Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Меченный фосфором-32 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат - ингибитор репликации ВИЧ, его получение и метаболизм в клетке

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Меченный фосфором-32 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат - ингибитор репликации ВИЧ, его получение и метаболизм в клетке"

российская академия наук институт молекулярной биологии им в а энгельгардта

На правах рукописи

январьв дмитрий васильевич

МЕЧЕННЫЙ ФОСФОРОМ-32 3'-АЗИД0-3'-ДЕ30КСИТИМИДШ1-5'-ХОЛИНФОСФАТ - ИНГИБИТОР РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ, ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ В КЛЕТКЕ

Специальность 03 00 03 - м(пекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

003069695

Работа выполнена в Лаборатории химического и биочогического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель.

кандидат химических наук Широкова Е А

Официальные оппоненты:

Туницкая В Л доктор химических наук

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Лебедев Ю Б доктор биологических наук

Институт биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова

Ведущая организация

Институт молекутярной генетики РАН

Защита диссертации состоится «/£»¿^>^2007 года в час ¿-о мин на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «» д^/^у^-Г 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Крицьш А М

Актуачьпость проблемы В 2006 году в мире насчитывалось более 70 млн человек ВИЧ - инфицированных и ежедневно их число увеличивается на 10-14 тысяч В настоящее время в терапии СПИД используется большой набор лекарств, но ни одно из них не приводит к потному выздоровлению Все усилия ученых направлены на перевод заболевания СПИД из разряда смертельных в разряд пожизненных заболеваний Основными мишенями для анти-ВИЧ агентов являются два ВИЧ-специфических фермента - обратная транскриптаза и протеаза. Одними из основных требований, предъявляемым к антивирусным соединениям - это селективное подавление фермента-мишени и минимальная степень участия во внутриклеточном метаболизме Сегодня в клинической практике применяют более 10 различных препаратов нуклеозидной природы, ориентированных на взаимодействие с вирусной обратной транскриптазой Однако высокая мутабельность вируса приводит к развитию резистентности к применяемым препаратам, что вызывает необходимость увеличения их дозы, и, как следствие, усилению токсического действия лекарства Применение комбинаций препаратов лишь замедляет эти процессы, поэтому потребность медицины в новых эффективных препаратах крайне высока Одним из путей повышения эффективности анти-ВИЧ соединений является структурная модификация препаратов, используемых в терапии ВИЧ-инфекции Этот подход оказался достаточно успешным и позволил получить соединения, эффективность которых превосходила таковую родительских нуклеозидов Ботыпой интерес представляет производное азидотимидина, модифицированное по 5'-положеншо, а именно, 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат Оно содержит холинфосфатную группу, которая входит в состав многих природных соединений и потому не вносит вклада в токсичность Кроме того, из-за наличия положительно заряженной аминогруппы и отрицательно заряженного фосфата оно является цвиттер-иопом и занимает промежуточное положение между заряженными и незаряженными соединениями Активность 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата в клетках МТ-4, инфицированных ВИЧ-1, оказалась почти в 60 раз выше таковой З'-гзидо-З'-дезокситимидина (АЗТ) Важно было выяснить причины повышенной активности этого соединения, изучив его метаболизм в клеточных культурах Подобные исследования могут способствовать выработке стратегии направленного синтеза новых эффективных анти-ВИЧ препаратов

Цель работы. Исследование внутриклеточного метаболизма З'-азидо-З'-дезокситимидик-5'-холинфосфата (ХФ-АЗТ) для установления причин повышения анти-ВИЧ активности Задачи1

- Разработать эффективный метод синтеза [32Р]-меченого ХФ-АЗТ, используя Нз32Р04 в качестве исходного радиоактивного соединения

- Изучить динамику проникновения ХФ-АЗТ через цитоплазматическую мембрану эукариотических клеток и сравнить с динамикой родительского АЗТ

- Исследовать состав и распределение внутриклеточных метаболитов ХФ-АЗТ и установить ферменты, отвечающие за внутриклеточную деструкцию исследуемого соединения

Научная новизна работы Предложен эффективный метод получения нуклеозид [5'-32Р]-монофосфатов высокой молярной активности из защищенного нуклеозида и [32Р]-ортофосфорной кислоты в присутствии ВгСМ, на основе которого разработан метод фосфорилирования АЗТ Разработана схема этерификации 32Р-меченных монофосфатов первичными спиртами в присутствии ВгСМ как конденсирующего агента При использовании ВгСИ возможен синтез фосфодиэфиров без выделения промежуточного фосфомоноэфира При этом, в случае спиртов со сравнимой нуклеофильностью гидроксильных групп, избыток одного из спиртов должен бьггь больше 100, а для спиртов, значительно отличающихся по степени нуклеофильности гидроксильных групп, этот избыток не более 2-3 раз Изучена динамика проникновения исследуемого ХФ-АЗТ в клетки НЬ-60 Установлен состав продуктов клеточного метаболизма ХФ-АЗТ и их внутриклеточная локализация Показано включение радиоактивных метаболитов в липиды клеточной мембраны Сделаны предположения о причинах повышения анти-ВИЧ активности исследуемого соединения по сравнению с АЗТ и о ферментах, отвечающих за деструкцию соединения в крови и в клетках Практическая пенность работы Разработанные химические методы позволяют получить широкий ряд производных нуклеозид 5'-монофосфатов, содержащих радиоактивный изотоп фосфора (как 32Р, так и 33Р) Результаты, полученные при исследовании метаболизма ХФ-АЗТ в клеточных культурах, могут быть использованы для направленной модификации клинически применяемых антивирусных препаратов в целях повышения их терапевтического индекса

Апробация работы Основные результаты работы были доложены на VII Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века»

(Пущино, 2003), Международной конференции для молодых учёных и аспирантов по молекулярной биологии «50 лет двойной спирали» (Киев, Украина, 2003 г), Международной конференции «Химические и биологические проблемы протеомики» (Новосибирск, 2004 г), VII Международной Энгельгардтовской конференции (Суздаль, 2004 г), XI Международной шкоте-конфсрснции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2005 г)

Публикации По материалам работы опубликовано 2 статьи

Объем диссертации Диссертация изложена на _ стр машинописного текста и

состоит из введения, обзора литературы «Методы получения нуклеозидмонофосфатов и возможность их применения для синтеза [32Р]-меченых нуклеотидов», обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов

содержание работы

Синтетические аналоги нуклеозидов широко применяются в медицинской практике для терапии вирусных инфекций Механизм их действия основан на внутриклеточном фосфорилировании до соответствующих трифосфатов, которые после включения в цепь вирусной ДНК терминируют ее биосинтез Вследствие этого эффективность подавления вируса определяется несколькими факторами, в частности, способностью вещества проникать в клетки, эффективностью внутриклеточного фосфорилирования нуклеозида до трифосфатного производного, и способностью модифицированного нуклеозид 5'-трифосфата распознаваться вирусными ДНК-полимеразами Одним из направлений в создании более эффективных антивирусных агентов нуклеотидной природы является модификация известных синтетических аналогов с целью снижения их токсичности, улучшения их проникновения в клетки и/ити прочонгации действия Такой модифицированный нуклеозид in vivo (в клетке или в организме) превращается в исходный «материнский» нуклеозид и далее воздействует на репликацию вируса по известной схеме Удачным примером такого подхода может служить 5'-Н-фосфонат З'-азидо-З'-дезокситимидина (Нюсавир®, Фосфазид), который уже несколько лет используется в России в ВИЧ-терапии как менее токсичный и более эффективный аналог З'-азидо-З'-дезокситимидича (Зидовудин®, АЗТ) [Skoblov et al Antiviral Res 2004,65,107-113]

СН3

О

II

CH3-+N-CH2— CHz-O-lj'-O ¿Нз О"

О"

Thy

N3

(1)

Ранее нами было показано, что целый ряд производных АЗТ, содержащих модифицированную фосфатную группу в 5'-положении, на культуре клеток проявляет способность подавлять развитие ВИЧ более эффективно, чем исходный АЗТ Одним из таких соединений является 5'-холинфосфат АЗТ (1), который по анти-ВИЧ активности значительно превосходил АЗТ (1С50ХФ"АЗТ =0,3 нМ, 1С5оАЗТ=17 нМ, клетки МТ-4, инфицированные ВИЧ-1, детекция по подавлению антигена р24) [Shipitsyn et al РСТ WO 2004/011480 Al, 05 02 2004] Очевидно, что анти-ВИЧ активность этого соединения обусловлена его способностью превращаться в клетке в АЗТ 5'-трифосфат При этом, соединение (1) может бьгть источником как АЗТ, так и АЗТ 5'-монофосфата. Чтобы изучить его метаболизм при наномолярных концентрациях, нам было необходимо синтезировать диэфир (1), меченный фосфором-32, с высокой специфической активностью (более 100 Ки/ммоль) Соединения, меченные радиоактивными изотопами фосфора, используют в научных исследованиях более 50 лет Высокая специфическая активность, простота детекции и доступность исходных соединений, содержащих 32Р-четку, стали основой для их широкого применения в структурно-функциональных исследованиях нуклеиновых кислот, молекулярной генетике и биотехнологии Использование радиоактивного изотопа фосфора позволяет изучить как внутриклеточные превращения фосфатной группы, так и изменения динамики проникновения препарата через клеточную стенку в наномолярных концентрациях, т е концентрациях, близких к концентрациям, при которых рост вируса ингибируется на 90% (IC90) В данной работе разработан метод синтеза з:Р-меченого (1) и представлены результаты изучения динамики его проникновения в клетки HL-60, исследований продуктов его метаболизма и возможных ферментов, участвующих в его внутриклеточной деградации

Синтсз 3'-азидо-2',3*- дидезокситичидин-[5'-32Р]-1!Олинфосфата (1)

Синтез соединений, меченных фосфором-32 высокой молярной (специфической) активности (более 100 Ки/ммочь), связан с рядом специфических проблем Во-первых, исходным радиоактивным сырьем является [32Р]-ортофосфорная кислота без носителя, и в ходе синтеза не должно проходить ее изотопное разбавление «холодным» ортофосфатом Во-вторых, масштаб синтеза (0,1-1,0 мкг фосфата) делает практически невозможным использование многих традиционных методов органического синтеза (например, кристаллизацию) и идентификации органических соединений (например, -ЯМР-слектрометрию) В-третьих, время синтеза должно быть максимально ограничено, так как в реакционной среде под воздействием высокоэнергетического ионизирующего излучения фосфора-32 быстро накапливаются побочные продукты

Возможны два подхода к синтезу целевого диэфира [32Р]-(1) (схема 1) Первый состоит в фосфорилировании нуклеозида с последующей этерификацией 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-[5'-32Р]-фосфата (2) холином Второй подход заключается в этерификации 32Р-ортофосфорной кислоты холином и последующей конденсации полученного [32Р]-хотинфосфата (3) с АЗТ

Схема 1. Подходы к синтезу целевого нуклеоткда [32Р]-(1)

О'

(СН3)3Ы(СН2)2-0-Р-0АЗТ

/{ [32рн1) ° .

Г . \ г

(СНз)зЙ(СН2)2-ОН+ НО-'р-ОАЗТ (СН3)31\|(СН2)2—о-^—он + АЗТ

° [32Р1-(2) [32Р]-(3)°

Схема, в которой продуктом первой стадии является нуклеозид мопофосфат[32Р]-(2), показалась нам более удобной, так как промежуточный нуклеотид легко детектировать и выделять ВЭЖХ

Наиболее распространенным химическим методом получения нерадиоактивных нуклеозидмонофосфатов является фосфорилирование нуклеозидов хлорокисыо фосфора Метод дает высокие выходы продуктов, слабо зависящие от природы нуклеозида Однако, при попытке применить этот подход к радиоактивному синтезу, исследователи столкнулись с радом трудностей, совокупность которых делает такой подход бесперспективным В частности, принципиально невозможно получить

необходимый фосфорилирующий агент с высокой молярной активностью прямым облучением нерадиоактивного РОС1з по реакции (п, у) Метод синтеза 32РОСЬ на основе [32Р]-ортофосфорной кислоты (основного источника изотопа 32Р) и нерадиоактивного пятихлористого фосфора приводит к значительному изотопному разбавлению полученного продукта, а невысокие выходы и необходимость работы с летучим радиоактивным веществом полностью сводят на нет выгоды от использования 32РОС1з как фосфорилирующего агента в синтезе меченых нуклеотидов

Поскольку единственным доступным в настоящее время источником радиоактивного фосфора без носителя является [32Р]-ортофосфорная кислота, нашей целью было подобрать активирующий агент для фосфорилирования модифицированных нуклеозидов, который способен обеспечить высокие выходы и минимальный набор радиоактивных примесей Кроме того, такой агент должен обеспечивать высокую скорость реакции, так как со временем в реакционной смеси накапливаются продукты свободнорадикальных реакций, индуцированных ионизирующим излучением

Мы использовали несколько конденсирующих агентов, широко применяемых в химии фосфорилирования нуклеозидов, а именно,

"О О

I I ___ 2,4,6-триизопропитбензотсульфохлорид(ТР8С1),

АЗТО—Р-О-Р-ОАЗТ '

¿О 14- морфолиноэтил- К'-циклогексил карбодиимид

(4) (МСС), Н>1'-дициклогесилкарбодиимид (ОСС) и

трихлороацетонитрил (ТСЫ) и сравнили выходы целевого монофосфата (2) и составы реакционных смесей в этих реакциях (таблица 1)

Таблица 1. Состав продуктов реакции фосфорилирования АЗТ [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии различных конденсирующих агентов

Конденсирующий агент Содержание компонентов в реакционной массе, %

(2) (4) Нз"Р04 ПП*

ТРБО 35 4 61 0

тек 15 0 84 1

ОСС 18 50 23 9

МСС 30 26 39 4

*Неидентифицированные примеси

Выбранное нами соотношение реагентов характерно для радиоактивного синтеза, в котором радиоактивная компонента используется в значительном недостатке

(к 1 экв [32Р]-фосфорной кислоты добавляли 100 экв АЗТ и 10 экв соответствующего конденсирующего агента) Столь значительный избыток нуклеозидной компоненты позволяет провести реакцию в условиях, при которых скорость реакции практически не зависит от изменения концентрации АЗТ, то есть в условиях реакции псевдо-первого порядка В случае применения ВЭЖХ такой избыток АЗТ не вызывает дополнительных потерь при выделении Использование 10 эквивалентов конденсирующего агента позволяет значительно повысить воспроизводимость реакции за счет нивелирования влияния качества растворителей и реактивов Реакции проводили в среде абсолютного пиридина при 18°С Ход реакции и выход продукта оценивали по ТСХ на силикагеле На рис 1 представлен радиоавтограф такой пластинки Точки отобраны в моменты времени, соответствующие максимальным выходам продукта [32Р]-(2) (15 мин для TPSC1,1 ч для TCN, 2,4 ч для DCC и 1,8 ч для МСС)

Выход фосфата (2), полученный нами в условиях классического синтеза Симонса с использованием TCN [Symons RH Methods Enzymology 1974, 29, 102-8] составлял 1-2% Замена растворителя (пиридин вместо DMSO) позволила существенно увеличить выход продукта (до 15%) и снизить количество побочных продуктов

Рис. 1. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммы (Кизельгель 60 F254) реакции фосфорилирования АЗТ [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии различных конденсирующих агентов (элюция в системе диоксан изопропанол вода 25% водный аммиак 3 3 3 1)

W) f ^

= ;

(2) В,

Jtk

Pi ш P £ II #

TPSC1 TCN DCC МСС BrCN

При использовании наиболее распространенного конденсирующего агента БСС так же как и его водорастворимой формы МСС, достигались сравнительно невысокие выходы целевого продукта [32Р]- (2) (20-25%) Кроме того, в этих реакциях

набтодалэсь образование значительного количества бис(азидотимидин)-[32Р]-

дифосфата (4) (до 50%)

В случае TPSC1 количество примесей было минимально, однако выход целевого

нуклеотида не превышал 30-32%

Поскольку ни один из изученных конденсирующих агентов не показал высокой

эффективности в реакции фосфорилирования АЗТ, мы исследовали возможность

использования в этом качестве BrCN - активирующего агента, который ранее

применяли для синтеза олигонуклеотидов [Shabarova et al Orig Life Evol Biosph 1997,

27, 555-66] Проведение реакции в присутствии BrCN в условиях, описанных выше для

других конденсирующих агентов, невозможно, так как авторами было показано, что в

среде абсолютного растворителя основным продуктом продуктом является дифосфат

(4) Использование N-алкилморфолинов в качестве основания нам показалось

неприемлемым, поскольку отмеченное авторами в этой работе расщеплепие третичных

аминов под действием BrCN приводит к нецелевому расходованию активирующего

агента и накоплению побочных продуктов Мы провели реакцию в 5 М водном

пиридине и получили монофосфат [32Р]- (2) с выходом 46% Выход дифосфата [32Р]- (4)

составит 4% Следует отметить, что существенное преимущество BrCN заключается в

том, что избыток этого реагента может быть полностью удален упариванием в вакууме,

что уменьшает потери при выделении продукта [32Р]-(2) до 1-2% Другим

преимуществом BrCN является крайне высокая скорость реакции Мы сравнили

динамику реакции фосфорилирования АЗТ в присутствии TPSC1 и BrCN в пиридине

при 20°С при оптимизированных соотношениях реагентов (рис 2 и 3)

Рис. 2. Динамика реакции фосфорилирования в присутствии TPSC1 а- неорганический фосфат, Ъ -продукт [32Р]-(2), с -продукт [3 Р]-(4) Суммарная радиоактивность реакционной смеси принята за 100%

100

Скорости этих реакций различаются, по крайней мере, на порядок Для реакции с ТРЭО оптимальное время реакции 10-20 мин, а затем выход незначительно уменьшается, вероятно, за счет процесса димеркзации монофосфата [32Р]- (2)

Рис. 3. Динамика реакции фосфорилирования в присутствии ВгСК а -неорганический фосфат, Ь -прод>кт [иР]-(2), с -продукт[32Р]-(4) Суммарная радиоактивность реакционной смеси принята за 100%

Время, мин

Скорость реакции в присутствии BrCN столь высока, что в начальной точке, которая реально составляет 10-15 с, наблюдается максимальный выход продукта [32Р]-(2) (46%) При этом количество примесей в этот момент времени минимально Дальнейшая инкубация снижает выход целевого продукта и увеличивает количество побочных продуктов Однако если увеличить время реакции до 20 минут, после чего провести кислотный гидролиз IM HCl реакционной смеси при комнатной температуре в течение 20 минут, то выход целевого монофосфата [32Р]-(2) увеличивается до 55-60%

Для оптимизации условий проведения реакции мы изучили влияние природы основания на скорость реакции и состав реакционной смеси Кинетика фосфорилирования АЗТ фосфорной кислотой была изучена в присутствии оснований с различным значением рКа см табл 2 где М.К-диметиламинопиридин (DMAP), N-метилимидазол (Mim), пиридин (Ру) и триэгичамин (рис 5) Таблица 2.

j амия триэтиламин Ру Mim DMAP

|РКа 10 78 5 17 6 95 9 70

В случае триэтиламина, имеющего самое высокое значение рКа в изученном ряду, конверсия фосфорной кислоты была самой низкой Напротив, в ароматическом

ряду с увеличением рКа основания конверсия фосфорной кислоты увеличивается, однако скорость реакции при этом понижается

Рис 5 Динамика расхода Нз32РС>4 (данные получены радиоавтографическим сканированием ТСХ) в присутствии различных аминов

Поскольку скорость реакций в присутствии гетероциклических аминов была ниже, чем

в случае алифатических третичных аминов, нам удалось проанализировать состав

продуктов реакции Ранее было показано (Fedorova О A et al Nucleosides Nucleotides

1996), что в результате такого взаимодействия происходит активация фосфорной

кислоты с образованием промежуточного цианата (Схема 2), который в водных

растворах крайне нестабилен и гидролизуется с образованием исходной фосфорной

компоненты СОг и аммиака На основании данных ЯМР и УФ спектроскопии мы

установили, что в случае применения гетероциклических аминов (Ру, MIm и DMAP)

образующийся цианат превращается в соответствующий фосфамид (5), который в присутствии спиртовой компоненты (в нашем случае АЗТ) претерпевает реакцию замещения с образованием фосфата (2)

Схема 2. Механизм этерификгции Н3РО4ШД действием BrCN в присутствии аминов

[Fedorova О A et al ] - q

-fc>- I

НП—Р

"О Rrw -О R-OH НО-Р—OR

I BfCN I g НО—P-ОН-J>~HO—P-OCN

A NR3 Д "О #

0 0 _^ I ^A3T

-HO—P-N4 -f>~ w

DMAP / о V

Mlm/Py (5)

Соединения (5a) и (5b) (Схема 3) оказались химически стабильными при рН 6-8, и это позволило выделить их методом ВЭЖХ Время полутидротиза производного пиридина (5с) в водных растворах составляет менее минуты (литературные данные), поэтому нам не удалось выделить его в свободном виде и охарактеризовать Физико-химические характеристики фосфоамидов (5а и 5Ь) совпали с описанными в литературе Схема 3

(5Ь) ~Ме (5с)

Таким образом, мы установили, что реакция этерификации фосфорной кислоты в присутствии ВгСК и гетероциклического амина состоит из следующих этапов активация фосфорной компоненты с образованием цианата, -замещение цианатной группы на остаток соответствующего гетероциклического амина с образованием фосфамида,

-нуклеофильная атака фосфоамида гидроксилом спиртовой компоненты и образование фосфоэфирной связи Учитывая полученные данные, можно утверждать, что наиболее эффективным активирующим агентом реакции фосфорилироваиия АЗТ [32Р]-ортофосфорной кислотой является ВгСК в присутствии ОМАР Метод с использованием этих реагентов можно рекомендовать для препаративной наработки 3'-азидо-3'-дезокситимидин-[5'-

32Р]-монофосфата (2) с высокой молярной активностью (>1000 Ки/ммоть) и загрузками до 20 мКи по радиоактивному сырью Этот метод был успешно применен нами для синтеза ряда других модифицированных нуклеотидов В частности, 5'-монофосфаты 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина, 2',3'-дидезоксиаденозина и З'-тиоцтидина были получены с выходами 30-40%

Можно отметить, что разработанный нами метод, без каких-либо модификаций, применим также к синтезу нуклеозидмонофосфатов на основе Нз33РС>4

Полученный АЗТ-[5'-32Р]-монофосфат (2) мы использовали для синтеза целевого диэфира [32Р]-(1) (схема 4) Следует отметить, что наши попытки провести синтез по схеме 4, не выделяя промежуточный [5'-32Р]-(2), оказались неудачными Из-за того, что реакционная способность ОН-группы холина ниже таковой для АЗТ, основным продуктом такого синтеза являлся дифосфат [5'-32Р] (4) (около 25%) Мы также обнаружили в реакционной смеси 8-10% бис-(3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин)-[5'-32Р]-фосфата Таким образом, перед проведением конденсации с холином необходима тщательная очистка продукта [5'-32Р]-(2) от АЗТ Применение многократных избытков холина, возможно, привело бы к образованию целевого диэфира [32Р]-(1), однако это невозможно в силу плохой растворимости его солей в абсолютных органических растворителях В воде фосфамиды (5а-Ь) гидролизуются, но скорость реакции гидролиза невелика (для (5Ь) Тш 40 мин) Применение водно-органических систем позволило создать высокие концентрации солей холиния в реакционной смеси (избыток спиртовой компоненты более 200 экв по отношению к [5'-32Р]-(2)) Мы исследовали растворимость ряда органических (2,4,6-триизопропилбензолсульфат, 2,4,6-триметилбензолсульфат, я-толуолсульфат, ацетат, пивалоат) и неорганических (СГ, Вг\ Г, СЮ/, ИОз") солей холиния Наибольшую растворимость в водно-органических системах (вода-пиридин, вода-ОМАР) показали соли арилсульфокислот,

несколько менее растворимыми бьпи иодид и перхлорат холиния Поскольку значительные избытки аниона арилсульфокислоты затрудняют хроматографию, мы использовали коммерчески доступный холиний иодид

Схема 4

ОН

32 | I, АЗТ

но—р—ОН -

II о

ВгСН 5М0МАРа„, 0°С

ОН

321

НО-Р—ОАЗТ II

0 (2)46% +

/ОН ч / 132 \ о4-р—ОАЗТ

1МНС1 >->-

холинии иодид

(2) 60%

'2 (4)22%

132Р]-(1)

12-15%

Фосфат [ Р]-(2) бьш этерифицирован 200-кратным избытком холина в условиях, описанных для первой стадии синтеза Выход целевого диэфира [32Р]-(1) на этой стадии составил 20-25%, однако, его суммарный выход не превышал 12-15% Варьирование температуры (0-37 °С), растворителя (1М-8М ОМАР в воде), соотношения ВгСЫ/(2) (20-200 экв) на второй стадии практически не влияло на выход [32Р]-(1)

В целях повышения выхода диэфира [32Р]-(1) мы реализовали другой путь, в котором промежуточным продуктом являлся хотиновый эфир фосфорной кислоты [32Р]-(3) (Схема 5) Схема 5

ОН

II о

холинии иодид

О

34 +

НО-?—0(СН2)2М(СНз)з

о

[32Р]-(3) ■

АЗТ.

132РМ1) 20-22%

Варьирование условий проведения первой стадии (таких, как соотношение реагентов, температура, время реакции) лишь незначительно сказывалось на выходе продукта этерификации, который сохранялся в пределах 25-30% Этерификацию нуклеозидом проводили без выделения 32Р -холинфосфата [32Р]-(3) Конденсация холинфосфата [32Р]- (3) с АЗТ протекала чрезвычайно эффективно - выход продукта [32Р]- (1) достигал 90% на этой стадии Кроме того, в реакционной смеси присутствовало около

10% монофосфата [32Р]- (2) Несмотря на эффективность второй стадии, суммарный выход синтеза не превышал 25%, что, тем не менее, значительно выше выхода синтеза по схеме 4 Молярная активность [32Р]- (1) составляла 1000 Ки/ммоль, радиохимическая чистота более 95%, что позволило провести ряд биохимических экспериментов по исследованию метаболизма этого соединения

Для получения физико-химических характеристик фосфоэфиров (1-4) и фосфоамидатов (5) были проведены их синтезы с индикаторным количеством радиоактивности (молярная активность 0 1 Ки/ммоль) Полученные соединения были выделены обращеннофазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме в условиях, аналогичных выделению целевых продуктов, и проанализированы методами УФ-, 'Н и 31Р ЯМР спектроскопии

Синтезированный [32Р]-(1) был использован как инструмент для изучения поведения в клеточных культурах соответствующего нерадиоактивного аналога

Изучение метаболизма в клетке.

Ранее было показано, что 3'-Азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат (1) проявляет высокую антивирусную активность на ВИЧ-инфицированных клетках МТ-4 Можно предположить, что повышение анти-ВИЧ активности этого соединения в клеточных системах связано с особенностями метаболизма, благодаря которым достигается увеличение концентрации внутриклеточного трифосфата АЗТ или с повышением скорости проникновения в клетки Найти ответ на этот вопрос мы попытались, используя радиоактивно меченые аналоги (1) и АЗТ, содержащие разные изотопы Такая комбинация позволяет провести изучение особенностей преодоления ими клеточных мембран в условиях одного эксперимента Кроме того, мы поставили задачу установить, является ли диэфир (1) источником внутриклеточного АЗТ или АЗТ-монофосфата На этот вопрос однозначно можно ответить, только заменив атом фосфора его радиоактивным изотопом

Мы начали исследования с изучения динамики проникновения соединения (1) в клетки В качестве модели была выбрана линия клеток НЬ-60 Динамика проникновения радиоактивности в клетки отражена на рис 6

Из рисунка видно, что количество радиоактивности в клетке в течение 24 ч постоянно нарастает, т е кривая проникновения не имеет явной области насыщения Для объяснения этого факта мы изучили спектр метаболитов, содержащих изотоп фосфора

Рнс. 6. Динамика проникновения диэфира (1) в HL-60 клетки

Концентрация (1) - 4 цМ (молярная активность 3,5 Ки/ммолъ), клетки HL-60 (1 млн клеток/мл)

в водорастворимой фракции клеточного лизата Используя ВЭЖХ, мы показали, что в любой момент времени на отрезке 0-24 часа в цитоплазме в виде исходного диэфира находится только 3-6% от общей радиоактивности, проникшей в клетку, а остальная доля радиоактивных продуктов приходится на холиновый эфир фосфорной кислоты и ортофосфат в соотношении приблизительно 4 1 Отдельно мы изучили поведение (1) в культуральной среде и показали, что гидролиз практически не протекал и составлял 34% через сутки Таким образом, при столь эффективной внутриклеточной деструкции диэфира градиент его концентрации внутри и вне клетки на исследуемом отрезке времени должеп оставаться неизменным, что и подтверждает линейный характер кривой проникновения Учитывая, что во внеклеточной среде гидролиз (1) пренебрежимо мал, можно сделать вывод, что радиоактивный изотоп фосфора поступил в клетку именно в виде [32Р]-холинфосфата A3T

Мы установили внутриклеточное распределение метаболитов, содержащих изотоп 32Р, для чего тщательно отмытые от культуральной жидкости клетки (после 24 ч инкубации) были разрушены криолизом, а водонерастворимый остаток экстрагировали смесью хлороформ метанол (11), как описано в работе [Vaskovsky et al J Lipid Res V9,1968, 396] Результаты ВЭЖХ анализа представлены на круговой диаграмме (рис 7) Водная фракция содержала 66 % суммарной радиоактивности клетки, липидная- 20%, 14% находилось в фракции, продукты которой не были идентифицированы (рис Id) К неидентифицированным подуктам мы отнесли фракцию, не растворимую ни в воде, ни в хлороформ-метанольной смеси Состав

водорастворимой фракции представлен на pite. Ib. Эта фракция содержала 73% колинфосфата (3), 6% (1) и 21% ортофосфата,

Рне 7, а: Внутриклеточное распределение радиоактивной метки после инкубащш осток с ди эфиром [32Р]-(1). Ь: Распределение НР в водорастворимой фракции клеточного лизата.

а Ь

И3Р04

ИМ - неидентифицированные метаболиты

12-106 клеток инкубировали 24 часа в среде, содержащей 4 мкМ [згР]-(1) (6 Ки/ммоль), криолизовали, и мембраны экстрагировали смесыо хлороформ-метанол.

Для исследования состава продуктов в липидной фракции, выделенной как описано ранее, использовали метод двумерной Т'СХ. Основными Р-мечеными продуктами бы;ш фосфатидилхолин и фоефатидилэтаноламин (рис. 8). В значительно меньших количествах была идентифицирована фосфат и дная кислота.

Таким образом, анализ клеточных лизатов показал, что ХФ-АЗТ в клетках гидра лизуется с образованием АЗТ и холинфосфата, т.е. диэфир (1) является

предшественником АЗТ, а не АЗТ-монофосфата,

Рнс.8. Идентификация 32Р меченых метаболитов (1).

I: хлороформ-МеОН-водн .аммиак 65:35:5

2\ х лоро форм-МеОН: АсОН: ацетон: во да 10:2:4:2:1

фосфатидилхолин фосфатидкая кислота фосфатидилэгаяолам ин Отнесение соединений проводили сравнением величин хроматографической подвижности радиоактивного Продукта и аутентичного нерадиоактивного образца.

Чтобы ответить на вопрос, являются ли различия в скорости проникновения (1) и АЗТ причиной изменения анти-ВИЧ активности, мы провели сравнение динамики совместного проникновения исследуемого диэфира [32Р]-(1) и материнского АЗТ, меченного 3Н Для решения этой задачи нами был использован [6-3Н]-АЗТ Динамика накопления 3Н-АЗТ и [32Р]-(1) в клетке представлена на рис 9

Рис 9. Динамика проникновения [32Р]-(1) и [3Н]-АЗТ в клетку при их одновременном внесении в концентрации 4 )лМ каждого

Молярная активность (1) 3,5 Ки/ммоль Данные получены в результате усреднения значений двух независимых экспериментов в двух параллелях

Из рисунка видно, что до 8 часов количество 3Н в клетке выше концентрации 32Р Поскольку (1) в клетке количественно метаболизируется до АЗТ, можно утверждать, что внутриклеточная концентрация АЗТ, достигнутая за счёт проникновения (1) составляет 94-97% концентрации 32Р Следовательно, в первые 8 часов внутриклеточная концентрация [3Н]-АЗТ выше концентрации АЗТ, освободившегося из (1) Далее скорость пропикновения [3Н]-АЗТ снижается и в клетке начинает преобладать АЗТ, образованный из диэфира (1) Через 24 часа достигается разница почти в 30% Тем не менее, следует отметить, что характер кривой проникновения [32Р]-(1) в присутствии АЗТ в равной концентрации через 6-7 часов инкубации не претерпевает существенных изменений

Таким образом, мы показали, что через 24 ч нуклеотид (1) обеспечивает более высокую внутриклеточную концентрацию АЗТ Однако разница в эффективности проникновения не столь велика, чтобы можно было именно ей приписать более высокую активность диэфира (1) по сравнению с АЗТ

Проявление конкурентных взаимодействий между соединениями при проникновении в клетку косвенно указывает на идентичность путей их проникновения

Поэтому мы решили выяснить, какие изменения произойдут в динамике

проникновения соединения (1) в присутствии АЗГ в различных концентрациях.

Рис.10. Динамика проникновения нуклеотида [згР]-(1) в присутствии АЗТ в различных концентрациях. Концентрация диэфира [52Р]-(1) в кулыуралыюй жидкости 1 мкМ (молярная активность 4 Ки/ммоль),

время, ч

1; без АЗТ, 2: 1 мкМ АЗТ, 3: 10 мкМ АЗТ. Данные получены в результате усреднения значений трёх независимых экспериментов

Изменение скорости проникновения наблюдали в присутствии АЗТ, равной концентрации [3~Р]-(1) и концентрации, превышающей ее в 10 раз (рис. 10).

Как видно из рис. 10, присутствие АЗТ несомненно влияет на скорость проникновения препарата, однако, это влияние весьма незначительно и его нельзя объяснить простым конкурентным взаимодействием.

Отсутствие явно выраженной конкуренции между АЗТ и (1) может указывать как на наличие иного пути проникновения последнего, так и являться следствием влияния других факторов, например, превышения концентрации природных нуклеозидов в клеточной жидкости над концентрацией исследуемых соединений, а также отсутствия взаимодействий при выбранных концентрациях изучаемых соединений.

Еще одним косвенным подтверждением того, что диэфир (1) может иметь пути проникновения я клетку, отличные от родительского яукяеоинда, якяяются данные проникновения соединения в концентрациях, на 2-3 порядка ниже ранее изученных. Мы изучили динамику проникновения диэфира (э:Р]-(1) в концентрации 37 нМ т.е., близкой к той, в которой он проявляет антивирусные свойства (1С(>оя 18 нм) (Рис. 11). Кривая, отражающая динамику проникновения, показывает наличие области

насыщения, которое достигается за 1-2 часа, те значительно отличается от кривой, ранее полученной для концентрации 4 мкМ Следует отметить, что при понижении внеклеточной концентрации нуклеотида в 100 раз его внутриклеточная концентрация уменьшилась не более, чем в 7 раз Вероятно, разчичия в динамике проникновения и внутриклеточной концентрации активного вещества проявляются именно в концентрациях, близких к тем, в которых вещества проявляют апти-ВИЧ активность К сожалению, даже с применением методов радиохимии невозможно провести аналогичное исследование динамики проникновения АЗТ в наномолярных концентрациях Наше исследование показало, что изучение кинетических параметров и метаболических превращений целесообразно проводить именно в концентрациях, приближенных к концентрациям веществ, в которых они проявляет антивирусные свойства

Суммируя полученные данные, можно заключить, что диэфир (1) эффективно проникает в клетки и превращается в АЗТ и холинфосфат, являясь, таким образом, депо-формой АЗТ Динамика его проникновения сквозь клеточную мембрану зависит от его внеклеточной концентрации и в наномолярных концентрациях значительно отличается от таковой при микромотярной концентрации

Рис. 11. Динамика проникновения диэфира [32Р]-(1) в концентрациях 37 нМ и 4 мкМ

90 оо

0,037 мкМ (1)

о

5

10

Время, ч

15

20

25

Клетки НЬ60 (106/мл) инкубировали с (1) (молярная активность 4,2 Ки/ммоль для 4 мкМ и 2760 Ки/ммоть для 37 нМ) Данные потучены в резучьтате усреднения зпачепий двух независимых экспериментов в двух параллелях

Оценка ферментативной стабильности

Химическая и ферментативная стабильность является важной характеристикой соединения с точки зрения его применимости в клинической практике Кроме того, эксперименты по исследованию ферментативной стабильности могут оказаться полезными для выявления ферментов, ответственных за внутриклеточную деструкцию соединения

В табл 3 приведены данные о химической и ферментативной стабильности диэфира (1) Стабильность оценивали по величине времени полугидролиза (Тщ) Время полугидролиза нуклеотида (1) в фосфатном буфере при 37°С в интервале pH 5-8 превышает 24 часа В 90% нормальной сыворотке крови человека время полугидролиза диэфира (1) составило 6,3 часа, при этом единственным наблюдаемым продуктом гидролиза был АЗТ Однако, поскольку скорость гидротиза нуклеотида (2) в условиях этого эксперимента на порядок выше таковой для холинфосфата АЗТ (1) (данные не приведены), монофосфат (2) в реакционной смеси не был обнаружен

Стабильность диэфира (1) была изучена в лизате клеток HL-60 Мы фракционировали лизат путем его центрифугирования при 14000 g в ЮОмМ PBS Оказалось, что супернатант (осветленный лизат) гидролизует соединение (1) почти в 5 раз медленнее, чем суспендированный в том же объеме осадок лизата после центрифугирования Качественный состав продуктов гидролиза при этом одинаков Эти факты указывают на то, что фермент, отвечающий за внутриклеточный гидролиз, возможно локализован на клеточной мембране

Мы попытались определить, какие ферменты способны расщеплять нуклеотид (1) и какие продукты при этом образуются Так оказалось, что суммарный ферментативный препарат змеиного яда легко гидролизует (1) с образованием холина, АЗТ и монофосфата АЗТ (2) Время полугидролиза составило примерно 60 мин К этому моменту времени продукты гидролиза АЗТ и монофосфат (2) накапливаются в реакционной смеси в соотношении 1 1 Поскольку (2) постепенно гидролизуется 5'-нуклеотидазой змеиного яда, то после четырех - часовой инкубации продуктами гидролиза являются АЗТ, холин и ортофосфорная кислота

В присутствии фосфодиэстеразы змеиного яда гидролиз (1) протекает с образованием холина и нуклеотида (2) с очень высокой скоростью Время полугидролиза составило 3-5 мик

Для 5'-нуклеотидазы змеиного яда диэфир (1) оказался очень плохим субстратом Скорость его расщепления этим ферментом в 1000 раз ниже скорости

гидролиза нуклеотида (2) и всего в 2-3 раза выше скорости обычпого химического гидролиза. По-видимому, эта ферментативная активность является остаточной активностью фосфодиэстеразы, содержащейся в виде 0,1% примеси в препарате 5'-нуклеотидазы

Фосфолипаза С из змеиного яда расщепляет диэфир (1) с образованием холинфосфата (3) и АЗТ почти в 50 раз медленнее, чем протекает гидролиз фосфатидидхолина (данные не приведены)

Таким образом, данные по ферментативной стабильности диэфира (1) позволяют предположить, что за первичную деструкцию соединения в крови отвечают фосфодиэстеразы Образовавшийся при этом монофосфат гидролизуется далее фосфомоноэстеразами до А2Т За внутриклеточный гидролиз, по-видимому, отвечают мембраносвязанные ферменты, одним из которых является фосфолипаза С Образовавшийся внутри клетки нуклеозид эффективно фосфорилируется до 5'-монофосфата А2'Г, а холинфосфат встраивается во вновь синтезируемые клеткой компоненты фосфолипидов

Таблица 3. Химическая и ферментативная стабильность нуклеотида (1)

Соотношение* продуктов гидролиза в Т1/2, % Время полугидролиза

АЗТ (2)

фосфатный буфер рН 5-8 90 10 >24 ч

90% нормальная сыворотка крови человека 96 4 4,8 ч

препарат змеиного яда 50 50 1ч

фосфодиэстераза змеиного яда 3 97 5 мин

5'-нуклеотидаза змеиного яда 99,5 0,5 24 ч

фосфо.шпаза С змеиного яда 99 1 18 ч

препарат клеточных мембран 93 7 32 мин

водорастворимая фракция клеточного лизата 99 1 2,5 ч

* сумма АЗТ и (2) принята за 100%

выводы

1 Показано, что З'-азидо-З'-дезокситимидин-б'-холинфосфат является депо-формой АЗТ, а образовавшийся в процессе внутриклеточного гидролиза холинфосфат участвует в клеточном метаболизме, включаясь в липиды

2 Сравнительный анализ динамики проникновения в клетки НЬ-60 З'-азидо-З'-дезокситимидин-5'-холинфосфата и АЗТ показал, что после 8 ч инкубации внутриклеточная концентрация АЗТ, образовавшегося из З'-азидо-З'-дезокситимидин-5'-холинфосфата, выше, чем при проникновении самого АЗТ

3 Выявлены различия в динамике проникновения 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата в микромолярных и наномолярных концентрациях

4 Повышение анти-ВИЧ активности 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата, очевидно, обусловлено не спецификой внутриклеточного метаболизма, а особенностью динамики проникновения в клетку

5а Разработан эффективный метод фосфорилирования первичных спиртов 32Р-

фосфорной кислотой с использованием ВгСЫ

5Ь Разработан метод синтеза 32Р-мечсных фосфодиэфиров АЗТ

Автор выражает глубокую благодарность к х н. Скоблову Ю.С. за поддержку и помощь в освоепии методов радиоактивного синтеза и научные консультации.

Список публикаций Статьи

1 Январев Д В , Широкова Е А, Скоблов Ю С Химический синтез AZT- [5'-32Р] монофосфата Биоорган Химия, 2005, Т 31, №4,357-361

2 Dmitry V Yanvarev, Elena A Shirokova, Мала V Astapova, Yury S Skoblov AZT 5'-choline phosphate as a potential anti-HIV drug the study of biochemical properties and metabolic transformations using its 32P-labelled counteipart Nucleosides Nucleotides, 2007, V 26, 23-36

Тезисы

3 D V Yanvarev, E A Shirokova, Yu S Skoblov "Anti-HIV Drug Design AZT 5'-32P-choline phosphate the penetration and study of the mechanism of its anti-HIV activity", Abstract book International Conference Chemical & Biological Problems of Proteomics, 2004,113

4 DV Yanvarev, EA Shirokova, YuS Skoblov "AZT 5'-32P-cholme phosphate preparation and study of the mechanism of its anti-HIV activity", Abstract book Conference for young scientists, PhD students on molecular biology and genetics, 2003, 190

5 D Yanvarev, E Shirokova, Yu Skoblov "The study of metabolic transformations of AZT-5'-choline phosphate, a potential anti-HIV agent in cell cultures", Киев 2003,230

Напечатано с готового оригинал-макета

Издатетьство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 05 04 2007 г Формат 60\90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 169 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Январёв, Дмитрий Васильевич

1. Список сокращений.стр.

2. Литературный обзор. "Методы получения нуклеозид 5'-монофосфатов и их применение для синтеза [32Р]-меченых нуклеотидов"

2.1 Прямое фосфорилирование действием фосфорной кислоты и её солей.стр.

2.2 Фосфорилирование через активацию гидроксильной группы

2.2.1 Активация арилсульфохлоридами.стр.

2.2.2 Активация металлорганическими соединениями.стр.

2.3 Этерификация моноэфирами фосфорной кислоты.стр.

2.4 Триалкилфосфиты как фосфорилирующие агенты.стр.

2.5 Галогениды фосфора.стр.

2.6 Агенты, активирующие фосфорную компоненту:

2.6.1 Карбодиимиды.стр.

2.6.2 Арилсульфохлориды.стр.

2.7 Другие фосфорилирующие реагенты.стр.

2.8 Биосинтетические и ферментативные методы фосфорилирования.стр.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Синтез 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-(холин-[ Р]-фосфата).стр.

3.2 Изучение внутриклеточного метаболизма

3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин-5'-(холин-[32Р]-фосфата).стр.

3.3 Оценка ферментативной стабильности.стр.

4. Экспериментальная часть.стр.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Январёв, Дмитрий Васильевич

выводы

1. Показано, что 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат является депо-формой АЗТ, а образовавшийся в процессе внутриклеточного гидролиза холинфосфат участвует в клеточном метаболизме, включаясь в липиды.

2. Сравнительный анализ динамики проникновения в клетки НЬ-60 З'-азидо-З'-дезокситимидин-5'-холинфосфата и АЗТ показал, что после 8 ч инкубации внутриклеточная концентрация АЗТ, образовавшегося из З'-азидо-З'дезокситимидин-5'-холинфосфата, выше, чем при проникновении самого АЗТ.

3. Выявлены различия в динамике проникновения 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата в микромолярных и наномолярных концентрациях.

4. Повышение анти-ВИЧ активности 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата, очевидно, обусловлено не спецификой внутриклеточного метаболизма, а особенностью динамики проникновения в клетку.

5а. Разработан эффективный метод фосфорилирования первичных спиртов Рфосфорной кислотой с использованием ВгСК.

5Ь. Разработан метод синтеза 32Р-меченых фосфодиэфиров АЗТ.

4. Экспериментальная часть Материалы и методы

В работе использовали 5 М BrCN в ацетонитриле, МСС и Н3РО4 (Merck), DCC, TCN, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота (Fluka). [32Р]-ортофосфорная кислота получена из Института реакторных материалов (Заречный, Свердловская обл.), AZT любезно предоставлен ассоциацией AZT (Москва). [3H]-AZT был синтезирован в Институте Молекулярной Генетики РАН (Москва). Сыворотка крови человека любезно предоставлена Гематологическим Научным Центром РАМН (Москва). Фосфолипазу С змеиного яда (Crotalus adamanteus), фосфодиэстеразу змеиного яда (Crotalus attrox) и 5'-нуклеотидазу змеиного яда (Crotalus attrox) (Sigma).

УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Shimadzu УФ-1201 (Япония). 'Н-ЯМР-спектры получены на спектрометре Bruker АМХ III-400 (400 МГц). 31Р-ЯМР-спектры - на том же приборе с рабочей частотой 162 МГц при подавлении фосфор-протонного спин-спинового взаимодействия с 85% Н3РО4 в качестве внешнего стандарта. ВЭЖХ осуществляли на хроматографе Gilson (Франция), с УФ-детектором тип 115 и проточным детектором радиоактивности тип 170, используя колонку (4 х 150 мм) Lichrosorb RP-18 (5 мкм), с градиентной элюцией в ион-парном режиме. Раствор А: 50 мМ ТЕАВ, раствор В: 75% этанол, скорость элюции 0,5 мл/мин. Элюция по программе: 0-5 мин (0% В), 5-10 мин (0->20% В), 10-30 мин (20-^30% В). Время удерживания соединения (2) - 14 мин, AZT - 20 мин, дифосфата (4) - 23 мин. Для ТСХ использовали пластинки Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) и элюирующие системы хлороформ-метанол 9 :1 (система А), диоксан-iPrOН-вода-25% водный NH3 3:3:3:1 (система В). Детектирование радиоактивных продуктов реакции проводили авторадиографически и с помощью Instant Imager Electronic Autoradiography (Packard Instrument Company, США). Количественный анализ реакционных смесей на пластинках ТСХ осуществляли на этом же приборе с использованием прилагаемого программного обеспечения.

Электрофорез выполняли в камере для горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле (60 х 30 мм), толщина геля 3-4 мм, электродный буфер 20 мМ однозамещенный фосфат натрия (рН 4,3). Напряжение 400 В, время разделения 10-12 мин. Выделение целевого продукта (2) проводили замораживанием геля при -18°С с последующим оттаиванием и отбором слоя жидкости. Соединения идентифицировали методом ВЭЖХ в условиях, описанных выше.

Общая методика синтеза 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-[5,-32Р]-фосфата { [32Р]-(2)} при активации ТРБСЛ, ТСГ*, БСС и МСС.

Раствор 10 мКи Нз32Р04 в 0,05 М НС1 (20-50 мкл в зависимости от объемной активности

Нз РО4) вносили в 10 мМ водный раствор фосфорной кислоты (10 мкл), растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 50% водном пиридине, раствор упаривали досуха и дважды переупаривали с абсолютным пиридином (2 х 20 мкл). Полученный остаток растворяли в 20 мкл абсолютного пиридина, добавляли 10 мкл 1 М раствора'А2Т в абсолютном пиридине и 10 мкл 0,1 М раствора соответствующего конденсирующего агента в пиридине. По окончании реакции (детекция ТСХ), растворитель удаляли в вакууме, остаток дважды соупаривали с 50 мкл воды, растворяли в 50 мкл воды, и продукт [ Р]-(2) выделяли с помощью ВЭЖХ. Выходы продукта (2): 28% в случае ТР8С1 (после повторной хроматографии), 15% в случае ТОЧ, 18% в случае БСС, 30% в случае МСС. Молярная радиоактивность 100 Ки/ммоль.

Н-ЯМР (Б20; 5, м.д.; У, Гц): 7,43 д (1 Н, У1, Н 6), 6,27 т (1 Н, /7,5, НГ), 4,4 (1 Н, м, НЗ'), 4,2 м (2 Н, Н5'), 4,07 м (1 Н, Н4'), 2,25 м (2 Н, Н2'), 1,88 д (3 Н, 31, 5-СН3).

31Р-ЯМР (Б20): 0,54 с.

Данные ЯМР-спектров приведены для образца соединения (2) с молярной радиоактивностью 0,1 Ки/моль.

Синтез 3'-азидо-2'3'-Дидезокситимидин-[5'-32Р]-фосфата { [32Р]-(2) } при активации ВКЖ

Раствор

10 мКи Н3 РО4 в 0,05 М НС1 (20-50 мкл в зависимости объемной активности) вносили в 1 мМ раствор Н3РО4 (10 мкл), раствор упаривали в вакууме, остаток растворяли в 50% водном пиридине (20 мкл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе ОМАР в воде (15 мкл), далее добавляли 2 М раствор К1Х в 5 М растворе БМАР в воде (10 мкл), затем вносили 2 мкл 5 М раствора ВгСИ в абсолютном ацетонитриле. По окончании реакции растворитель удаляли в вакууме, остаток дважды соупаривали с 50 мкл воды, растворяли в 50 мкл воды и продукт [32Р]-(2) выделяли с помощью ВЭЖХ. Выход составил 46%. Молярная радиоактивность 1000 Ки/ммоль.

Синтез 3'-азидо-2'3'-Дидезокситимидин- [5'-32Р]-холинфосфата {[32Р]- (1)}.

К 10 мКи Нз32Р04 в 0,5 мМ НС1 добавляли Н3Р04 (10 мкл 1 мМ раствора в воде) вносили 40 мкл ацетонитрила, растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе прирдина в воде (15 мкл), добавляли холиний иодид (1 мкмоль, 231 мкг) и реакционную смесь термостатировали 10 мин при 0°С. Добавляли раствор 50 мМ ВгСЫ в ацетонитриле (6 мкл), и после 20 мин при 0°С удаляли растворитель в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе ОМАР в воде (20 мкл), вносили А.ЪТ

1 мкмоль, 267 мкг) и 50 мМ раствор ВгСК в ацетонитриле (6 мкл). Через 10 мин добавляли 30% водный аммиак (10 мкл), через 20 мин раствор упаривали, а остаток переупаривали с водой (50 мкл). Остаток растворяли в 50 мМ ТЕАВ (50 мкл) и продукт выделяли методом ВЭЖХ. Выход продукта 18-20%, радиохимическая частота 99%, молярная активность 1000 Ки/ммоль. Я/(ТСХ, система В,): 0,6.

УФ: >.тах 266,3 нм (е = 8440) (рН 7,0, вода), Хта}Дтт 3,3.

Н-ЯМР (Б20; 8, м.д.; 7, Гц): 7,63д (1Н, 71 Гц, Н-6); 6,20т (1Н, У 6,5 Гц, Н-Г); 4,43 дт (1Н, 76,5 и 11 Гц, Н-3'); 4,25 м (2Н, СНгО холин); 4,12-4,04 м (ЗН, 2Н-5'+Н-4'); 3,61 м (2Н, СЩМ холин); 3,16с (9Н, Ме3 холин) 2,47 т (2Н, У 6,5 Гц, Н-2'); 1,86 с (ЗН, Ме-ТЬу). 31Р-ЯМР (Б20; 5, м.д.; 7, Гц): -0,16 с.

13С-ЯМР(020; 5, м.д.; 7, Гц): 166,8, 151,9 (С-2 + С-4); 137,7 (С-6); 111,9 (С-5); 85,4 (С-Г); 83,1 д (7 8,5, С-4'); 66,3 тс (7МС 3,9, СН2К холин); 65,4д (7 5,2, С-5'); 60,5 (С-3'); 59,8д (74,9, СН20 холин); 54,3 тс (Тыс 3,7, Ме3 холин); 36,5 (С-2'); 12,0 (Ме-ТЬу).

Синтез образцов сравнения:

Синтез 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин-5'-фосфата (2):

Продукт (2) получали конденсацией 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидина с РОС1з в среде БМГ аналогично [73]. Выход 92%.

Синтез фосфамидов (5а) и (5Ь):

Фосфамиды (5) получали реакцией ОМАР или М1ш и ортофосфорной кислоты в Б МБ в присутствии избытков дипиридинилдисульфида и трифенилфосфина, как описано в [79]. Выход (5а) - 66%, (5Ь) - 51% в пересчете на ортофосфорную кислоту.

Синтез бис-(3'-азидо-2'3'- дидезокситимидин)-5'-дифосфата (4):

К раствору 10 мг (28,8 мкмоль) 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин-5'-фосфата в 2 мл безводного Б МБ добавшш 12 мг (57,6 мкмоль) БСС, через 7 часов в реакционную массу добавили 2 мл воды и оставили на 2 ч при 0°С. Выпавший осадок отфильтровали, супернатант упарили в вакууме, растворили в 0,5 мл воды и продукт выделяли методом ВЭЖХ в условиях, идентичных выделению монофосфата (2) используя колонку (25 х 300 мм) ЬюЬгоэогЬ ЯР-18 (5 мкм). Выход 68%.

Ферментативные эксперименты

Нерадиоактивный диэфир (1) (50 мг) наносили на Бо\уех 50 в Н+ форме (колонка 50x200 мм), элюировали 10% водным аммиаком. Растворитель удаляли в вакууме и полученный нуклеотид растворяли в воде получая 114 мкМ раствор.

Гидролиз клеточным лизатом:

12-106 клеток НЬ60 суспендировали в 500 мкл 5 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,5). После 4 циклов замораживания-оттаивания жидким азотом, суспензию осветляли центрифугированием (5 мин, 1000 §). В 50 мкл осветлённого клеточного лизата внесли 5 мкл 55 мМ раствора М§СЬ в 500 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,5), смесь термостатировали до температуры 37°С и вносили 114 мкМ (1) (3,2 Ки/ммоль, 2 мкл). Итоговые концентрации: 4 мкМ (1) в 44 мМ ТРИС-НС1 буфере (рН 7,5) в присутствии 5 мМ М§2+. Для анализа отбирали 2,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали в системе А и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз гомогенатом клеточных мембран:

Осадок, образовавшийся при центрифугировании криолизованных 12-106 клеток НЬ60, суспендировали ультразвуком в 50 мМ ТРИС-НС1, содержащего 5 мМ М§2+(100 мкл, рН 7,5). Суспензию термостатировали до 37°С и вносили 114 мкМ (1) (4 мкл). Для анализа отбирали 5 мкл аликвоты с молярной активностью 3,7 Ки/ммоль, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз сывороткой крови человека:

100 мкл нормальной сыворотки крови человека термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 4 мкл 114 мкМ (1) с молярной активностью 2,9 Ки/ммоль. Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, добавляли к 10 мкл метанола и суспензию осаждали центрифугированием 2 мин при 14000 g. Супернатант концентрировали до объёма 4-5 мкл в вакууме, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз ферментами змеиного яда:

0,25 мг препарата змеиного яда растворяли в 50 мМ ТРИС НС1 буфера, содержащего 10 мМ Mg2+(200 мкл, рН 8,0). Раствор термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (8 мкл) с молярной активностью 3,2 Ки/ммоль. Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз фосфодиэстеразой змеиного яда:

- 0,5 ед. активности фермента (по ди(п-нитрофенил)фосфату) растворяли в 50 мкл 50 мМ ТРИС-НС1 буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ Mg2+ и 0,11 М NaCl. Раствор термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (2 мкл раствора в воде, 2,8 Ки/ммоль). Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз 5'-нуклеотидазой змеиного яда:

Фермент (1 ед. активности по л-нитрофенилфосфату) растворяли в 50 мМ ТРИС-НС1 буфере (50 мкл, рН 8,0), содержащего 10 мМ Mg2+ и 0,11 М NaCl. Раствор термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (2 мкл раствора в воде, 3,2 Ки/ммоль). Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Клеточные эксперименты

Клетки промиелоцитарного лейкоза человека (promyelocytic leukemia cells) HL-60 культивировали в среде RPMI - 1640 содержащей 2 мМ L-глутамин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг. При плотности

1 млн.клеток/мл в культуральную жидкость добавляли исследуемый радиоактивный (1) с молярной активностью 4-5 Ки/ммоль и проводили отбор 2 параллельных аликвот по 3 мл через 0, 1, 3, 7, 24 часа. Клетки центрифугировали при 180 g и 4°С 4 мин, супернатант анализировали отдельно, клетки дважды промывали 5 мл охлажденного до 5°С PBS и суспендировали в 5 мМ ТРИС-НС1 (200 мкл, рН 7,5). Клетки разрушали четырёхкратным замораживанием-оттаиванием в среде жидкого азота, вносили 400 мкл метанола, осаждали образовавшуюся суспензию центрифугированием (2 мин при 14000 g), надосадочную жидкость пипетировали и удаляли растворитель в вакууме при 37°С. Остаток растворяли в 25 мкл 50 мМ ТЕАВ и анализировали ВЭЖХ.

Анализ липидного состава мембранной фракции осуществляли на ТСХ (силикагель), в качестве образцов сравнения выступали аутентичные нерадиоактивные образцы соответствующих липидных компонентов.

32

Идентификация Р меченых метаболитов (1), выделенных из липидной фракции клеток.

Идентификацию проводили двумерной хроматографией на силикагеле. Система 1 (хлороформ-метанол- 25% водный аммиак 65:35:5), пластинку тщательно высушивали, далее хроматографировали в системе 2 (хлороформ:МеОН:АсОН:ацетон:вода 10:2:4:2:1). Детекцию нерадиоактивных фосфолипидов проводили по методу Васьковского и Костевского [83]. Липиды содержащие 32Р детектировали с помощью фосфоимиджера.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Январёв, Дмитрий Васильевич, Москва

1. Honjo, М., Fumkawa, Y. Kobayashi, К. Studies on phosphorylation. Phosphorylation of nucleosides with organic amine salts of phosphoric acid, Chem. Pharm. Bull.;1. V 14,1966,1061-1065

2. Holy A., Smrt J. Synthesis of a GpUpU analogue containing 5'-deoxyuridine 5'-phosphonic acid and its effect upon the binding of I4C]valyl- and [14C]alanyl-tRNA to ribosomes. Collect. Czech. Chem. Commun.; V 31,1963,128-130

3. Ztverteczky J. Szabo P., Szabo L. Phosphorylated Sugars. XIII. A new synthesis of D-arabinose-5-dilitium phosphate. J.Chem.Soc. Perkin Trans.; V 1,1973, 872-879

4. Sakakura A., Katsukawa M., Ishihara K. Selective Synthesis of Phosphate Monoesters by Dehydrative Condensation of Phosphoric Acid and Alcohols Promoted by Nucleophilic Bases, Organic Letters; V 7 (10), 2005,1999-2002

5. Ishihara K., Kosugi Y., Akakura M. Rational design of an L-histidine-derived minimal artificial acylase for the kinetic resolution of racemic alcohols, J. Am. Chem. Soc., 126 (39), 2004,12212-12213

6. De Graaf R. and Schwartz A. Thermal synthesis of nucleoside H-phosphonates under mild conditions, OrigLife EvolBiosph., 35(1), 2005,1-10

7. Biebricher K., A simple procedure for the synthesis of a-32P-nucleoside triphosphates, Anal BiochemV 95 (2), 1979,429-432

8. Stock J. Synthesis of phosphonate analogs of thymidine di- and triphosphate from 5'-0-toluenesulfonylthymidine, J. Org. Chem; V 44 (22), 1979,3997-4000

9. Davisson V., Davis R., Dixit V. and Poulter C. Synthesis of nucleotide 5'-diphosphates from 5*-0-tosyl nucleosides, J. Org. Chem.; V 52, 1987,1794-1801

10. Davisson V., Woodside A., Neal Т., Stremler K., Muehlbacher M., Poulter C.; Phosphorylation of isoprenoid alcohols, J. Org. Chem.; V 51, 1986,4768-4779

11. Davisson V., Woodside A., Poulter C., Methods Enzymol.; V 110,1984,130-144

12. O-Selective Phosphorylation of Nucleosides without N-protection; Uchiyama M., Aso Y., Noyori R., Hayakawa Y., J. Org. Chem; V 58,1993, 373-379

13. Howes P.D., Slater M.J., Wareing K. The Regiospecific One-Pot Phosphorylation of Either the 5'- or 2'-Hydroxyl in З'-Deoxytimidines Without Protection: Critical Role of the Base, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic acids; V 22(5-8), 2003,687-689

14. Hata Т., Chong K. Synthesis of thiamine diaikyl phosphate disulfide. Bull. Chem. Soc. Jpn. V 45,1972,654-661

15. Taguchi Y., Mushika Y., Synthesis of O-acylthyamine disulfides. J. Org. Chem. V 40, 1975,2310-2317

16. Taguchi Y., Mushika Y., Synthesis of O-benzoylthiamine disulfide. Tetrahedron Lett. 1975,1913-1918

17. Taguchi Y., Mushika Y., Studies on biologically active haloganenated compounds. III. Synthesis and antibacterial activity of 7-fluoromethyl-l,8-naphthyridine and quinoline derivatives. Bull. Chem. Soc. Jpn.; F48,1975,1528-1536

18. Tener G. 2-Cyanoethyl phosphate and its use in the synthesis of phosphate ester. J.Am.Chem. Soc.; K83,1961,159-170

19. Hillers S. Popova T., Shanshtein Z., Analogs of pyrimidine mono- and polynucleotides. V. Synthesis of models of di- and trinucleotides by thermal polycondensation, Khim. ' Geterotsikl. Soed., 1975, 401-411

20. Kappler K., Hampton A., Synthesis of 5'-C-acylaminomethyl derivatives of adenosine 5'-phosphate and adenosine 5'-triphosphate. J.Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides.1. V 2,1975,109-117

21. Carpenter J., Shaw G. Chemical synthesis of specifically a-, (3-, and y-32P-labeled ucleoside-5'-triphosphates. J.Chem. Soc., 1970,2016-2022

22. Kulikowski T., ZmudzkaB., Shugar D., Acta Biochim. Pol; V 16,1969,201-209

23. Holy A., Sorm F., Effect of 5'-substitution on the template activity of oligo-nucleotides for the binding of valine and alanine tRNA to ribosomes. Collect. Czech. Chem. Commun.,1. V 36,1971,3282-3299

24. Schoffstal A., Cyclopropylmethyl dihydrogen phosphate. Preparation and use in the phosphorylation of nucleosides, J. Org. Chem.-, V 40,1975,3444-3451

25. Moffat A. Chemical synthesis of specifically a-, (3-, and y-32P-labeled ucleoside-5'-triphosphates. Methods Enzymol., Part A; V 12,1967,182-199

26. Holy A. Oligonucleotidic compounds. XI. Synthesis of ribonucleoside-2',3'-cyclophosphates from nucleosides via nucleoside-2',3'-phosphites. Smrt J., Collect. Czech. Chem. Commun.-, V 31(4), 1966,1528-1530

27. Holy A., Sorm F. Oligonucleotidic compounds. XXXIV. Preparation of some 0-L-ribonucleosides, and 2',3'-cyclic phosphates. Collect. Czech. Chem. Commun.;1. V 34(11), 1969, 3383-3385

28. Frezit W., Schattka K., Cramer F., Jastorff B. Neue darstellungsmethode von nucleotide-analogen der 5'-amino-5'-deoxy-nucleotide. Chem. Ber.; V 105(3), 1972,991-996

29. Takaku H., Shimada Y., Studies of phosphorylation. IV A selective phosphorylation of 5'-hydroxy group of nugleosides by means of tris(8-quinolyl) phosphate, Tetrahedron Lett. 1974,1279-1282

30. Takaku H., Shimada Y., Studies.of phosphorylation. III. Effect of metallic compound on the phosphorylation of alcohols, phosphates, and nucleosides by 8-quinolyl phosphates; Chem Pharm Bull {Tokyo). V 22,1974, 1743-1747

31. SchiffH., Diarylamines and their derivatives, Justus Liebigs Ann. Chem-,1. V 102,1857,337-342

32. Levene P., Tipson R., The Synthesis of Ribose-S-phosphoric Acid. J. Biol. Chem.,1. V 106,1934,113-117

33. Levene P., Tipson R., conversion of uronic acids into corresponding hexoses. J. Biol. Chem.', V 111, 1935,313-319

34. Yoshikava M., Kato T., A novel method for phosphorylation of nucleosides to 5'-nucleotides. Tetrahedron Lett-, 1967,5065-5068

35. Yoshikava M., Kato T., Studies of phosphorylation. I. Phosphorylation of 2',3'-o-isopropylidene nucleoside by phosphoryl chloride. Bull. Chem. Soc. Jpn,1. V 42,1969,3505-3511

36. Kasashio K., Yoshikava M., Studies of phosphorylation. II. Reaction of 2',3'-0-isopropylideneinosine and -guanosine with phosphoryl chloride. Bull. Chem. Soc. Jpn. V 41, 1968,142-151

37. Ludwig J., A new route to nucleoside 5'-triphosphates. Acta Biochim., Biophys., Acad., Set, Hung; V 16,1981,131-137

38. Levene P., Tipson R., catalytic reduction and deacetylation of the methyl ester of 2,3,4-triacetyl a-methyl-d-galacturonide. J. Biol. Chem. V 111, 1937,185-188

39. Khorana H. G. and Todd A. R. Studies on phosphorylation. Part XI. The reaction between carbodi-imides and acid esters of phosphoric acid. A new method for the preparation of pyrophosphates. J. Chem. Soc. 1953,2257 2260

40. Kennedy E.P. The synthesis of cytidine diphosphate choline, cytidine diphosphate ethanolamine, and related compounds. J. Biol. Chem. 1956. V 222(1), 185-191

41. Smith, M., Moffatt, J.G. and Khorana, H.G. Carbodiimides. VIII. Observations on the reactions of carbodiimides with acids and some new applications in the synthesis of phosphoric acid esters. J. Amer. Chem. Soc. 1958; V 80,6204-6212

42. Hughes, N. A., Kenner, G. W. & Todd, A. Part III. A synthesis of diphosphopyridine nucleotide (cozymase), and some observations on the synthesis of triphosphopyridine nucleotide. J. Chem. Soc. 1957,3733-3778.

43. G.W. Kenner G.W. Phosphoric esters and related compounds; report of a symposium held at the Chemical Society anniversary meeting, Cambridge, on April 9-12th, London, 1957,99-101

44. Tener G. M., Khorana H. G., Markham R., Pol E. H. Studies on Polynucleotides. II. The Synthesis and Characterization of Linear and Cyclic Thymidine Oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80(23), 6223-6230

45. Weimann, G. and Khorana, H.G. Studies on polynucleotides XVII. On the Mechanism of Internucleotide Bond Synthesis by the Carbodiimide Method. J. Am. Chem. Soc. 1962,1. V 84,4329-4341

46. Jacob, T. M., and H. G. Khorana. Studies on polynucleotides. XXX. A comparative study of reagents for the synthesis of the CsA35f intemucleotidic linkage. J. Am. Chem. SOC. 1964; V 86,1630-1635.

47. B. D. Mehrotra and H. G. Khorana. Studies on Polynucleotides XL. Synthetic deoxyribopolynucleotides as templates for ribonucleic acid polymerase: the influence of temperature on template function. J Biol Chem. 1965; V 240,1750-1753.

48. Letsinger RL, Caruthers MH, Miller PS, Ogilvie KK. Oligonucleotide syntheses utilizing beta-benzoylpropionyl, a blocking group with a trigger for selective cleavage. J Am Chem Soc. 1967 Dec 20; 89(26), 7146-7147

49. Katagiri N, Itakura K, Narang SA. The use of arylsulfonyltriazoles for the synthesis of oligonucleotides by the triester approach. J Am Chem Soc. 1975. Dec 10; 97(25). 7332-7337

50. Seth AK, Jay E. A study of the efficiency and the problem of sulfonation of several condensing reagents and their mechanisms for the chemical synthesis of deoxyoligoribonucleotides. Nucleic Acids Res. 1980, 8(22), 5445-5459

51. Todd A. Some Aspects of Phosphate Chemistry. PNAS. 1959,45,1389-1397

52. Michelson A.M. Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Academic Press, London and New York, 1963, 412-417

53. DG Knorre and VF Zarytova. The mechanism of the chemical synthesis of oligonucleotides and its synthetic consequences. Nucl. Acids Res. 1976. 3. 2709-2729

54. The role of metaphosphate in the activation of the nucleotide by TPS and DCC in the oligonucleotide synthesis. Nucleic Acids Res. 1986,25-14(6), 2699-2706

55. T.M . Chapman, D.G . Kleid, Activated Phosphate Triesters. The Synthesis and Reactivity of N-Hydroxysuccinimide and N-Mercaptosuccinimide Esters

56. J. Org. Chem., 1973; V 38(2), 250-252

57. Tri-t-butyl Phosphite and Some of Its Reactions; Mark V and J.R. Van Wazer, J. Org. Chem-, V 29,1964,1006-1008.

58. R. W. Taft, D. Gurka, L. Joris, P. v. R. Schleyer and J. W. Rakshys; zbad.,1. V 91,1969,1801

59. Arnett E. M. Quantitative comparisons of weak organic bases, Progr. Phgs. Org. Chem.-,1. V 1,1963,223-403

60. Biosynthetic Preparation of 32P-Labaled Nucleoside 5'-Phosphates and Derivatives; R. Hurlbert, N. Furlong, Nucleic Acids Components, 193-202

61. Вояковская E.E., Захарова Л.Ю., Зуева E.B., Кулене В.В., Карпавичене Д.П., Цветков B.C., Титкова Е.Г. Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами, II Симпозиум стран-членов СЭВ, Ленинград, 1981. ЦНИИ Атоминформ, Москва, 1982,141

62. Скоблов Ю.С., Королёв А.Э., Маслова Р.Н.Синтез 5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, Успехи химии, 64(8), 1995, 850-858

63. Франк-Каменская М.Д., Книжниева Г.В., Мясоедов М.Ф.; Биоорганическая химия, 10,1984,515-518

64. R. Hurlbert, Furlong N. Methods Enzymol,Part A, 12,1967,193-198

65. Феофанов C.A.; дис.канд.хим.наук. НИБХ CO АН СССР, Новосибирск, 1985

66. Ch.K. Biebricher. A simple procedure for the synthesis of alpha-32P-nucleoside triphosphates, Anal. Biochem., 1979; V 95,429-432

67. Скоблов Ю.С., Королев А.Э., Маслова P.H. Синтез нуклеозид 5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора. Успехи химии. Т. 64,1995, 850-858.

68. Walseth T.F., Johnson R.A. Biochim. Biophys. Acta. V 526,1979,11-16

69. Шипицый A.B., Ясько M.B., Широкова E.A., Куханова М.К., Проняева Т.Р., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Госслен Ж., Периго К., "Холинфосфат З'-азидо-З'-дезокситимидина как антивирусный агент", Заявка на изобретение2002119748 от 26.06.2002 г

70. Turcotte J.G., Pivarnik Р.Е., JShirali S.S., Preparative-scale high-performance liquid chromatographic separation and purification of 3 '-azido-3 '-deoxythymidine-5 '-phosphate.

71. J. Chromatography, 1990; V 499,55-61

72. Suesy P., Zagarny M. A biosynthetic method for the preparation of high specific activity 32P- labeled phospholipids, Chem. Phys. Lipids. 1969. V 56,9-13

73. Symons R.H. Synthesis of a-32P-ribo- and deoxyribonucleoside 5'-triphosphate. Methods Enzymology, 1974; V 29, 102-108

74. Fedorova O.A., Gottikh M.B., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Cyanogen Bromide-induced Chemical Ligation: Mechanism and Optimization of the Reaction Conditions, Nucleosides Nucleotides., 1996; V 15,1137-1147

75. E. Kanaya and H. Yanagava, Template-Directed Polymerization of Oligoadenylates Using Cyanogen Bromide, Biochemistry, 1986; V 25,7423-7430

76. Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Промежуточные реакции при синтезе олигонуклеотидов по данным спектроскопии Я.М.Р. на ядрах Р31, Доклады академии наук, 1973, Т 212,630-633

77. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Халимская Jl. М., Реакционноспособные фосфамиды моно- и динуклеотидов. Биоорганическая Химия, 1986,12(4), 475-481

78. Лебедев А.В., Резвухин А.И. Закономерности изменений химических сдвигов ядер фосфора в спектрах 31Р-ЯМР производных нуклеотидов, Биоорганическая химия, 1983, Т 9 (2), 149-185

79. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; V 226,497-501

80. Vaskovsky V.E., Kostevsky E.Y. Modified spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms, J.Lipid Res.-, V 9,1968, 396