХК во внутреннем цептромерном домене кинетохора в прометафазе Эта функция Bubi у позвоночных животных консервативна Показано, что Bubi регулирует стабильность ТХК Также выявлено, что Bubi обеспечивает связывание белка Sgo с митотическим хроматином, но не с кинетохором При этом связывание самой киназы Bubi с кинетохором не является обязательным условием для выполнения этой функции Локализация белка Sgo во внутреннем цептромерном домене в метафазе регулируется ТХК Выполнение обеих функций по сборке ВЦЦ - регуляция связывания белка Sgo с хроматином и обеспечение правильной локализации ТХК - требует киназной активности Bubi Также продемонстрировано, что формирование наружного и внутреннего центромерного доменов может происходит после митотической конденсации хроматина
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов формирования кинетохора Выявленные два различных пути регуляции формирования внутреннего центромерного домена позволяют предположить существование многоуровневой системы контроля сборки кинетохора Более
того, в свете предшествующих исследований, показавших роль белка Bubi в формировании наружного кинетохора и в функционировании контрольной точки сборки веретена деления, наши данные говорят о роли этого фермента в координации многочисленных аспектов прохождения митоза и регуляции прохождения клеточного цикла
Теоретические результаты работы используются в курсе «Структура и функция хроматина» для магистров СПбГУ, а также могут быть использованы в учебных спецкурсах по клеточной биологии, читаемых на биолого-медицинских факультетах высших учебных заведений
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисных сообщения, представленных на XV Всероссийском совещании «Структура и функция ядра» (СПб, 2005), и на международных конференциях American Society for Cell Biology, 44lh meeting (Washington, DC, 2004), The Cell Cycle (Cold Spring Harbor, 2006) и American Society for Cell Biology, 46lh meeting (San Diego, CA, 2006)
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материал и методика», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», выводов и списка цитируемой литературы Иллюстрационный материал представлен 24 рисунками, из них 15 цветных
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ
Рекомбинантиые белки и антитела кДНК, кодирующие xenopus BublK87IR и xenopus Aurora В KI22R были получена методом ПЦР Нарушения киназной активности в белке xenopus Bubi были описаны ранее (Sharp-Baker and Chen, 2001) Мутация K122R была внесена в последовательность xenopus Aurora В исходя из данных о нарушениях киназной активности в гомологе этой киназы у человека (Ditchfield et al, 2003) Bub 1 и Bub 1K87IR были клонированы в модифицированный вектор pGEM, содержащий 5' и 3' UTR ß-глобина X laevis Aurora В и Aurora В |2" , слитые с zz последовательностью (двумя z доменами - производными от домена связывания белка A Staphylococcus aureus, zz последовательность была клонирована из вектора pEZZ 18 (Amersham Bioscience)), были клонированы в сходным образом модифицированный вектор, содержащий промотер SP6 (оба вектора любезно предоставлены д-ром Йем-Бо Ши, Национальные Институты Здравоохранения, Бетезда, США) Транскрипцию РНК проводили при помощи транскрипционного набора mMessage mMACHINE (Ambion) Экспрессию белков в экстракте ооцитов проводили по протоколу Р-Х Чен (Sharp-Baker and Chen, 2001) 6His-Bubl и 6His-BublK87IR экспрессировали в клетках High Five (культура клеток Tnchopulsia m, Invitrogen, бакуловирусы любезно предоставлены д-ром Дж Маллером, Университет Колорадо, Денвер, США)
В работе были использованы антитела против следующих белков RCC1, PIASy и топоизомераза II были получены в лаборатории д-ра M Дассо
(Национальные Институты Здравоохранения, Бетезда, США) и охарактеризованы ранее, промежуточная цепь динеина (Dynein 1С, Abeam, clone 74 1), pl50glucd, hAuroraB (Beckman Dickens), Survivin (R&D), фосфорилированная форма гистона НЗ (рНЗ S10, Upstate Biotechnology), xenopiis Bub3 and Mad2 (предоставлены д-ром P-X Чен, Корнелльский университет, Итака, США), xenopiis Dasra А (любезно предоставлены д-ром X Фунабики, Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, США), xenopiis INCENP (любезно предоставлены д-ром Т Стукенбергом, Университет Вирджинии, Шарлотсвилль, США), xenopiis Циклин В (любезно предоставлены д-ром Т Хантом, Лондонский Исследовательский институт, Лондон, Великобритания), hBubl (Sigma, клон 14Н5) Сыворотка CREST была любезно предоставлена д-ром И Успенским (Национальные Институты Здравоохронения, Бетезда, США) Поликлопальпые антитела против xenopiis Bubi (ак 274-467), хепорш Aurora В, xenopiis RanGAPl, Sccl (пептид EPYSDIIATPGPRFH), xenopiis BubRl (ак 189-359), hMCAK( пептид C-IQKQKRRSVNSKIPA), xenopiis Sgo (ак 1-663), xenopiis Cenp-A (пептид MRPGSTPPSRRKSRPPRRVS-C) были получены при иммунизации кроликов или куриц и аффинно очищены Все вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромами Alexa Fluor - 488, 568 или 647, были приобретены в фирме Molecular Probes Inc
Приготовление цнтоплазматического экстракта из ооцитов X. laevis
Ядра спермиев и цитоплазматические экстракты из зрелых ооцитов X laevis были получены согласно опубликованным ранее протоколам (Kornbluth, 2001) Ядра спермиев добавляли в концентрации 1000-4000 ядер на 1 мкл экстракта При индукции митоза добавляли нокодазол (Sigma) в концентрации 20 мкг/мл
Для иммуноистощения белка из экстрактов конъюгированные с белком А магнитные частицы (Dynal Со) инкубировали в течение 16 ч с указанными антителами или с контрольными IgG из сыворотки кролика (Vector) при +4°С, а затем ковалентно связывали, используя диметил пимелимидат*2 HCl (Dimethyl pimelimidate'2 HCl, Pierce) по протоколу производителя Частицы инкубировали в 10%-ном растворе гидролизовапного желатина (Sigma) в буфере CSF-XB (10 мМ Hepes-KOH, pH 7 7, 100 мМ KCl, 2 мМ MgC12, 5 мМ EGT А) 20 мин , промывали буфером CSF-XB и инкубировали в течение 1 ч с экстрактами при +23°С или при +4°С Магнитные частицы вместе с образовавшимися имммунными комплексами удаляли из экстракта сильным магнитом
Очистка хроматина. Для получения очищенной фракции сформированных в экстрактах хромосом 100 мкл цнтоплазматического экстракта, содержащего хроматин, разбавляли в 5 раз 0 8-кратпым буфером CSF-XB содержащим 20 мМ ß-глицерофосфата, 5% глицерина и 0 5% Triton X-100, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин , наслаивали на подушку, содержащую буфер CSF-XB и 35% глицерина, и центрифугировали при 10000g в течение 5 мин при +4°С Осадок пипетировали в том же буфере, наслаивали на подушку и центрифугировали при тех же условиях К осадкам добавляли 60 мкл буфера Лэммли и кипятили в течение 5 мин Для очистки хроматина из интерфазных экстрактов 100 мкл экстракта, содержащего
хроматин, разбавляли 0 8-кратным буфером CSF-XB, содержащим 20 мМ ß-глицерофосфата, 5% глицерина, инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре и центрифугировали так же, как и хромосомы
Для иммунофлуоресцентного анализа 30 мкл экстракта, содержащего хроматин, разбавляли в 10 раз 0 8—кратным буфером CSF-XB, содержащим 250 мМ сахарозы Хроматин фиксировали, добаляя равный объем того же буфера, содержащего 4% параформальдегида После 30 мин фиксации при комнатной температуре хроматин осаждали на покровные стекла центрифугированием через подушку, содержащую 40% глицерина Для окраски антинелами против Сепр-А, хроматин фиксировали в течение 5 мин , добавляя 5 объемов 0 8-кратнрого буфера CSF-XB, содержащего 4% параформальдегида, осаждали на стекла через подушку и затем фиксировали в течение 5 мин охлажденным метанолом при -20°С
Клеточные линии, их культивирование, получение стабильных клеточных линий, РНК интерференция. В работе использовали клеточную линию HeLa Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота Конструкция EGFP-Survivin была любезно предоставлена д-ром С Дмитровым (институт Альбера Боннуа, Ля Тронш, Франция) Клеточная линия, экспрессирующая EGFP-Survivin, была сделана с использованием реагента Effectin (Qiagen) по протоколу производителя Дуплексы РНК для истощения Ламина А/С и Bubi (нуклеотиды 273-295) были транфицированы при помощи реагента Oligofectamin (Invitrogen) по протоколу производителя Клетки анализировали спустя 48 часов после трансфекции Перед фиксацией клетки инкубировали в течение 1 ч в присутствии 0,4 мкг/мл нокодазола
Иммунофлуоресценция и анализ изображений. Клетки промывали PBS, содержащим 1 мМ MgC12 и фиксировали 4%-ным формалином После фиксации клетки пермеабилизовали 0 2% Triton Х-100 Осажденный на стекла хроматин и пермеабилизированые клетки инкубировали 40 мин в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (Sigma) в TBS, содержащем 0,1% Tween-20, окрашивали первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем - вторичными антителами в течение 40 мин ДНК окрашивали красителем Хехст 33342 (4 мкг/мл) Образцы анализировали при помощи микроскопа Axioskop, Carl Zeiss Microimaging, Inc , с объективом Iris lOOx/l 4 или 40x/l 3 (Carl Zeiss Microimaging, Inc) Изображения снимались камерой Orea II, Hamamatsu Photonics К К Управление системой осуществлялось программным обеспечением Openlab Software (Imprevisión) В случае Рис 5 изображения были получены с использование конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 Meta system Масштабные отрезки - 20 мкм (кроме специально отмеченных случаев)
Иммунопреципитация и zz-прещтитация. Взаимодействие белков изучали с помощью методов иммунопреципитаци и zz-преципитации Для иммунопреципитации конъюгированные с белком А частицы Сефарозы (Amercham Bioscience) связывали с антителами в течение 16 ч при +4°С ЦСФ-
экстракты разбавляли в 5 раз буфером CSF-XB, содержащем 20 мМ Р-глицерофосфата, 10 мкг/мл ингибиторов протеаз (леупептина, пепстатина и химостатина) и инкубировали с антителами, связанными с сефарозой в течение 2 ч при +4°С После окончания инкубации частицы промывали буфером CSF-XB, содержащем 20 мМ p-глицерофосфата и 0,5% Triton Х-100 Иммунные комплексы элюировали с сефарозы 0 1 М глицином (рН 2 4), растворяли в двукратном буфере для SDS-электрофореза, кипятили и использовали для электрофореза с последующим выявлением белков методом Вестерн-блотинга или окраской геля серебром или красителем кумаси синий
Для zz-преципитации в экстракты добавляли рекомбинантные Aurora В-zz или Aurora BK122R-zz и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре После окончания инкубации экстракты разбавляли в 5 раз буфером CSF-XB, содержащем 20 мМ p-глицерофосфата и 10 мкг/мл ингибиторов протеаз, и инкубировали с IgG-Сефарозой (Amercham Bioscience) в течение 2 ч при +4°С По окончании инкубации частицы сефарозы промывали 3 раза буфером CSF-XB, содержащем 20 мМ Р-глицерофосфата и 0 5% Triton-XlOO Комплексы элюировали с IgG-Сефарозы 0 1М глицином (рН 2 4) и использовали для электрофореза с последующим выявлением белков методом Вестерн-блотинга
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выбор модели для изучения строения и регуляции формирования
кинетохора
Одной из распространенных моделей для исследования регуляции сборки кинетохора и его функции являются цитоплазматические экстракты из зрелых ооцитов Xenopus laevis Эта система позволяет воспроизвести in vitro процессы репликации, конденсации и сегрегации хромосом (Maresca and Heald, 2006) Среди основных достоинств системы следует отметить способность цитоплазматических экстрактов поддерживать в течение долгого времени определенную стадию клеточного цикла (митоз или интерфазу) и возможность воспроизведения в экстрактах многочисленных морфологических и биохимических процессов, которые происходят in vivo в течение клеточного цикла Более того, система экстрактов X laevis позволяет получить биохимический нокаут любого белка путем его истощения из цитоплазматического экстракта аффинными антителами, и таким образом исследовать роль данного белка в ходе клеточного цикла
Зрелые ооциты остановлены на стадии метафазы II мейоза действием цитостатического фактора (ЦСФ) (Kornbluth, 2001) Полученная центрифугированием цитоплазматическая фракция (ЦСФ-экстракты) сохраняет все биохимические особенности таких ооцитов In vivo проникновение спермия вызывает выброс ионов кальция из внутренних компартментов ооцита Повышение цитоплазаматической концентрации Са2+ приводит к инактивации ЦСФ и завершению ооцитом мейотического деления Добавление СаСЬ в ЦСФ-экстракты имитирует выброс ионов кальция и приводит к инактивации ЦСФ и
переходу экстрактов в интерфазу Существуют два метода получения митотических хромосом с использованием экстрактов ооцитов (рис 1)
Формирование ЦСФ-хромосом
Добавление ядер спермиев
добавление нокодазопз
ЦФС-экстракты-
Очнстка ЦСФ-хромосом
Ремоделинг хроматина слергия Митотическзя конденсация хрлматина Формирование кинетохорз
120 мин
Формирование М-хромосом
Индукция интерфазы
(добавление CaCfcj
Индукция митоза
(добавление ЦСФ-экстрзкта)
Очистка М хромосом
ЦСФ-зкстракты-
добавление ядер спермиев
L
добавление ноходчзола /
5 60
Ремоделкнг хроматина спермкя Образование ядерной оболочга Деконденсация ДНК Репликация ДНК
120 мин
Разборка ядерной оболочки Митотичесгая конденсация хроматина Формирование кинегохора
Рисунок 1. Схема получения ЦСФ- и М-хромосом Для получения ЦСФ-хромосом в ЦСФ-экстракты добавляли 4000 ядер спермиев/мкл и нокодазол в конечной концентрации 20 мкг/мл Хромосомы очищали после 2 ч инкубации при 23°С Для получения М-хромосом в ЦСФ-экстрактах индуцировали интерфазу добавлением 0,06 мМ СаС'Ь, а затем к таким экстрактам добавляли 2000 ядер спермиев/мкл Через 1 ч в экстрактах индуцировали переход в митоз, добавляя 2/3 объема ЦСФ-экстрактов и нокодазол Хромосомы очищали через 1 ч после инициации митоза
По первому методу ядра спермиев добавляются непосредственно в ЦСФ-экстракт Это приводит к формированию нереплицированных митотических хромосом (ЦСФ-хромосом) При использовании второго метода в ЦСФ-экстрактах сначала инициируют интерфазу, и ядра спермиев добавляют уже в интерфазные экстракты, где образуется ядро, и ДНК спермия проходит репликацию Добавление к интерфазным экстрактам 2/3 объема ЦСФ-экстрактов приводит к переходу экстрактов в митоз и формированию реплицированных митотических хромосом (М-хромосом) Обоснованность использования ЦСФ-хромосом для исследования структуры и регуляции формирования кинетохора представлялась нам спорной, так как в последние годы стали накапливаться данные о существенных нарушениях в структуре ЦСФ-хромосом (Sawin and Mitchison, 1991,Maresca et al, 2005)
Для того, чтобы определить, являются ли ЦСФ-хромосомы адекватной моделью для изучения процесса сборки кинетохора, мы сравнили Количество некоторых белков кинетохора на 1(СФ- и M-хромосомах. Уровень белков наружного кинетохора Bnbl, Bublil и субьединицы Динактина plSO®1 , а также некоторых компонентов В1Щ - белков Aurora В и Dasra А был значительно снижен в ЦСФ- хромосомах (рис. 2А). Кроме того, расположение компонентов ТХК (Aurora В и Suivi vin) в ЦСФ-хромосомах было нарушено. В М-хромосомах Aurora В и Survivin связаны исключительно с ВЦД, тогда как в ЦСФ-хромосомах значительная доля Aurora В и Survivin располагалась на плечах хромосом (рис. 2Б). Следует отметить, что в прометафазс в соматических клетках компоненты ТХК располагаются строго во внутреннем цеитромерном домене ((Vagnarelli and Earnshaw, 2004), рис. SA).
Aurora В
ВиЫ
** ■#»* ВиЫ
piso
Aurora В
тшЖ Dasra А
рНЗ
■Л*
р» Н2А/Н2В
2 О •û. X
e о =r
. i ' '' ** . Q
■ % ib H ftp J>t * 4 * 1 ж Я щ , j|B Up
Хроматин
Рисунок 2, Кинетохоры^сформированные на ЦСФ-хромосомах, имеют нарушенную ст руктуру, (Л) Очищенные ЦСФ- и М-хромосомы, полученные согласно схеме, изображенной на рис 1, анализировали методом Вестерн-блотинга с анти телами против указанных белков Уровень фосфор или ров а иного in сто на НЗ (рНЗ) и гиетонои H2A/N2B использовали в качестве контроля загрузки. Количество гистонов Н2А/Н2В выявляли методом SDS-PAGE с последующей Окраской серебром. (Б) ЦСФ- и М-хромосомы анализировали методом непрямой и м мунофлу оресцв] i ни и с антителами против белкон Aurora В, и Bub I; ДНК (здесь и далее) окрашивали красителем Хёхст 33342
Более того, отсутствие белка ВнЫ в экстрактах по-разному влияло па сборку кинетохоров па ЦСФ- н М-хромосомах, Истощение Bubi из экстрактов при формировании М-хромосом приводило к снижению количества связанных с хроматином белков BubRI и plSO^""1 (рис. ЗА), Сходное уменьшение количества связанных с хроматином белков НК в отсутствии Bnbl характерно и для кинетохоров соматических клеток (Johnson et al., 2004). В отличие от М-хромосом и соматических клеток, отсутствие ВнЫ при сборке кинетохоров па
ЦСФ-хромосомах полностью блокировало связывание ВнЬИ. 1 и р150к1и"1 с хроматином (рис. ЗА, I)), Основываясь на полученных результатах, мы заключили, что организация кинетохоров на М-хромосомах сходна с организацией кинетохоров соматических клеток. Поэтому в дальнейших исследованиях в качестве модели для анализа организации и способов регуляции сборки кинетохора были использованы М-хромосомы.
а
•о
_УСФ:
Ü о ¡я
ЦСШ-хроМ-
BubR1
[I! <
ш - 4«
*
■т «А
nfi .и „и, ■„■■■
- и, № „
Bubi BifbRI
riued pi ED
Aurora В рНЗ
H2A/H28
Цитоплазмзт. Хроматин экстракт
М-хром.
BubR1
Рисунок Л. Различная чу Hei внтельность к отсутствию белка liul»I при сборке наружно! о кинетохоров и ЦСФ-II М-хромосомах. (А) Образцы цитоплазмати чес к н х экстрактов и очищенные ЦСФ- м М-хромосомы, сформированные в контрольных экстрактах или экстоактах. лишенных Bubi (ДВиЫ), анализировали методом Вестерн-блотинга с антителами против указанных белков: уровень фосфорилированного гистона 113 (рНЗ) и гиетонов Н2А/Н2В использовали в качестве контроля загрузки. Количество шетонов Н2А/Н2В выявляли методом SDS-PAGE с последующей окраской серебром. (Ii) Хромосомы анализировали методам непрямой иммунофлуоресценции с антителами против BubRl и р150*Ч
2.1. Bubi контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене в системе экстрактов ооцнтов Xenopus laevis
ТХК представляет собой комплекс, состоящий из кииазы Aurora В и белков INCENP, Surviviö и DasraA. Блокирование активности киназы Aurora В или отсутствие одного из компонентов комплекса приводит к аномальной ориентации хромосом, их неправильной Сегрегации, потере Способности клетки к генерации Сигнала контрольной точки сборки веретена деления и многим другим нарушениям прохождения митоза (Vagnarelli and Eamshaw,
2004ji Сходные нарушения наблюдаются и в клетках, где отсутствует белок Bub I (Johnson et al., §004; Nieraldi and Sorge г, 2005), что говорят о потенциальной связи между ТХК и Bubi. Fi то же время, недавние исследования показали, что белок Bubi регулирует расположение одного из компонентов ВЦД - белка Sgo (Kitajima et al., 2004). Основываясь па этих данных, мы предположили, что Bub) может быть регулятором организации всего внутреннего qeiпромерного домена.
SubRt
Autora В
виы шт
BubRI ШД]
elued
ц«тош1. хроматин
dp
* ^
р150
íffífeu
Survivin
ДНК
т Як........
——. i «MMN»
-
BuM Au гага В Survivin Das ra А рНЗ
цитопл- хроматин
Рисунок 4. Itiil)l контролирует расположение ТХК во внутреннем центромерном домене кннетохора в системе цитоплазмати чес ки х экстрактов ооннтов X. laevis. (А, Б) Тотальные цитоплазматический экстракты л очищенный митогический хроматин, сформированный в контрольных или лишенных эндогенного ВиЫ (ДВиЫ) экстрактах, анализировали методом Вестерн-бйотнsira с использованием антител против компонентов ПК (BubRI, р150г ; Mad2, ВиЬЗ и промежуточной цепи дипеина (Dynein 1С)), компонентов ТХК (Aurora В, Survivin, Dasra А) и фосфорнлироваиной формы пистона ИЗ (рПЗ). Уровень топонзомеразы II (Тори II) использовала в качестве контроля загрузки, (В, Г) Очищенный мнтотическнй хроматин анализировали методом непрямой иммунофлуоресценции (И) с антителами против Aurora В н BubRI, (Г) прочна Survivin и р!50в)|в" . На (! ) показаны индивидуальные хромосомы. Масштабные отрезки - 20 мкм (В) и 3 мкм (Г).
Для определения роли Buhl в формировании внутреннего центромернюго домена были проанализированы М-хромосомы, сформированные в контрольных экстрактах и экстрактах, лишенных эндогенного ВчЫ, Истощение Bub] приводило к снижению уровня многих белков наружного кинетохора (рис. ЗА, 4Л), что согласуется с ранее опубликованными результатами (Sharp-Baker and Chen, 2001 ;Vigneron et а!., 2004). I 1ри истощении Bubi падало также и количество связанных с хроматином компонентов Т.ХК (рис. 4А, Б). Более того, расположение ТХК в отсутствие Bub] было нарушено. Ii хромосомах, Сформированных в контрольных экстрактах, белок Aurora В располагался строго в ВЦД (рис. 4В), тогда как в отсутствии белка Bub! Aurora В распределялся равномерно по всей длине хромосом. Имму нофлуоресце! ггн ый анализ расположения белка Surviviu па М-хромосомах, сформированных в экстрактах, лишенных Bubi, выявил сходные нарушения в локализации этого компонента ТХК: в отличие от четкого расположения в ВЦД в контрольных образцах, белок Sum vi п не накапливался на кинетохоре в отсутствии Bubi.
2.2. Bul) I контролирует расположение транзит ною хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене в соматических клетках
Чтобы определить, является ли зависимость расположения транзитного хромосомного комплекса от белка ВиЫ общей для позвоночных, было проанализировано расположение ТХК в присутствии и в отсутствии Bubi в соматических клетках. Истощение ВиЫ из клеток HcLa проводили методом интерференции РНК (иРНК).
Ё s о сч
"5
- -> Ф * $' .> -'/л* Шшк
• Вэ Чг
'to.
о
г з
X га
Щ- и шгщ ш J Ii
ш ■9 в п
<й it I X
• 2 j^^^^HHpj^XHB-^ifS Рисунок 5. Белок ВиЫ необходим § ^^^^^ИИКМиЯИшЯЕИ для правильном Локализации ТХК
на кинетохоре в соматических клетках.
(А) Клетки линии HeLa грапсфецирйвали дуплексами РНК, специфичными для последовательностей Ламина А/С (ДЛамин А/С) или Bubi (ДВиЫ). Через 24 ч после трапсфекции клетки обрабатывали нокодазолом а течение ! ч, фиксировали п окрашивали антителами против белков Bubi и Aurora В. (Б) Клетки линии HeLa, экспресс и рующие Survivin-EGFP, обрабатывали как в (А) и окрашивали антителами против цеитромерного маркера CREST.
В контрольных клетках киназа Aurora В располагалась строго в ВЦД, тогда как в отсутствии Bubi Aurora В была связана с хроматином и не имела четко выраженной локализации (рис 5А) Количество связанного с хроматином белка Aurora В также было снижено Сходные результаты были получены при анализе клеточной линии HeLa, конститутивно экспрессирующей Survivin-EGFP спустя 24 ч после обработки специфическими дуплексами РНК большинство клеток, находящихся в прометафазе митоза, имело диффузное распределение белка Survivin-EGFP по плечам хромосом, тогда как в контрольных образцах (после обработки дуплексами, специфическими для Ламина А/С) Survivin-EGFP был сконцентрирован в ВЦД (рис 5Б)
Основываясь на этих данных и данных, полученных с использованием системы цитоплазматических экстрактов ооцитов X laevis, мы заключили, что у позвоночных роль Bubi в контроле расположения ТХК во внутреннем центромерном домене кинетохора в митозе консервативна
2.3. Bubi контролирует стабильность транзитного хромосомного
комплекса
Известно, что целостность ТХК необходима для связывания компонентов этого комплекса с хроматином (Sampath et al, 2004) Следовательно, падение уровня связанного с хроматином ТХК в отсутствии Bubi могло быть вызвано биохимическими изменениями в ТХК Изменения стабильности ТХК оценивали, используя взаимодействие компонентов ТХК с рекомбинантным компонентом комплекса - киназой Aurora В, слитой с zz-последователыюстью (Aurora B-zz) Рекомбинантный белок добавляли в контрольные экстракты и экстракты, лишенные Bubi, в концентрации близкой к эндогенному количеству Aurora В Сформировавшийся на рекомбинантном белке Aurora B-zz комплекс очищали при помощи IgG-сефарозы (zz-преципитация) Было обнаружено, что в отсутствие Bubi компоненты ТХК (INCENP, Dasra A, Survivin) менее эффективно связываются с Aurora B-zz (рис 6) Следует отметить, что падение эффективности формирования комплекса не было вызвано деградацией компонентов комплекса в отсутствии белка Bubi в экстрактах (рис 6)
Известно, что стабильность ТХК регулируется киназной активностью Aurora В (Honda et al, 2003) В наших экспериментах истощение Bubi из экстрактов не приводило к падению уровня фосфорилирования гистона НЗ (рис 4Б) - одного из наиболее изученных субстратов киназы Aurora В (Murnion et al, 2001), и, следовательно, нарушение локализации Aurora В на хроматине и отсутствие в экстрактах Bubi не блокировало полностью активность киназы Тем не менее, чтобы исключить возможность того, что нарушение формирования комплекса с рекомбинантной формой Aurora В в отсутствии Bubi было вызвано изменением киназной активности Aurora В, в экспериментах по формированию комплекса была использована форма Aurora B-zz с мутацией, ииактивирующей киназную активность (Aurora Вк 22R-zz) Белки INCENP, Dasra А и Survivin значительно хуже связывались с Aurora BKI22R-zz в контрольных экстрактах (рис 6), что согласуется с данными о необходимости киназной активности Aurora В для формирования ТХК
(Honda et al., 2003). Однако в отсутствие в экстрактах белка Rubi образование Комплекса Практически полностью блокировалось. Эти результаты указывают на то. что Bubi контролирует стабильность ТХК независимо от кипазной активности Aurora В,
Цитоплазма!ическии экс гракт zi-прецклитация
Рисунок 6. liuh! INCENP стабилизирует ТХК
Рекомбинантные белки DasraA Aurora li-zz или Survivlrs Aurora Bklz2lt-zz
добавляли в Контрольные Aurora В-72 экстракты или экстракты,
лишенные эндогенного *** Bub! (ABubi).
Сформированный на рекомбинаи i пом белке комплекс очищали с помощью IgO-сефарозы (zz-преципитация). Количество компонентов ТХК в элюатах проверяли методом Вестерн -блотинга.
2.4. Киназвая активность Bubi абсолютно необходима для связывания ТХК с внутренним центомерным доменом
Рапсе было показано, что присутствие Bubi па кииетохоре усиливает связывание белков наружного киистохора посредством белок-белковых взаимодействий и независимо от км н аз пой активности Bubi (Sharp-Baker and Chen, 2001). Для того, чтобы определить, требуется ли киназная активность Bub! для правильного расположения ТХК в ВЦД, мы получили рекомбинантн ые белки: Bubi дикого типа (wt) и Bubi, киназная активность которого была нарушена точечной мутацией в кииазном домене BublKS7IR. Рекомбинантные белки добавляли в экстракты, лишенные белка Bubi, в концентрации, близкой к концентрации эндогенного Bubi. Анализ сформированного в таких экстрактах митотического хроматина показал, что рекомбинантный Bubi дикого типа способен восстановить расположение ТХК во внутреннем центромер ном домене (рис. 7). Усиление связывания с хроматином компонентов ПК не требовало киназной активности Bubi (рис 713), что согласуется с результатами предшествующих исследований (Sharp-Baker and Chen, 2001). Однако киназная активность Bubi оказалась абсолютно необходимой для восстановления правильной локализации ТХК. Добавление BublKlí7IK приводило к восстановлению уровня компонентов НК, связанных с хроматином, по не восстанавливало нарушенного расположения ТХК, вызванного истощением эндогенного белка Bubi из экстрактов.
о <ь
Хт хт
3F
т «■ ■ ■щл] й^Ц'
-fi
mm •fi
AtiB-zz AuBn
ûBubl
контр буф WT K871R ¡■и» <Ш и«» I ВиЫ
BifbRI
xSgo Aurora В Dasra А Survfvin RCC1
хроматин
Рисунок 7, Киназиая активность Bubi необходима для локализации ТХК но внутреннем центромерном домене. (А) В
экстракты, лишенные эндогенного Bubi (AB ubi), добавляли буфер
(Буф) или рекомбннантпые белки: Bubi дикого типа (WT) или форму Bubi с нарушенной ки пашой активностью Bubi к (K.87I R). Очищенный хроматин, сформированный в таких экстрактах, анализировали методом Вестерн-блотинга с применением антител против указанных белков; Уровень RCCI использовали в качестве контроля загрузки, (Б) Очищенный хроматин, полученный как в (А), Опрашивали ант ителами против BubR ! и Aurora В.
Таким образом, Bubi контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем домене кппетохора во время митоза у позвоночных, причем эта функция требует киназной активности Bub I
3.1. Bubi контролирует связывание xSgo с митотическпм
хроматином
Недавние исследования на дрожжах и млекопитающих показали, что ВиЫ контролирует связывание с кинетохорами еще одного компонента BI [Д - белка Sgo (Kitajima et a!., 2004;Tang et al., 2004). Также известно, что в дрожжах S pombe для накопления Sgo па кипстохорс требуется киназиая активность Bubi (Kitajima et al., 2004). В отличие от опубликованных данных, где отсутствие Bubi приводило только к нарушению расположения Sgo на хромосоме, анализ митотического хроматина, сформированного в экстрактах, лишенных эндОгевного Bubi, показал, что в системе цитоплазматических экстрактов xenopiis Sgo (xSgo) пс способен связаться с хроматином в отсутствие ВиЫ (рис. 7А, 8). Добавление рекомбинантного Bubi или BubKR 1К в экстракты, лишенные эндогенного Bubi, показало, что для связывания xSgo с митотичсским хроматином требуется киназиая активность Bubi: только добавление Bubi дикого типа приводило к появлению xSgo па хроматине (рис, 7А, 8). Следует отметить, что добавление рекомбинантного Bubi
приводило к восстановлению не только связывания xSgo с хроматином, но и его расположения в В1Щ (рис. 8).
ЛВиЬ I
. : >ч ■ - f
4 * У *4 * в п Шшя if ' î * , • *
■ЯВУ&Ь* s тг- ш Л 4
Рисунок 8. Кйназая активность liut» 1 необходима дли связыванияс ми loi н чес к» м хроматином.
Очищенный мнготический хроматин, сформированный как па рис. 7, окрашивали антителами против xSgo и BubRl.
3.2. /(ля связывания xSgo с митотическнм хроматином не требуется накопления киназы Buhl ни кинетохоре
Белок Bubi является компонентом наружного кинстохора и связывается с кипстохором в профазе митоза, Мы исследовали вопрос о том, требуется ли накопление Bnbl на кинетохоре для формирования ВЦД, или же растворимая форма киназы Bubi также способна выполнять эту функцию. Известно, что истощение Aurora В из экстрактов полностью ингибирует связывание Bubi с хроматином (Vigneron et al., 2004). Наши исследования подтвердили опубликованные ранее данные: белок Bubi не связывался с хроматином в отсутствие ТХК (рис. 9). При этом количество Bubi в экстрактах и его кииазиая активность не изменялись. В отсутствие ТХК белок xSgo связывался с митотическнм хроматином, хотя и не так эффективно, как в контроле (рис. 9). Этот результат позволяет предположить, что растворимая форма Bubi способна вызвать связывание xSgo с митотическнм хроматином.
Рисунок ч Растворимая кнназа Bubi способна контролировать связывание xSgo с митотическнм хроматином. Тотальные цитоплазматичеекпе экстракты н очищенный митотичеекпй хроматин, сформированный в
контрольных экстрактах, экстрактах, лишенных Bubi (ЛВиЫ), ТХК (АТХК) или совместно ГХК п Bub I (ATXK/ABubl ), анализировали метолом Вестерн-блотинга с ант ителами против указанных белков.
ir ^ Ä' F iS
о <п ß ¿-аз ami £лв
* >3 tj Ar tj V XI т}
Цитоплазм, экстракт
mm xSgo
ButH Aurora В
Хроматин
Для доказательства этой гипотезы было произведено совместное истощение из экстрактов компонентов ТХК и Buhl. Отсутствие ТХК и Bubi приводило к потере связывания xSgo митотнческим хроматином. Таким образом, наши результаты показали, что хотя для связывания Sgo с митотнческим хроматином киназная активность Bubi абсолютно необходима, физическая связь самой киназы Bubi с кинетохором для выполнения этой функции не требуется, и Bubi регулирует накапливание xSgo ira ми топ im ее ком хроматине независимо от своей локализации.
3.3. Транзитный хромосомный комплект необходим для правильного расположении xSgo на кинетохоре
Как было отмечено выше, отсутствие ТХК в экстрактах приводило к некоторому уменьшенною количества связанного с хроматином xSgo. 1юлес подробное исследование хроматина, сформированного в отсутствии ТХК, выявило, что в отличие от четкой локализации xSgo в ВЦД в контрольных образцах, в отсутствии ТХК белок xSgo диффузно располагался на хромат ине (рис. ЮЛ). Таким образом, наличие кимлзпой активности Bubi достаточно для связывания xSgo с хроматином, тогда как для правильного расположений xSgo па кинетохоре требуется присутствие ТХК.
контроль
dîXK
*■ 1 ** * щ * ' * t * f|f<
ШЁШг РЯ§ MÊL ■■
(Р: ^
■asra f Survivm
Рисунок 10. ТХК необходим для правильно!о расположения xSgo на кинетохоре. (Л) Хроматин, сформированный в контрольны^ экстрактах и в экстрактах, лишенных ТХК (ДТХК), окрашивали 32 антителами против xSgo.(b) ТХК и xSgo прецицитировали из 11СФ~экстрактов указанными антителами, 11олученные иммунные комплексы анализировали методом Вестерн-б лотннга антителами против Aurora В и xSgo. (В) ТХК, преципитированный антителами против Aurora В. анализировали методом SOS-PAGE с последующей окраской красителем кумаси синий. Стрелками указаны положения компонентов ТХК и xSgo.
Одним из возможных механизмов регуляции расположения xSgo в &ЦД может служить прямое физическое взаимодействие между ТХК и xSgo.
Реципрокная иммунопреципитация с использованием антител против Aurora В и xSgo показала, что ТХК и xSgo образуют комплекс (рис 9Б) Следует, однако, отметить, что xSgo не является стохиометрическим компонентом ТХК (рис 9В) Таким образом, физическое взаимодействие между ТХК и xSgo может обуславливать связывание последнего именно в ВЦД в митозе Опубликованные недавно исследования регуляции локализации Sgo в клетках D melanogaster отчасти подтверждают наши результаты Резник и др показали в своей работе, что фосфорилирование dmSgo киназой Aurora В необходимо для накопления этого белка на кинетохоре (Resnick et al, 2006)
4. Формирование внутреннего центромерного домена и наружного кинетохора происходит независимо от митотической конденсации
хроматина
Чтобы определить точку клеточного цикла, в которой присутствие киназы Bubi необходимо для формирования ВЦД, был проделан следующий эксперимент митотические хромосомы формировали в экстрактах, лишенных Bubi, после чего к таким сформированным хромосомам добавляли рекомбинантный Bubi или BublK8 (рис 11)
Рисунок 11. Схема эксперимента. В
контрольных или лишенных эндогенного Bubi (ABubi) ЦСФ-экстрактах индуцировали переход в интерфазу Через 60 мин в таких экстрактах вызывали преход из интерфазы в митоз Через 30 мин в экстракты, лишенные эндогенного Bubi, добавляли буфер (Буф) или рекомбинантные белки 6His-Bubl (Bubi) или 6His-Bubl R(Bubl ) Хроматин очищали в момент добавления рекомбинантных белков (30') и после 30 минут инкубации (60')
Согласно нашим предыдущим результатам (рис 4 и 8), в хромосомах, сформированных в отсутствии Bubi, киназа Aurora В располагалась на плечах хромосом, и xSgo не связывался с хроматином (рис 12А, Б) Увеличение времени формирования митотического хроматина не приводило к накоплению Aurora В в ВЦД и связыванию xSgo с хроматином Добавление рекомбинантного Bubi к таким предсформированным хромосомам полностью восстанавливало правильное расположение Aurora В и xSgo в ВЦД и способствовало формированию полноценного наружного кинетохора Добавление Bubi 87 R восстанавливало только формирование НК, но не приводило к сборке функционального ВЦД па таких хромосомах Таким образом, Bubi способен индуцировать сборку ВЦК на уже предсформированных митотических хромосомах Более того, наши результаты предполагают, что сборка ВЦД происходит независимо от многих аспектов митотической конденсации
ИНДУ интер истощение (Bubi/IgG) добав КЧ11Я ВиЬШ фазы индукция митоза ! ПРниа уфера
60' 0' 10 60' 1 I очистка хроматина
D дВиМ
контроль ДВиЫ
30 60 30 _60
6УФ8иМ xSgo +бУФ +BUb1 +BUb1"'
:: Bi BD Di
BubR1 AurB BubR1 AurB BubR1 AurB
Рисунок 12. Сборка ВЦД не зависит от митотической конденсации хроматина Сформированный и очищенный согласно схеме на рис 10 хроматин анализировали (А) методом Вестерн-блотинга с указанными антителами и (Б) методом непрямой иммунофлуоресценции с антителами против Aurora В и BubRl Масштабный отрезок - 2мкм
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основываясь на изложенных выше наблюдениях, можно предложить следующую схему сборки кинетохора Во время профазы митоза киназа Aurora В инициирует формирование кинетохора Один из возможных механизмов процесса инициации может быть фосфорилирование некоего центромерного белка, например Сепр-А (Zeitlin et al, 2001) Это приводит к связыванию с кинетохором различнх компонентов наружного кинетохора, в том числе и белка Bubi Связывание Bubi с кинетохором приводит в дальнейшем к формированию субдомена НК, вовлеченного в регуляцию контрольной точки сборки веретена деления Связанная с кинетохором или растворимая киназа Bubi также контролирует формирование ВЦД двумя способами
Во-первых, киназа Bubi способствует перемещению ТХК с плеч хромосом в ВЦД Весьма вероятно, что киназа Bub 1 контролирует не только стабильность ТХК, но и его связывание с неким, не установленным в настоящее время, компонентом ВЦД, который обеспечивает связывание ТХК с кинетохором Это предположение отчасти подтверждается данными о невозможности восстановления нарушений, возникающих при истощении ТХК из экстрактов, добавлением смеси рекомбинантных компонентов ТХК (Sampath et al, 2004) Исходя из этих результатов, также можно предположить существование не известных пока субъединиц ТХК помимо четырех описанных (Aurora В, INCENP, Survivin, Dasra А) Так же возможно, что Bubi фосфорилирует компонент ВЦД, который обеспечивает физическое связывание ТХК с хроматином в этом домене
Во-вторых, Bubi может фосфорилировать сам белок Sgo или компонент хроматина, который связывается с Sgo, и вызывать таким образом накопление Sgo на хроматине Связавшийся с хроматином Sgo при участии ТХК
хроматин
накапливается в ВЦД
ВЫВОДЫ
1 Реплицированые митотические хромосомы, сформированные в цитоплзазматических экстрактах зрелых ооцитов Xenopus laevis, могут служить хорошей моделью для изучения строения, сборки и функционирования кинетохора позвоночных
2 Киназа Bubl контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене кинетохора позвоночных
3 Киназа Bubl обеспечивает связывание белка xSgo с митотическим хроматином
4 Накопление xSgo на кинетохоре требует присутствия транзитного хромосомного комплекса
5 Процессы формирования наружного кинетохора и внутреннего центромерного домена происходят независимо от митотической конденсации хроматина
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Boyarchuk Y, Arnaoutov A, Dasso М Bubl is essential for the kinetochore localization of Aurora B/Survivin complex in Xenopus egg extracts American Society for cell biology, 44lh meeting, Washington, DC, 2004, p 551-552)
2. Боярчук E. Ю., Зенин В В , Никольский Н Н Белок Bubl необходим для формирования центромерного домена митотических хромосом Цитология 2005,47 (9), 796 Тезисы XV Всероссийского совещания «Структура и функция ядра», СПб, 2005
3. Boyarchuk Y., Salic А, Dasso, М, Arnaoutov A Shugoshin has two functions during cell cycle in Xenopus egg extracts (The Cell Cycle Cold Spring Harbor, NY, 2006, p 29)
4. Boyarchuk Y, Salic A, Dasso, M, Arnaoutov A Bubl Is Essential for Assembly of the Inner Centromere American Society for cell biology, 46th meeting, San Diego, С A, 2006, pr 701)
5. Boyarchuk Y.Yu , Nikolsky N N , Dasso M , Arnaoutov A M Assembly of correct kinetochore architecture in Xenopus egg extract requires transition of sperm DNA through interphase Cell and Tissue Biology 2007, 1 (1) 80-88
6 Boyarchuk Y., Salic A, Dasso, M, Arnaoutov A Bubl is essential for assembly of the functional inner centromere J Cell Biol 2007, 176 919-928
Список сокращений ВЦД внутренний центромерный домен МТ микротрубочки
М-хромосомы хромосомы, полученные после репликации хроматина спермиев (см рис 1)
НК наружный кинетохор
ТХК транзитный хромосомный комплекс
ЦСФ цитостатический фактор
ЦСФ-хромосомы хромосомы, полученные при добавлении хроматина спермиев в ЦФС-экстракты (см рис 1)
ЦСФ-экстракты цитоплазматические экстракты, полученные из зрелых ооцитов, остановленных в метафазе Н мейоза
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Andrews, Р D et al 2004 Aurora В regulates МСАК at the mitotic centromere Dev Cell 6 25368 Cleveland, D.W. et al 2003 Centromeres and kinetochores from epigenetics to mitotic checkpoint signaling Cell 112 407-421 Ditchfield, C. et al 2003 Aurora В couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubRl, Mad2, and Cenp-E to kinetochores J Cell Biol 161 267-280 Honda, R et al 2003 Exploring the functional interactions between Aurora B, INCENP, and survivin in mitosis Mol Biol Cell 14 3325-41 Johnson, V L. et al 2004 Bub 1 is required for kinetochore localization of BubRl, Cenp-E, Cenp-F and Mad2, and chromosome congression JCellStiWl 1577-89 Kitajima, T.S etal 2004 The conserved kinetochore protein shugoshin protects centromenc cohesion during meiosis Nature 427 510-7 Kornblutli, S.Y. et al 2001 Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extratcs In Current Protocols in Cell Biology 11 11 11-11 11 13 Maresca, T.J etal 2005 Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation m Xenopus laevis egg extracts J Cell Biol 169 859-869 Maresca, T.J and R Heald 2006 Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts Methods Mol Biol 322 459-474 Meraldi, P. and P К Sorger 2005 A dual role for Bub 1 in the spindle checkpoint and chromosome congression EmboJ 24 1621-33 Murnion, M.E. et al 2001 Chromatin-associated protein phosphatase 1 regulates aurora-B and histone 113 phosphorylation J Biol Chem 276 26656-26665 Resnick, T D et al 2006 INCENP and Aurora В promote meiotic sister chromatid cohesion through localization of the Shugoshin MEI-S332 m Drosophila Dev Cell 11 57-68 Rivera, T. and A Losada 2006 Shugoshin and PP2A, shared duties at the centromere Bioessavs 28 775-779 Sampath, S C. et al 2004 The chromosomal passenger complex is required for chromatm-mduced microtubule stabilization and spindle assembly Cell 118 187-202 Sawin, K.E and T J Mitchison 1991 Mitotic spindle assembly by two different pathways m vitro J Cell Biol 112 925-940 Sharp-Baker, H and R II Chen 2001 Spindle checkpoint protein Bub 1 is required for kinetochore localization of Mad 1, Mad2,Bub3, and CENP-E, independently of its kinase activity J Cell Biol 153 1239-50 Tang, Z. et al 2004 Human Bubl protects centromenc sister-chromatid cohesion through Shugoshin during mitosis Proc Natl Acad Sci U S A 101 18012-7 Vagnarelh, P. and W С Earnshaw 2004 Chromosomal passengers the four-dimensional regulation of mitotic events Chromosoma 113 211-222 Vigneron, S etal 2004 Kinetochore localization of spindle checkpoint proteins who controls whom'' Mol Biol Cell 15 4584-96 Zeitlin, S G etal 2001 CENP-A is phosphorylated by Aurora В kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis J Cell Biol 155 1147-1157
Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97
Подписано в печать 18 04 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 1527Ь
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Боярчук, Екатерина Юрьевна
ГЛАВА 1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Цитоплазматические экстракты ооцитов шпорцевой лягушки Хепориз 1аеу1$ как модельная система изучения событий клеточного цикла
2.2 Строение и функция кинетохора позвоночных
2.2.1 Центромер
2.2.2 Наружный кинетохор
2.2.2.1 Строение наружного кинетохора
2.2.2.2 Регуляция сборки НК
2.2.2.3 Функции наружного кинетохора 24 В настоящеем разделе мы рассмотрим механизмы, отвечающие за каждую из этих функций.
2.2.3 Строение и функция внутреннего центромерного домена 33 2.2.3.1 Транзитный хромосомный комплекс
2.2.3.1.2.1. Роль ТХК в регуляции митотической конденсации и поддержании структуры хромосом
2.2.3.1.2.2 Роль ТХК в регуляции сегрегации хромосом
2.2.3.1.2.3 Роль ТХК в 8АС
2.2.3.1.2.4 Роль ТХК в формировании веретена деления
2.2.3.1.2.5 Роль ТХК в цитокинезе 45 2.2.3.3 Кинезин МСАК 46 2.2.3.3 Комплекс 51п^051ип/РР2А
2.2.3 Регуляция сборки ВЦЦ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ
3.1. Рекомбипантые белки и антитела
3.2. Приготовление цитоплазматического экстракта из ооцитов X. 1аеУ!
3.3. Очистка хроматина 59 3.4 Клеточные линии, их культивирование, получение стабильных клеточных линий, РНК-интерференция
3.5. Иммунофлуоресценция и анализ изображений
3.6. Иммунопреципитация и гг-преципитация
3.7. Вестерн-блотинг
3.8. Киназная активность in vitro
Глава 4. Результаты
4.1 Выбор модели для изучения строения и регуляции формирования кинетохора
4. 2. Регуляция расположения транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене кинетохора
4.2.1. Белок Bubi контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене в системе экстрактов ооцитов Xenopus iaevis
4.2.2. Нарушение расположения ТХК на кинетохоре в отсутствие Bubi не связано с задержкой в прохождении митоза.
4.2.3 Bubi контролирует расположение ТХК во внутреннем центромерном домене в соматических клетках
4.2.4 Киназная активность Bubi абсолютно необходима для связывания ТХК с внутренним центромерным доменом.
4.2.5 Bubi контролирует стабильность транзитного хромосомного комплекса
4.2.6 Bubi фосфорилирует INCENP 83 4.3. Регуляция расположения белка Shugoshin в ВЦД
4.3.1 Динамика xenopus Sgo в ходе клеточного цикла
4.3.2. Bubi контролирует связывание Sgo с митотическим хроматином.
4.3.3. Для связывания xSgo с митотическим хроматином не требуется накопления киназы Bubi на кинетохоре 89 4.3.4 Транзитный хромосомный комплекс необходим для правильного расположения Sgo на кинетохоре
4.4 Регуляция расположения кинезина МСАК в ВЦД
4.5 Формирование внутреннего центромерного домена и наружного кинетохора происходит независимо от митотической конденсации хроматина.
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных"
ГЛАВА 1 ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность проблемы
Разделение генетического материала между дочерними клетками -один из важнейших шагов в ходе клеточного цикла. Для осуществления правильной сегрегации хромосом во время митоза в клетке происходят сложнейшие взаимодействия между микротрубочками (МТ) веретена деления и хроматином. Хромосомы присоединяются к микротрубочкам, растущим с противоположных полюсов митотического веретена, при помощи кинетохоров. Кинетохор представляет собой многокомпонентную белковую структуру, которая формируется на цептромерном участке каждой сестринской хромагиды. Кинетохор может быть условно разделен на 2 субдомена: внутренний центромерный домен (ВЦЦ) и наружный кинетохор (НК) (Chan et al., 2005; Cleveland et al., 2003; Meraldi et al., 2006). Компоненты наружного кинетохора участвуют в непосредственном присоединении микротрубочек к хроматину и генерируют сигнал, блокирующий начало выхода из митоза до тех пор, пока все хромосомы не будут присоединены к митотическому веретену. Внутренний центромерный домен состоит из белков, вовлеченных в удержание сестринских хроматид до наступления анафазы и в регуляцию присоединения микротрубочек. Основные компоненты ВЦЦ -транзитный хромосомный комплекс (ТХК, chromosomal passenger complex), кинезин МСАК, Когезин и комплекс Sgo/PP2a
Shugoshin/фосфатаза 2a) (Chen, 2002; Cleveland et al., 2003; Maiato et al., 2004; Rivera and Losada, 2006). Sgo в комплексе с PP2a блокирует диссоциацию комплекса Когезина в центромерном районе, предохраняя таким образом сестринские хроматиды от преждевременного расхождения. Кроме этого, Sgo регулирует динамику МТ веретена деления и стабилизирует кинетохорные МТ. ТХК состоит из киназы Aurora В и белков INCENP, Survivin и Dasra A/Borealin. ТХК фосфорилирует гистон НЗ, что является обязательным условием митотической конденсации хромосом (Goto et al., 2002); он также необходим для инициации сборки кинетохора (Ditchfield et al., 2003). Более того, ТХК регулирует активность кинезина МСАК и, таким образом, участвует в регуляции полимеризации и деполимеризации тубулиновых филаментов и контролирует формирование правильного (амфителического) присоединения МТ веретена деления к кинетохорам (Andrews et al., 2004; Lan et al., 2004).
Сборка функционального кинетохора происходит заново в ходе каждого клеточного цикла. Считается, что сборка наружного кинетохора происходит в строгом иерархическом порядке; т. е. связывание одних компонентов регулируется присутствием на кинетохоре других. (Johnson et al., 2004; Sharp-Baker and Chen, 2001; Vigneron et al., 2004; Wong and Fang, 2006). Несмотря на значительные успехи в изучении строения наружного кинетохора, регуляция формирования ВЦД остается плохо изученной. Известно, что во время перехода из профазы в прометафазу ТХК переходит с плеч хромосом в ВЦД (Andrews et al., 2003). Механизм, регулирующий этот переход, неизвестен. Недавние исследования показали, что локализация белков МСАК и Sgo во внутреннем центромерном домене зависит от ТХК (Andrews et al., 2004; Lan et al., 2004; Resnick et al., 2006), но детали регуляции сборки функционального ВЦД не ясны. Поиск механизма регуляции сборки внутреннего центромерного домена и являлся предметом данной работы.
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Боярчук, Екатерина Юрьевна
ВЫВОДЫ:
1. Киназа Bubi контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене кинетохора позвоночных животных.
2. Киназа Bubi обеспечивает связывание белка xSgo с митотическим хроматином.
3. Накопление xSgo на кинетохоре требует присутствия транзитного хромосомного комплекса.
4. Процессы формирования наружного кинетохора и внутреннего центромерного домена происходят независимо от митотической конденсации хроматина
ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Мы можем предложить следующую схему сборки кинетохора. Во время профазы митоза киназа Aurora В инициирует формирование кинетохора. Один из возможных механизмов процесса инициации -фосфорилирование некоего центромерного белка, например Сепр-А (Zeitlin et al., 2001). Это приводит к связыванию Bubi с кинетохором, а затем - к формированию субдомена наружного кинетохора, который вовлечен в регуляцию контрольной точки сборки веретена. В свою очередь, связанная с кинетохором или растворимая киназа Bubi контролирует формирование ВЦД двумя способами.
Во-первых, она способствует перемещению ТХК с плеч хромосом в
ВЦЦ. Весьма вероятно, что Bubi контролирует не только стабильность
ТХК, но и его связывание с неким не установленным в настоящее время компонентом ВЦЦ, который обеспечивает связывание ТХК с кинетохором. Это предположение отчасти подтверждается данными о невозможности устранения нарушений, возникающих при истощении
103
ТХК из экстрактов добавлением смеси рекомбинантных компонентов ТХК (Sampath et al., 2004). Исходя из этих результатов, также можно предположить существование не известных пока субъединиц ТХК, помимо четырех описанных (Aurora В, INCENP, Survivin, Dasra А).
Во-вторых, Bubi может фосфорилировать сам белок Sgo или компонент хроматина, который связывается с Sgo, и вызывать таким образом накопление Sgo на хроматине. Связавшийся с хроматином Sgo при участии ТХК накапливается в ВЦД. Затем непосредственное действие Bubi и/или опосредованное киназой Bubi накопление ТХК в ВЦД приводит к накоплению в ВЦД кинезина МСАК.
Таким образом, внутренний центромерный домен - это динамическая структура, сборка которой не зависит от многих аспектов митотической конденсации хромосом и контролируется киназой Bubi через сложную сеть взаимодействий.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Боярчук, Екатерина Юрьевна, Санкт-Петербург
1. Енукашвили Н.И; Кузнецова И.С.; Подгорная О.И. Организация центромерамлекопитающих. 2003. Цитология. Том 45. №. 3 С. 255-270.
2. Лебедева Л.И.; Федорова С.А.; Трунова С.А.; Омельянчук Л.В. 2004. Генетика.
3. Том 40. №. 12. С. 1589-1608.
4. Abrieu, A., L.Magnaghi-Jaulin, J.A.Kahanaet al. 2001. Mpsl is a kinetochore-associated kinase essential for the vertebrate mitotic checkpoint. Cell 106:83-93.
5. Adams, R.R., S.P.Wheatley, A.M.Gouldsworthyet al„ 2000. INCENP binds the Aurora-related kinase AIRK2 and is required to target it to chromosomes, the central spindle and cleavage furrow. Curr Biol 10:1075-8.
6. Ainsztein, A.M., S.E.Kandels-Lewis, A.M.Mackay, and W.C.Earnshaw. 1998. INCENP centromere and spindle targeting: identification of essential conserved motifs and involvement of heterochromatin protein HP1. J. Cell Biol. 143:17631774.
7. Alexandru, G., F.Uhlmann, K.Mechtler, M.A.Poupart, and K.Nasmyth. 2001. Phosphorylation of the cohesin subunit Sccl by Polo/Cdc5 kinase regulates sister chromatid separation in yeast. Cell 105:459-72.
8. Altieri, D.C. 2003. Validating survivin as a cancer therapeutic target. Nat. Rev. Cancer 3:46-54.
9. Altieri, D.C. 2006. The case for survivin as a regulator of microtubule dynamics and cell-death decisions. Curr. Opin. Cell Biol. 18:609-615.
10. Ambrosini, G., C.Adida, and D.C.Altieri. 1997. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat. Med. 3:917-921.
11. Amor, DJ. and K.H.Choo. 2002. Neocentromeres: role in human disease, evolution, and centromere study. A m. J. Hum. Genet. 71:695-714.
12. Amor, D.J., P.Kalitsis, H.Sumer, and K.H.Choo. 2004. Building the centromere: from foundation proteins to 3D organization. Trends Cell Biol. 14:359-368.
13. Andreassen, P.R., F.B.Lacroix, E.Villa-Moruzzi, and R.LMargolis. 1998. Differential subcellular localization of protein phosphatase-1 alpha, gammal, and delta isoforms during both interphase and mitosis in mammalian cells. J. Cell Biol. 141:1207-1215.
14. Andrews, P.D., E.Knatko, WJ.Moore, and J.R.Swedlow. 2003. Mitotic mechanics: the auroras come into view. Curr Opin Cell Biol 15:672-83.
15. Andrews, P.D., Y.Ovechkina, N.Morrice, M.Wagenbach, K.Duncan, L.Wordeman, and J.R.Swedlow. 2004. Aurora B regulates MCAK at the mitotic centromere. Dev Cell 6:253-68.
16. Arnaoutov, A., Y.Azuma, KRibbecket al„ 2005. Crml is a mitotic effector of Ran-GTP in somatic cells. Nat Cell Biol 7:626-32.
17. Arnaoutov, A. and M.Dasso. 2003. The Ran GTPase regulates kinetochore function. Dev Cell 5:99-111.
18. Arnaoutov, A. and MJDasso. 2005. Ran-GTP regulates kinetochore attachment in somatic cells. Cell Cycle 4:1161-1165.
19. Azuma, Y., A.Arnaoutov, T.Anan, and M.Dasso. 2005. PIASy mediates SUMO-2 conjugation of Topoisomerase-II on mitotic chromosomes. Embo J 24:2172-82.
20. Azuma, Y., A.Arnaoutov, and M.Dasso. 2003. SUMO-2/3 regulates topoisomerase II in mitosis. J Cell Biol 163:477-87.
21. Bernard, P., J.F.Maure, J.F.Partridge, S.Genier, J.PJaverzat, and R.C.Allshire. 2001. Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres. Science 294:25392542.
22. Biggins, S. and A.W.Murray. 2001. The budding yeast protein kinase Ipll/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes Dev. 15:3118-3129.
23. Bishop, J.D. and J.M.Schumacher. 2002. Phosphorylation of the carboxyl terminus of inner centromere protein (INCENP) by the Aurora B Kinase stimulates Aurora B kinase activity. J Biol Chem 277:27577-80.
24. Blower, M.D., T.Daigle, T.Kaufman, and G.H.Karpen. 2006. Drosophila CENP-A mutations cause a BubRl-dependent early mitotic delay without normal localization of kinetochore components. PLoS. Genet. 2:ell0.
25. Blower, M.D. and G.H.Karpen. 2001. The role of Drosophila CID in kinetochore formation, cell-cycle progression and heterochromatin interactions. Nat. Cell Biol. 3:730-739.
26. Blower, M.D., B.A.Sullivan, and G.H.Karpen. 2002. Conserved organization of centromeric chromatin in flies and humans. Dev. Cell 2:319-330.
27. Bolton, M.A., W.Lan, S.E.Powers, M.L.McCleland, J.Kuang, and P.T.Stukenberg. 2002. Aurora B kinase exists in a complex with survivin and INCENP and its kinase activity is stimulated by survivin binding and phosphorylation. Mol Biol Cell 13:3064-77.
28. Buffin, E., C.Lefebvre, J.Huang, M.E.Gagou, and R.E.Karess. 2005. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/ZwlO complex. Curr. Biol. 15:856-861.
29. Carvalho, A., M.Carmena, C.Sambade, W.C.Eamshaw, and S.P.Wheatley. 2003.
30. Survivin is required for stable checkpoint activation in taxol-treated HeLa cells. J Cell Sci 116:2987-98.
31. Castro, A., C.Bernis, S.Vigneron, J.C.Labbe, and T.Lorca. 2005. The anaphase-promoting complex: a key factor in the regulation of cell cycle. Oncogene 24:314325.
32. Chan, G.K., S.T.Liu, and T.J.Yen. 2005. Kinetochore structure and function. Trends Cell Biol. 15:589-598.
33. Cheeseman, I.M., J.S.Chappie, E.M.Wilson-Kubalek, and A.Desai. 2006. The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore. Cell 127:983-997.
34. Cheeseman, I.M., S.Niessen, S.Anderson, F.Hyndman, J.R.Yates, III, K.Oegema, and A.Desai. 2004. A conserved protein network controls assembly of the outer kinetochore and its ability to sustain tension. Genes Dev. 18:2255-2268.
35. Chen, R.H. 2002. BubRl is essential for kinetochore localization of other spindle checkpoint proteins and its phosphorylation requires Madl. J Cell Biol 158:487-96.
36. Clarke, A.S., T.T.Tang, D.L.Ooi, and T.LOrr-Weaver. 2005. POLO kinase regulates the Drosophila centromere cohesion protein MEI-S332. Dev Cell 8:53-64.
37. Cleveland, D.W., Y.Mao, and K.F.Sullivan. 2003. Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell 112:407-421.
38. Cooke, C.A., M.M.Heck, and W.C.Earnshaw. 1987. The inner centromere protein (INCENP) antigens: movement from inner centromere to midbody during mitosis. J. Cell Biol. 105:2053-2067.
39. Dasso, M. 2002. The Ran GTPase: theme and variations. Curr. Biol. 12:R502-R508.
40. Dasso, M. 2006. Ran at kinetochores. Biochem. Soc. Trans. 34:711-715.
41. DeLuca, J.G., Y.Dong, P.Hergert, J.Strauss, J.M.Hickey, E.D.Salmon, and B.F.McEwen. 2005. Heel and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Mol. Biol. Cell 16:519531.
42. DeLuca, J.G., W.E.Gall, C.Ciferri, D.Cimini, A.Musacchio, and E.D.Salmon. 2006. Kinetochore microtubule dynamics and attachment stability are regulated by Heel. Cell 127:969-982.
43. DeLuca, J.G., B.J.Howell, J.C.Canman, J.M.Hickey, G.Fang, and E.D.Salmon. 2003. Nuf2 and Heel are required for retention of the checkpoint proteins Madl and Mad2 to kinetochores. Curr. Biol. 13:2103-2109.
44. DeLuca, J.G. and E.D.Salmon. 2004. Kinetochores: if you build it, they will come. Curr. Biol. 14:R921-R923.
45. Desai, A., A.Murray, T.J.Mitchison, and C.E.Walczak. 1999. The use of Xenopus egg extracts to study mitotic spindle assembly and function in vitro. Methods Cell Biol. 61:385-412.
46. Diaz-Martinez, L.A., J.F.Gimenez-Abian, Y.Azuma, V.Guacci, G.Gimenez-Martin, L.M.Lanier, and DJ.Clarke. 2006. PLASgamma Is Required for Faithful Chromosome Segregation in Human Cells. PLoS. ONE. I:e53.
47. Ditchfield, C., V.LJohnson, A.Tigheet al. 2003. Aurora В couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubRl, Mad2, and Cenp-E to kinetochores. J. Cell Biol. 161:267-280.
48. Earnshaw, W.C. and N.Rothfield. 1985. Identification of a family of human centromere proteins using autoimmune sera from patients with scleroderma. Chromosoma 91:313-321.
49. Fang, G. 2002. Checkpoint protein BubRl acts synergistically with Mad2 to inhibit anaphase-promoting complex. Mol. Biol. Cell 13:755-766.
50. Ferrell, J.E., Jr. 1999. Xenopus oocyte maturation: new lessons from a good egg. Bioessays 21:833-842.
51. Foltz, D.R., L.E.Jansen, B.E.Black, A.O.Bailey, J.R.Yates, III, and D.W.Cleveland. 2006. The human CENP-A centromeric nucleosome-associated complex. Nat. Cell Biol. 8:458-469.
52. Fukagawa, T. 2004. Centromere DNA, proteins and kinetochore assembly in vertebrate cells. Chromosome. Res. 12:557-567.
53. Gadea, B.B. and J.V.Ruderman. 2006. Aurora В is required for mitotic chromatin-induced phosphorylation of Opl8/Stathmin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103:44934498.
54. Gandhi, R., P.J.Gillespie, and T.Hirano. 2006. Human Wapl is a cohesin-binding protein that promotes sister-chromatid resolution in mitotic prophase. Curr. Biol. 16:2406-2417.
55. Gardner, M.K. and DJ.Odde. 2006. Modeling of chromosome motility during mitosis. Curr. Opin. Cell Biol. 18:639-647.
56. Gassmann, R., A.Carvalho, AJ.Henzinget al. 2004. Borealin: a novel chromosomal passenger required for stability of the bipolar mitotic spindle. J Cell Biol 166:179-91.
57. Gerlich, D., T.Hirota, B.Koch, J.M.Peters, and J.Ellenberg. 2006. Condensin I stabilizes chromosomes mechanically through a dynamic interaction in live cells. Curr. Biol. 16:333-344.
58. Giet, R. and D.M.Glover. 2001. Drosophila aurora B kinase is required for histone H3 phosphorylation and condensin recruitment during chromosome condensation and to organize the central spindle during cytokinesis. J. Cell Biol. 152:669-682.
59. Gillespie, P.J. and T.Hirano. 2004. Scc2 couples replication licensing to sister chromatid cohesion in Xenopus egg extracts. Curr Biol 14:1598-603.
60. Glover, D.M., M.H.Leibowitz, D.A.McLean, and H.Parry. 1995. Mutations in aurora prevent centrosome separation leading to the formation of monopolar spindles. Cell 81:95-105.
61. Gorbsky, G.J. 2004. Mitosis: MCAK under the aura of Aurora B. Curr. Biol. 14.R346-R348.
62. Goshima, G., T.Kiyomitsu, K.Yoda, and M.Yanagida. 2003. Human centromere chromatin protein hMisl2, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J. Cell Biol. 160:25-39.
63. Goto, H., Y.Yasui, A.Kawajiriet al. 2003. Aurora-B regulates the cleavage furrow-specific vimentin phosphorylation in the cytokinetic process. J. Biol. Chem. 278:8526-8530.
64. Goto, H., Y.Yasui, E.A.Nigg, and M.Inagaki. 2002. Aurora-B phosphorylates Histone H3 at serine28 with regard to the mitotic chromosome condensation. Genes Cells 7:11-17.
65. Grewal, S.I. and D.Moazed. 2003. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science 301:798-802.
66. Grimes, B.R., J.Babcock, M.K.Rudd, B.Chadwick, and H.F.Willard. 2004. Assembly and characterization of heterochromatin and euchromatin on human artificial chromosomes. Genome Biol. 5:R89.
67. Guenatri, M., D.Bailly, C.Maison, and G.Almouzni. 2004. Mouse centric and pericentric satellite repeats form distinct functional heterochromatin. J. Cell Biol. 166:493-505.
68. Habu, T., S.H.Kim, J.Weinstein, and T.Matsumoto. 2002. Identification of a MAD2-binding protein, CMT2, and its role in mitosis. EMBO J. 21:6419-6428.
69. Hahnenberger, K.M., M.P.Baum, C.M.Polizzi, J.Carbon, and L.CIarke. 1989. Construction of functional artificial minichromosomes in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86:577-581.
70. Harel, A. and D J.Forbes. 2004. Importin beta: conducting a much larger cellular symphony. Mo/. Cell 16:319-330.
71. Hauf, S., R.W.Cole, S.LaTerraet al. 2003. The small molecule Hesperadin reveals a role for Aurora B in correcting kinetochore-microtubule attachment and in maintaining the spindle assembly checkpoint. J Cell Biol 161:281-94.
72. Hauf, S., E.Roitinger, B.Koch, CM.Dittrich, K.Mechtler, and J.M.Peters. 2005. Dissociation of cohesin from chromosome arms and loss of arm cohesion during early mitosis depends on phosphorylation of SA2. PLoS Biol 3:e69.
73. Hauf, S., I.C.Waizenegger, and J.M.Peters. 2001. Cohesin cleavage by separase required for anaphase and cytokinesis in human cells. Science 293:1320-3.
74. Honda, R., R.Korner, and E.A.Nigg. 2003. Exploring the functional interactions between Aurora B, INCENP, and survivin in mitosis. Mol Biol Cell 14:3325-41.
75. Hori, T., T.Haraguchi, Y.Hiraoka, H.Kimura, and T.Fukagawa. 2003. Dynamic behavior of Nuf2-Hecl complex that localizes to the centrosome and centromere and is essential for mitotic progression in vertebrate cells. J. Cell Sci. 116:3347-3362.
76. Howman, E.V., KJ.Fowler, A.J.Newson, S.Redward, A.C.MacDonald, P.Kalitsis, and K.H.Choo. 2000. Early disruption of centromeric chromatin organization in centromere protein A (Cenpa) null mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97:11481153.
77. Hoyt, M.A., L.Totis, and B.T.Roberts. 1991. S. cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function. Cell 66:507-517.
78. Hsu, J.Y., Z.W.Sun, X.Liet al. 2000. Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipll/aurora kinase and Glc7/PPl phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell 102:279-291.
79. Hudson, D.F., KJ.Fowler, E.Earleet al. 1998. Centromere protein B null mice are mitotically and meiotically normal but have lower body and testis weights. J. Cell Biol. 141:309-319.
80. Indjeian, V.B., B.M.Stern, and A.W.Murray. 2005. The centromeric protein Sgol is required to sense lack of tension on mitotic chromosomes. Science 307:130-3.
81. Johnson, V.L., M.I.Scott, S.V.Holt, D.Hussein, and S.S.Taylor. 2004. Bubl is required for kinetochore localization of BubRl, Cenp-E, Cenp-F and Mad2, and chromosome congression. J Cell Sci 117:1577-89.
82. Jones, M.H., BJ.Huneycutt, C.G.Pearsonet al. 2005. Chemical genetics reveals a role forMpsl kinase in kinetochore attachment during mitosis. Curr. Biol. 15:160165.
83. Kaitna, S., P.Pasierbek, M.Jantsch, J.Loidl, and M.Glotzer. 2002. The aurora B kinase AIR-2 regulates kinetochores during mitosis and is required for separation of homologous Chromosomes during meiosis. Curr Biol 12:798-812.
84. Katis, V.L., M.Galova, K.P.Rabitsch, J.Gregan, and K.Nasmyth. 2004. Maintenance of cohesin at centromeres after meiosis I in budding yeast requires a kinetochore-associated protein related to MEI-S332. Curr Biol 14:560-72.
85. Kelly, A.E., S.C.Sampath, T.A.Maniar, E.M.W00, B.T.Chait, and H.Funabiki. 2007. Chromosomal enrichment and activation of the aurora B pathway are coupled to spatially regulate spindle assembly. Dev. Cell 12:31-43.
86. Kerrebrock, A.W., D.P.Moore, J.S.Wu, and T.LOir-Weaver. 1995. Mei-S332, a Drosophila protein required for sister-chromatid cohesion, can localize to meiotic centromere regions. Cell 83:247-56.
87. Kitajima, T.S., S.Hauf, M.Ohsugi, T.Yamamoto, and Y.Watanabe. 2005. Human Bubl defines the persistent cohesion site along the mitotic chromosome by affecting Shugoshin localization. CurrBiol 15:353-9.
88. Kitajima, T.S., S.A.Kawashima, and Y.Watanabe. 2004. The conserved kinetochore protein shugoshin protects centromeric cohesion during meiosis. Nature 427:510-7.
89. Kitajima, T.S., T.Sakuno, K.Ishiguro, S.Iemura, T.Natsume, S.A.Kawashima, and Y.Watanabe. 2006. Shugoshin collaborates with protein phosphatase 2A to protect cohesin. Nature 441:46-52.
90. Kline, S.L., I.M.Cheeseman, T.Hori, T.Fukagawa, and A.Desai. 2006. The human Mis 12 complex is required for kinetochore assembly and proper chromosome segregation. J. Cell Biol. 173:9-17.
91. Kline-Smith, S.L., A.Khodjakov, P.Hergert, and C.E.Walczak. 2004. Depletion of centromeric MCAK leads to chromosome congression and segregation defects due to improper kinetochore attachments. Mol. Biol. Cell 15:1146-1159.
92. Kline-Smith, S.L. and C.EWalczak. 2002. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol. Biol. Cell 13:27182731.
93. Kops, G.J., Y.Kim, B.A.Weaveret al. 2005. ZW10 links mitotic checkpoint signaling to the structural kinetochore. J. Cell Biol. 169:49-60.
94. Kornbluth, S.Y.J.a.P.M. 2001. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extratcs. In In Current Protocols in Cell Biology. 11.11.11-11.11.13.
95. Kueng, S., B.Hegemann, B.H.Peters, J.J.Lipp, A.Schleiffer, K.Mechtler, and J.M.Peters. 2006. Wapl controls the dynamic association of cohesin with chromatin. Cell 127:955-967.
96. Lan, W., X.Zhang, S.L.Kline-Smithet al. 2004. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol 14:273-86.
97. LeBlanc, H.N., T.T.Tang, J.S.Wu, and T.L.Orr-Weaver. 1999. The mitotic centromeric protein MEI-S332 and its role in sister-chromatid cohesion. Chromosoma 108:401-11.
98. Lens, S.M., J.A.Rodriguez, G.Vader, S.W.Span, G.Giaccone, and R.H.Medema. 2006. Uncoupling the central spindle-associated function of the chromosomal passenger complex from its role at centromeres. Mol. Biol. Cell 17:1897-1909.
99. Lens, S.M., R.M.Wolthuis, R.Klompmakeret al. 2003. Survivin is required for a sustained spindle checkpoint arrest in response to lack of tension. EMBO J. 22:29342947.
100. Li, F., G.Ambrosini, E.Y.Chu, J.Plescia, S.Tognin, P.C.Marchisio, and D.C.Altieri. 1998. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature 396:580-584.
101. Li, X., G.Sakashita, H.Matsuzakiet al. 2004. Direct association with inner centromere protein (INCENP) activates the novel chromosomal passenger protein, Aurora-C. J. Biol. Chem. 279:47201-47211.
102. Lipp, J.J., T.Hirota, I.Poser, and J.M.Peters. 2007. Aurora B controls the association of condensin I but not condensin II with mitotic chromosomes. J. Cell Sci.
103. Liu, J. and J.L.Maller. 2005. Calcium elevation at fertilization coordinates phosphorylation of XErpl/Emi2 by Plxl and CaMK II to release metaphase arrest by cytostatic factor. Curr. Biol. 15:1458-1468.
104. Liu, S.T., G.K.Chan, J.C.Hittle, G.Fujii, E.Lees, and T.J.Yen. 2003. Human MPS1 kinase is required for mitotic arrest induced by the loss of CENP-E from kinetochores. Mol. Biol. Cell 14:1638-1651.
105. Liu, S.T., J.B.Rattner, S.A.Jablonski, and T.J.Yen. 2006. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J. Cell Biol. 175:41-53.
106. Lohka, M.J. 1998. Analysis of nuclear envelope assembly using extracts of Xenopus eggs. Methods Cell Biol. 53:367-395.
107. Losada, A., M.Hirano, and T.Hirano. 1998. Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. Genes Dev 12:1986-97.
108. Losada, A., M.Hirano, and T.Hirano. 2002. Cohesin release is required for sister chromatid resolution, but not for condensin-mediated compaction, at the onset of mitosis. Genes Dev 16:3004-16.
109. Losada, A. and T.Hirano. 2005. Dynamic molecular linkers of the genome: the first decade of SMC proteins. Genes Dev. 19:1269-1287.
110. Mackay, A.M., A.M.Ainsztein, D.M.Eckley, and W.C.Earnshaw. 1998. A dominant mutant of inner centromere protein (INCENP), a chromosomal protein, disrupts prometaphase congression and cytokinesis. J. Cell Biol. 140:991-1002.
111. Maiato, H„ J.DeLuca, E.D.Salmon, and W.C.Earnshaw. 2004. The dynamickinetochore-microtubule interface. CellSci. 117:5461-5477.
112. Mao, Y., A.Abrieu, and D.W.Cleveland. 2003. Activating and silencing the mitotic checkpoint through CENP-E-dependent activation/inactivation of BubRl. Cell 114:87-98.
113. Mapelli, M., F.V.Filipp, G.Rancatiet al. 2006. Determinants of conformational dimerization of Mad2 and its inhibition by p31 comet. EMBO J. 25:1273-1284.
114. Maresca, T.J. and R.Heald. 2006a. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol. Biol. 322:459474.
115. Maresca, T.J. and R.Heald. 2006b. The long and the short of it: linker histone HI is required for metaphase chromosome compaction. Cell Cycle 5:589-591.
116. Marston, A.L. and A.Amon. 2004. Meiosis: cell-cycle controls shuffle and deal. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:983-997.
117. Marston, A.L., W.H.Tham, H.Shah, and A.Amon. 2004. A genome-wide screen identifies genes required for centromeric cohesion. Science 303:1367-70.
118. Martin-Lluesma, S., V.M.Stucke, andE.A.Nigg. 2002. Role of Heel in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Madl/Mad2. Science 297:22672270.
119. Masumoto, H., H.Masukata, Y.Muro, N.Nozaki, and T.Okazaki. 1989. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J. Cell Biol. 109:1963-1973.
120. McEwen, B.F., A.B.Heagle, G.O.Cassels, K.F.ButtIe, and C.L.Rieder. 1997. Kinetochore fiber maturation in PtKl cells and its implications for the mechanisms of chromosome congression and anaphase onset. J. Cell Biol. 137:1567-1580.
121. McGuinness, B.E., T.Hirota, N.R.Kudo, J.M.Peters, and K.Nasmyth. 2005. Shugoshin prevents dissociation of cohesin from centromeres during mitosis in vertebrate cells. PLoS Biol 3:e86.
122. Meluh, P.B., P.Yang, L.GIowczewski, D.Koshland, and M.M.Smith. 1998. Cse4p is a component of the core centromere of Saccharomyces cerevisiae. Cell 94:607-613.
123. Meraldi, P., R.Honda, and E.A.Nigg. 2004. Aurora kinases link chromosome segregation and cell division to cancer susceptibility. Curr. Opin. Genet. Dev. 14:2936.
124. Meraldi, P., A.D.McAinsh, E.Rheinbay, and P.K.Sorger. 2006. Phylogenetic and structural analysis of centromeric DNA and kinetochore proteins. Genome Biol. 7:R23.
125. Meraldi, P. and P.K.Sorger. 2005. A dual role for Bubl in the spindle checkpoint and chromosome congression. Embo J 24:1621-33.
126. Mollinari, C., C.Reynaud, S.Martineau-Thuillieret al. 2003. The mammalian passenger protein TD-60 is an RCC1 family member with an essential role inprometaphase to metaphase progression. Dev Cell 5:295-307.
127. Morrison, C., AJ.Henzing, O.N.Jensenet al. 2002. Proteomic analysis of human metaphase chromosomes reveals topoisomerase II alpha as an Aurora B substrate. Nucleic Acids Res 30:5318-27.
128. Murnion, M.E., R.R.Adams, D.M.Callister, C.D.Allis, W.C.Earnshaw, and J.R.Swedlow. 2001. Chromatin-associated protein phosphatase 1 regulates aurora-B and histone H3 phosphorylation. J. Biol. Chem. 276:26656-26665.
129. Murray, A.W. and M.W.Kirschner. 1989. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature 339:275-280.
130. Murray, A.W., M.J.Solomon, and M.W.Kirschner. 1989. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature 339:280-286.
131. Nasmyth, K. 2002. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science 297:559-65.
132. Nurse, P.M. 2002. Nobel Lecture. Cyclin dependent kinases and cell cycle control. Biosci. Rep. 22:487-499.
133. Obuse, C., O.Iwasaki, T.Kiyomitsu, G.Goshima, Y.Toyoda, and M.Yanagida. 2004. A conserved Misl2 centromere complex is linked to heterochromatic HP1 and outer kinetochore protein Zwint-1. Nat. Cell Biol. 6:1135-1141.
134. Ohi, R., M.L.Coughlin, W.S.Lane, and T.J.Mitchison. 2003. An inner centromere protein that stimulates the microtubule depolymerizing activity of a KinI kinesin. Dev. Cell 5:309-321.
135. Ohi, R., T.Sapra, J.Howard, and TJ.Mitchison. 2004. Differentiation of cytoplasmic and meiotic spindle assembly MCAK functions by Aurora B-dependent phosphorylation. Mol. Biol. Cell 15:2895-2906.
136. Okada, M., I.M.Cheeseman, T.Horiet al. 2006. The CENP-H-I complex is required for the efficient incorporation of newly synthesized CENP-A into centromeres. Nat. Cell Biol. 8:446-457.
137. Peters, J.M. 2002. The anaphase-promoting complex: proteolysis in mitosis and beyond. Mol. Cell 9:931-943.
138. Peters, J.M. 2006. The anaphase promoting complex/cyclosome: a machine designed to destroy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:644-656.
139. Petersen, J. and I.M.Hagan. 2003. S. pombe aurora kinase/survivin is required for chromosome condensation and the spindle checkpoint attachment response. Curr. Biol. 13:590-597.
140. Pinsky, B.A. and S.Biggins. 2005. The spindle checkpoint: tension versus attachment. Trends Cell Biol. 15:486-493.
141. Qi, W„ Z.Tang, and H.Yu. 2006. Phosphorylation- and Polo-Box-dependent Binding of Plkl to Bubl Is Required for the Kinetochore Localization of Plkl. Mol. Biol.1. Cell.
142. Rabitsch, K.P., J.Gregan, A.Schleiffer, J.P.Javerzat, F.Eisenhaber, and K.Nasmyth. 2004. Two fission yeast homologs of Drosophila Mei-S332 are required for chromosome segregation during meiosis land II. CurrBiol 14:287-301.
143. Rauh, N.R., A.Schmidt, J.Bormann, E.A.Nigg, and T.U.Mayer. 2005. Calcium triggers exit from meiosis II by targeting the APC/C inhibitor XErpl for degradation. Nature 437:1048-1052.
144. Regnier, V., P.Vagnarelli, T.Fukagawaet al. 2005. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubRl. Mol. Cell Biol. 25:3967-3981.
145. Resnick, T.D., D.LSatinover, F.MacIsaac, P.T.Stukenberg, W.C.Earnshaw, T.LOrr-Weaver, and M.Carmena. 2006. INCENP and Aurora B promote meiotic sister chromatid cohesion through localization of the Shugoshin MEI-S332 in Drosophila. Dev. Cell 11:57-68.
146. Riedel, C.G., V.LKatis, Y.Katouet al. 2006. Protein phosphatase 2A protects centromeric sister chromatid cohesion during meiosis I. Nature 441:53-61.
147. Rieder, C.L. 2005. Kinetochore fiber formation in animal somatic cells: dueling mechanisms come to a draw. Chromosoma 114:310-318.
148. Rivera, T. and A.Losada. 2006. Shugoshin and PP2A, shared duties at the centromere. Bioessays 28:775-779.
149. Roberts, B.T., K.A.Farr, and M.A.Hoyt. 1994. The Saccharomyces cerevisiae checkpoint gene BUB1 encodes a novel protein kinase. Mol Cell Biol 14:8282-91.
150. Rubin, C.I. and G.F.Atweh. 2004. The role of stathmin in the regulation of the cell cycle. J. Cell Biochem. 93:242-250.
151. Saffery, R., D.V.Irvine, B.Griffiths, P.Kalitsis, LWordeman, and K.H.Choo. 2000. Human centromeres and neocentromeres show identical distribution patterns of >20 functionally important kinetochore-associated proteins. Hum. Mol. Genet. 9:175-185.
152. Saitoh, H„ C.A.Cooke, W.H.Burgess, W.C.Earnshaw, and M.Dasso. 1996. Direct and indirect association of the small GTPase ran with nuclear pore proteins and soluble transport factors: studies in Xenopus laevis egg extracts. Mol Biol Cell 7:1319-34.
153. Salic, A., J.C.Waters, and T.J.Mitchison. 2004. Vertebrate shugoshin links sister centromere cohesion and kinetochore microtubule stability in mitosis. Cell 118:56778.
154. Sampath, S.C., R.Ohi, O.Leismann, A.Salic, A.Pozniakovski, and H.Funabiki. 2004. The chromosomal passenger complex is required for chromatin-induced microtubulestabilization and spindle assembly. Cell 118:187-202.
155. Sandall, S., F.Severin, I.X.McLeod, J.R.Yates, III, K.Oegema, A.Hyman, and A.Desai. 2006. A Birl-Slil5 complex connects centromeres to microtubules and is required to sense kinetochore tension. Cell 127:1179-1191.
156. Sawin, K.E. and T.J.Mitchison. 1991. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. J. Cell Biol. 112:925-940.
157. Schwab, M.S., B.T.Roberts, S.D.Gross, BJ.Tunquist, F.E.Taieb, A.L.Lewellyn, and J.L.Maller. 2001. Bubl is activated by the protein kinase p90(Rsk) during Xenopus oocyte maturation. Curr Biol 11:141-50.
158. Sharp, D.J., G.C.Rogers, and J.M.Scholey. 2000. Microtubule motors in mitosis. Nature 407:41-47.
159. Sharp-Baker, H. and R.H.Chen. 2001. Spindle checkpoint protein Bubl is required for kinetochore localization of Madl, Mad2, Bub3, and CENP-E, independently of its kinase activity. J Cell Biol 153:1239-50.
160. Skoufias, D.A., C.Mollinari, F.B.Lacroix, and R.L.Margolis. 2000. Human survivin is a kinetochore-associated passenger protein. J. Cell Biol. 151:1575-1582.
161. Smythe, C. and J.W.Newport. 1991a. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods Cell Biol. 35:449-468.
162. Smythe, C. and J.W.Newport. 1991b. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods Cell Biol. 35:449-468.
163. Sullivan, B.A. and G.H.Karpen. 2004. Centromeric chromatin exhibits a histone modification pattern that is distinct from both euchromatin and heterochromatin. Nat. Struct. Mol. Biol. 11:1076-1083.
164. Sumara, I., E.Vorlaufer, C.Gieffers, B.H.Peters, and J.M.Peters. 2000. Characterization of vertebrate cohesin complexes and their regulation in prophase. J Cell Biol 151:749-62.
165. Sun, X., H.D.Le, J.M.Wahlstrom, and G.H.Karpen. 2003. Sequence analysis of a functional Drosophila centromere. Genome Res. 13:182-194.
166. Sun, X., J.Wahlstrom, and G.Karpen. 1997. Molecular structure of a functional Drosophila centromere. Cell 91:1007-1019.
167. Tamm, I., Y.Wang, E.Sausville, D.A.Scudiero, N.Vigna, T.Oltersdorf, and J.C.Reed. 1998. lAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs. Cancer Res. 58:5315-5320.
168. Tanaka, T.U., N.Rachidi, CJankeet al. 2002. Evidence that the Ipll-SH15 (Aurora kinase-INCENP) complex promotes chromosome bi-orientation by altering kinetochore-spindle pole connections. Cell 108:317-329.
169. Tang, C.J., C.Y.Lin, and T.K.Tang. 2006a. Dynamic localization and functional implications of Aurora-C kinase during male mouse meiosis. Dev. Biol. 290:398-410.
170. Tang, Z., H.Shu, D.Oncel, S.Chen, and H.Yu. 2004a. Phosphorylation of Cdc20 by Bubl provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol Cell 16:387-97.
171. Tang, Z., H.Shu, W.Qi, N.A.Mahmood, M.C.Mumby, and H.Yu. 2006b. PP2A Is Required for Centromeric Localization of Sgol and Proper Chromosome Segregation. Dev. Cell 10:575-585.
172. Tang, Z., Y.Sun, S.E.Harley, H.Zou, and H.Yu. 2004b. Human Bubl protects centromeric sister-chromatid cohesion through Shugoshin during mitosis. Proc Natl AcadSciUSA 101:18012-7.
173. Taylor, S.S. and F.McKeon. 1997. Kinetochore localization of murine Bubl is required for normal mitotic timing and checkpoint response to spindle damage. Cell 89:727-35.
174. Terada, Y., M.Tatsuka, F.Suzuki, Y.Yasuda, S.Fujita, and M.Otsu. 1998. AIM-1: a mammalian midbody-associated protein required for cytokinesis. EMBO J. 17:667676.
175. Tutter, A.V. and J.C.Walter. 2006. Chromosomal DNA replication in a soluble cellfree system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322:121-137.
176. Uhlmann, F., F.Lottspeich, and K.Nasmyth. 1999. Sister-chromatid separation at anaphase onset is promoted by cleavage of the cohesin subunit Sccl. Nature 400:3742.
177. Uhlmann, F. and K.Nasmyth. 1998. Cohesion between sister chromatids must be established during DNA replication. CurrBiol 8:1095-101.
178. Uren, A.G., L.Wong, M.Pakusch, K.J.Fowler, FJ.Burrows, D.L.Vaux, and K.H.Choo. 2000. Survivin and the inner centromere protein INCENP show similar cell-cycle localization and gene knockout phenotype. Curr. Biol. 10:1319-1328.
179. Vader, G., J.J.Kauw, R.H.Medema, and S.M.Lens. 2006a. Survivin mediates targeting of the chromosomal passenger complex to the centromere and midbody. EMBO Rep. 7:85-92.
180. Vader, G., R.H.Medema, and S.M.Lens. 2006b. The chromosomal passenger complex: guiding Aurora-B through mitosis. J. Cell Biol. 173:833-837.
181. Vagnarelli, P. and W.C.Eamshaw. 2004. Chromosomal passengers: the four-dimensional regulation of mitotic events. Chromosoma 113:211-222.
182. Vaisberg, E.A., M.P.Koonce, and J.R.Mcintosh. 1993. Cytoplasmic dynein plays a role in mammalian mitotic spindle formation. J. Cell Biol. 123:849-858.
183. Van Hooser, A., D.W.Goodrich, C.D.Allis, B.R.Brinkley, and M.A.Mancini. 1998. Histone H3 phosphorylation is required for the initiation, but not maintenance, of mammalian chromosome condensation. J. Cell Sci. 111 (Pt 23):3497-3506.
184. Vigneron, S., S.Prieto, C.Bemis, J.C.Labbe, A.Castro, and T.Lorca. 2004. Kinetochore localization of spindle checkpoint proteins: who controls whom? Mol Biol Cell 15:4584-96.
185. Vong, Q.P., K.Cao, H.Y.Li, P.A.Iglesias, and Y.Zheng. 2005. Chromosome alignment and segregation regulated by ubiquitination of survivin. Science 310:14991504.
186. Warburton, P.E., C.A.Cooke, S.Bourassaet al. 1997. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr. Biol. 7:901-904.
187. Watanabe, Y. and T.S.Kitajima. 2005. Shugoshin protects cohesin complexes at centromeres. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 360:515-21, discussion.
188. Wei, R.R., J.A1 Bassam, and S.C.Harrison. 2007. The Ndc80/HEC1 complex is a contact point for kinetochore-microtubule attachment. Nat. Struct. Mol. Biol. 14:5459.
189. Wheatley, S.P., A.Carvalho, P.Vagnarelli, and W.C.Earnshaw. 2001. INCENP is required for proper targeting of Survivin to the centromeres and the anaphase spindle during mitosis. Curr Biol 11:886-90.
190. Wong, O.K. and G.Fang. 2006. Loading of the 3F3/2 Antigen onto Kinetochores Is Dependent on the Ordered Assembly of the Spindle Checkpoint Proteins. Mol. Biol. Cell.
191. Wood, V., R.Gwilliam, M.A.Rajandreamet al. 2002. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. Nature 415:871-880.
192. Xia, G., X.Luo, T.Habu, J.Rizo, T.Matsumoto, and H.Yu. 2004. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. EM BO J. 23:3133-3143.
193. Yan, X., L.Cao, Q.Liet al. 2005. Aurora C is directly associated with Survivin and required for cytokinesis. Genes Cells 10:617-626.
194. Yang, C.H., J.Tomkiel, H.Saitoh, D.H.Johnson, and W.C.Earnshaw. 1996. Identification of overlapping DNA-binding and centromere-targeting domains in the human kinetochore protein CENP-C. Mol. Cell Biol. 16:3576-3586.
195. Yu, H. 2006. Structural activation of Mad2 in the mitotic spindle checkpoint: the two-state Mad2 model versus the Mad2 template model. J. Cell Biol. 173:153-157.
196. Zeitlin, S.G., R.D.Shelby, and K.F.Sullivan. 2001. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. J. Cell Biol. 155:1147-1157.
-
Боярчук, Екатерина Юрьевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2007
-
ВАК 03.00.25
- Структура и свойства центромерного комплекса мыши в клеточном цикле
- Индукция патологических митозов и изменение клеточного цикла в первичных фибробластах человека, инфицированных цитомегаловирусом
- Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса
- Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом
- Поиск генов Schizosaccharomyces pombe, участующих в инициации анафазы
