Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм электротранслокации ДНК через клеточную мембрану

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм электротранслокации ДНК через клеточную мембрану"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.352.336

КЛЕНЧИН Вадим Александрович МЕХАНИЗМ ЭЛЕКТРОТРАНСЛОКАЩИ ДНК ЧЕРЕЗ КЛЕТОЧНУЮ МЕМБРАНУ 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1992

Работа выполнена в отделе биоэлектрохимии Института электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН

Научный руководитель: член-корреспондент РАН

Ю.А.Чизмаджев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

А.В.Зеленин

А.А.Булычев

Ведущая организация: Онкологический Центр РАМН

Защита состоится

24

1992 Г. В

часов на

заседании Специализированного совета К.053.05.68 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленгоры, МГУ, Биологический факультет, ауд. ЛИК-5

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан апреля 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Трансакция клеток, опосредуемая импульсами электрического поля высокой напряженности электротрансфекция - является в настоящее время наиболее универсальным и эффективным способом введения в клетки чужеродной ДНК. Этот метод широко используется во всех областях применения генноинженерной технологии - как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. В то же время, сам механизм электротранслокации ДНК через плазматическую мембрану клетки неясен,.что отражает недостаточное понимание механики,> поведения и взаимодействия биологических мембран и ДНК в сильных электрических шлях. Кроме того, дальнейшее повышение эффективности метода (возможности чего, по всей видимости, ограничены без понимания механизма процесса) особенно необходимо для решения таких, актуальных задач, как генная терапия, клонирование генов, основанное на их функциональной актиг :ости и получение трансгвнных злаков.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение электротранслокации ДНК в клетки в терминах физических основ явления, в связи с чем были поставлены следующие задачи.

1. Изучить характер влияния на электротрансфекцию клеток млекопитающих различных фйзико-химических факторов.

2. выявить двияущие силы электротранслокации ДНК через мембрану.

3. Охарактеризовать взаимодействие ДНК и мембраны в. ход? электротрансфэкции клеток животных.

Научная новизна и практическая ценность работы. .. Впервые проведено систематическое исследование электротрансфекции клеток животных. Показано, что осмотические процессы не играют какой-, лбо существенной роли в процессе электротранслокации. Продемонстрировано и изучено новое явление ЛШ-зависимого увеличения электропермеаоилизации клеток. Доказана гипотеза об электрофоретическом движении ДНК как то меньшей мере одной из движущих сил процесса. Полученные знания помогают рационально под юдить к оптимизации экспериментов по. электротрансфекции конкретного т,да клеток и позволяют повысить эффективность метода в целом.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всесоюзном совещании по биоэлектрохимии мембран <Рига, 1990), на конференции молодых ученых ИЭЛ РАН им. А.Н.Фрумкина (1990), на Международной конференции по биофизике трансмембранных электрических полей (Элкридк, США, 1990), на объединенном съезда Обществ Биофизики и Молекулярной биологии США (Хьюстон, 1992 j.

Публикации. По теме диссертации опубликовано Б работ.

Структура и объем диссертации.. Диссертация , состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа -.," изложена на 84 страницах машинописного текста, включая 2.таблицы и 21 рисунок. Список цитируемой литературы включает 162 ссылки. \

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . .

I. Материалы и методы. В работе были использованы клетки почек зеленой мартышки Coe-1 (Glusman,. 1981) и плазмида рСНИО Pharmacia, Швеция), несущая ген ß-галактозидазы Е. coli. Клетки культивировали в среде ДМШ с 10.« эмбриональной - сыворотки теленка ,

- э -

в атмосфере Ъ% COg. Плазмвду из клеток Е. coli экстрагировали щелочным лизисом с последующим осаждением полиэтиленгликолем (Hattori, Sasaki, 1986). Использовали также коммерческие препараты ДНК фага К (Олайне, СССР) и ДНК тимуса теленка (Sigma, США).

Электротрансфе.сцию клеток в суспензии проводили с использованием специально сконструированного высоковольтного генератора в основном в ячейках цилиндрического типа (Агаркова и др., 1987) в стандартном фосфатно-солевом буфере без кальция и магния (ФСБ) при концентрации клеток 1-2 млн/мл и плазмиды 10-50 мкг/мл. Проводили электрообработку одним прямоугольным импульсом амплитудой 3,5 kB/см и длительностью 100 же. До электрообработки и за 10 мин до последующего рассева в ростовую среду клет.еи инкубировали с ДНК 10 мин при комнатной температуре. В экспериментах, требующих быстрого добавления реагентов, использовали ячейки кюветного типа (Potter et al., 1984).

Для электротрансфекции клеток в монослое на проводящей подломсе использовались ячейки, идентичные описанным для электрослияния в монослое Сухаревым и др. (1990). Электрообработку проводили так же, как в случае суспензии клеток, но при параметрах импульса 2,75 кВ/см; 100 мке и концентрации плазмиды 30 мкг/мл.

Эффективность трансфекции (ЭТ) определяли по активности ß-галактозидазы через 48 ч после эксперимента стандартным колориметрическим методом (Ал et al., 1982) и выражали в единицах удельной активности на живую клетку (живыми считали все клетктг, прикрепленные к пластику к моменту определения ЭТ).

Измерение электропермеабилизации клеток проводили при поме л красителя Люцифера Желтого (JDK) или флуоресцеинизотиоцианат

декстранов различных молекулярных' масс (ФД-4, 20, 40, 70 кДа), добавляемых к клеткам до или после электрообработки в присутствии или отсутствии ДНЕ. . В. экспериментах по ДНК-зависимой электропермеабилизации после оптимизации, условий использовалась концентрация тимусной ДНК 100 мкг/мл-и импульс 1,5 кВ/см; I мс. После электрообработки и 10 мин инкубации с красителем в ФСБ следовала инкубация 1ч в полной ростовой среде с последующими промывками 3 раза средой и один раз ФСБ. Флуоресценцию измеряли при длинах волн возбуждения 428, 488 нм и испускания 540, 520 нм для Я и ФД, соответственно. Использовавшаяся в работе линейная форма рснио была получена рестрикцией по EooRl-сайту, линейная -форма ДНК фага Л. - нагреванием до 68°С с. последующим охлаждением во льду, фрагментированная тимусная ДНК - пропусканием нативней ДНК 20 раз через иглу М9.

В двухимпульсной методике электрообработки использовали установку из двух синхронизованных генераторов, что дало возможность обрабатывать клетки сначала - импульсом 6 тсВ/см; .10'. мкс, а затем импульсом 0,2 кВ/см различной длительности так, что время между подачей импульсов могло точно задаваться в диапазоне 10 МКС - 100, с. ■

Измерение проводимости клеточных осадков с использованием . схемы компенсации проводили согласно Абидор. и др. (1989) при концентрации тимусной ДНК , 100. мкг/мл с лараметраметрами порирующего импульса 3,5 кВ/см, 100 ше и тестирующих импульсов 10 В, I мс при частоте 100 Гц. ';; .

II. Электротранслокация ДНК через мембрану клеток млеко--... питающих: основные закономерности. ' Измерение •эффективности трансфекщш (ЗТ) в единицах удельной активности р-галактозидазы

на выжившую клетку позволило разделить эффекты электрического поля на электротранслокацшо ДНК и на жизнеспособность клеток. Показано,. что ЭТ линейно зависит от концентрации плазмиды по меньшей мере до 60 мкг/мл. Таким образом, экспериментальная система адекватна поставленной задаче - определение ЭТ позволяет судить о количестве проникшей в клетку ДНК.

Проведена экспериментальная проверка гипотез о механизме электротранслокации ДНК через мембрану:

I. ДНК: диффундирует в клетку через долгоживущие поры из объема (Neumann et al., 1982) или из преадсорбированно^о состояния (Xie. and Teoiig, 1990);

2 ДНК • увлекается в клетку вместе с потокам воды коллоидно-осмотической (Stopper et al., 1987) и. л электроосмотической природы (Dimitrov and Sowers, 1990);

3. ДНК проникает в клетку под действием электрофоре-ТИЧескоЙ СИЛЫ (Winterbourne et al., 1988).

Показано, что электротранслокация ДНК через мемОану -чрезвычайно быстрый процесс. Так, добавление ДНК к клеткам немедленно после их,электрообработки вызывает падение ЭТ на два порядка (рис. I), а быстрое добавление ДНК-азы к клеткам, обработанным в присутствии" ДНК, не • влияет на ЭТ (рис. 2). Повышение температуры приводило к увеличению ЭТ, в то время как хорошо ' известно, . что время жизни пор резко падает с ростом

ор

температуры. С помощью Р-меченой полноразмерной плазмиды показано отсутствие измеримой адсорбции ДНК на клетках вне зависимости от времени предынкубации.

■Все изложенные результаты противоречат предположению < простой диффузии ДНК через образующиеся поры.

При злектрообработке в условиях, предотвращающих коллоидно-

эт

иреия, мин

Рис. I. Зависимость эффективности трансакции от времени добавления плазмиды к клеткам до и после наложения импульса.

осмотическое набухание клеток (легкая гипертоничность среды электрообработки за счет добавления нейтрального полисахарида, плохо проникающего через поры), ЭТ не изменяется. Следовательно, коллоидно-осмотические процесы не играют существенной роли в электротранслокации ДНК.

Роль электроосмотического потока воды и электрофореза ДНК -векторных процессов, зависящих от направления электрического поля, изучалась в специальной системе электрогрансфекции клеток, растущих на проводящей подложке. В такой системе возможна электрообработка клеток импульсами поля, направленного по нормали ч плоскости монослоя так, что ДНК при этом находится только с одной стороны (; ;:с. 3). Полученная 10-кратная разница между ЭТ при различных полярностях импульсов однозначно свидетельствует о

ЭТ

Рис. 2. Влияние ДНКазы на эффективность трансфекции. К суспензии клеток, содержащей ДНК, добавляли ДНКазу до концентрации 0.5 мг/мл и МёС12 до концентрации 5 мМ за 3 с (а), через 3 с (б) и через 20 с (в) после наложения импульса; г -добавляли только

важной роли электрофореза ДНК, но не электроосмотического потока воды, в электротранслокации ДНК, так как соответствующие потоки в данном случае направлены противоположно (рис. 4),

Существенная роль электрофореза ДНК показана также при электротрансфекции в условиях его частичного ингибирования: как повышение вязкости среды за счет фиколла-400, так и снижение эффективного заряда ДНК за счет экранировки фосфатов ионами магния вызывали ингибирование электротрансфекции (рис. 5). Контрольные эксперименты показали, что не стимулирует

адсорбции ДНК на клетках и не изменяет электропорации клеток, л эффект фюсолла не связан со снижением диффузии ДНК до электроооработки. Отметим, что в присутствии фиколла ЭТ снижается

+

+

ЭТ = 6.3 ЭТ - 65,4

Рис. 3. Схема электротрансфекции клеток в монослое и результаты эксперимента. Стрелками показано направление электрофореза ДНК, цифрами - значения ЭТ при соответствующих полярностях импульсов.

настолько же, насколько возрастает вязкость 'среды. Этот факт является дополнительным аргументом против гипотезы о латеральной дифф!зии преадсорбированной ДНИ, так как в последнем случае диффузия зависела бы от подвижности компонентов мембраны и от локальной вязкости у ее поверхности, но не от вязкости раствора в объеме.

Специальная двухимпульсная электрообработка клеток позволила разложить роль электрического поля при электротрансфекции на два эффекта: порообразование и электрофорез ДНК. Как импульс высокой амплитуды и малой длительности (6 . кВ/см, : 10 ' мкс "порообразующий"), так и импульс низкой' амплитуды, но большой длительности (0.2 кВ/см, 10 мс - "электрофоретический") были неэффективны в электротрансфекции сами по себе, в то время как

электрофорез

+

Рис. 4. Силы, действующие на ДНК вблизи поры в ходе импульса. Электрофоретичеекая сила направляет ДНК к положительно заряженному электроду, в то время как электроосмотический поток воды направлен в противоположную сторону.

двухимпульсная обработка, ведущая к рождению пор и последующему электрофоретическому движению ДНК в поры, приводила к росту ЭТ на порядок (рис. 6). Из рис. 6 видно также, что поры, "компетентные" к действию второго импульса, являются долгоживущими - характерное время их жизни больше 10 с. Важно отметить, что обращение последовательности импульсов (сначала - "электрофоретический", не способный рождать поры) приводило к тому же результату, как и в случае обработки одним "электропорирукщим" импульсом. В другом эксперименте, добавление ДНК в промежутке мевду импул1_ гат (н > что требовалось 2 с)- давало чрезвычайно низкий уровень трансфекции. Следовательно, если электрофорез ДНК действительно является движущей силой электротрансфекции, то тот факт, что

ЭТ, усл. ед.

75-

50-

25 -

I.

0

5

10

концентрация добавок

Рис. 5. Зависимость эффективности трансакции от концентрации фиколла-400 (в процентах в/о) и М£С12 (в мМ) в среде олектрообработки. Открытые столбики ,- МвС12, заштрихованные столбики - фиколл.

наличия "нормальных" пор и электрофоретической силы недостаточено для транслокации ДНК, указывает на то, что ДНК влияет на электропорацию в ходе первого импульса

Таким образом, изложенные результаты доказывают , что . электрофорез ДНК участвует в ее электротранслокации в клетку, но не дают возможности однозначно утверждать, что именно электрофорез * ДНК обусловливает . электротранслокацию. Альтернативным предположением может служить утверждение, что электрофоретическая сила действует как фактор, только концентрирующий ДНК вблизи поверхности клетки, тогда как проникновение в клетку происходит диффузионно за короткое (менее 2 с) время после импульса.

эт

15 -

10 -

5

только первый импульс

—L-LH-iua—| I ини—| I ищи—| IIIIIH—I i шва—'■ : um»_i I щчн , i i Ulm

0.0001 0.01 1 100 время между импульсами, с

Рас. 6. Зависимость эффективности тренсфекции от времен"■ задержки между двумя импульсами в двухитульсной системе. Пунктиром показан, уровень ЭТ при наложении лишь первого, "электропорирующего" импульса.

III. Взаимодействие ДНК с мембраной при электротранслокации: влияние ДНК на электропермеабилизацию клеток. Специальная

серия экспериментов, проведенная с целью проверки предположения о влиянии ДНК на электротерапию, показала, . что электрообработка клеток в присутствии ДНК ведет к увеличению проницаемости клеточной мембраны как для низкомолекулярных веществ (флюоресцентный краситель Люцифер Желтый), так и для высокомолекулярных (дексграны определенных размеров). Этот эффект зависит от размеров ДНК (рис. 7) и от ее концентрации (в диапазоне концентраций ДНК от I до 100 мкг/мл наблюдается 4-х-кратный рост захвата декстрана с молекулярной массой 4 кДз).

Рис. 7. Зависимость электроиндуцируемого захвата клетками ФД4 (открытые столбцы) и ФД20 (заштрихованные столбцы) от размера ДНК: плазмида рСН110 (7,2 т.п.о.) или ДНК фага Л, (48 т.п.о.) при концентрациях I и 7 мкг/мл, соответственно.

.ДНК-стимулируемый рост проницаемости мембран выражен тем сильнее, чем меньше размер зонда и не наблюдается для декстранов с молекулярной массой больше или равной 40 . кДа (рис. 8). Этот результат означает, по-видимому, что эффективный диаметр пор на временах 1-2 сек (оцениваемое характерное время диффузионного проникновения ФД в клетку) находится в диапазоне 3,3-4,8 нм. В токе время, зависимое от ДНК изменение свойств пор ..вляется долгоживущим: эффект наблюдается и в случае добавления красителя к клеткам по меньшей мере 1|5 мин поело обработки (рис. 9).

Электрофорез ДНК врвлечен в наблюдаемый . рост электропермеабилизации клеток: в системе двухимпульсной обработки захват флуоресцентного зонда прямо коррелирует с захватом ДНК при

Рис. 8. Влияние тДНН (0,1 мг/мл) на индуцируемую электрообработкой проницаемость клеток для ФИТЦ-декстранов различных размеров. В отсутствие ДНК (заштрихованные столбцы) интенсивность флюоресценции везде принята равной единице.

элекгротрансфекции (рис. 10, ср. с рис. 6).

Неспецифичность обнаруженного феномена подтверждена изменениями проводимости клеточных осадков, сформированных из суспензии, содержащей или не содержащей ДНК. Как видно из табл.1, в присутствии ДНК прирост тока через осадок после электропорации (5 с после импульса) и сопротивление осадка после залечивания пор (500 с после импульса) выше, чем через контрольный осадок. Поскольку рост сопротивления осадка есть следствие коллоидно-осмотического набухания клеток (Абидор и др., 1989), очевидно, что оба измеряемых параметра отражают рост проницаемости мембран, то есть принципиально эффект взаимодействия ДНК с порами наблюдается и в этой системе.

Таким образом, из представленных результатов следует, что

Рис. 9. ДНК-зависимый рост электропермеабилизации: эффект добавлена ФД-20' • после электрообработки. Пунктиром показан уровень флуоресценции в контроле без импульса.

при электрообработке клеток шесте с ДНК наблюдается силовое взаимодействие ДНК с мембраной, ведущее к долгоживущему изменению свойств пор - происходит либо рост их диаметра, либо увеличение временг их жизни, либо и то и другое.

Имея ввиду, что (а) ДНК эф^зктивно проникает в .клетки только в тех же условиях, в которых она вызывает рост проницаемости мембран и что' (б) проникновение ДНК в клетку зависит от ее электрофорстическоро движения, можно- заключить, что именно электрофорез является движущей силой электротранслокации ДНК через мембрану. Действительно, мсасно допустить, что роль электрофореза ДНК сводится лишь к концентрированию ДНК вблизи поры, а проникновение происходит диффузионным образом. Однако в этом случае невозможно объяснить, каким образом диффузия ДНК

100

50

контроль ОД мс 1с 100 с

Рис. 10. Проницаемость клвтск для СД-4 после дзузшмпульсной обработки: влияние тДНК (0,1 мгЛ'л) и врекэки задержки между импульсами. Открытые столбцы - в присутствии ДНК, закрытые - в ее отсутствии. Контроль ~ результаты, лолучекнно при обработке только ОДНИМ ЕЫССКОВОЛЬТНЫМ ИМПУЛЬС СМ.

Таблица I. Влияние ЕЯ на электрсгорацию клэточных осадков

Захват <Т>Д, усл. ед.

1 Л ■:

ря ж ' 1 * »тгг^тгп

1 ЯМ ШЗ ;1 ш!

ПорирующиЯ импульс, .'г Добавление ДНК Прирост тока, 1лА Сопротивление осадка, кО;д

0,31 1,85

+ 0,76 2,05

3 0,-39 2.С-5

+ 1,П 3,82

через пору едоль. кардинально изменяет свойства пор по меньшей мере на 1,6 мин (рис. 9) - гораздо большее время, чэк требуется для проникновения ДНК в. клетку (максимум 3 с - рис. 2), тогда как идея об электротранслокации ДНК под действием алоктрофоретической силы естественны^ образом объясняет все полученные результаты.

В рамках это? модели возможны следующие гипотетические пути транслокации ДНК в' клетку: ДНК, ориентированная в электрическом поле проходит через пору в виде сильно вытянутой глобулы; ДНК, затянутая различным?; участками в несколько пор, "разрезает" участок мембранц' между порами; ДНК индуцирует инвагинацию мембраны, которая зцтеад отшнуровывается внутрь клетки.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны оригинальные методики электротрансфекции клеток млекопитающих: ,электротрансфвкция клеток в монослое импульсами электрического поля, направленного по ■. нормали, к плоскости-монослоя, и эадтротранофекция двумя последовательными неодинаковыми импульсами,

2. Доказано, что ни предварительная адсорбция ДНК на поверхности клетки, ни осмотический поток -воды в клетку, ни диффузия ДНК не играют существенной роли в процессе электротранслокации ДНК . в клетки млекопитающих,

3. Движущей силой электротранслокации ДНК через мембрану клеток -млекопитающих является электрофорез ДНК.

4. Показано, что перенос ДНК внутрь клетки под действием влектро-форетической силы сопровождается силовым взаимодействием ДНК и клеточной мембраны. Результатом этого взаимодействия является повышение, эффективного диаметра и/или времени жизни мембранных электропор. ''•''■

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЯ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кленчин В.А., Серов С.М., Сухарев С.И., Черномордик Л .'В., Чизмаджев Ю.А. Электрофорез ДНК играет важную роль в электро-индуцируемом захвате ДНК клетками//Биол. мембраны. -1990. -Т.7, М. -С.446-447. '

2. KlenChin Y.A., Sukharev S.I., Sarcv З.М., №evnomordik L.Y., Ch'izmadzhev Yu.A. Electrically induced D!;A uptake by cells is fast process involving ША electr-ophoresis//Biophya. <J. -1991. -V.60, #4. -?.804-811.

3. Кленчин В.А., Серов C.M., Сухарев С.И., Черномордик Л.В.,-Чизмаджев Ю.А. . Электрофорез ДНК играет' важную роль в электроиндуцкруемой транслокации ДНК в клотки//Биол. мембраны, -1991. -Т.8. Ш7. -С.769-777.

4. Сухарев С.И., Кленчин'В.А., Серов С.М., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю.А. О механизме электроиндуцируемого переноса ДНК через плазматическую мембрану: взаимодействие ДНК с электропорами при электрофорезе в клетку//Биол. мембраны. -1992. -Т.9, JM . -С.405-419.

'5. Sukharev 5.1., Klenohin Y.A., Serov S.H., Chernomordik L.Y., Chizmadzhev Уц.А. Eleotroporation and electrophoretic MA. transfer into cells: the effect of DNA int eleotroporesZ/Biophys. J. -1992, в печати.

Подписано в печать /3. О и 199.fr.___ 3 ак Тир 400

Л1АЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»