Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков с использованием методов изотопного мечения и селективного концентрирования

Каньшин, Евгений Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков с использованием методов изотопного мечения и селективного концентрирования
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков с использованием методов изотопного мечения и селективного концентрирования"

На правах рукописи

КАНЬШИН Евгений Дмитриевич

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ ИЗОТОПНОГО МЕЧЕНИЯ И СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

03.00 04 - биохимия 03 00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2008

003454898

Работа выполнена в лаборатории координационных металлоорганических соединений кафедры органической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова совместно Монреальским университетом

Научные руководители доктор химических наук, профессор

Нифантьев Илья Эдуардович кандидат химических наук, профессор Пшежецкий Алексей Валерьевич

Официальные оппоненты доктор химических наук

Курочкин Илья Николаевич доктор химических наук, профессор Заикин Владимир Георгиевич

Ведущая организация Институт ГУ Российский Онкологический

научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Защита состоится «2» декабря 2008 года в 16 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «30» октября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

г.

/ Сакодынская И.К.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

Обратимое фосфорилирование белков является одним из основных механизмов регуляции процессов в живой клетке, включая перенос сигнала, дифференциацию, пролиферацию, контроль клеточного цикла и метаболизм, что делает анализ фосфобелков важной задачей при изучении ключевых клеточных функций. Считается, что около 30 % всех белков могут быть фосфорилированы в тот или иной момент времени, а количество сайтов белкового фосфорилирования в человеческом протеоме может достигать 100,000 [Kalume D Е. et al., 2003]. Результаты расшифровки человеческого генома также подтверждают физиологическую важность фосфорилирования: гены, кодирующие ферменты, отвечающие за фосфорилирование и дефосфорилирование белков, соответствуют как минимум 2% генома [Johnson S А. et al., 2005].

Существуют различные подходы, позволяющие получать информацию о фосфорилировании белков. Наиболее общим из них является фосфопротеомика -наука, изучающая всю совокупность фосфорилированных белков в клетке или организме - фосфопротеом. В связи с высокой сложностью белкового состава биологических систем, анализ как протеома, так и фосфопротеома представляют собой сложную задачу, для решения которой в настоящее время широкое применение находит масс-спектрометрия в сочетании с различными техниками разделения белков и пептидов (гель-электрофорез, ВЭЖХ, капиллярный электрофорез и т.д) [Ham В.М. et al., 2008].

В настоящее время основными направлениями в развитии фосфопротеомики являются разработка и внедрение методов, увеличивающих эффективность масс-спектрометрического анализа фосфорилированных белков, включая разработку новых методов для выделения фосфобелков и фосфопептидов, что позволяет уменьшить долю нефосфорилированных компонентов сложной смеси и тем самым упростить ее анализ. В настоящей работе нами предложены новые химические методы для высокоселективного концентрирования фосфопептидов и фосфобелков, а также определения стехиометрии фосфорилирования белков. На основе данных подходов разработаны и охарактеризованы новые методы количественного анализа фосфопротеома.

Цель работы

Цель работы заключалась в разработке новых методов для масс-спектрометрического анализа фосфопротеома и определения их пригодности для анализа биологических образцов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. исследовать ряд новых хроматографических фаз, которые могут быть использованы для эффективного выделения фосфопептидов и фосфобелков из сложных белковых образцов;

2. разработать высокочувствительный метод анализа фосфопротеома, основанный на совместном выделении фосфорилированных белков и пептидов;

3. разработать метод для экспериментального определения и сравнения стехиометрии фосфорилирования белков.

Научная новизна результатов

Результатом работы явилась разработка группы методов для масс-спектрометрического исследования фосфопротеома. Была синтезирована новая аффинная фаза для концентрирования фосфорилированных пептидов из сложных образцов, характеризующаяся высокой селективностью. Был разработан новый метод определения стехиометрии фосфорилирования белков при помощи комбинации изотопной модификации и энзиматического дефосфорилирования; с помощью названного метода был впервые проведен анализ стехиометрии фосфорилирования белков в сложных биологических образцах.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что разработанные методы могут применяться в фосфопротеомике для определения фосфорилированных белков, сайтов фосфорилирования, а также их стехиометрии. Получейные результаты могут быть использованы в исследовании механизмов биологических процессов, скрининге биомаркеров и разработке новых фармацевтических препаратов. В настоящий момент разработанная технология и аффинные хроматографические фазы нашли коммерческое применения для анализа образцов в Инновационном центре университета МакГила (Монреаль).

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на 7-ом ежегодном международном конгрессе организации человеческого протеома (НЦРО 2008, Амстердам, Нидерланды, 16-20 августа 2008), втором ежегодном собрании монреальского диабетического центра (МОКС, Монреаль, Квебек, Канада, 11 января

2008), конференции канадского протеомического общества (Квебек, Квебек, Канада, 9 мая 2008), десятом ежегодном конгрессе студентов и молодых ученых исследовательских центров госпиталей Монреаля (Монреаль, Квебек, Канада, 18 декабря 2007), XXIII конгрессе студентов университета Монреаля (Монреаль, Квебек, Канада, 12 июня 2008), 54-ой ежегодной конференции американского масс-спектрометрического общества (Сиэтл, Вашингтон, США, 28-31 мая 2006) и симпозиуме по протеомике и биоинформатике в Кейстоуне (Кейстоун, Колорадо, США, 8-13 апреля 2005).

Результаты работы опубликованы в восьми печатных работах, в том числе в одной статье в рецензируемом научном журнале.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы из 171 наименований. Работа изложена на 151 страницах и включает 48 рисунков и 12 таблиц

Содержание работы

Выделение фосфопептидов на сефадексе-С25 модифицированном алюминием

Нами была разработана новая аффинная фаза для концентрирования фосфопептидов, представляющая из себя кросс-сшитый декстран сефадекс-025, ковалентно модифицированный гидроксидом алюминия. Для модификации было использовано взаимодействие триэтилалюминия с гидроксильными группами, содержащимися в составе сефадекса (Рис. 1). При хроматографическом разделении фосфо-группы на пептидах образуют комплексы с ионами алюминия, приводя к удерживанию фосфопептидов на фазе. Элюирование фосфопептидов осуществляют 50 мМ фосфатным буфером.

Принципиальное отличие нашей фазы от ранее разработанных фаз заключается в способе иммобилизации иона металла В методах, относящихся к IMAC (хроматография на фазах с иммобилизованными ионами металлов, от англ Immobilised Metal Affinity Chromatography) [Porath J. et al, 1975], взаимодействие металла с фазой осуществляется за счет хелатирования иона металла, тогда как методы, использующие оксиды металлов (в основном, TiCbHPinkse M.W. et al., 2004], не содержат «инертной» фазы как таковой. Мы предполагали, что ковалентная

иммобилизация металла на поверхности сефадекса приведет к более прочному связыванию металла, что уменьшит потерю фосфопептидов при хроматографии.

°н ЕуЧ;/гексан "Л-<\н

о.

А1(ОН) 5

А1{ОН) 2

Рис. 1. Схема модификации сефадекса G25 триэтилалюминием На первой стадии происходит замещение протонов гидроксильных групп на диэтилалюминиевые группы Последующий гидролиз которых сопровождается заменой этильных групп на гидроксильные

Сравнение прочности связывания ионов алюминия на синтезированной фазе и IMAC-фазе, представляющей из себя коммерчески доступную сефарозу с иммобилизованными имидодиацетатными группами (Таблица 1), показало, что разработанная фаза характеризуется более прочным удерживанием металла, несмотря на то, что удельное содержание алюминия в ней ~ 18 раз выше (1,33 ммоль А1 грамм*1 против 0,074 ммоль А1 грамм'1 для IMAC). Тестирование эффективности выделения фосфопептидов и оптимизация условий разделения были выполнены с модельными белками: альфа-казеином и бычьим сывороточным альбумином (БСА). Белки были энзиматически расщеплены трипсином и полученные пептидные смеси (дайджесты) использовались для тестирования концентрирования фосфопептидов.

Таблица 1. Элюирование алюминия с аффинной фазы в буферных растворах со значениями рН 5, 6, 7 и 8 Для сравнения использовалась IMAC фаза (сефароза, модифицированная имидодиацетатными группами (ИДА), заряженная ионами алюминия) Измерение концентрации алюминия проводили спектрофотометрически при помощи 8-оксихинолина Концентрация алюминия выражена в наномоль*мл"'*мг"'

Фаза рН

5 6 7 8

Сефароза-ИДА 0 83 0.22 0 22 1 1

Сефадекс G25 0 07 0 04 0 05 0.05

Тестирование эффективности выделения фосфопептидов и оптимизация условий разделения были выполнены с модельными белками: альфа-казеином и бычьим сывороточным альбумином (БСА). Белки были энзиматически расщеплены трипсином и полученные пептидные смеси (дайджесты) использовались для концентрирования фосфопептидов.

Исследование зависимости эффективности связывания фосфопептидов от рН среды было проведено в буферных растворах со значениями рН от 2 до 8 Полученные результаты (Рис. 2) показали, что оптимальным значением рН для выделения фосфопептидов является рН=6. При этом аффинная фаза эффективно

связывает все фосфопептиды, а использование 50 мМ фосфатного буфера позволяет провести их полное элюирование.

При использовании смеси дайджестов казеина и БСА была обнаружена высокая степень неспецифического связывания. На фазе удерживались не только фосфопептиды, но и значительная часть нефосфорилированных пептидов из БСА (Рис. ЗА). Взаимодействие нефосфорилированных пептидов с фазой может быть объяснено наличием в их составе кислородсодержащих донорных групп, способных взаимодействовать с ионами алюминия.

рН

Рис. 2. Зависимость количества фосфопептидов в элюате (в % от содержания в исходном образце) от значения рН среды при выделении фосфопептидов.

К таким группам можно отнести в первую очередь карбоксильные группы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Гидроскильные группы в составе серина, треонина и тирозина при рН 6 обладают слабыми донорными свойствами, а для «мягких» N - и 8 - доноров не характерно образование прочных связей с «жестким» ионом алюминия. В этой связи для уменьшения неспецифического связывания в состав буфера были введены аспарагиновая и глутаминовая кислоты, которые, не препятствуя масс-спектрометрическому анализу, способны конкурентно заблокировать взаимодействия карбоксильных групп пептидов с ионами алюминия. Данные представленные на Рис. ЗБ свидетельствуют о том, что данная модификация способствует значительному снижению неспецифического связывания.

Для определения емкости фазы использовалось «титрование» казеином. На 50 мг аффинной фазы последовательно наносили порции, содержащие по 30 мкг дайджеста казеина в буфере, содержащем 50 мМ аспарагиновую и глутаминовую кислоты (рН=6). Концентрация фосфопептидов в образцах, прошедших через фазу измерялась при помощи масс-спектрометрии. Как видно из результатов, приведенных на Рис. 4, фаза насыщается после нанесения 150 мкг пептидов казеина (~ 0.7 нмоль фосфогрупп). При дальнейшем нанесении пептидов во фракциях прошедших через фазу, начинают появляться фосфопептиды. При этом прочность связывания фосфопептида на фазе увеличивается с ростом степени его фосфорилирования. Так,

после превышения емкости фазы, при добавлении новых порций казеина дважды фосфорилированный пептид 0Ю(р8)Е(р8)ТЕ0(ЗАМЕ01К начинает вытеснять связанные монофосфорилированные пептиды.

1000 1100 1200 т/2

Рис. 3. Масс-спектры элюатов после концентрирования фосфопептидов из смеси казеина и БСА в отсутствие (А) и при добавлении 50 мМ аспарагиновой и глутаминовой кислот (Б). Стрелками обозначены сигналы соответствующие фосфопептидам.

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Казеин, мкг

Рис. 4. Определение емкости аффинной фазы. На 50 мг фазы последовательно наносили 30 мкг порции пептидов казеина. Количество фосфопептидов прошедших через фазу без связывания измерялось масс-спектрометрически.

Для тестирования эффективности выделения фосфопептидов из сложных белковых смесей, был использован препарат белков, выделенных из печени мыши. Полученный в ходе концентрирования элюат был проанализирован хроматомасс-спектрометрически с целью определения неспецифически связанных нефосфорилированных пептидов. В результате анализа было обнаружено 26

фосфопептидов, содержащих 29 сайтов фосфорилирования и 6 нефосфорилированных пептидов.

К достоинствам разработанного метода следует прежде всего отнести высокую специфичность и методическую простоту процедуры выделения фосфопептидов. Ковалентная иммобилизация алюминия на стационарной фазе приводит к прочному взаимодействию металла и фазы, что, в свою очередь позволяет проводить варьирование условий разделения в широких пределах, не опасаясь элюирования алюминия и потери фосфопептидов. В настоящей работе хроматографическое разделение проводилось с использованием спин-колонок, что обеспечивало эффективное отделение фазы от образца и сильно упрощало процесс выделения, который занимал всего около 30 мин. В то же время разработанный метод полностью совместим с ВЭЖХ при условии изготовления соответствующих колонок. Такая модификация позволит анализировать микроколичества веществ из труднодоступных биологических образцов. Необходимо также отметить невысокую стоимость реагентов, использующихся для синтеза аффинной фазы.

Двух стадийное выделение фосфорилированных белков и пептидов

Для повышения специфичности выделения фосфопептидов нами был разработан подход, сочетающий выделение фосфобелков и фосфопептидов (Рис. 5) на IMAC фазе с хелатированными ионами алюминия (IDAS-AI, от англ. Iminodiacetic Acid Sepharose charged with Aluminum ions).

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая принцип анализа фосфопротеома с использованием двухстадийного выделения фосфорилированных белков и пептидов

На первой стадии анализа проводится аффинное выделение фосфобелков. Это позволяет уменьшить сложность образца, избавившись от нефосфорилированных белков, не представляющих интерес для исследования (на этой стадии происходит также отделение многих структурных и внеклеточных белков, таких как альбумин,

гемоглобин, кератин и актин). Выделенные фосфобелки осаждают трихлоруксусной кислотой и энзиматически расщепляют до пептидов, после чего из полученной смеси выделяют фосфопептиды Необходимо отметить, что масс-спектрометрический анализ проводится не только для фосфопептидов, но также для нефосфорилированных пептидов из фосфобелков. Это дает дополнительную информацию для подтверждения правильности идентификаций фосфобелков и может использоваться для количественного сравнения концентрации белков между образцами. Как нетрудно заметить, такое сравнение может проводиться даже для белков, для которых соответствующие фосфопептиды не были детектированы.

Эффективность выделения фосфопептидов была протестирована с использованием смеси пептидов казеина (20%), БСА (60%) и овальбумина (20%). При этом было показано высокоспецифичное и количественное выделение для всех фосфопептидов казеина и овальбумина (Рис. 6 и Таблица 2).

HQGLPQEVLNENLLR, тУ1»В8141

- - исходный образец

— фосфоэлюат

27 5 30 0 32 5 35 0 время,МИН 2 5 37 5 4 0 42 5 врбМЯ.МИН

Рис. 6. Хроматограммы фосфопептида VPQLEIVPNsAEER и нефосфорилированного пептида HQGLPQEVLNENLLR в исходном образце и элюате, иллюстрирующие количественное и специфическое выделение фосфопептидов на IDAS-AI

Таблица 2. Фосфопептиды, детектированные в элюате

Z Счет Фосфосайт Пептид m/z Белок

3 21.44 S130 YKVPQLEIVPNsAEER 651.47

2 14.2 S130 VPQLEIVPNsAEER 831.23

2 13.12 S61/S63 DIGsEsTEDQAMEDIK 964.35 Альфа-

2 14.83 S61 DIGsESTEDQAMEDIK 925.03 казеин

2 16.4 Т159 TVDMEStEVFTK 733.88

3 19 49 S46 NMAINPsKENLCSTFCK 699.03

2 15.7 S345 EVVGsAEAGVDAASVSEEFR 1044.98 Овальбумин

Эффективность выделения фосфорилированных белков на IDAS-AI была продемонстрирована на примере лизата клеток линии HeLa. При этом было проведено сравнение нашего метода с коммерчески доступным аффинным гелем для выделения фосфобелков (Phosphoprotein purification kit, Qiagen) (Рис. 7). Экстракция клеточных белков проводилось как в нативных условиях (50 мМ МЕС, рН=6, в отсутствии детергента), так и в 6М мочевине, вызывающей денатурацию белков и,

как следствие, инактивацию всех клеточных протеаз и фосфатаз а также способствующей более эффективной солюбилизации белков. Обе фазы показали схожую селективность в системе, не содержащей мочевины.

В то же время в присутствии мочевины для синтезированной нами фазы эффективность выделения не изменилась. Таким образом, выделение фосфобелков может проводиться в денатурирующих условиях, полностью исключающих активность протеаз и фосфатаз. Выделенные в ходе этого эксперимента фосфобелки были сконцентрированы, расщеплены трипсином и полученные пептидные смеси были использованы для концентрирования фосфопептидов. При этом мы провели сравнение между нашей и коммерчески доступной (Phosphopeptide isolation kit, Pierce biotechnologies) фазами для выделения фосфопептидов. Результаты (Таблица 3) показали, что около 90% всех пептидов выделенных на нашей фазе являются фосфорилированными, в то время как для коммерчески доступной фазы этот параметр составил ~ 60%.

н о.

1 I

1J ÄKS

OTl^Ill I.Ii ц.(

6 <

О <

— Ä i-ä

6Г

——

г., , ГГ-Ч ... . FT-Sur

Silver stain ProQ Diamond stain

Рис. 7. Сравнение эффективности выделения фосфобелков из клеток HeLa с использованием сефарозы с иммобилизованным алюминием (IMAC-A1) и коммерчески доступной фазы (Qiagen). На акриламидный гель были нанесены образцы до разделения (L), а также фракции удержанные на фазе (Е) и прошедшие через нее без связывания (FT). Белки на геле были окрашены серебром (А), фосфорилированные белки были окрашены ProQ Diamond (Б).

Таблица 3. Сравнение эффективности выделения фосфопептидов между нашей фазой (IMAC-A1) и коммерчески доступной фазой (Pierce kit)

Метод № анализа Фосфо-пептиды нефосфорили-рованиые пептиды Селективность, %

IMAC-A1 1 44 6 88

2 39 4 91

Pierce kit 1 44 27 62

2 38 22 63

Для оценки специфичности связывания и элюции фосфобелков мы провели эксперименты с лизатом клеток HeLa, меченных в культуре радиоактивным фосфатом 32Р. Результаты измерения радиоактивности в полученных в ходе выделения фракциях, показали, что специфическая радиоактивность (количество распадов в минуту на 1 мг белка) для элюата в среднем в 6 раз выше, чем в исходном клеточном лизате. В то же время в белковых фракциях, прошедших через колонку без задержки, удельная радиоактивность значительно снижена

Разработанный метод был использован нами для анализа фосфорилирования цитозольных белков печени крыс стимулированных инсулином. После двухстадийного выделения фосфорилированных белков и пептидов, фракции, соответствующие фосфопептидам и нефосфорилированным пептидам были разделены при помощи двумерной ВЭЖХ с использованием анионообменной хроматографии и хроматографии на обращенной фазе С18, и проанализированы с помощью масс-спектрометрии.

Используя 5 мг белка из каждой биологической реплики, мы детектировали 3267 различных пептидов из 1311 белков (Рис. 8). При этом 797 (~60%) из них согласно литературным данным являются фосфорилированными. 669 белков, для каждого из которых было детектировано два и больше пептидов, были использованы для последующего анализа.

Анализ фосфопептидного элюата привел к детектированию 500 различных фосфопептидов, содержащих 549 сайтов фосфорилирования, и 89 нефосфорилированных пептидов, что соответствует ~ 85%-ной селективности выделения 79% обнаруженных сайтов фосфорилирования содержат фосфосерин, 20% - фосфотреонин и 1% - фосфотирозин.

Сравнение распространенности различных аминокислот между 89 нефосфорилированными пептидами детектированными в фофоэлюате и всеми аминокислотными последовательностями из базы UniProt/SwissProt (Рис. 9) показало увеличенное содержание остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот (на 166% и 290% соответственно). Присутствие этих пептидов в фосфоэлюате можно объяснить

взаимодействием свободных карбоксильных групп в составе аминокислот с ионами алюминия на фазе.

Фракция нефосфорилированных пептидов:

2678 пептидов

1120 белков

199 фосфопептидов было подтверждено нефосфорилированными пептидами

Рис. 8. Фосфопептиды и фосфобелки идентифицированные в цитозоле печени крыс.

зоо ■

250 -

» 200

1 150 о.

0 Ч

8 юо о>

1 50

I '

* -бо о

-100 -150 -1

Т¥

ТГГ" к

|Т¥

аминокислота

Рис. 9. Содержание различных аминокислот в нефосфорилированных пептидах детектированных в фосфоэлюате по сравнению со средней распространенностью аминокислот в белковой базе данных ишРгй/Бу^ззРго!.

Интересно отметить, что для 199 фосфопептидов нами были обнаружены нефосфорилированные пептиды из соответствующих белков, что показывает важность параллельного анализа нефосфорилированной фракции пептидов как источника дополнительной информации.

Для оценки воспроизводимости мы проанализировали три образца полученные из различных животных. В каждой реплике было детектировано от 495 до 585 белков

(2 и более пептида для каждого белка). 375 (56%) белков было обнаружено во всех трех репликах, а белки детектированные только в одной реплике составляли всего 10% от общего количества (Рис. 10).

400 350 300 250 200

1 2 3

Рис. 10. Распределение идентифицированных белков между репликами (А) и соотношение количеств белков детектированных в Зх, 2х и 1 ой реплике (Б).

Подобные различия между репликами стандартны для протеомного анализа, и, наиболее вероятно, являются следствием информационно-зависимого выбора ионов для фрагментации. Т.к. образец характеризуется сложным пептидным составом, выбор ионов для фрагментации будет различаться между анализами, приводя к различию в идентифицированных пептидах и, соответственно, белках.

Для анализа биологических функций и внутриклеточного распределения детектированные белки были аннотированы при помощи «онтологии генов» (GO, от англ. GeneOntology, www.geneontology.org). Функциональные связи между белками были проанализированы с помощью программного пакета Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com). Функциональное и клеточное распределение белков приведено на Рис. 11. Т.к. крысы были стимулированы инсулином, то мы ожидали детектировать белки, которые подвергаются фосфорилированию в процессе переноса инсулинового сигнала. Нами был обнаружен 31 фосфобелок связанный с переносом сигнала от инсулинового рецептора (Рис. 12), для которых было детектировано 7 новых и 10 ранее описанных сайтов фосфорилирования. Сравнение наших результатов с работой Уайта и сотрудников [White F. et al., 2006], в которой было детектировано 299 фосфопептидов из 223 белков в печени крысы, выявило только 92 общих фосфопептида. Таким образом, наши данные содержат информацию о новых сайтах фосфорилирования белков, еще не описанных в литературе.

В целом, приведенные данные свидетельствуют об эффективности предложенной схемы анализа фосфопротеома, основанной на двухстадийном выделении фосфорилированных белков и пептидов. Данный подход позволяет не только увеличить общую селективность выделения фосфопептидов, но и упрощает последующий биоинформатический анализ за счет наличия дополнительной информации, получаемой в ходе анализа нефосфорилированных пептидов. В силу

этого, метод может эффективно использоваться для анализа сложных биологических образцов.

Эндоплазматический , Митохондрия ретикулум,

Цитоскеле1 * /о 2%

Ядро, 25%

Экспрессия генов, 11%

Синтез белка, 10%

Клеточная смерть,

15% Плазматическая

мембрана, 6%

Пост-трансляционные Д Модификации, 5%

Метаболизм

Транспорт, 6%

Метаболизм жиров, Цитозоль,

11% 53%

Клеточный рост, 18%

Структурные белки, 12%

Рис. 11. Распределение детектированных белков по функциям (А) и по компонентам клетки (Б).

Тгапвспрйоп-ОАрорЮ515

Рис. 12. Схема передачи сигнала от инсулинового рецептора. Детектированные нами фосфобелки выделены красным цветом.

Измерение стехиометрии фосфорилирования белков

Фосфорилирование белков представляет собой один из основных регуляторных механизмов клетки. При этом тот или иной белок может проявлять свою функцию только в фосфорилированном состоянии или наоборот. Таким образом, соотношение между концентрациями фосфорилированной и нефосфорилированной фракциями белка может влиять на его активность в том или ином процессе. В настоящее время большинство протеомических исследований основаны на выделении фосфорилированных белков и/или пептидов, что приводит к потере нефосфорилированной части образца и делает определение стехиометрии фосфорилирования невозможным.

В данной части работы для измерения стехиометрии фосфорилирования в сложных белковых смесях нами был использован подход, основанный на комбинации изотопной модификации и энзиматического дефосфорилирования пептидов (Рис. 13).

Рис. 13. Общая схема определения стехиометрии фосфорилирования с использованием изотопного мечения и энзиматического дефосфорилирования Доля нефосфорилированного пептида в смеси выражена в процентах

Белки денатурируют и расщепляют протеазами (например, трипсином). Далее полученные пептиды разделяют на две равные части, которые модифицируют легкой и тяжелой формами изотопных меток, синтезированных в нашей лаборатории (Рис. 14). В ходе реакции происходит замещение пентафторфенильной группы на аминогруппу пептида и образуется амидная связь. Эффективность изотопной модификации для сложных пептидных смесей (отношение числа модифицированных пептидов к общему количеству пептидов) составляет в среднем около 70%. Далее одна из частей обрабатывается щелочной фосфатазой, что приводит к полному дефосфорилированию пептидов. Поле инактивации фосфатазы посредством осаждения трихлоруксусной кислотой обе части смешивают и анализируют при помощи хроматомасс-спектрометрии. При этом соотношение нефосфорилированных

форм пептида в образце необработанном и обработанном фосфатазой используется для определения стехиометрии фосфорилирования.

Данный подход был протестирован нами для пептидов, полученных при протеолизе альфа-казеина. При этом была успешно определена стехиометрия фосфорилирования для всех ранее описанных фосфосайтов казеина (Error! Reference source not found.).

Группа несущая изотопы

Реакционная группа

Рис. 14. Химическая структура изотопных меток Молекула метки содержит реакционоспособную группу, взаимодействующую с М-терминальными аминогруппами пептидов (пентафторфениловый эфир) и группу, несущую стабильные изотопы (фенильная группа, содержащая 6 атомов изотопа С12 или 6 атомов изотопа С13)

Таблица 4. Пептиды альфа-казеина фосфорштирование которых было обнаружено по соотношению изотопных форм в образцах обработанных и необработанных фосфатазой Сайты фосфорилирования выделены строчными буквами

Пептид Фосфосайт Отношение форм Станд. отклон. % фосфорилирования

DIGsEsTEDQAMEDIK S61 /63 83 06 88

QMEAEsIsssEEIVPNSVEQK S79/81 /82/83 86 06 88

TVDMEsTEVFTK S158 7 05 86

NMAINPsK S46 66 04 85

YKVPQLEIVPNsAEER S130 6.4 03 84

Для определения точности измерения стехиометрии были использованы смеси, содержащие нативный и энзиматически дефосфорилированный казеин в соотношениях от 1:9 до 9:1, которые имитировали различную степень фосфорилирования белка При этом данные анализа показали, что значения степени фосфорилирования пептидов, экспериментально определенные с использованием описанного подхода, хорошо коррелируют с рассчитанными (Рис. 15). Ошибка определения в основном зависит от точности измерения интенсивности сигнала (соотношение сигнал/шум) и может быть значительно снижена при использовании масс-спектрометров с более высокими показателями разрешения и чувствительности.

Разработанный метод был использован для измерения стехиометрии фосфорилирования белков в адипоцитах мыши при стимуляции липолиза Использовалось две группы мышей - контрольная группа и группа, которой была сделана внутрибрюшинная инъекция фармакологического агониста бета-адренергетического рецептора, что должно было стимулировать процессы липолиза в жировой ткани. Эксперимент был выполнен для трех биологических реплик. Гомогенизация жировой ткани проводилась в присутствии ингибиторов протеаз и фосфатаз.

г?

0) 2

тс го

о о. 0> г

Ожидаемая стехиометрия, % Рис. 15. Корреляция между экспериментально определенными и рассчитанными значениями стехиометрии фосфорилирования на примере фосфопептида казеина УКУРС^ЕХУРИзАЕЕЯ

Для выделения жировых капель использовалось низкоскоростное центрифугирование (17д) при котором жировые капли концентрируются в виде липидного слоя над супернатантом и осадком. В соответствии с результатами проведенных иммуноблотов, в полученных таким образом образцах концентрация белков-маркеров жировых капель перилипина и гормонально-регулируемой липазы (НБЬ) увеличена приблизительно в 5 раз по сравнению с исходным гомогенатом. В то же время наблюдается значительное снижение концентрации маркеров плазматической мембраны (Аннексии 1), цитоскелета (Актин), лизосом (лизосомальный мембранный гликопротеин-1), цитозоля (ГАФД) и митохондрий (Цитохром-с). Мы также обнаружили значительную концентрацию калретикулина (маркер эндоплазматического ретикулума) в жировых каплях, что может быть объяснено их образованием путем эволюции пузырьков эндоплазматического ретикулума (Рис. 16).

После изотопного мечения, обработки фосфатазой и объединения, образцы из каждой реплики были разделены на 48 фракций при помощи анионообменной ВЭЖХ, каждая из которых была проанализирована хроматомасс-спектрометрически.

В результате масс-спектрального анализа нами было идентифицировано 385 белков, для каждого из которых было обнаружено как минимум 2 различных пептида

,„ ш ш

0 а о

1 -j

а о

X _1

Перилипин

Глицеральдегид-З-фосфат Дегидрогеназа (GAPDH)

Калретикулин

Гормонально регулируемая липаза (НЭЬ)

« »

• • шВР

» * м

ИИ я*

Цитохром-С Актин

Аннексины I и II

Лизосомный мембранный гликопротеин 1 (LAMP 1)

NaVK'-атфаза

Рис. 16. Результаты иммуноблотов с образцами гомогената жировой ткани (Нв) и белковыми экстрактами жировых капель (ЬОЕ1/2).

Полученные соотношения между изотопными формами пептидов были использованы для вычисления стехиометрии фосфорилирования. При анализе учитывалось, что отклонение соотношения изотопных форм от единицы может быть следствием не только фосфорилирования, но и ряда других параметров (ошибки в количественном измерении и интерпретации масс спектров, низкая интенсивность сигнала, наложение сигналов и т.д.). В этой связи критерии дискриминации фосфорилированных и нефосфорилированных пептидов были определены исходя из распределения изотопных соотношений для совокупности пептидов, которые не могут быть фосфорилированы т.к. не содержат в своем составе серина, треонина и тирозина (Рис. 17А). Данное распределение использовалось в дальнейшем как «нулевая гипотеза», что позволило для каждого значения соотношения изотопных форм пептидов рассчитать вероятность того, что данное соотношение было получено случайно (параметр Р). Как и ожидалось, отклонение изотопных соотношений от 1 уменьшается с ростом интенсивности сигналов изотопных форм (Рис. 17Б).

- __ lll|llli...r— —

Изотопное соотношение

Интенсивность сигнала

ы о

О -о

Рис. 17, Гистограмма распределения изотопных соотношений для нефосфорилированных пептидов (среднее -0.05, стандартное отклонение 0.26) (А) и влияние интенсивности сигнала на отклонение изотопного соотношения от единицы (Б).

Для пептидов со статистически значимым (Р<0.05) отклонением соотношения изотопных форм от единицы была дополнительно проведена проверка, основанная на визуальном сравнении ионных хроматограмм, соответствующих разным изотопным формам пептида. Для 7 пептидов нами были обнаружены изменения изотопных соотношений в различных образцах, что указывает на их фосфорилирование/ дефосфорилирование в ответ на стимуляцию липолиза.

Нами было обнаружено, что при стимуляции липолиза происходит фосфорилирование пептидов Е40,8ЕМЕРЕ8ЕР1ЮГОЫР8ЛЕАЕ114М (Рис. 18) и 0458Ь8АР8СРСЕВВК47° (соотношение форм между образцами 1 : 1.4) из перилипина - белка, который играет важную роль в формировании поверхности липидной капли. Помимо этого мы также обнаружили увеличение стехиометрии фосфорилирования (от 38% в контрольном образце до 80 в стимулированном) для пептида 85"У8ЕААЕА<ЗРЕСЕЕСТОТЬКК577 из гормонально-регулируемой липазы, содержащего два ранее описанных в литературе положения фосфорилирования (8557/8559). Эти данные хорошо согласуются с описанной в литературе гипотезой о том, что при стимуляции липолиза фосфорилированный перилипин изменяет конформацию на поверхности жировой капли, открывая тем самым доступ к триглицеридам для гормонально-регулируемой липазы, которая, в свою очередь, актривируется при фосфорилировании серина 559. Также нами были обнаружены изменения в фосфорилировании белков, участвующих в поддержании структуры и подвижности клетки (альфа-спектрин), метаболизме (аполипопротеин А1, малатдегидрогеназа) и переносе сигнала (дельта связывающийся белок белковой киназы С).

Липолиз

Контроль

1360 т/г

Рис. 18. Соотношение изотопных форм пептида Е4098ЬМЕРЕ5ЕРКОШЫР8ЛЕАЕН4:™ из перилипина На рисунке показаны изотопные кластеры и ионные хроматограммы характеризующие соотношение изотопных форм в образце где был стимулирован липолиз (А) и в контрольном образце (Б)

Для подтверждения идентификации фосфопептидов и определения положений их фосфорилирования были проведены эксперименты, включающие аффинное выделение фосфопептидов и последующий хроматомасс-спектрометрический анализ. Для концентрирования фосфопептидов мы использовали описанную ранее сефарозу, модифицированную ионами алюминия (IDAS-AI). Всего в эксперименте было обнаружено 15 фосфопептидов. При этом, было получено подтверждение фосфорилирования вышеупомянутых пептидов из перилипина и HSL, а также обнаружено несколько новых фосфопептидов из этих белков. Интересно отметить, что из 7 фосфопептидов соответствующих перилипину, данные по измерению стехиометрии фосфорилирования указывают на значительную степень фосфорилирование только 2 из них (S410 и S460). Соотношения изотопных форм для пептидов, содержащих оставшиеся пять положений фосфорилирования (S81/130/174/222/492) статистически не отличаются от 1. Таким образом, несмотря на присутствие в образце форм перилипина фосфорилированных по данным положениям, их доля от общего количества перилипина и, соответственно, биологическая роль незначительны.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что разработанный метод пригоден для идентификации и определения стехиометрии фосфорилирования фосфобелков в составе как простых (смесей нескольких белков), так и сложных белковых смесей. Прямое сравнение между фосфорилированной и нефосфорилированной частями пептида методом масс-спектрометрии осуществить сложно, т.к. наличие фосфогруппы может оказывать сильное влияние на ионизацию пептида. Наш метод позволяет обойти это препятствие, т.к. при его использовании стехиометрия фосфорилирования пептида определяется путем сравнения нефосфорилированных частей пептида между исходным образцом и образцом обработанным фосфатазой. Таким образом, разработанный метод предоставляет количественную информацию о степени фосфорилирования белков и позволяет проводить сравнение фосфорилирования между несколькими образцами. К тому же, аналогичный подход может быть применен для анализа других посттрансляционных модификаций (при использовании соответствующих ферментов).

Основные результаты и выводы

1. Синтезирована новая аффинная хроматографическая фаза для выделения фосфопептидов из сложных смесей. Фаза характеризуется высокой селективностью, а процесс выделения является относительно быстрым и не требует применения дополнительного дорогостоящего оборудования. Условия выделения фосфопептидов были оптимизированы с целью увеличить селективность метода. Фаза была успешно применена для анализа биологических образцов.

2. Разработан метод анализа фосфопротеома, основанный на двухстадийном выделении фосфорилированных белков и пептидов. Эффективность выделения была продемонстрирована как для простых (смеси очищенных белков), так и для сложных (клеточный лизат) белковых образцов. Сравнение с коммерчески доступными решениями, показало, что разработанная нами аффинная фаза для выделения фосфорилированных белков и пептидов обладает большей специфичностью. После оптимизации условий выделения, метод был успешно использован для анализа фосфорилированных белков из цитозольной фракции печени крыс стимулированных инсулином.

3. Для определения стехиометрии фосфорилирования белков был разработан метод, основанный на изотопной модификации пептидов и энзиматическом дефосфорилировании. Оптимизация условий эксперимента была проведена с использованием смесей очищенных белков. При этом была показана хорошая корреляция между рассчитанной и экспериментально определенной стехиометрией фосфорилирования пептидов. Метод был успешно применен для исследования стехиометрии фосфорилирования белков в жировых каплях адипоцитов мыши

Публикации по теме диссертации

1. Каньшин Е.Д., Нифантьев И.Э., Пшежецкий А.В. " Синтез и тестирование новой аффинной фазы для обогащения и последующего масс-спектрометрического анализа фосфопептидов "// Масс-спектрометрия 5(3), 195 (2008).

2. Е. Kanshin, S.P. Wang, M. Ashmarina, G.A. Mitchell, I. Nifant'ev and A.V. Pshezhetsky // "Analysis of stoichiometry of protem phosphorylation in adipocyte lipid droplets by isotopic tagging"// 7th Annual World Congress HUPO 2008, Amsterdam, The Netherlands, 16-20 August 2008, p. 51.

3. E. Kanshin, M. Fedjaev, K. Vetrogon, S. Wang, G. Mitchell, A.V. Pshezhetsky // "Analysis of stoichiometry of phosphorylation in proteins by combination of N-terminal isotopic tagging and enzymatic dephosphorylation" // Second Annual Retreat of the Montreal Diabetes Center, Montreal, Quebec, Canada, Jan 11,2008, p. 23.

4. E. Kanshin, M. Fedjaev, K. Vetrogon, S. Wang, G Mitchell, A.V. Pshezhetsky // "Analysis of stoichiometry of phosphorylation in proteins by combination of N-terminal isotopic tagging and enzymatic dephosphorylation: application to complex biological samples" // Canadian proteome society regional meeting, Quebec city, Quebec, Canada, May 9,2008, p. 17

5. E. Kanshin, M. Fedjaev, K. Vetrogon, A.V. Pshezhetsky "Quantitative Phosphoproteomics. combination of Stable Isotopic Labeling of peptides and 2-step phosphopurification" // 10e Congres des étudiants et stagiaires du CRCHUM, Montreal, Quebec, Canada, Dec 18, 2007, p. 25

6. E. Kanshin, S.P. Wang, G. Mitchell, A.V. Pshezetsky "Analyse stoechiometrique de la phosphorylation des proteines" // XXIII congres annuel de la recherche des étudiants gradues et post-gradues, Montreal, Quebec, Canada, June 12,2008, p. 56.

7. M. Fedjaev, E. Kanshin, A. Mazur, I. Nifant'ev, A. Pshezhetsky "Global Isotopic Labeling of Protein Digests' Application in Quantitative Proteomics and Phosphoproteomics" // 54th Annual ASMS Conference, Seattle, Washington, USA, May 28 -31,2006.

8. M. Fedjaev, E. Kanshin, O. Shirobokov, I. Nifant'ev, A. Pshezhetsky "SIMPL: A Novel Technology for Protein Quantification Based on Isotopic Labeling" // Keystone Symposium on Proteomics and Bioinformatics, Keystone, Colorado, USA, Apr 8- 13, 2005.

Заказ № 162/10/08 Подписано в печать 20 10.2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.ru; e-mail info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Каньшин, Евгений Дмитриевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Масс-спектрометрическое секвенирование белков.

2.1.1. Деградация Эдмана.

2.1.2. Бомбардировка быстрыми атомами.

2.1.3. Ионизация в электроспрее.

2.1.4. Ионизация MALDI.

2.1.5. Тандемные масс-спектрометры.

2.1.6. Основы интерпретации МС-МС спектров.

2.2. Фосфопротеомика.

2.2.1. Селективное фосфоконцентрирование.

2.2.2. Масс-спектрометрия в фосфопротеомике.

2.2.3. Сравнительная фосфопротеомика.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков с использованием методов изотопного мечения и селективного концентрирования"

В настоящее время протеомика является одной из наиболее актуальных и быстро развивающихся областей молекулярной биологии. Эта наука занимается изучением клеточных протеомов (англ. proteome), то есть наборов белков данной клетки (организма) в данной фазе развития в определенный момент времени.

Данная наука возникла как продолжение геномики - науки, занимающейся расшифровкой геномов. Термин «протеом» своим происхождением обязан словам protein (белок) и genome (геном), и был впервые употреблен на конференции по двухмерному электрофорезу в 1994 году в Сиенне, Италия.

Возникновение протеомики вслед за геномикой обусловлено тем, что в клетках организмов никогда не происходит экспрессии всех имеющихся в наличии генов, поэтому информация о геноме дает только информацию о том какие белки принципиально могут присутствовать в клетке. Результатом генной экспрессии является образование белка. Поскольку белки являются основой всех процессов, происходящих в клетках, именно они являются наиболее интересным объектом для изучения.

Безусловно, основным вызовом для протеомики является изучение механизма взаимодействия около 300,000 белков в человеческом организме. Для подобных исследований требуются мощные аналитические технологии.

До недавнего времени большая часть работ в протеомике выполнялась с использованием двумерного гель-электрофореза, однако этот метод показал себя недостаточно эффективным. Объем работ, которые необходимо выполнить в рамках протеомики, требует использования методов и приборов, отличающихся большими производительностями, информативностью и чувствительностью. В роли таких методов на сегодняшний день выступает масс-спектрометрия в сочетании с различными техниками разделения белков и пептидов (ВЭЖХ, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез и т.д.).

Особое внимание в современной протеомике уделяется изучению фосфорилирования белков, что объясняется чрезвычайной важностью данной посттрансляционной модификации. Обратимое фосфорилирование белков является одним из основных механизмов регуляции их активности в широком спектре клеточных процессов. В соответствие с предсказаниями, основанными на анализе баз данных белковых последовательностей, в протеоме млекопитающих содержится как минимум 105 сайтов фосфорилирования (wwvv.phosphosite.org). Согласно другой оценке, оклоло 30-50 всех белков могут содержать фосфорилированые остатки аминокислот, что делает фосфорилирование также одной из наиболее распространенных посттрансляционных 5 модификаций белка. Изучение всей совокупности фосфорилированных белков в клетке (фосфопротеома) является задачей отдельной области протеомики - фосфопротеомики.

Основной целью данной диссертационной работы было создание группы методов, которые могли бы использоваться в современной фосфопротеомике для определения фосфорилированных белков в образце, аминокислотных остатков, по которым они фосфорилированы (сайтов фосфорилирования) и их стехиометрии фосфорилирования.

2. Литературный обзор.

Общей задачей масс-спектральных экспериментов является определение структуры различных молекул. Протеомика анализирует белки и соответствующие им пептиды.

Первая попытка использования масс-спектрометрии для определения аминокислотной последовательности пептидов была выполнена в 1959 году [1]. В своем воплощении она явилась лишь демонстрацией принципиальной возможности определения структуры пептидов с помощью масс-спектрометрии наряду с другими биомолекулами, например, алкалоидами, для анализа которых масс-спектрометрия в то время уже успела себя зарекомендовать. Реализованный метод имел ряд ограничений и, кроме того, был довольно трудоемким - включал в себя предварительную модификацию пептидных связей до вторичных аминов и карбоксильных групп до силиловых эфиров соответствующих спиртов (для увеличения гидрофобности, что позволяло использовать газовую хроматографию и ионизацию электронного удара, которые являлись тогда основными техниками).

Таким образом, предложенный метод не смог составить конкуренцию химическим подходам к определению аминокислотной последовательности, использовавшимся в то время.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Каньшин, Евгений Дмитриевич

5. Выводы.

2. Разработан метод анализа фосфопротеома, основанный на двухстадийном выделении фосфорилированных белков и пептидов. Эффективность выделения была продемонстрирована как для простых (смеси очищенных белков), так и для сложных (клеточный лизат) белковых образцов. Сравнение с коммерчески доступными решениями, показало, что разработанная нами аффинная фаза для выделения фосфорилированных белков и пептидов обладает большей специфичностью. После оптимизации условий выделения, метод был успешно использован для анализа фосфорилированных белков из цитозольной фракций печени крыс стимулированных инсулином.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Каньшин, Евгений Дмитриевич, Москва

1. K. Biemann, F. Gapp, J. Seibl, "Amino acid sequence in peptides", J. Am. Chem. Soc. 81, 2274-2275 (1959)

2. P. Edman, "Method for determination of the amino acid sequence in peptides", Acta Chem. Scand. 4, 283-293 (1950)

3. P. Edman, G.A. Begg, "A protein sequenator", Eur. J. Biochem. 1, 80-91 (1967)

4. P. Edman, "Method for determination of the amino acid sequence in peptides", Acta Chem. Scand. 4,283-293 (1950)

5. M. Barber, R.S. Bordoli, R.D. Sedgwick, A.N. Tyler, "Fast atom bombardment of solids (F.A.B.): a new ion source for mass spectrometry ", J. Chem. Soc. Chem. Commun. 7, 325-327 (1981)

6. M. Barber, R.S. Bordoli, R.D. Sedgwick, A.N. Tyler, "Fast atom bombardment of solids as an ion source in mass spectrometry ", Nature 293, 270-295 (1981)

7. F.W. Haddon, F.W. McLafferty, "Metastable Ion Characteristics. VII. Collision-Induced Metastables ", J. Am. Chem. Soc. 90, 4745 4746 (1968)

8. K.R. Jennings, "Collision-induced decompositions of aromatic molecular ions", Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1, 227-235 (1968)

9. K. Biemann, "The Primary Structure of Thioredoxin from Chromatium vinosum Determined by High-Performance Tandem Mass Spectrometry ", Anal. Chem. 58, 1289A-1300A (1986)

10. M. Yamashita, J.B. Fenn , "Another Variation on the Free-Jet Theme", J. Phys. Chem. 88, 4451-4459(1984)

11. M. Yamashita, J.B. Fenn , "Negative ion production with the electrospray ion source", J. Phys. Chem. 88, 4671-4675 (1984)

12. M. Dole, L.L. Mack, R.L. Hines, "Molecular Beams of Macroions ", J. Chem. Phys. 49, 5, 2240-2249 (1968)

13. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, В.Я.Иванов, В.И.Николаев, "Расчет свободной поверхности проводящей жидкости, находящейся в сильном электрическом поле.", Известия АН СССР, Механика жидкости и газа №6, с. 165-167. (1983)

14. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров, "Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый метод масс-спектрометрического анализа", ДАН СССР, 277, №2, с.379-383. ()

15. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров, "Прямая стыковка микроколоночного жидкостного хроматографа с масс-спектрометром", Биоорганическая химия т.10, с.710-711 (1984)

16. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров, "О механизме образования ионов при электрогидродинамическом распылении жидкости в вакуум", ЖАХ. т.39, с. 1596-1602. (1984)

17. Л.Н.Галль, М.Я.Туркина, "Возможности масс-спектрометрического анализа нелетучих и термически нестабильных биоорганических соединений. (Обзор)", Успехи химии т.65, №5, с.741-745. (1985)

18. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Г.И.Барам, М.А.Грачев, В.И.Николаев и др., "Новый массспектрометрический метод определения аминокислотной последовательности пептидов", Биоорганическая химия т.11, №5, с.705-708. (1985)

19. R.D. Smith, J.A. Loo, C.G. Edmonds, C.J. Barinaga, H.R. Udseth , "New developments in biochemical mass spectrometry: electrospray ionization", Anal Chem. 62(9):882-99. (1990)

20. A.N. Verentchikov, W. Ens, K.G. Standing, "Reflecting time-of-flight mass spectrometer with an electrospray ion source and orthogonal extraction", Anal Chem. 66(l):126-33. (1994)

21. C.M. Whitehouse, R.N. Dreyer, M. Yamashita, J.B. Fenn , "Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers", Anal. Chem. 57, 675-679 (1985)

22. J.B. Fenn, M. Mann, C.K. Meng, S.F. Wong, C.M. Whitehouse , "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules", Science 246, 64-71 (1989)

23. A. Shevchenko, M. Wilm, 0. Vorm, M. Mann, "Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels", Anal. Chem. 68, 850-858 (1996)

24. M. Wilm, A. Shevchenko, T, Houthaeve, S. Breit, L. Schweigerer, T. Fotsis, M. Mann, "Femtomole sequencing of proteins from Polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry ", Nature 379, 446-469 (1996)

25. M. Karas, F. Hillenkamp, "Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding lO'OOO daltons", Anal. Chem. 60, 2299-3201 (1988)

26. J.H. Beynon, R.G. Cooks, J.W. Amy, W.E. Baitinger, T.Y. Ridley, "Design and performance of a mass-analysed ion kinetic energy (MIKE) spectrometer", Anal. Chem. 45, 1023A-1027A (1973)

27. F.W. McLafferty, P.J. Todd, D.C. McGilvery, M.A. Baldwin, "High-Resolution Tandem Mass Spectrometer (MS/MS) of Increased Sensitivity and Mass Range", J. Am. Chem. SOC. 102, 3360-3363 (1980)

28. R.A. Yost, C.G. Enke, "Selected ion fragmentation with a tandem quadrupole mass spectrometer", J. Am. Chem. Soc. 100, 2274-2275 (1978)

29. S.A. McLuckey, G.L. Glish, R.G. Cooks, "Kinetic energy effects in mass spectrometry: mass spectrometry using a sector-quadrupole tandem instrument", Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 39, 219-230(1981)

30. S.A. McLuckey, G.J. Van Berkel, D.E. Goeringer, G.L. Glish, "Ion trap mass spectrometry. Using high-pressure ionization", Anal. Chem. 66, 737A-743A (1994)

31. K.R. Jonscher, J.R. Yates , "The quadrupole ion trap mass spectrometer—a small solution to a big challenge", Anal. Biochem. 244, 1-15 (1997)

32. M.C. Wiley, I.H. McLaren , "Time-of-Flight Mass Spectrometer with Improved Resolution ", Rev. Sei. Instrum. 26, 1150 (1955)

33. R.J. Cotter, "Time-of-Flight Mass Spectrometry: Instrumentation and Applications in Biological Research ", American Chemical Society Washington D. C. (1997)

34. A.G. Marshall, C.L. Hendrickson, G.S. Jackson , "Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: a primer", Mass Spectrom Rev. 17(l):l-35. (1998)

35. A. Comisarow, A.G. Marshall, "Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy MB", Chem. Phys. Lett. 25, 282-283 (1974)

36. M. Hardman, А.А. Makarov, "Interfacing the orbitrap mass analyzer to an electrospray ion source.", Anal Chem. 75(7): 1699-705. (2003)

37. М.И. Явор, A.H. Веренчиков, "Планарный многоотражательный времяпролетный масс-анализатор, работающий без ограничения диапазона масс", Научное приборостроение, т. 14 № 2, 38-45. (2004)

38. A.L. McCormack, J.L. Jones, V.H. Wysocki, "Surface-Induced Dissociation of Multiply Protonated Peptides", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 3, 859-862 (1992)

39. A.L. McCormack, A. Somogyi, A.R. Dongre, V.H. Wysocki, "Fragmentation of protonated peptides: surface-induced dissociation in conjunction with a quantum mechanical approach", Anal. Chem. 65, 2859-2872 (1993)

40. K.A. Cox, S .J. Gaskell, M. Morris, A. Whiting , "Role of the site of protonation in the low-energy decompositions of gas-phase peptide ions", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 7, 522-531 (1996)

41. D. E. Kalume, H. Molina, A. Pandey, "Tackling the phosphoproteome: tools and strategies", Curr. Opin. Chem. Biol. 7(1), 64-9 (2003)

42. S.A. Johnson. T. Hunter, "Kinomics: methods for deciphering the kinome", Nat. Methods. 2(1), 17-25 (2005)

43. A. Sickmann, H. E. Meyer, "Phosphoamino acid analysis", Proteomics 1(2), 200-6 (2001)

44. J. V. Olsen, B. Blagoev, F. Gnad, B. Macek et al., "Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks", Cell 127(3), 635-48 (2006)

45. M. Zhou, T. Veenstra, "Mass spectrometry: m/z 1983-2008", Biotechniques 44(5), 667-8, 670 (2008)

46. H. Issaq, T. Veenstra, "Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE): advances and perspectives", Biotechniques 44(5), 697-8, 700 (2008)

47. G. Van den Bergh, L. Arckens, "Reducing sample complexity by RP-HPLC: beyond the tip of the protein expression iceberg", Methods Mol. Biol. 424, 147-56 (2008)

48. C.W.Huck, G.K. Bonn, "Analysis of proteins by capillary electrophoresis", Methods Mol. Biol. 384, 507-40 (2008) ■

49. V. Dolnik, "Capillary electrophoresis of proteins 2005-2007", Electrophoresis 29(1), 143-156 (2008)

50. T. Hunter , "When is a lipid kinase not a lipid kinase? When it is a protein kinase", Cell 83(1), 1-4(1995)

51. J. Schlessinger, Harvey Lectures 89, 105-123 (1993).

52. H. Zhang, X. Zha, Y. Tan, P. V. Hornbeck et al., "Phosphoprotein analysis using antibodies broadly reactive against phosphorylated motifs", J Biol Chem 277(42), 39379-87 (2002)

53. S. Hattori, N. Lida, H. Kosako, "Identification of protein kinase substrates by proteomic approaches", Expert Rev. Proteomics 5(3), 497-505 (2008)

54. H. Steen, B. Kuster, M. Fernandez, A. Pandey, M. Mann , "Tyrosine phosphorylation mapping of the epidermal growth factor receptor signaling pathway", J Bio! Chem 277(2), 10319 (2002)

55. N. Sugiyama, H. Nakagami, K. Mochida, A. Daudi, M. Tomita, K. Shirasu, Y. Ishihama, "Large-scale phosphorylation mapping reveals the extent of tyrosine phosphorylation in Arabidopsis", Mol Syst Biol. 4, 193 (2008)

56. J. Villen, S. A. Beausoleil, S. A. Gerber, S. P. Gygi , "Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver", Proc Natl Acad Sci U S A 104(5), 1488-93 (2007)

57. J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage , "Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation", Nature 258(5536), 598-9 (1975)

58. H. P. Michel, J. Bennett , "Tandem mass spectrometry reveals that three photosystem II proteins of spinach chloroplasts contain N-acetyl-O-phosphothreonine at their NH2 termini", J Biol Chem 263(3), 1123-30 (1987)

59. Y. Li, Y. Liu, J. Tang, H. Lin, N. Yao, X. Shen, C. Deng, P. Yang, X. Zhang, "Fe304@A1203 magnetic core-shell microspheres for rapid and highly specific capture of phosphopeptides with mass spectrometry analysis", J. Chromatogr. A. 1172(1), 57-71 (2007)

60. T. S. Nuhse, A. Stensballe, O. N. Jensen, S. C. Peck, "Large-scale analysis of in vivo phosphorylated membrane proteins by immobilized metal ion affinity chromatography and mass spectrometry", Mol. Cell. Proteomics 2(11), 1234-43 (2003)

61. M. C. Posewitz, P. Tempst , "Immobilized gallium(III) affinity chromatography of phosphopeptides", Anal Chem 71(14), 2883-92 (1999)

62. S. B. Ficarro, M. L. McCleland, P. T. Stukenberg, D. J. Burke et al., "Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae", Nat Biotechnol 20(3), 301-5 (2002)

63. R. Kange, U. Selditz, M. Granberg, U. Lindberg, G. Ekstrand, M. Gustafsson, "Comparison of different IMAC techniques used for enrichment of phosphorylated peptides", J. Biomol. Tech. 16(2), 91-103 (2005)

64. M. Machida, H. Kosako, K. Shirakabe, M. Kobayashi, M. Ushiyama, J. Inagawa, J. Hirano,

65. T. Nakano, Y. Bando, E. Nishida, S. Hattori, "Purification of phosphoproteins by immobilized143metal affinity chromatography and its application to phosphoproteome analysis", FEBS J. 274(6), 1576-87 (2007)

66. M. O. Collins, L. Yu, M. P. Coba, H. Husi et al., "Proteomic analysis of in vivo phosphorylated synaptic proteins", J Biol Chem 280(7), 5972-82 (2005)

67. T.E. Thingholm, O.N. Jensen, P.J. Robinson, M.R. Larsen, "SIMAC (Sequential Elution from IMAC), a Phosphoproteomics Strategy for the Rapid Separation of Monophosphorylated from Multiply Phosphorylated Peptides", Mol Cell Proteomics 7(4), 661-671 (2008)

68. L. Riggs, C. Sioma, F. E. Regnier , "Automated signature peptide approach for proteomics", J. Chromatogr. A 924(1-2), 359-68 (2001)

69. C. S. Raska, C. E. Parker, Z. Dominski, W. F. Marzluff, "Direct MALDI-MS/MS of phosphopeptides affinity-bound to immobilized metal ion affinity chromatography beads", Anal. Chem. 74(14), 3429-33 (2002)

70. M.W. Pinkse, P. M. Uitto, M. J. Hilhorst, B. Ooms, A. J. Heck , "Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns", Anal Chem 76(14), 3935-43 (2004)

71. Y. Li, X. Xu, D. Qi, C. Deng, P. Yang, X. Zhang, "Novel Fe304@Ti02 Core-Shell Microspheres for Selective Enrichment of Phosphopeptides in Phosphoproteome Analysis", J. Proteome Res., 7 (6), 2526 2538 (2008)

72. S. Mohammed, K. Kraiczek, M.W.H. Pinkse, S. Lemeer, J.J. Benschop, A.J.R. Heck, "Chip-Based Enrichment and NanoLC-MS/MS Analysis of Phosphopeptides from Whole Lysates", J. Proteome Res., 7 (4), 1565 1571 (2008)

73. M. R. Larsen, T. E. Thingholm, O. N. Jensen, P. Roepstorff, T. J. Jorgensen , "Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns", Mol Cell Proteomics 4(7), 873-86 (2005)

74. H, K. Kweon, K. Hakansson , "Selective zirconium dioxide-based enrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis", Anal Chem 78(6), 1743-9 (2006)

75. F. Wolschin, S. Wienkoop, W. Weckwerth , "Enrichment of phosphorylated proteins and peptides from complex mixtures using metal oxide/hydroxide affinity chromatography (MOAC", Proteomics 5(17), 4389-97. (2005)

76. S.B. Ficarro, J.R. Parikh, N.C. Blank, J.A. Marto, "Niobium(V) Oxide (Nb205): Application to Phosphoproteomics", Anal. Chem., 80 (12), 4606 4613 (2008)

77. S.S. Jensen, M.R. Larsen, "Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques", Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 3635 3645 (2007).

78. H.K. Kweon, K. Häkansson, "Selective zirconium dioxide-based enrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis", Anal. Chem. 78(6), 1743-9 (2006)

79. B. Bodenmiller, L. N. Mueller, M. Mueller, B. Domon, R. Aebersold , "Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome", Nat Methods 4(3), 231-7 (2007)

80. A. J. Link, J. Eng, D. M. Schieitz, E. Carmack, et al., "Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry", Nat Biotechnol 17(7), 676-82 (1999)

81. S. A. Beausoleil, M. Jedrychowski, D. Schwartz, J. E. Elias et al., "Large-scale characterization of HeLa cell nuclear phosphoproteins", Proc Natl Acad Sei USA 101(33), 12130-5(2004)

82. J. C. Trinidad, C. G. Specht, A. Thalhammer, R. Schoepfer, A. L. Burlingame , "Comprehensive identification of phosphoiylation sites in postsynaptic density preparations", Mol Cell Proteomics 5(5), 914-22 (2006)

83. B. Zhai, J. Villen, S.A. Beausoleil, J. Mintseris, S.P. Gygi, "Phosphoproteome Analysis of Drosophila melanogaster Embryos", J. Proteome Res., 7 (4), 1675 1682 (2008)

84. J. V. Olsen, B. Blagoev, F. Gnad, B. Macek et al., "Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks", Cell 127(3), 635-48 (2006)

85. Y. Oda, T. Nagasu, B. T. Chait, "Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome", Nat Biotechnol 19(4), 379-82 (2001)

86. H. Zhou, J. D. Watts, R. Aebersold , "A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation", Nat Biotechnol 19(4), 375-8 (2001)

87. W. A. Tao, B. Wollscheid, R. O'Brien, J. K. Eng et al., "Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry", Nat Methods 2(8), 591-8 (2005)

88. B. Domon, R. Aebersold , "Mass spectrometry and protein analysis", Science 312(5771), 212-7 (2006)

89. K. M. Loyet, J. T. Stults, D. Arnott, "Mass spectrometric contributions to the practice of phosphorylation site mapping through 2003: a literature review", Mol Cell Proteomics 4(3), 23545 (2005)

90. L, McHugh, J.W.Arthur, "Computational methods for protein identification from mass spectrometry data", PLoS Comput. Biol. 4(2), el2 (2008)

91. A. Ducret, I. Van Oostveen, J. K. Eng, J. R. Yates, R. Aebersold , "High throughput protein characterization by automated reverse-phase chromatography/electrospray tandem mass spectrometry", Protein Sci 7(3), 706-19 (1998)

92. D. N. Perkins, D. J. Pappin, D. M. Creasy, J. S. Cottrell , "Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data", Electrophoresis 20(18), 3551-67 (1999)

93. X. Yang, H. Wu, T. Kobayashi, R.J. Solaro, R.B. van Breemen, "Enhanced ionization of phosphorylated peptides during MALDI TOF mass spectrometry", Anal. Chem. 76(5), 1532-1536(2004)

94. A.J. Ibanez, A. Muck, A. Svatos, "Metal-Chelating Plastic MALDI (pMALDI) Chips for the Enhancement of Phospliorylated-Peptide/Protein Signals ", J. Proteome Res., 6 (9), 3842 -3848 (2007)

95. R.A. Zubarev, A.R. Zubarev, M.M. Savitski, "Electron capture/transfer versus collisionally activated/induced dissociations: solo or duet?", J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19(6), 753-61 (2008)

96. H. J. Cooper, K. Hakansson, A. G. Marshall , "The role of electron capture dissociation in biomolecular analysis", Mass Spectrom Rev 24(2), 201-22 (2005)

97. J. E. Syka, J. J. Coon, M. J. Schroeder, J. Shabanowitz, D. F. Hunt , "Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry", Proc Natl Acad Sci U S A 101(26), 9528-33 (2004)

98. R. A. Zubarev , "Electron-capture dissociation tandem mass spectrometry", Curr Opin Biotechnol 15(1), 12-6 (2004)

99. A, Stensballe, 0. N. Jensen, J. V. Olsen, K. F. Haselmann, R. A. Zubarev , "Electron capture dissociation of singly and multiply phosphorylated peptides", Rapid Commun Mass Spectrom 14(19), 1793-800 (2000)

100. K.D. Rand, C.M. Adams, R.A. Zubarev, T.J. Jorgensen, "Electron capture dissociation proceeds with a low degree of intramolecular migration of peptide amide hydrogens", J. Am. Chem. Soc. 130(4), 1341-9 (2008)

101. S.M. Sweet, A. J. Creese, H. J. Cooper , "Strategy for the identification of sites of phosphorylation in proteins: neutral loss triggered electron capture dissociation", Anal Chem 78(21), 7563-9 (2006)

102. A. Chi, C. Huttenhower, L. Y. Geer, J. J. Coon et al., "Analysis of phosphorylation sites on proteins from Saccharomyces cerevisiae by electron transfer dissociation (ETD) mass spectrometry", Proc Natl Acad Sci U S A 104(7), 2193-8 (2007)

103. H. Molina, D. M. Horn, N. Tang, S. Mathivanan, A. Pandey , "Global proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem mass spectrometry", Proc Natl Acad Sci U S A 104(7), 2199-204 (2007)

104. D. L. Swaney, G. C. McAlister, M. Wirtala, J. C. Schwartz et al., "Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors", Anal Chem 79(2), 477-85 (2007)

105. J. V. Olsen, M. Mann , "Improved peptide identification in proteomics by two consecutive stages of mass spectrometric fragmentation", Proc Natl Acad Sci U S A 101(37), 13417-22 (2004)

106. M. J. Schroeder, J. Shabanowitz, J. C. Schwartz, D. F. Hunt, J. J. Coon , "A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry", Anal Chem 76(13), 3590-8 (2004)

107. B. L. Williamson, J. Marchese, N. A. Morrice , "Automated identification and quantification of protein phosphorylation sites by LC/MS on a hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer", Mol Cell Proteomics 5(2), 337-46 (2006)

108. H. Steen, B. Kuster, M. Mann , "Quadrupole time-of-flight versus triple-quadrupole mass spectrometry for the determination of phosphopeptides by precursor ion scanning", J Mass Spectrom 36(7), 782-90 (2001)

109. H. Steen, J.A. Jebanathirajah, M. Springer, M.W. Kirschner, "Stable isotope-free relative and absolute quantitation of protein phosphorylation stoichiometry by MS", Proc Natl Acad Sci USA. 102(ll),3948-53 (2005)

110. A.D. Hegeman, A.C. Harms, M.R. Sussman, A.E. Bunner, J.F. Harper, "An isotope labeling strategy for quantifying the degree of phosphorylation at multiple sites in proteins", J Am Soc Mass Spectrom, 15(5), 647-53 (2004)

111. S. A. Gerber, J. Rush, O. Stemman, M. W. Kirschner, S. P. Gygi , "Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS", Proc Natl Acad Sci U S A 100(12), 6940-5 (2003)

112. S. Putz, J. Reinders, Y. Reinders, A. Sickmann , "Mass spectrometry-based peptidequantification: applications and limitations", Expert Rev Proteomics 2(3), 381-92 (2005)148

113. S. E. Ong, M. Mann , "Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative", Nat Chem Biol 1(5), 252-62(2005)

114. S. J. Ding, W. J. Qian, R. D. Smith , "Quantitative proteomic approaches for studying phosphotyrosine signaling", Expert Rev Proteomics 4(1), 13-23 (2007)

115. K. Aggarwal, L. H. Choe, K. H. Lee , "Shotgun proteomics using the iTRAQ isobaric tags", Brief Funct Genomic Proteomic 5(2), 112-20 (2006)

116. R. D. Unwin, C. A. Evans, A. D. Whetton , "Relative quantification in proteomics: new approaches for biochemistry", Trends Biochem Sci 31(8), 473-84 (2006)

117. X. Chen, L. Sun, Y. Yu, Y. Xue, P. Yang , "Amino acid-coded tagging approaches in quantitative proteomics", Expert Rev Proteomics 4(1), 25-37 (2007)

118. M. Mann , "Functional and quantitative proteomics using SILAC", Nat Rev Mol Cell Biol 7(12), 952-8 (2006)

119. M. Ono, M. Shitashige, K. Honda, T. Isobe et al., "Label-free quantitative proteomics using large peptide data sets generated by nanoflow liquid chromatography and mass spectrometry", Mol Cell Proteomics 5(7), 1338-47 (2006)

120. O. Rinner, L. N. Mueller, M. Hubalek, M. Muller et al., "An integrated mass spectrometric and computational framework for the analysis of protein interaction networks", Nat Biotechnol 25(3), 345-52 (2007)

121. H. Steen, J. A. Jebanathirajah, M. Springer, M. W. Kirschner , "Stable isotope-free relative and absolute quantitation of protein phosphorylation stoichiometry by MS", Proc Natl Acad Sci USA 102(11), 3948-53 (2005)

122. J. Rappsilber, U. Ryder, A. I. Lamond, M. Mann , "Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome", Genome Res 12(8), 1231-45 (2002)

123. Y. Ishihama, Y. Oda, T. Tabata, T. Sato et al., "Exponentially modified protein abundance index (emPAI) for estimation of absolute protein amount in proteomics by the number of sequenced peptides per protein", Mol Cell Proteomics 4(9), 1265-72 (2005)

124. Y. Oda, K. Huang, F. R. Cross, D. Cowburn, B. T. Chait, "Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation", Proc Natl Acad Sci USA 96(12), 6591-6 (1999)

125. S. E. Ong, B. Blagoev, I. Kratchmarova, D. B. Kristensen et al., "Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics", Mol Cell Proteomics 1(5), 376-86 (2002)

126. N. Ibarrola, D. E. Kalume, M. Gronborg, A. lwahori, A. Pandey , "A proteomic approach for quantitation of phosphorylation using stable isotope labeling in cell culture", Anal Chem 75(22), 6043-9 (2003)

127. I. Kratchmarova, B. Blagoev, M. Haack-Sorensen, M. Kassem, M. Mann , "Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation", Science 308(5727), 1472-7(2005)

128. B. Blagoev, S. E. Ong, I. Kratchmarova, M. Mann , "Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics", Nat Biotechnol 22(9), 1139-45 (2004)

129. R. Bose, H. Molina, A. S. Patterson, J. K. Bitok et al., "Phosphoproteomic analysis of Her2/neu signaling and inhibition", Proc Natl Acad Sci U S A 103(26), 9773-8 (2006)

130. V. L. Goss, K. A. Lee, A. Moritz, J. Nardone et al., "A common phosphotyrosine signature for the Bcr-Abl kinase", Blood 107(12), 4888-97 (2006)

131. J. Krijgsveld, R. F. Ketting, T. Mahmoudi, J. Johansen et al., "Metabolic labeling of C. elegans and D. melanogaster for quantitative proteomics". Nat Biotechnol 21(8), 927-31 (2003)

132. C. C. Wu, M. J. MacCoss, K. E. Howell, D. E. Matthews, J. R. Yates , "Metabolic labeling of mammalian organisms with stable isotopes for quantitative proteomic analysis", Anal Chem 76(17), 4951-9(2004)

133. S. P. Gygi, B. Rist, S. A. Gerber, F. Turecek et al., "Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags", Nat Biotechnol 17(10), 994-9 (1999)

134. E. C. Yi, X. J. Li, K. Cooke, H. Lee et al., "Increased quantitative proteome coverage with (13)C/(12)C-based, acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisition scheme", Proteomics 5(2), 380-7 (2005)

135. S. E. Ong, I. Kratchmarova, M. Mann , "Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)", J Proteome Res 2(2), 173-81 (2003)

136. A. Thelemann, F. Petti, G. Griffin, K. Iwata et al., "Phosphotyrosine signaling networks in epidermal growth factor receptor overexpressing squamous carcinoma cells", Mol Cell Proteomics 4(4), 356-76 (2005)

137. P. L. Ross, Y. N. Huang, J. N. Marchese, B. Williamson et al., "Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents", Mol Cell Proteomics 3(12), 1154-69 (2004)

138. R. P. Munton, R. Tweedie-Cullen, M. Livingstone-Zatchej, F. Weinandy et al., "Qualitative and quantitative analyses of protein phosphorylation in naive and stimulated mouse synaptosomal preparations", Mol Cell Proteomics 6(2), 283-93 (2007)

139. Y. Zhang, A. Wolf-Yadlin, P. L. Ross, D. J. Pappin et al., "Time-resolved massspectrometry of tyrosine phosphorylation sites in the epidermal growth factor receptor signalingnetwork reveals dynamic modules", Mol Cell Proteomics 4(9), 1240-50 (2005)150

140. K. Schmelzle, S. Kane, S. Gridley, G. E. Lienhard, F. M. White , "Temporal dynamics of tyrosine phosphorylation in insulin signaling", Diabetes 55(8), 2171-9 (2006)

141. A. Wolf-Yadlin, N. Kumar, Y. Zhang, S. Hautaniemi et al., "Effects of HER2 overexpression on cell signaling networks governing proliferation and migration", Mol Syst Biol 2, 54 (2006)

142. M. B. Goshe, T. P. Conrads, E. A. Panisko, N. H. Angell et al., "Phosphoprotein isotope-coded affinity tags: application to the enrichment and identification of low-abundance phosphoproteins", Anal. Chem. 74(3). 607-16 (2002)

143. W. J. Qian, M. B. Goshe, D. G. Camp, L. R. Yu et al., "Phosphoprotein isotope-coded solid-phase tag approach for enrichment and quantitative analysis of phosphopeptides from complex mixtures", Anal. Chem. 75(20), 5441-50 (2003)

144. S. A. Beausoleil, J. Villen, S. A. Gerber, J. Rush, S. P. Gygi , "A probability-based approach for high-throughput protein phosphorylation analysis and site localization", Nat Biotechnol 24(10), 1285-92 (2006)

145. P. V. Hornbeck, I. Chabra, J. M. Kornhauser, E. Skrzypek, B. Zhang , "PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation", Proteomics 4(6), 1551-61 (2004)

146. P.G.A. Pedrioli h .up. "A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research", Nat. Biotechnol. 22, 1459-66 (2004)

147. L. Martens h ap. "Do we want our data raw? Including binary mass spectrometry data in public proteomics data repositories", Proteomics 5, 3501-05 (2005)

148. E.I. Chen, D. Cociorva, J.L Norris, J.R. Yates 3rd, "Optimization of mass spectrometry-compatible surfactants for shotgun proteomics", J. Proteome Res. 6(7), 2529-2538 (2007)

149. K. Moser, F.M. White, "Phosphoproteomic analysis of rat liver by high capacity IMAC and LC-MS/MS" J Proteome Res. 5(1), 98-104 (2006)

150. M. Fedjaev, S. Trudel, N. Tjon-A-Pan, A. Parmar, B.I. Posner, E. Levy, I. Nifant'ev, A.V. Pshezhetsky, "Quantitative analysis of a proteome by N-terminal stable-isotope labelling of tryptic peptides", Rapid Commun Mass Spectrom. 21(6), 2671-9 (2007).

Информация о работе

Каньшин, Евгений Дмитриевич
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков с использованием методов изотопного мечения и селективного концентрирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы