Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм геннопротекторного действия препаратов антиоксидантов и стероидов в условиях повреждения печени тетрахлорметаном

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм геннопротекторного действия препаратов антиоксидантов и стероидов в условиях повреждения печени тетрахлорметаном"

ГБ ОД 2 ¡Ш fe-*

АКАДЕШЯ ЙЕДИЧННХ НАУК УХРДКНИ

ШСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГ!!

На правах рукопису

В1СТУНОВА 1рина 6вген1вна

i£XAHI3i5f ГЕНОПРСТЕКТОРШ! Д11 ПРЕПАРАТ IB АНПЮКСНДАНТ1В ГА CTEPOlXIB ЗА УШЗ ПОЖОДШШ ПЕЧ1ПКН ТЕТРАХЖРМЕТАНОМ

03.00.04. - 61ох1и1я

АВТОРЕФЕРАТ дисерпшИ на здобупт паукового ступеяю кандидат б!ожог1чних наук

К и Î в 1996

Дисертац1ею s рукопис Робота виконана у в!ддШ б1ох1м1чно1 фармакологи 1нституту фармакологи та токсикологи АМН Укра'1ни

Науков!. кер1вкики: чл.-кор. АМН Укра1ни, доктор медичвих

паук, професор Mpiä 1ваповт ГУБСЫШЙ доктор б1одоа1чних наук, професор Шааа Данилова ХОЛОДОМ 0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б1олог1чних наук, професор

ЛШя Наумова БОГАЦЬКА чм. -кор. HAH i АМН Укра?ни, доктор иедшних наук, професор Opiü Соломонович КАГАН

Пров1дна установа: Харк1вський державний медичний

ун!верситет

Захист в1дбудеться "_"_1996р. о _годин1 на

вас1данн1 спец1ал1зовано! вчено1 ради 50.15.01 в 1нститу-Ti геронтологи АМН УкраТни.

3 дисертац!ею можна озаайомитись в б1бл1отец1 1нституту геронтологи АМН Укра!ни (252114, Ки!в, вул. Вишгородська,67).

Автореферат роз!слано "_"_1995р.

Вчений се!фетар

спец1ад1зовано! вчено! ради Р.I.Потапенко

-3-

ЗАГАШ1А ХАРАКТЕРИСТИКА РОБСТИ

Актуальность проблеик. Зростаяня к1дькост1 захворюваяь, зу-мовлених д1ею чужор1дних для орган1зму сполук (ксеноб!отик!в), е одк1еп з найвалшш1ших медичнях та соц1альних проблем, э якими людство зусгр1чаеться напередодн! XXI стор1ччя. В останн! роки накопичиласъ велика к!льк1сть даних про те, що в основ1 багатьох захворювань, зокрема, 1 зумовлених впливом ксеноб1отик1з, в окси-дантний стрес. Його проявом е стимудяц1я реакц!й л!попереокислен-ня СГубский,1989; ВеПога,19913. Ц1 процеси носять загальноб1оло-гХчяий характер 1, за сучасними уявленнями, е ун!версальними ме-хан1зиами пошкодасення кл!тин.

В роботах, до стосуються механ!зм1в д11 ксеноб1отик!в, об'-ектами досл1дження були здеб1льше цШ кл1тини або б1омембрани [Владимиров и Арчаков,1972; ГеЬег,1991; СагШ,19923. Питания, цо стосуються визчення функцХонування ядерного хроматину, як ц!льного автономного утвореяня, за умов порушення л1попероксида-цП, не енайшли надежного висв1тдення в л!тератур1. В1домо, щр до складу хроматину входять лШди [Адесенко.1987; Кучеренко, 19833, як1, очевидно, необх!дн1 для нормального зчитування генетично! 1нфориац11; отже, 1х зм1ни здатн1 призвестн до порушення процесХв нормального функц1онуваяня хроматику. При д11 ксеноб1отик!в на юПтину або орган1зм вЦбуваетъся пошкоджеиня Л1п1д1в, яке пов'-язане яередус1и э актнвад1еи процес1в переокислення

СУаса,1989; Уа№а,1990; Губский,1991;1992; Костик, 19913. Утворен-' ня продукт! в л!поперомсидац11 може впливати на будову та нормаль-не функц1онування хроматину. Дроте, молекулярн1 механ1эми цих процес!в б практично невквченими. В1дом1 сполуки, що мають анти-эксидантн! властнвост! 1 едага! корегувати зм1ни, що спостер1га-пться за актнвацН перекисного окисления л!п1д1в (ПОЛ). Особливий 1нтерес являють природн! акткоксиданти [Холодова,1979;

Вагеата5ее,1980; Ландау, 1981], ак1, будучи б!оаог1чно активкики сполуками, виявляють позитивяяй вшшв на орган!вм людини 1 тва-рин, не зумовлшчи поб!чаого токсичного ефекту. До таких антиок-сидаят!в, що маоть потенц1йн1 генопротекторн! властивост!, напекать в1там!н Е та нов! ф!топрепарати: ф!тостеро!ди, флараксин (препарат рослинного походяення, е пох!дним галлово! кислоги) СХолодова,1987; Мельничук,1988; Коо1тап.1990]. Проте, до останкь-ого часу практично не досл!джен1 механ!зми д11 антиоксидант!в на ядерний алар.ат кд1тини в умовах модиф1кац11 процес1в ПОЛ при дП на орган!зм р!зних ксеноб!отик1в.

Особистш вяесок дисертанта у виконану роботу лолягае в тому. що экспериментальна частика роботи та статистична обробка результата досд!джень виконан! дисертантом самост1йно.

Нота 1 задач! дасл!дяення. Метою досл1дження було вивчити модекулярн! иехан!зми взаеыодИ б1олог!чно активних сполук (БАС) з ядерним хроматином печЛнки ва умов поткодження його тетрахдор-метаном (ТХМ). В!дпов£дно до поставлено! мета передбачалося вир1-шити наступи;! задач!: 1). Вивчити механ1зми генопротекгорно! дП _в1там1ну. Е за умов !нтоксикац!1 тварин ТХМ. 2). ДосИдити генопротекторн!' ■■ властивост1 ■ препарату флараксин за умов пошкодження ядерного хроматину ТХМ. : 3); ■ Досл!дити генопротекторну д!» 61оло-г1чно активно! речовини на основ1 ф!тостеро!д1в (БТК-8Л) за умов ушкодхення печ!нки ТХМ. 4). Вивчити вшшв ф1тостеро'1д1в на хроматин за умов деф!циту в..орган1зм1 !специф1чного стеро!ду - в!таы!ну Из-

Наукава новизна роботи.. Вперше проведено комплексний анал1з структурово-функцШого стану - фракц1онованого хроматину печ!нки щур1в за 1нтоксикац!1 Ш га проф1лактичного введения ряду фарма-колог!чно активних речовин (в!там1н Е, флараксин, БТК-8Л).

Встановлено, що внасл!док ыодиф1кацП ксенобЮтиком процес!в

' -5-

ПОЛ у фрагаЦях ядерного хроматину печ1нки порушуеться його струк-турово-функц!йна орган!зац1я.

Проф1лактичне введения.препарат1в, щр мають антиоксидантн! властивост1; дозволяв значков ni ров зменшити зумовлен! введениям ТХМ пошкоддення структура та функц1йно! активност1 хроматину. Ме-хан!зм ■ тако! дП препарат!а по в1дношенню до ядерного хроматину пов'язашш з 1х антиоксидаятними властивостями.

B ochobI генопротекторних ефект1в досл1джуваних препарат 1з е 1х зв'язування з фракц1ми хроматину. Так, й-токоферол зв'язуеться з б1лками та дШдами репресованого та транскрипц1йяо активного хроматину; флараксин - з б1лкамк та лШдами транскрипц1йно активного хроматину (TAX) та з ДНК в репресованму хроматин1 (РХ); БТК-8Л - з г!стоновими б!лками та лШдами TAX та РХ.

Препарат БТК-8Л, на в!дм1ну в1д стеро!дних гормон!в ссавц!в, безпосередньо зв'язуеться з фракциями хроматину, не утворюючи гормон-рецеяторких комплекс!в.

Продемонстровано стимулюючу д1п БТК-8Л на процеси репл1кад11 та транскрипцП в обох фракц!ях хроматину та репаративного синтезу в РХ.

Теоретична значим1сть робот. В результат! комплексного дос-л1дження компонент 1 в та функц1й хроматину показано генопротектор-ний ефект препарат1в антиоксидантного типу дП - «-токоферолу,' флараксину, БТК-8Л. Вивчено молекулярн! механ!зми д!1 препарат!в на генетичний аларат кл1тини. Досл!джено.законом!рност!» що характеризуют генопротекторну д1ю досл1джуваних препарат1в.

, Розшифровано нев!дом! ран1ше молекулярн! иехан!зми д11 на ядерний геном вевластивих орган!зму ссавц!в ф1тостеро!дних гормо-н1в... 0тркман1 результата п1дтвердхують та св!дчать про значну роль переокислення хроматин-зв'язаних л1п!д1в у лошкодженн! геному. На п!дстав! : виявлених законом!рностей рсзроблен! принципа

фармаколог1чно![ корекцП в1льнорадикальних пошкоджень генетичного апарату кл!тини.

Практична цхнн1сть робота. 0гриман1 експериментальн! дан! дозволяюсь визначити шляхи використання препарат!в на ochobí рослинно! сировини (флараксин, БТК-8Л), а також в!та-м1ну Е для проф!лактики га л!кування зуыовлено! променевим впливом патологи, хвороб печ1нки тошр. Сл1д оч!кувати, шр створен! на основ! ф!тостеро!дних гормон!в д!карськ1 препа-рати не виявлятимуть несприятлкво! поб!чно'1 дП на орган!зм лвдини та тварин.

Ochobhí положения, tap виносяться на захнст:

1. Досл1дження in vivo та In vitro функцЮнування хроматину за !нтоксикацЛ та проф1лактичного введения препарата антиокси-дант!в дозволило виявити деяк! нев!дом! ран!ше молекулярн! меха-Hi зми генотоксично! дП ТХМ та гекопротекторного ефекту препара-т!в антиоксидант1в.

2. Препарати антиоксидант1в значнсю uípaa нормал1зують структурно-функц!йн! властивост! ядерного хроматину, порушен! в умовах генотоксично! д!1 ТХМ. Механ1зми тако! генопротекторно! дП моасуть бути пов'язаними, передус!м, з нормад!зад1еп данный препаратами процес!в ПОЛ в хроматин!.

3. Анал1з результат!в досл!джень, отриманих при вивченн! ме-хан!зыу д11 ф!тостеро!д!в на хроматин, щр лежать в основ! 1х ге-нопротекторного ефекту, показав, до в1н в в1ды!нним в!д такого, властивого для стеро!дних гормонiв людини i тварин.

АпробагЦя робота. Матер!али дисертацИ буди представлен! на науков!й конференц!! "Школа академ!ка 0.I.Черкеса: !де1, роэви-ток, перспективи" (Ки1в,1994).

Вправаджеяня. Дисертад!йна робота е фрагментом планово! нау-ково! тематики в!дд!лу 61ох1м1Чно1 фармакологи 1нституту фармакологи та токсикологи АМН УкраТни. Результата дослШень вико-

ристовуються при ВШШДащЦ курсу ÖioxiMl'i в Укра*нському державному медичному ун!верситет1 iM. акад. О.О.Богоиольця.

Публ1кацП. Основний зм!ст дисертац1йно! роботи викладено в 7 публ!кац!ях, з яких б - журнальн! статт!.

Об'еы роботи. Дисертац1я сгсладаеться з встуггу, огляду л!те-ратури, экспериментально! частини з обговоренням результата дос-л1джень, заключения, висновк1в, перед1ку л1тератури (267 джерел). Робота викладена на 165 стор1нках иашинопису 1 м1стить в соб! 34 таблиц! та 22 малюнка.

НАТЕРЦШ ТА ИЕТОДИ Д0СЛ1ДЯЕНЬ Робота була виконана на б!лих щурах-самках масою т!ла 150-200г. ТХМ вводили внутр!шньочеревно з розрахунку 1,75 ид на 1 кг маси т!ла, шр в1дпов!дае 1 ЛД50. Досл!дження проводили через 2 год п!сля введения, в пер1од максимального прояву пошкодаення хроматину ¡Тубский и др.,19891. В1гам1н Е (а-гокоферялацетат фар-макопейний) вводили внутр1шньочеревно за 30 хв до введения ТХМ з розрахунку 50 мг на 1 кг. Препарат БТК-8Л вводили такса за 30 хв до ТХМ у вигляд1 0,152-01 водно! суспензИ з розрахунку 4 мл на 1 кг маси т1ла. ВТК-8Л - препарат, отрицаний з рослини Serratula coronata L., м!стить у своему склад! 8% екдистерону, и1норн1 ф!-тоекдистеро!ди - «оно- та диацетоно!ди екдистерону, ot-екдизон, псийподин В, !нтегристерон А, моноацетонид ангастерону С, птерос-терон, а таколс л1п1ди; препарат був синтезований в ¡нститут! 6io-х!м!1 1м. О.В.Паялад!на HAH Укра1ни п!д кер1вництвом проф. Ю.Д.Холодово!, Препарат "Флараксин" у ф!з!олог1чному розчин! вводили тваринам в хвостову вену одночасно в ТХМ з розрахунку 4 мг/кг. Флараксин - л!оф!льно висушении препарат рослинного поход-ження, б пох!дним галово! кислоти, виготовлений на Ки!вському завод! медпрепарат!в; автор препарату - I.A.Кулик.

Досл1дження Д-г1пов1там1нозу проводили на 4-х трупах тварин:

1) тварин утримуваш т1льки на рах1тогенн!й д1ет1, 1х розглядали як в1д'емкий контроль; 2) шурам давали комб1корм в!вар1ю, вони правили ва поэитивний контроль; 3) тварин утримували 2 тижн1 на рах1тогенн1й д!ет1,,.пот1м 1м вводили екдистерон (100 мкг) протя-гом 20-ти. дн!в один раз на 2 дн1; 4) щури отримували протягом 2-х тижнйв рах1т<)генний рац1он, пот!м екдистерон та в1там1н Da, добо-ва доза - 0,33 мкг.

■ Одержаявя фракц!онованого хроматину з. печ!нки иур1в провади-' ли за [Чихирлеина, 19763. Концентрац1п ДНК визначали спектрофото-ыетрично за сп1вв1дноиенням оптично! густини sa довжини хвиль 260 та .230 нм, б1лка -. ва 224 га 233 нм [Цанев и Марков, 19603. ДНК з ядер та фракц1й хроматину вид 1 ля ли депроте'1н1вац1ею ва [Маниатис и др.,1984].

Bmíct д1енових кюн*югат1в (ДК) визнвчали за СКостюк и Пота-пович,19843; пвидк1сть накопичення малонового диальдег1ду (МДА) sa активац11 ПОЛ NADPH (NADPH-залеине ПОЛ, НЭП) та, аскорбатом (аскорбат-залежне ПОЛ, АЗП) визначали за [Владимиров и Арча-ков, 19721. CiynlHb ПОЛ рееструвади спектрофотометрично як в1дно-шення оптично! густини ДК Qzsz та неокислювано! форми л1п1д1в 0215 [Владимиров и Арчаков,19723. Функц1ину активн1сть фракц!й хроматину : оц1шовали за активн1стю ендогеяних ДНК- та РНК-пол1ме-' раз CFlchot et al¿,1979; Костюченко и др.,19823.

14С-оротат та 14С-лейцин вводили внутр1шньочеревно за 30 хв до декап!тацП в доз1 4,0 та 1.3 МБк/кг в1дпов1дно. 3Н-тимидин вводили внутр1шяьочеревно аа 1 год.до декап1тац11 8 роврахунку 235 МБк/кг. Рад1оактивн1сть виэначали за. [Губский,1989]. Антира-дикапьну активн!счъ препарат!в визначали за [Мельничук,19883. Зв'язування етид1я бромиду в ДНК визначали за tlawrence,19743. Стан нег1стокових б!лк1в фракЩй хроматину - . за СЛакович,19863, вм1ни Пстонових.б1лк1в визначали за [Bode,19793. Структуру хроматину анад!зували, вигоэристовуючи флуоресцентн! зонди п!рену та

1-ан1линонафтал!н-8-сульфонату [Владимиров и Добредав,1980;1988]. Л1посоми а фосфал1п1д!з отримували аа [Лебедь и др.,1939]. Елект-рофорез препарат!в хроматину та ДНК-фракц!й провалили за CKadura,1985]. Хроиатограф!чнэ розд1лення препарат1в хроматину зд1йонювали за СЧабанный,1989].

Результата обробляли методами непараметрично! статистики 8 використанням критер1я В1лкоксона-Манна-У1тн1 [Ашмарин и др.,1975].

РЕЗУЛЬТАТН ХА iX ОВГОВОРЕШИ 1. Нехан!зми генопротектсрко! дп в!там1ну Е на хроматин за умов 1итоксияацП гвдркн ТХЬ. 1нтоксикац1я тварин ТХИ призводить до порушень процес1в пероксидацИ' хроматин-зв'язаних л1п1д1в, сп1вв1дношень м1лс фракц1ями та б1лок/ДНК у фракц1ях хроматину, ДНК-'та РНК-пол1меразко1 активностей. Проф1лактичне введения в1-там!ну Е запоб!гае порушенням зазначених характеристик хроматина (мал.1), до в1дпов1дав ран1ше отриманим в наш1й лабораторП даним СГубский и др.,1992].

У затруених тварин вростае параметр D230/D260 У спектр! пог-линання TAX, • якийг продовжуе зб1льшуватися i у тварин, щр зазнали проф!лактячного введения в1там1ну Е. Ц1 дан1- вказують на те, то структура б!лково! компонент« в TAX зазнав релаксацП 1 в!дбува-еться зм1на сп1вв1днсиення б1лок/л!п1д. У випадку проф1лактичного : введения в!там!ну Е зазначене зб!лыпення може бути пов'язано з утворенням иолекулярннх' комплекса' препарату з хроматином. У фракц1ях РХ зм1я параметр!в дгзо^гво не спостер!галося.

ЗбШшення флуоресценцИ б1лк!в в обох фракц!ях хроматину за !нтоксикад!1 ТХМ, 1мов!рно, пов'язано 18 ровгортанням молекул б1лк!в. Введения в1там1ну Е зумовлие подальше зростання цього по-казника, що може бути зумовлено в1дкриттям додаткових хромофор!в внасл!док зв'язування препарату з б!лками хроматину.

„ 1^^ластивос'1'1 Фракц1й хроматину яеИнки щур!в за îktokck-

кацП ТХМ та введения в!там!ну Е (la - РХ, 16 - ГАХ). %

а)

б)

тш

Ш + вгт.Е

12 34 5 67 89 1 - ДК (гептанова фаза), 2 - ДК Цзопропанолова фаза), 3 - НЗП, 4 - АЗП, 5 - кеШц1йований контроль (ЩА), б - сп1вв!дношення фракц!и, 7 - вгдношення б!лок/ДНК. 8 - тотальна ДНК-пол1меразнй активн!сть, 9 - тотальна РНК-пол1меразна активнгсть.

¥г Р<0,05 по вЦноиенню до контролю на мал. 1-3.

Bel дан! на мал. 1-3 представлен! у в!дсотках в!дносно контролю.

1нтоксикац1я ТХМ зумовдюе порушення м1кров'язкост! л1п1дово'1 компонента хроматину, про щр св1дчить еб!дьшення ступени ексиые-ризацП п!рену як у фракцН TAX, так ! у РХ. Д1я в!там1ну Е приз-водить до подадьшого "розр1ддження" лШдово! компоненти в РХ та нормал1зац11 м1кров'язкости в TAX.

Отже, як !нтоксикац1я ТХМ, так 1 проф1лактичне введения в1-там1ну Е призводять до структурово-динамХчних зм1н в глибинних г1дрофобних дшнках фраки!й хроматину.

Спектрофотометрйчне титрування показало, що екзогенний в1та-м1н Е б!лып ефективно взасиод1е э хроматином за отруення пор!вня-но з 1нтактними тваринами та тваринами, що отримували в!там1н Е. 1мов1рно, це зумовлено "вивМнениям" (або демаскуванням) д1лянок зв'язування ендогенного токоферолу у фраку1ях хроматину за умов 1нтоксикац11 внасл!док вкчерпування запас!в ендогенного токоферолу.

За допомогою м!крокалориметричних досл1джень показано, що за приеднання екзогенного о:-токоферолу до фракц1й хроматину маг м!с-це ендотерм!чний ефект. Це може вказувати на наявн1сть г1дрофоб-них або "стек1нгн- вваемод!й, що зуковлсять комплементарне встро-ювання молекул «-токоферолу на поверхн1 хроматину, або ж "сте-к1нг"-в8аемод1й парвлелько ор1ентовзнкх систем спряжения я-елект-рон1в. Менша величина ендотерм1чного ефекту, отримана при досл1д-женн1 TAX, пов'язана, 1мов1рно, в тим, до певний внесок в сумар-нии. ефект вносить взаемод!я сс-тош^ролу з лШдовою складовою хроматину.

Наявн1сть певно! захисно! дИ у в1там1ну Е узгоджуеться з тим, що у тварин, якии його проф1лактично вводили, п1двищуеться виживаем!сть на 60Z пор!вняно а !нтоксикованими ТХМ тваринами.

Таким чином, показано, щр проф!лактичне введения в1там1ну Е запоб!гае порушениа структурово фузкцШю! орган!зацИ хроматину

8а умов 1нтоксикац11 тварин ТХМ. НайбШш 1мов1рним механ1амом генопротекторко! дП в!там1ну Е иоже бути його "вбудова" в хроматин завдяки взаемодП з <51лками та дШдами, ш,о призводить до ре-лаксацП хроматину. Нормал1эац1я в1льнорадикальних процес1в, яка спостер1гаеться за введения в!там1ну Е, може, в свою чергу, бути одн1ею з найважлив1пшх ланок в данцюгу молекулярних под1й, ¡до за-поб1гае поруиенна структури та Функц1й хроматину за умов х1м1чно-го пошкодження.

2. Внвчення генопротекторнкх &ластивостей препарату "Фларан-снн** аа умов ушодження хроматиу ТХМ. Флараксин е новою протипух-линнои сполукою рослинного походження фенольно! природи. Докл1-н1чн1 та кл1н1чи! досл!дження цього препарату показали у нього, на в1дм!ну в!д традид1йних протипухлинних васоб1в, в1дсутн!сть токсичного ефекту.

Вивчення фларакскну In vitro дало можлив1сть встановити, що в1н мае антиоксидантну дш (1нг1буе спонтанне та 1ндуковане ПОЛ). Додазання до розчииу стаб1дьного радикала трифенилвердазила фла-раксину призводить до зм!н поминания за 402 i 740 нм, до св!д-чить про здатн1сть препарата служити "пасткою" стаб1льних радика-л1в. Отже, флараксин виявляе антирадикальну здатн!сть.

; Виявлен1 в умовах 1л vitro властиЕсст1 флараксину п1дтверди-лися" в досл1дах in vivo. Так, за умов одночасного в ТХМ введения йог о тваринш спостер1гаеться кормал1зац!я процес1в л!поперокси-дацИ, що особливо виявляеться у ФракцП РХ. Введения флараксину також повертае до контрольного р!вня сп!вв1дношення м!ж фракц!ями хроматину та в1дношення б!лок/ДНК, а також частково нормал!зуе РНК-пол1меразну активн!сть (мал^2). При введенн! флараксину по-вертаеться до р!вая норми 8б1львене за ШоксикацП значения параметра D230/0260 У ФРакцП TAX.

Дсюл1джешм поверхневого потешЛалу Фракц1й хроматину пока-

б)

Мал. 2. 8ластивост1 фракц!й хроматину печ!нки щур!в за 1нтокси-кацП ТХМ та введения фдаравсину (2а - РХ, 26 - ТАХ).

а)

I % 2 3 4 5 6 7

—*-

Ш

НМ+флараксин

1 2 3 4 5 6 7 1 - ДК (гептавова фаза), 2 - ДК (1зопропанолова фаза), 3 - НЭП, 4 - АЗП, 5 - неШщйований контроль (ОДА), б - спхвв!дношення фракхЦй. 7 - РНК-полхмераана активШсть.

зало, но 1нтоксикац1я тварин Ш призводить до зростання в!д*ем-ного заряду на поверхн1 л!п!дово! компонента обох фракц!й, шр, 1мов1рно, е насл!дком порушення в!дьнорадикальних реакц1й або зм1ни сп1вв1дношення б1лок/яШд в хроматин!. Введения тваринам флараксину повн!стю нормад1ауе досл!джуваний показник.

Таким чином, при введенн! флараксину нормаШзуеться порушена за 1нтоксикацП ТХМ структурово-функц!йна орган!зац1я хроматину.

Резудыати спектрофотометричного Еитрування флараксином подельник систем - лецитинових л1посом та альбум!ну сироватки кров! людини (АСКЛ) - вказують на 8датн!сть препарату утворювати м1цк! комплекои в 0!лковов та л!п1довою компонентою хроматину.

Як показали м1крокалориыетричн1 досл1дження, характер реак-ц!й вэаемодН флараксину з РХ е близьким до ДНК-взабмод!1, а в TAX к1нетичн! крив1 s аналог1чниии до таких для л1посом та АСКЛ. Величини теплово1. вэаемодП флараксину з TAX та АСКЛ в бливькиыи, т дае можлив!сть припустити дом!яуючий внесок в продес вваемодИ флараксину з д1ею фракц! ею хроматину б1лвово1 компоненти.

Досл1дження гас1ння флуоресценцП б!лк!в показало, що в при-сутност! флараксину зменшуеться в1дстань м!ж донором енергП (б!лковими флуорофорами РХ та TAX) та П акцептором (п!рен). Це иожливо як за умов зумовленого д1ею флараксину эменшення компактной! структур« б!лк!в хроматину, так i эа б1льшо! 1мов!рност! встроювання п!рену в л!п!дову фазу хроматину при зниженн! ПОЛ (вважаючи на антиоксидантну д!ю флараксину). Б1льше значения ве^-личини переносу енергН у випадку з TAX вказуе на те, що взаемо-д1я флараксину з ц!ею фракц!ею в!дбуваегься переважно за участю б!лк!в, а у випадку з РХ - з ДНК,

Наявн1сть гахисно? д!1 у фларвксину по в!дношенню до хроматину виявляеться у п!двищенн! виживаемост! тварин, яким вводився препарат, на 502 в!дносно 1нтоксикованих ТХМ тварин.

Таким чином, проведен! досШдяенвя дозволит виявити у фла-раксину генопротекторн! властивост1. Принайми! частково, аазначе-ний ефект зумовлений антирадикальниш властивостями препарата. Механ1зм генопротекторно'1 д11 флараксину реал!зуеться завдяки йо-го зв'язуванню в ДНК в РХ, б!лкаии та л1п1дами в TAX, що залоб!-гае в!лъворадикал1>ноиу ушкодленнх) хроматику.

3. Генощютекторна д!я б1олог1чно активна* речовинн на основ! ф!тостероХд1в (ВТК-8Л) за уиов попкоджоння печ!ики ТХМ. Вив-чения впливу терапевтичного введения препарату БТК-8Л на процеси спонтанного та 1ндукованого ПОЛ у фракц1ях хроматину печХнки щу-р1в, 1нтоксикованих ТХМ, св1дчизъ на користь значно! антиокси-дантно! д!Т препарату. Так, в обох фракц!ях повертаеться до контролю вм1ст ДК 1 МДА. Проф!лактичне введения препарату повн1ст» i

запоб1гае порушенню в!дсотксвого с«1вв1дношення Mix фракц1ями хроматину та в1дношення б1лок/ДНК. Введения БТК-8Л виявляе частково' нормал1зуючий ефект на р1вн1 репл!кацП та транскрилцИ ДНК, б!льше виражений у фракцИ РХ. Проте на р1вн! трапсляцП препарат подЮно1 д11 не вкявляе (мал.З).

; Як за !нтоксикацП, так 1 за проф1лактичного введения препарату. БТК-8Л у фракцИ TAX спостгрХгаеться зрссгання сп!вв!дношен-ня D230/D260. ЩР може св!дчити про змекшення компактност1 струк-тури: б!лку та зм1ни в!дношення б!лок/д1п!д. Тобто БТК-8Л може ут-ворювати молекулярн1 комплекси з хроматином.

Проф1лактичне введения препарату sanoOlrae зумовлюваним. 1н-токсикац!ев порушенню м1кров'язкост1 в обох фракц!ях хроматину, а такоя"величина заряду поверхн! лШдово! компонента.в РХ.

Структурова лаб1л1зац!я.хроматину, ю виявлена електорофоре-тичними досл1даеннями,. за умов введения БТК-8Л пов'язаяа, 1мов!р-но, з к1лькЛсними зм!нами б1лк!в за рахунок 1х протеол1зу. За введения, препарату в1дбуваеться. декомпактазац1я структур, нов'-

Мад. 3. Властивост1 фракц!й хроматину печ1нки щур1в за 1нтокси-кац^.Щ* та введения препарату БТК-8Л (За - РХ, 36 - ТАX).

а)

б)

НИ

ТХМ + БТК-8Д

I - ДК (Г£иханова фаза). 2 - ДК Цзопропанолова фаза), 3 - КЗИ, 4 - АЗП, 5 - кеШ«1йований контроль (МДА), 6 - сп1вв!дношенш Фракц1й, 7 - з1дношення 61док/ДНК, а - включения 3-Н-т1м1дину 1 ДНК, 9 - включения 14-3-оротату в РНК, 10 - включения 14-3-лейцину в 61Л0К.

язаних з матриксовими елементами ядра, особливо у фракцП TAX. Стан генетичного аларату кл1тини за введения БТК-8Л визначаеться, 1мов1рно, стимуляц1ею стресорних процес!в, у зв'язку з чим проф!-лактичне введения препарату здатно запоб1гати пошкодженню хроматину ТХМ.

Досл1дження 1ндуктивно-резонансного переносу енергП показало, що за 1нтоксикад11 в!дбувавться зм1на структури хроматину за рахунок активацП внутр1шньомолекулярноЗ динам1ки б!лк!в. Введения препарату значною Mlpon нормал1зуе зазначений показник.

Таким чином, як штоксикаЩя, так 1 проф1лактичне введения препарату БТК-8Л приэводять до структурово-динам1чних зм!н в гли-бинних Пдрофобних д!лянках фракЩй хроматину.

За допоиогою м1крокалориметричних досл1джень встановлено, що взаемод!я препарату БТК-8Л з фракц!ями хроматину супроводжуеться екзотерм1чним ефектом. Ц1 дан1 св!дчать на користь того, що препарат утворюе з фракц!ями молекулярн1 комплекси з водневим зв'яз-ком, або х м!ж ними в1дбуваеться електростатичиа чи Ван-дер-ва-апьсова взаемод1я. Тепловий ефект реакц1й БТК-8Л з фракц1ею TAX з печ1нки контрольних тварин s вдв!ч1 бХльшим за ефект реакц1й з FX, щр може св!дчити про участь л1п1д1в у взаемодП препарату з TAX, оск!льки 'fx вм1ст в Щй фракцП в вищим пор!вняно з РХ.

Термограми реакц1й В8аемод11 препарату БТК-8Л з альбум1ном с кроватки бика, фосфол!п1довими б1шарами з нейтрального лецитину, в!д'емно зарядаеним сф!ягом1ел!нои та ДНК показали, що в умовах In vitro препарат взаемод1е з б1лковою та л1п1довою компонентою хроматину.

Результата флуоресцентного зондування основних клас!в б1лк1в 1 ДНК фракц!й хроматину за умов введения тваринам препарату та додавання його до РХ 1 TAX In vitro виявили, що цей препарат прнаводить до ровгортання (розрихлення структури) г!стонових 61л-

kIb в оОок фракц1ях хроматику, але не зач!пае структурового укла-дення неПстонових б1лк1в та ДНК. Imobipho припустити, щр особлива роль в цьому процес! належить г1стоновi HI, який, на в!дм!ну в1д 1няш ricTOHlB, не формуе Пстоновий октамер 1 може бути б1лып доступним для зв'язування препарату БТК-8Л.

Введения 1нтактним тваринам БТК-8Л суттево не впливае на включения и1чених оротату та лейцину у фрзкцП хроматину, проте зумовлюе суттезе п1двищення включения т!мидину в ДНК РХ. При ць-ому р1вень включения еазначеного 1зотопу б TAX достов!рно не зм1-нюеться за умов введения препарату. Зб1льшення включения 3Н-т1ми-дину в РХ п!д впливом БТК-8Л за своею природою може бути репара-тивним, оск!льки за введения препарату не було виявлено зб!лыпен-ня сумарного синтезу ДНК га прол1ферацП кл!тин на 1нших моделях [Munsch,1982; Холодова,19921.

Захисн! властивост!. препарату по в1дношенюо до фракц1й хроматину проявляются в п1двшденн1 виживаемост1 на 65Х за його про-ф1лактичного введения пор1вняно 8 1нтоксикованими ГХМ тваринами.

Таким чином, прсф1лактично введений препарат БТК-8Л бевпосе-редньо зв'яауеться з Пстоновиш б1лкамн та л1п!дами хроматину, зумовлюючи декомпактизаЩю його структура. Можливо, це е проявом адаптивних процес1в транскрипц1йно! або ж репаративно! д1яльност1 ядра.. Генопротекторний ефект препарату БТК-8Л може бути також ву-мовленим , його антиоксидзлтною д!ею, ш;юл!док чого в1льноради-кальн1 метабол1ти ТХМ можуть бути "знеппсодженГ* препаратом на гсо-• верхн1 хроматину, що запоб!гае порушенню структурово-функц1йно! орган1зац11 хроматину.

' 4. Вивчення впливу $1тостеро1д1в на хроматин за умов деф!ци-1 ту в opraaisMi спецнф1чних стеро£д1в. в,експериментадьн1й модел1 Д-г1пов1там1нозу з метою корекцП порушень застосовували препарата рослинних стеро1д1в 1 в!там!н D3.

■ Виявлена неоднакова д1я препарат!в на порушен1 за умов Д-г!-пов!там1нову структурово-функц!йн! властивост! хроматину. Так, введения екдистерону нормал!ауе процеси спонтанного та 1 иду кованого ПОЛ, а сум1сне еастосування екдистерону 1 в1там1ну D3 приз-водить до нормал1зац11 активност! ДНК- та РНК-пол!мераэ та сп1в-а1дношення фракц!й хроматину. Несп!впадання ефект1в, го зумовдю-ються препаратами, може св1дчити на користь того, що механ!вми дП екдистерону га в1там1ну Бз-на хроматин р1зняться.

Досл1дження спектр1в флуоресценцП б!лк1в фракц!й хроматину показало, цр Д-г!пов!там1яоз призводить до структурово! компакти-аац1Т фракц1й.

Сум1сне введения екдистерону та в1там1яу D3 нормал1зуе 61л-кову флуоресценц1ю у фращИ FX га лср/жену за Д-г1пов1там1нозу м1кров'язк!сть л1п1дово! компонента в обох фракц1ях хроматину.

Про компа:стизац1ю структури хроматину за Д-г1пов1там1нозу св!дчать також результат електрофоретичних досл1дкень, як! вка-зують на зменшоння електрофоретично! зони, ир в!дпов!дав мононук-леосомам. Шсля застосування екдистерону не спостер1гагться нор-мал1зац1я структури хроматину, а за сум1сного введения екдистерону га в1там1ну D3 в!дбуваеться повна нормал1зац!я структури РХ.

Зг!дно даиим термоденатурацП, у фракцН РХ за Д-г!пов!там1-нозу мае м1сце релаксац1я б1льшо! дол! посл1довностей ДНК. Введения - екдистерону- частково в!дновлюв ДНК-б1днов! контакта в ц!й-фракцИ хроматину. В TAX Д-г!пов1там!нов призводить до появи д1-лянок дестабШоованоГ- ДНК, вниження дол! структурових комплекс1в ДНК з неПстоновими б1лкаыи та зм!ни складу комплекс1в девоксири-бонуклеопротеШв. Внасл1док введения екдистерону нормал!зуеться териоденагураД1я TAX.. Ц1 дан! узгоджуються з нашими. результатами про значну стг/ляц!и синтезу ДНК в TAX аа введения екдистерону.

Проведен! досл1дження дали можлив!сть створити експеримен-

таяьну модельну систему, що базуеться на фармаколог!чн!й корекцп пошкодлень ядерного хроматину внасл!док деф!циту кл1тинного каль-ц!ю. 0триман1 результата св!дчать про те, що механ1зм д11 роошш-них стеро1д1в на хроматин ссавц1в р!зниться в1д такого для специ-ф!чних стеро!д!в ссавц!в.

* » #

Узагальнюшчи реэультати проведения досл1джень, сл!д назначите, :'шр проф1иактичне введения таких препарат!в, як в1там!н Е, флараксин, БТК-8Л дозволяе значнов м!рою знизити пошкодження структури та функц!й хроматину печ!нки 1нтоксикованих ТХМ тварин. В OCHOB1 тако! генопротекторно! д!!:мокуть бути, передус1м, антиоксид антн! властивост1 даних препарат!в. Захисн1 властивост1 пре-парт1в реал1зуються, 1мов1рно, вкасл!док 1х зв'язування з компонентами фракц!й хроматину.

вшювки

1. Виявлено та досл1даено генопротекторну д1ю препарат!в природнього походження - в!там1ну Е, пох1дного галлово! кислоти флараксину, препарату на основ! ф!тостеро1д1в БТК-8Л - за умов 1х проф!лактичного введения на фон! ураження печ!нки щур!в ТХМ.

2. Генопротекгорний ефект загначених препарат!в зумовлений наявн1стп у них антиоксидантнкх властивостей по в!дношенно до процес!в л!попероксидац11 хроматянзв'язаних д!п!д!в.

; 3. Проф!лактичне введения в1там!ну Е часгково нормал!зуе структуру хроматину (в!дношення б!лок/ДНК та '.фракц!й хроматину, м!кров'язк1сть дШдово! компоненти у фракцП TAX), а також пору-шену; внасл!док затруення тварин ТХМ активн1сть ДНК- та РНК-пол1-мераэ. 1

4. В ochobI нормал1зуючо! д11 в1там!ну Е лежить його взаемо-д!я з б!лками га лШдами хроматину, вд лродемонстровано в досл!-дах 1л vitro.

-215. Введения флараксину нормал!ауе в!дноиення б!лок/ДНК га фракц1й хроматину, м!кров'язк!сть лШдово! компонента та поверх-невий потенц!ал обох фракцШ хроматину, а також частково нормал1-зуе порушеву за 1нтоксикац!1 ТХМ актиьн1сть РНК-пол1мераэ.

6. В ochobI генопротекторно'1 д!1 флараксину ледить його вза-5мод1я з б!лками та л1п1дами TAX та ДНК РХ, що продемонстровано в досл1дах in vitro.

7. Захисна д1я б1олог!чно активно! речовини на ochobI ф!то-екдистеро1д!в ВТК-8Л пов'язана 1з значною нормал!зац!5» порушено! за 1нтоксккац11 струкг/ропо-функцайно! орган!зацП хроматину. В основ! цього ефекту делить взаемод!я препарату з г!стоновими баками та д!п1дами хроматину.

8. БТК-8Л стимулов активац!о процес!в репл1кац!1 та транс-крипцП, а таксж репаративного синтезу ДНК.

. 9. За умов Д-г!пов!там1нозу зм1нюегься структурово-функц1йна орган1зад!я'хроматину, найсуттев!шим проявом! чого в порушення спонтанного ¡та !ндукованого л!попереокислення, активац1я ДНК- та РНК-пол1мераз, структуров1 зм!ни б!лк!з та л1п1дово'1 компонента хроматину, компактизац1я структури хроматину.

■10. Механ!з).с дИ ф!тостеро1д1в на хроматин ссавц1в р!знить-ся в!д такого, властивого для специф!чних стеро!д!в, що виявля-еться у. в1дсутност1 утворення гормон-рецепторних комплекс1в та в1дм1нностях в ' точках прикладення на хроматин1 (г!стонов1 б!лки для Ф1тостеро'!д1в та нег1стонов! 61лки та ДНК для специф1чних стеро!д1в)J

! ПЕРЕД IK Р0Б1Т, 00 0ПУВЛ1К0ВАН1 ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАГЦК

; 1. Левицкий Е.Л., Холодова Ю.Д. / Губский Ю.И., Примак Р.Г., ЧабанныйВ.Н., Кендрук Н.Л., Мозжухина Т.Г.j Ленчевская Л.К., Вистунова й:е. , Миронова В.Н., Саад Л.М., Шатурский я.т., Шайлий В. И. Биохимические характеристики фракционированного хроматина

-22. печени крыо в условиях экспериментального д-гиповитаминоза и при введении препаратов стероидов // Укр. биохим. журн. - 1993.-Т. 65, N 1.-С.28-36.

2. Губсккй Ю.К., Левицкий Е.Л., Холодова Ю.Д., Горюшко А.Г.. Примак Р.Г., Вистунова И.Е., Саченко Л.Г. Механизмы генопротек-торного действия препарата на основе фитоэкдистероидов (БТК-8Л) в условиях повреждения хроматина тетрахлорметаном // Там же. -1993.-Т. 65, N 6.-С.75-83.

3. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Примак Р.Г., Горюшко А.Г., Ленчевская Л.К., Вистунова И.Е., Матюшкин В.А., Саченко Л.Г. Влияние витамина Е на структурно-функциональную организацию хроматина печени в'условиях повреждения тетрахлорметаном // Биополимерь и клетка. -1993.-Т. 9, Н 3.-С.27-34. t

• 4. Чабанный В.Н., Левицкий Е.Л., Губский Ю.И., Холодова Ю.ДЛ Вистунова И.Е., Вудмаска М.И. Генопротекторный эффект препаратов на основе зкдистероидов при отравлении крыс тетрахлорметаном и хлорофосом // Укр. биохим. журн.: - 1994.-Т. 66, N 5.-С.67-76.

5. Губский Ю.И., Левицкий Е.Л., Кулик И.А., Горюшко A.F., Примак Р.Г.; Саченко Л.Г., Вистунова И.Е. Изучение генопротектор-ных j свойств препарата "Флараксин" в условиях повреждающего действия; тетрахлорметана // Биополимеры и клетка.' - 1995.-Т. 11,. N 1.-С.70-81.! '

i б. В1стунова 1.6. Вшша 61одоПчно-активно! речовини на ос-нов1' ф1тостеро!д1в БТК-8Л на структурово-функц1йну орган1зац1г хроматину печ1нки щур1в 8а !нтоксикац!1 тетрахлорметаном // Укр. науково-медичний молод1жний журн. - 1995. - N 3. - С.27-28.

7. В1стунова I.S. Механ1зми генопротекторно! д11 препарату БТК-8Л в ■ уювах пошкодження хроматину тетрахлорметаном // Школа академ1ка 0.I.Черкеса: 1деТ, роввиток, перспективи: Наук. конф.,

i ; • i i i ■ !

I

t

i

присв'ячена 100-р1ччю а дня народження акад. 0.I.Черкеса (3-5 травня 1994 р., м.Ки'1в). - К., 1994.- С. 160.

Vistunova г. Ye. Mechanisms of gen-protection action of antloxydant and steroid preparates at tetrachlormethane damage of liver. Dissertation for degree of candidate of biological science (manuscript). Kiev, Institute of gerontology of AMS of Ukraine, 1995. Speciality 03.00.04 - biochemistry.

7 scientific works, which content theoretical investigation in pharmacological biochemistry, are defended. Prophylactic using such preparates as vitamin E, flaraxin and BTK-8L allows to decrease structure's and function's damage of liver of tetrachloromethane intoxicled rats. In base of their gen-protective action may be, first of all, their antioxidant properties. Probably, defending properties of thease drugs are realized owing to their binding with components of chromatine fractions.

Вистунова И.E. Механизмы генопротекторного действия препаратов антиоксидантов и стероидов в условиях повреждения печени тет-рахдорметаном: Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киев, Институт геронтологии АМН Украины, 1995.

Защищается 7 научных работ, которые содержат теоретические исследования по фармакологической биохимии. Установлено, что профилактическое введение таких препаратов, как витамин Е, фларак-син, БТК-8Л позволяет в значительной мере уменьшить поврежденние структуры и функций хроматина печени интоксицированных тетрахлор-метаном животных. В основе генопротекторного действия могут лежать, прежде всего, антиоксидангные свойства данных препаратов. Защитные свойства препаратов реализуются , вероятно, воладотвие их свяоывания с компонентами фракций хроматина.

Кятов1 слова: генопротекторна д!я,антиоксиданти, репресова ний та транскршщ1йно активний хроматин, 61олог1чно активн! речо вини, в!там1н Е, флараксин, ф1тоекдистеро!ди, БТК-8Л.