Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток"
На правах рукописи
00347143Б
Копылов Артур Тигранович
РАЗРАБОТКА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВ БЕЗ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОТОПНЫХ МЕТОК
03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА - 2009
2 б 1\^ ?нгу}
003471435
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН.
Научный руководитель:
Кандидат биологических наук Згода Виктор Гаврилович Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Шевченко Валерий Евгеньевич
Доктор биологических наук , Прозоровский Владимир,Николаев
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт питания РАМН.
Защита состоится 18 июня 2009 года в 12 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН по адресу: 119121 Москва, улица Погодинская, дом 10, корпус 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН
Автореферат разослан _2009 г.
Ученый секретарь , /
диссертационного совета, ^ /
кандидат химических наук ■■ ) - Карпова Е.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Любой биологический процесс неразрывно сопровождается изменениями химического состава клетки и биологических жидкостей. Определение динамических изменений в белковом составе биологических образцов является основной задачей протеомных исследований, направленных на фундаментальное понимание биологических процессов и на применение новых методов в диагностике и лечении заболеваний. Решение этих вопросов достигается путем сравнительного анализа белков в протеоме, содержание которых может меняться в ответ на воздействия химического или физиологического характера. Именно такие изменения представляют собой наибольший интерес для дальнейших исследований.
В последнее время к протеомике предъявляются требования количественной оценки наблюдаемых изменений. Однако из-за значительных технических и методических ограничений масс-спектрометрия, которая является основным инструментом современной протеомики, не всегда способна осуществлять количественную оценку содержания белка в отсутствие внутренних стандартов. Для решения проблемы количественного анализа были разработаны методы относительной количественной протеомики с использованием стабильных тяжелых изотопов кислорода, углерода, азота и дейтерия. Тяжелые атомы включались в состав пептидов или белков, либо замещали их легкие изотопы, тем самым смещая молекулярную массу пептида. Сравнивая площади под пиками пептидов одинакового химического состава, но с различным содержанием тяжелых изотопов, проводят относительную количественную оценку белков в организмах при различных состояниях. С течением времени исследователи обнаруживали все больше недостатков в методах количественной оценки с использованием различных изотопов. Прежде всего, к ним относится ограниченная специфичность меток: многие из них были направлены на связывание с тиольной группой аминокислотного остатка цистеина. Это вызывало трудности, связанные с необходимостью максимально полного восстановления цистеинов в процессе пробоподготовки и увеличивало время постановки эксперимента. Невозможно было проводить количественную оценку для белков с малым содержанием или отсутствием цистеинов в первичной цепи, или недоступными для протеолиза цистеинами. Метод метаболического изотопного мечения доступен только для использования в культуре клеток in vitro или для простейших организмов. Изотопное мечение тяжелыми атомами кислорода [180] в ходе реакции гидролитического расщепления трипсином требовало использование масс-спектрометров с высоким разрешением, чтобы не допустить перекрывания изотопных распределений масс измеряемых пептидов
Однако, в последнее десятилетие все больше внимания стали обращать на подход в количественной протеомике, не требующий использования изотопных меток. Выявление и изучение закономерностей зависимости между сигналом масс-спектрометра и количеством измеряемого белка привело к развитию двух основных направлений количественной протеомики без использования меток. Более раннее из них основано на корреляции суммарного индекса достоверности идентификации белка по всем зафиксированным в ходе эксперимента его пептидам с количеством анализируемого белка. Второе направление основано на существовании зависимости
между усредненной суммы масс-спектрометрических сигналов пептидов, принадлежащих одному белку, и его содержанием в биологической пробе. Оба направления постоянно совершенствуются и имеют все перспективы в недалеком будущем успешно конкурировать с количественными методами с использованием тяжелых изотопных атомов.
В настоящей работе была выявлена зависимость уровня масс-спектрометрического сигнала от содержания белка в пробе, детально исследован характер зависимости для индивидуальных белков и для белковых смесей; показаны особенности зависимости, связанные с числом индивидуальных пептидов одного белка и их сочетанием. Кроме того, определено влияние скорости потока наноэлектроспрея на линейность кривой зависимости и на уровень интенсивности на отдельных участках зависимости. На основе полученных результатов разработан и охарактеризован новый метод количественного протеомного анализа без использования меток, а также проведено его сравнение с изотопными технологиями количественной масс-спектрометр ии.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке метода количественной оценки содержания белков в модельных растворах и биоматериале без использования меток.
Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
1. Выявить наличие и характер зависимости между уровнем масс-спекгрометрического сигнала и концентрацией растворов 8 индивидуальных белков и их смесей. Определить концентрационные интервалы, в рамках которых проявляется линейная зависимость масс-спектральной интенсивности от концентрации.
2. Определить условия линейности зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации триптических пептидов анализируемого белка в пробе.
3. Выявить влияние скорости потока наноэлектроспрея на зависимость интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации для указанных белков виде чистого препарата и в смеси.
4. Оценить эффективность разработанного метода путем его использования для количественной оценки белка МиРЗ в пробе микросом ткани печени мыши.
Научная новизна работы. В диссертации разработан и охарактеризован метод количественного протеомного анализа без использования изотопных меток. Для этого установлено существование линейной корреляции уровня масс-спектральной интенсивности от концентрации анализируемого белка. Показано, что границы корреляции для количественного анализа с использованием масс-спектрометра типа ионной ловушки составляют от 1 нМ до 1 мкМ. Зависимость в данном интервале концентраций сохраняет линейность в условиях анализа чистого препарата и в смеси белков и не зависит от физико-химических свойств белка или его структурно-функциональных особенностей. Кроме того, показано, что для соблюдения линейности в
анализе необходимо наличие минимум четырех различных достоверно идентифицированных пептидов, принадлежащих одному белку, причем присутствие данных пептидов должно прослеживаться на протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона. Нами также были подобраны оптимальные условия скорости потока наноэлектроспрея, применимые для проведения количественной оценки белков на масс-спектрометрах типа ионных ловушках.
Практическая значимость работы. В работе показано, что разработанный метод позволяет осуществлять оценку содержания белковых компонентов в биологических пробах и в чистых препаратах без использования химических или метаболических меток. Разработан общий подход к оптимизации условий количественной оценки белков с использованием масс-спектрометров типа ионной ловушки. Предложены метод нормирования масс-спектрометрических данных для эффективного выявления линейных участков зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации анализируемого белка в чистом препарате и в смеси белков.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международной конференции «Биология - наука XXI века», Пущино, Россия, 2007; международной конференции HUPO-2008, Amsterdam, the Netherlands; VII Всероссийская конференция в рамках Федерального конкурса инновационных проектов «Живые системы», Москва, Россия, 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ: 4 статьи в российских и иностранных научных изданиях и 3 публикации в докладах научных конференций.
Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (8 глав), описания материалов и методов исследования (2 главы), результатов (6 глав), обсуждения (6 глав), выводов, заключения, списка литературных источников, цитируемых в диссертационной работе и приложения. Работа изложена на 161 странице печатного текста, содержит 15 таблиц, 24 рисунков и 1 приложение. Список цитируемой литературы включает 158 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препараты белков для количественного анализа
В качестве модельных объектов были отобраны 8 белков в виде чистого коммерческого препарата: бычий сывороточный альбумин (ICN Biomedical, США), 69,293 кДа; миоглобин из спермы кита (Serva, Германия), 17,331 кДа; пероксидаза хрена (Reanal, Венгрия), 11,832 кДа; цитохром 2Ь4 из ткани печени кролика (Serva, Германия), 55,713 кДа; цитохром За4 человеческий, экспрессируемый в культуре клеток E.coli (Serva, Германия), 57,343 кДа; NADPH-цитохром Р450 редуктаза из ткани печени кролика (Sigma, США), 76,588 кДа; алкогольдегидрогеназа из культуры винных дрожжей (GIBCO, США), 36,823 кДа; и цитохром С из клеток сердечной мышцы лошади (Serva, США), 11,832 кДа.
Белки растворяли в 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4, до конечной концентрации 100 мкМ. Затем из маточного раствора отбирали по 20 мкл (2 нМ белка) и переносили в чистую
пробирку объемом 200 мкл. Раствор упаривали в вакуумном испарителе при температуре 30°С и 4200 об./мин в течение 45-60 минут и хранили при -80°С до использования.
Проведение гидролиза белков трипсином в растворе
Сухой остаток белка ресуспендировали в 20 мкл буферного раствора для проведения трипсинолиза. Раствор содержал 100 мМ гидрокарбоната аммония, 15 % ацетонитрила и 0,02 % додецилсульфата натрия и 0,5 мМ хлорида кальция при pH 8,0. Добавляли по 1 мкл раствора свиного модифицированного трипсина (Promega) с концентрацией 0,05 мкг/ мкл (1 : 400 по массе). Реакционную смесь инкубировали при температуре 42°С. Через 2 часа после начала реакции к смеси добавили еще 0,05 мкг раствора фермента и инкубировали при 37°С; через последующие 2 часа вносили еще 1 мкл раствора трипсина с концентрацией 0,10 мкг/мкл. Затем реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение ночи.
Полученную смесь пептидов высушивали в вакуумном испарителе при 45°С при 4200 об./мин в течение 1,5 часов. После процедур предварительной пробоподготовки получали 1 нмоль смеси пептидов интересующих белков, которую растворяли в 10 мкл 5% раствора муравьиной кислоты.
Масс-спектрометрический анализ
Пробы разбавляли с получением последовательных разведений по 20 мкл с конечной концентрацией пептидов от 100 пмоль/мкл до 1 фмоль/мкл в 5% муравьиной кислоте. Для анализа проб пептидов и построения калибровочного графика зависимости использовали систему высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометром типа ионной ловушки (Agilent 6330 Series ХСТ Ultra Chip Cube IT, США). Источник ионов и колонка Zorbax с обращенной фазой (40 нл Trap 75 мкм X 43 мм, 5 мкм, С - 18SB - ZX) интегрированы в чип Chip Cube (Agilent). Каждую пробу анализировали в пяти повторах при следующих условиях: загрузка 1 мкл пробы в течение 6 минут при скорости потока 3,000 мкл/мин в изократическом растворе С (5 % ацетонитрила и 0,1 % муравьиной кислоты) па предварительно уравновешенную раствором С колонку. Элюция с колонки в линейном градиенте растворов А (водный раствор 0,1 % муравьиной кислоты) и В (80 % ацетонитрила с 0,1 % муравьиной кислотой) при скорости потока градиента 0,3 мкл/мин в течение 80 минут. По окончании цикла колонку уравновешивали раствором С в течение 5 минут.
Сканирование масс-спектров в режиме MS/MS начинали с восьмой минуты после начала загрузки образца на колонку. При сканировании в MS/MS режиме устанавливали ограничения диапазона m/z от 425 до 1250, нижний порог интенсивности от 1,5* 105, режим ICC (ion current control, контроль тока ионов) аккумуляции и контроля зарядов пептидных ионов не менее 100000 ионов за не более, чем 50 мс. РВС-хроматографический (peak-based chromatography) мониторинг элюции пептидов. Сканирование проводили в режиме положительной полярности на электроде при максимальном напряжении на капилляре - 2050 В.
и ecu модельных белков для масс-спектрометрического анализа
меси получали так, чтобы в каждой модельной смеси содержался один из белков, шсутствующих в другой смеси. Общее количество мольных частей белков, входящих в >став модельной смеси, варьировали от 12 до 71. Для постановки эксперимента были шготовлены следующие модельные смеси белков в следующих молярных количествах соотношения:
итохром С / цитохром 2Ь4 / БСА - 1 : 1,7 : 10, 1 : 10 : 20 ADPH-цитохром Р450 редуктаза / цитохром 2Ь4 / БСА —1:5: 10,1 :1,7 :20 ADPH-цитохром Р450 редуктаза / миоглобин / БСА - 1 : 10 : 30, 1 : 10 : 60 онцентрация белков в смесях в количественном молярном выражении изменялась от 001 до 0,6 мкМ. Смеси готовили в объёмах по 10 мкл для проведения эксперимента не енее чем в 4 повторениях. Масс-спектрометрический анализ проводили на ионной эвушке в условиях, указанных выше.
репарат синтетических пептидов
ля анализа были отобраны три модельных пептида пептида белка MUP3 (Major Urinary rotein 3) с молекулярной массой 1410,555 Да, 1368,475 Да и 1054,639 Да. Пептиды были имически синтезированы Fmoc-методом и лиофилизированы в лаборатории белковой нженерии ИБМХ РАМН (зав. - проф. Е.Ф.Колесанова). На С-конце пептиды массой 368,475 Да и 1410,555 Да содержали аминокислотный остаток треонинамида, щдащаюгций предшествующий ему 3[К15],6[С13]-аргинин. Пептид 1054,639 Да на С-энце содержал открытый аминокислотный остаток з[К15],6[С13]-аргинина со свободной арбоксильной группой.
[ептиды растворяли в 10 % муравьиной кислоте до 10 мг/мл (7.3 мМ для 1368,475 Да, .01 мМ для 1410,555 Да и 8.6 мМ для 1054,639 Да) и анализировали на MALDI-TOF асс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) для определения примесей, [робы получали методом сухой капли: по 10 нМ каждого пептида были смешаны в авных объемах с раствором матрицы (8 мг/мл 2,5-дигидроксибензоат в 50 % цетонитриле, 0,75 % трифторацетате и 15 % 2-пропаноле) и нанесены на мишень типа Iround Steel (Bruker, Германия) по 1,5 мкл. Высушивали при комнатной температуре 35 50 минут. Снятие спектров проводили в диапазоне mlz от 760 до 1600 Да. [ля отщепления треонинамидной группы по 100 нмоль пептидов массой 1368,475 Да и 410,555 Да были подвергнуты гидролитическому расщеплению трипсином (1 : 200 по массовым частям) в объёме 20 мкл в буфере 100 мМ NH4HCO3 рН 8,0, при температуре инкубации 37°С в течение ночи. Реакцию ингибировали добавлением 2 мкл 1% трифторуксусной кислоты. Пептиды обессоливали с помощью ZipTip С-18 (Agilent, USA), и высушивали при температуре 30°С в вакуумном испарителе в течение 1 часа.
Очистка пептидов после протеолиза на колонке с обращенной фазой и анализ чистоты препарата посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии.
Сухой остаток пептидов растворяли в 50 мкл 5% муравьиной кислоты. Загружали по 100 нмоль пептидов на колонку с обращенной фазой (mRP-C18, 5 мкм, 4,6 мкм х 50 мм) в течение 5 минут в изократическом растворе С при скорости потока 0,75 мл/мин; рабочая температура колонки 80°С. Элюцшо пептидов с колонки осуществляли в градиенте растворов В и А при скорости потока 0,75 мл/мин в течение 25 минут. После каждого
s
цикла колонку уравновешивали в течение 7 минут 5 % ацетонитрилом с 0,1 % муравьиной кислотой и 95 % водным раствором 0,1 % муравьиной кислоты, при скорости потока 0,9 мл/мин. Фракции собирались в интервале времени с 0 по 20 минуты по 1,5 мл.
Фракции высушивали при 30°С в течение 50-60 минут, ресуспендировали в 15 мкл 5% муравьиной кислоты и анализировали посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии для выявления целевого пептида.
Масс-спектрометрический количественный анализ препарата з[№15],([Cn]-Arg пептидов
Пептиды анализировали в MS режиме в диапазонах m/z от ([М+ЗН]3+ - 100) до номинальной моноизотопной величины m/z; для MS/MS режима задавали диапазон от 420 до 1450 m/z. Отбирали по 1 мкл из маточных растворов каждого пептида, смешивали их в чистой пробирке на 200 мкл и доводили объем до 30 мкл 5% муравьиной кислотой, получая смесь из трех пептидов, каждого в конечной концентрации 1 мкМ. По 1 мкл полученной смеси пептидов анализировали в 5 повторениях на масс-спектрометре типа ионной ловушки в условиях хроматографического разделения, полностью повторяющих таковые для проб с белками в чистом препарате и в смеси, как описано выше. С 10 по 70 минуты пептидные пики сканировали в режиме MS/MS. После проведения верификации пептидов каждую пробу раститровывали от 100 мкМ до 1 нМ в 5% муравьиной кислоте по 20 мкл в соответствие с концентрациями, выбранными для модельных белков. Полученные пробы анализировали в 5 повторениях в условиях, идентичных условиям анализа пептидов модельных белков.
Мечете пептидов тяжелыми атомами кислорода [ ,80]
Модельные белки смешивали в различных молярных пропорциях. Смесь высушивали при температуре 45°С в течение одного часа. Сухой остаток ресуспендировали в рабочем буфере для проведения трипсинолиза, приготовленного на основе Н2180 (90,5 %, Sigma, Germany): 100 мМ NH4HC03, 10 % ацетопитрила, 0,05% додецилсульфата натрия, pH 7,8. Добавляли 2 мкл раствора трипсина с концентрацией 200 нг/мкл, в воде содержащей 30 мМ уксусной кислоты. Реакционную смесь инкубировали при температуре 45°С в течение 1,5 часов, затем при 37°С в течение 1,5 часов. Спустя 3 часа, добавляли еще 1 мкл раствора трипсина, инкубировали при 37°С 2 часа, и затем добавляли последние 2 мкл раствора фермента и оставляли реакцию при 37°С в течение ночи. Для полного замещения атомов кислорода на их тяжелые изотопы проводили второй этап реакции, в котором ингибировали амидазную активность фермента добавлением неразбавленной трифторуксусной кислоты при pH 4,5-5,0. Добавляли по 1,5 мкл трипсина (200 нг/мкл), растворенного в Н2180 через каждые два часа в течение 6 часов и инкубировали при температуре 42°С. После добавления последней аликвоты трипсина реакционную смесь инкубировали при температуре 37°С в течении 12 часов. Таким образом, общее время проведения второго этапа составляло 18 часов, а количество трипсина, участвующего в реакции, - 900 нг.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ зависимости между уровнем интенсивности масс-спектрометрического сигнала и количеством белка в пробе
Для построения калибровочной кривой зависимости интенсивности сигнала от концентрации анализируемого белка в качестве модельных объектов были отобраны 8 белков. Молекулярные массы модельных белков находились в диапазоне от 10 до 100 кДа. Среди исследуемых белков представлены молекулы с различной степенью гидрофобности (мембранные и цитозольные белки) и с хорошо изученными физико-химическими и структурными свойствами. Отобранные белки подвергали ферментативному гидролизу с высоким выходом детектируемых пептидов.
Таблица 1. Модельные белки, использовавшиеся для построения зависимости масс-спсктралыюй интенсивности от концентрации.____
Название белка Идентификатор [ в базе Swiss Prot ! 1 Молекулярная масса, кДа Число уникальных идентифицированных пептидов Покрытие аминокислотной последовательности, %
NADPH-mrroxpoM-P450- .Р0038Э- I 76,5884 19 35
редуктаза i
Цитохром 2Ь4 Р00178 i 55,7137 21 55
Миоглобин P02185 ■ ! 17,3312 8 ! 49
Алкогольдегидрогеназа P00330 | 36,8233 14 52
Цитохром С P00004 I 11,8328 13 67
Бычий сывороточный альбумин P02759 | 1 69,2939 18 25
Пероксидаза P00433 ! 38,8253 10 31
Цитохром ЗА4 P08684 | 57,3435 32 55
Выбор концентрационного диапазона для построения калибровочной кривой количественного анализа проводили, исходя из литературных данных об ограничениях чувствительности масс-спектрометрии. При этом учитывали реальные концентрации известных белков в живых организмах и необходимость охвата динамического диапазона концентраций, составляющего, как минимум, 3 порядка. Минимальное количество, с которого исследователи начинают количественный анализ белков, в том числе и с пост-трансляционными модификациями, исчисляется от 1 нМ с относительной погрешностью ±10% на nanoLC-MS/MS, на QQQ (тройной квадруполь) с применением MRM (Kuhn Е. Et al, 2004, Proteomics, 4, 1175-86) до 6 нМ на nanoLC-MS/MS, Q-TOF и QQQ (Yu.L.-R. et al, 2004, J. Proteome Res, 3, 469-77; Parker.K.C. et al, 2004, J. Mol. Cell. Proteomics, 3, 625-59). Ионные ловушки и гибридные масс-спектрометры являются приблизительно равными в условиях динамического диапазона определяемых концентраций. Таким образом, для анализа на масс-спектрометре типа ионной ловушки нами был определен диапазон концентраций от 10'9М до Ю^М.
На рисунке 1 показаны зависимости интенсивности масс-спектрального сигнала от концентрации для каждого анализируемого белка в диапазоне концентраций от 1 нМ до 10 мкМ. Видно, что корреляция, при которой наблюдается равномерный линейный рост интенсивности сигнала, проявляется только на участке от 1 нМ до 1 мкМ. Это составляет три порядка концентраций, после чего рост интенсивности замедляется и после 1-3 мкМ
приобретает вид логарифмической кривой. Диапазон линейной зависимости концентраций являлся общим для всех анализируемых белков. Мы предполагаем, что причиной ограничения сигнала рамками рассматриваемых концентраций может служить верхний и нижний пределы чувствительности ионной ловушки, на которой проводились экспериментальные измерения. Верхняя граница чувствительности, скорее всего, обусловлена насыщением сигнала пептидных ионов в высокой концентрации, в результате чего показатели сигнала перестают соотноситься с концентрацией измеряемого вещества. Так, экспериментально показано, что величина интенсивности масс-спектрометрического сигнала в точках концентрации 10 мкМ и 100 мкМ отличается на 5-7%. Таким образом, показатели интенсивности сигнала после 6-10 мкМ не позволяют достоверно определять концентрации белков в растворах.
II
2 4 6
концентрация, мкмМ
■ HADPH-iitrroxjioM Р450реду!£там — — — цнтохром 2Ы
- мпоглебнн - ■ - ■ - алкогояьдетидрогенма
■ цитохром С -------бычий сывороточньн! ¿1ь6уШ!Н
- пероксидма ----цшохром
Рисунок 1. Зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации в интервале от 0,001 до 10 мкМ. Зависимости для каждого белка получены путем усреднения показателей интенсивности ответного сигнала в четырех повторениях. Смесь пептидов анализировали на масс-спектрометре типа ионная ловушка (Agilent 6330 Series ХСТ Ultra Chip Cube IT, Agilent, США). Подробности условий проведения масс-спектрометрического анализа обозначены в разделе «материалы и методы»
Сигналы пептидов модельных растворов белков в диапазоне концентраций от 3 мкМ до 100 мкМ практически не отличаются друг от друга; отличие нормированных на общий ионный ток значений сигнала составляет 15 %, что сравнимо с уровнем относительной ошибки измерений прибора (±12%).
19 пептидов, 35% 1?' = 0,9885
13 пептидов, 67% (I1 = 0,9938
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 концентрация, мкМ
+ ГМОРН-цитохром Р450 редуктаза
Шцитохром2Ь4 \ алкогольдегидрогеназа £ бычий сывороточный альбумин ♦ цитохром 5э4
а миоглобин X цитохром С Эпероксидаза
Рисунок 2. Линейная аппроксимация зависимости масс-спектрального сигнала для модельных белков в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1мкМ. Каждая концентрационная точкам представляет собой результат усреднения значений интенсивности всех идентифицированных в ней пептидов по пяти повторениям.
На рисунке 2 показаны результаты линейной аппроксимации зависимости сигнала от концентрации для каждого модельного белка в диапазоне от 1 нМ до 1 мкМ. Значительных различий между белками в свойствах зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации не было найдено. Об этом свидетельствует тест Фишера (3,257<Б<1,004, Р( = 9,28), значение которого рассчитывали при сравнении массивов данных зависимости различных белков. Как видно из рисунка 2, коэффициент Пирсона для рассматриваемых модельных белков находится в пределах 0,97 - 0,99, что свидетельствует в пользу линейной корреляции между масс-спектральной интенсивностью и концентрацией. Из таблицы 1 и рисунка 2 видно, что покрытие аминокислотной последовательности по уникальным идентифицированным пептидам колеблется от 25% (бычий сывороточный альбумин) до 67% (цитохром с).
2. Условие линейной зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации белка
Мы определили минимальное количество различных идентифицированных пептидов для одного белка, необходимое для линейной корреляции между уровнем масс-спектрометрического сигнала и анализируемой концентрацией. Для того, чтобы условие выполнялось, необходимо учитывать интенсивность масс-спектрального сигнала от четырёх различных пептидов с показателем индекса достоверности
идентификации для каждого не менее 6,0 (Spectrum Mill, Agilent). Пептиды при этом должны принадлежать только одному белку (генному продукту) и их присутствие должно прослеживается на протяжении всего концентрационного .диапазона. Чем больше идентифицированных пептидов относится к одному белку, тем более сглаженной является суммарная зависимость.
На рисунке 3 показаны зависимости масс-спектрометрического сигнала от концентрации для четырех пептидов миоглобина кашалота. Как видно, кривые зависимости для каждого пептида в отдельности характеризуются коэффициентом Пирсона от 0,76 (для двухзарядных ионовг2=0,76 для 797,00; г2=0,83 для 643,04; г2=0,79 для 705,35; 1^=0,86 для 758,52). Однако усреднение значений интенсивности по четырем пептидам в совокупности дает новую зависимость с коэффициентом корреляции 0,927. Такую аппроксимирующую зависимость мы в дальнейшем будем называть базовой. Аппроксимация базовой зависимости по четырем различным пептидам практически совпадает с зависимостью, полученной для всех уникальных идентифицированных пептидов белка. Коэффициент Пирсона находится в пределах г2 > 0,91-0,95, а относительное стандартное отклонение значений интенсивности в различных точках концентраций не превышает 23-25 %. Такое отклонение сравнимо с показателями суммарной зависимости сигнала от концентрации пептидов (рисунок 2).
2500
2000
1500 -
1000
500
0,2 0,4 0,6 0,8 7S7 концентрация, мкМ .........ш04
■ 70535
- 797,00-64i.04»705,35
- 797.00*643,0-1+705,35*755.52
-----797,00*643,04
--- 758,52
Рисунок 3. Изменение коэффициента линейной корреляции с ростом числа идентифицированных пептидов при интеграции кривых зависимости сигнала от концентрации для миоглобина. Кривые зависимости сигнала от концентрации построены в диапазоне от 0,001 до 1 пМ. Для интегрированной кривой зависимости по двум пептидам (797+643) г2=0,89, для зависимости по трем пептидам (797+643+705) коэффициент корреляции г* 0,902.. Базовая кривая зависимости, сформированная по четырем пептидам обнаруживает rz=0,917. Отклонение величины коэффициента Пирсона базовой кривой зависимости в четырех повторениях составляет ±0,06. Измерение масс-спестральной интенсивности пептидов миоглобина п диапазоне концентраций от 1 нМ до 1 мкМ проводили на ионной ловушке типа ионной ловушки (Agilent 6330 ХСТ Ultra Chip Cube IT, Agilent, США). Подробности условий проведения масс-спектрометрического анализа описаны в разделе «материалы и методы»
В ряде случаях, например, для бычьего сывороточного альбумина, цитохрома Р450 2Ь4, цитохрома с, для появления линейных свойств зависимости с коэффициентом Пирсона в пределах 0,94 - 0,96 достаточно трех регистрируемых пептидов.Соблюдение «правила четырех пептидов» становятся тем сложнее, чем меньше молекулярная масса белка, а, следовательно, и меньше количество получаемых после трипсинолиза нротеотипических пептидов. Так, для миоглобина, нероксидазы, алкогольдегидрогеназы, цитохрома Р450 ЗА4 необходимо четыре пептида, а для цитохрома 2Ь4, бычьего сывороточного альбумина и цитохрома с - трех пептидов уже достаточно для формирования уверенной линейной зависимости.
3. Зависимости масс-спектрометрической интенсивности от концентрации, полученные для различных белков и их смесей.
Для того, чтобы установить, будут ли отличаться зависимости для изолированных белков и белковых смесей, были поставлены эксперименты на приготовленных препаратах смесей модельных белков с различными концентрационными соотношениями. Растворы модельных смесей были составлены таким образом, чтобы в одной смеси присутствовали белки, отличные по таким свойствам, как молекулярная масса, степень гидрофобности, принадлежность к различным функциональным и структурным классам (таблица 2). Анализ проводили на примере трех модельных смесей белков, отличающихся по композиции белков и их молярному соотношению: cabl/2 -cytochrome 2Ь4, bovine serum albumin, myoglobin; nabl/2 - NADPH-cytochrome P450 reductase, cytochrome 2b4, bovine serum albumin; nmbl/2 - NADPH-cytochrome P450 reductase, myoglobin, cytochrome 2b4.
Полученные данные позволили нам выяснить отличия интенсивности пептидов в одной и той же концентрационной точке для белков в составе смеси и в виде чистых препаратов. В смеси белков с различными молярными отношениями (таблица 2) закономерность линейной зависимости масс-спектрометрического сигнала от концентрации пептидов на участке 0,001-1 мкМ сохраняется (рисунок 4). Коэффициент линейной корреляции для белков в смеси близок к таковому, рассчитанному для отдельных белков и находится в пределах 0,93-0,98 при аппроксимации по всей совокупности идентифицированных уникальных пептидов па протяжении всего анализируемого концентрационного диапазона.
Таблица 2. Распределение белков по концентрации и группам аналитических модельных смесей.
модельная смесь название белка количество белка, мкМ мольные доли
cabl бычий сывороточный альбумин 0,03 1
цитохром 2Ь4 0,05 1,7
миоглобин 0,3 10
саЬ2 бычий сывороточный альбумин 0,1 20
цитохром 2Ь4 0,5 10
миоглобин 0,05 1
nabl бычий сывороточный альбумин 0,01 1
цитохром 2Ь4 0,1 10
NADPH-цитохром Р450 редуктаза 0,05 5
nab2 бычий сывороточный альбумин 0,05 1,7
миоглобин 0,6 20
NADPH-цитохром Р450 редуктаза 0,03 1
nmbl бычий сывороточный альбумин 0,3 30
NADPH-цитохром Р450 редуктаза 0,01 1
миоглобин 0,1 10
птЬ2 цитохром 2Ь4 0,6 60
NADPH-цитохром Р450 редуктаза 0,1 10
миоглобин 0,01 1
В таблице 3 представлены данные, свидетельствующие о том, что зависимость масс-спеюгральной интенсивности от концентрации сохраняет линейность в смесях и не отличается по основным свойствам от таковой для изолированных белков даже если концентрация белков в смеси отличалась на порядки. В пользу этого свидетельствуют близкие по значению коэффициенты Пирсона (рисунок 4), вариация значений нормированной интенсивности и значения относительного стандартного отклонения (таблица 3).
В растворах изолированных модельных белков разброс значений интенсивности в интервале концентраций от 1 нМ до 1 мкМ составлял около трех порядков. Такой разброс значений оставался характерным и для модельных белков в смесях. Количество уникальных пептидов в определенных концентрационных точках для белка в смеси и в чистом препарате оставалось приблизительно одинаковым (таблица 3).
количество, нормированная нормированная число уникальных
мкМ интенсивность в смеси интенсивность в чистом препарате пептидов в смеси
цитохрам ZM
0,05 723±62,53 809173,01 8
0,1 937±90,51 12601134,17 11
0,3 2722±419,2 29801187,67 13
0,5 3651*263,2 41001433,15 18
0,6 4709±369,2 56801601,3 20
NADPH-цитохром Р450 редуктаза
0,01 72±б,б1 15419,78 5
0,03 198123,7 241130,61 8
0,05 510+96,39 563154,11 9
0,1 1996+180,04 21701241,3 12
бычий сывороточный альбумин
0,01 300121,93 367135,95 4
0,03 1221±166,9 13701149,6 4
0,05 1987±260,1 23901276,83 5
0,1 2491±209,74 28701300,72 9
0,3 69301632 72001693,74 13
плиогяобин
0,01 325±24,7 427134,92 3
0,05 765±108 11901122,36 3
од 2340±490,7 25601280,75 4
0,3 59901620,56 65401677,15 6
0,6 10760+109,43 120001111,6 7
На рисунке 4 продемонстрировано, что нормированные масс-спектральные интенсивности возрастают в обоих случаях, но для белков в модельных смесях изменение происходит с небольшим отставанием в 10 - 14%. Снижение интенсивности обусловлено более высоким уровнем общего ионного тока в смеси и ионной супрессии, как следствие возросшего разнообразия пептидных ионов в смеси. Так, для смесей группы cabl и саЬ2 общее число протеотипических пептидов всех белков составляет 36 и 32 соответственно, для nabi и лаЬ2 - 34 и 31, а для mnbl и гапЬ2 - 21 и 28. Причем, 70 % всех пептидных ионов в различных зарядных состояниях регистрировали в интервале от 570 до 920 единиц m/z.
В некоторых случаях, например, для NADPH-цитохром Р450 редуктазы значения нормированной масс-спектральной интенсивности отличались на 53,24% (в 2,138 раза в точке 0,01 мкМ (таблица 3)). В целом, линейность зависимости сохранялась как для белков в смеси, так и для чистого препарата. Разброс линейного коэффициента корреляции больше для белков в смеси и составлял Дг2=0,208, тогда как для индивидуальных белков он не превышал Дг2=0,191. О незначительном снижении линейности зависимости в смесях свидетельствовало увеличение относительного стандартного отклонения масс-спектральной интенсивности до 7-21 %. При этом значительно возрос нижний предел отклонения, так как в случае с индивидуальными белками он составлял 2,38%.
л 7.00
о
>,00 х 5,00
з:
Х4.00
1з,оо
а в
12.00 ш
§.1,00
К! - 0,9763
Я2 =--0,9642
= 0,7836
концентрация, мкМ
12Ь4 в смеси а 2Ь4 ч. препарат
0,01 0,03 0,05 0,1 концентрация, глкМ
а N АОРН-цитохром Р450 редуктаза о смеси
Б а МАОРН-цитохром Р450 ч.препарат
= 0,8854 йг = Й.8916
0,01
0,05 0.1 концентрация, мкМ
■ л
т. '1 щ ц
1 й
: ш
V. 1 ы • н
0,3 0,6
я миоглобин о смеси я миоглобин ч.препарат
Рисунок 4. Корреляции между масс-спсктралыюй интенсивностью и концентрацией белка в чистом препарате и в смеси; А - цитохром 2Ь4, Б - N АОРН-цитохром Р450 редуктаза, В - бычий сывороточный альбумин, Г - миоглобин.
Исследование влияния количества регистрируемых уникальных пептидов белка на линейность зависимости показало, что в смеси также необходимо соблюдение «правила четырех пептидов», принадлежащих одному белку и формирующих базовую зависимость интенсивности от концентрации. При этом качественное сочетание пептидов в смеси может отличаться от такового для индивидуальных белков. К примеру, в начальной точке концентрационного диапазона (1 нМ) у трех (цитохрома с, цитохрома 2Ь4 и бычьего сывороточного альбумина) из пяти белков в смесях были найдены замены до двух из четырех пептидов в сравнении с набором пептидов, идентифицированных в чистом препарате белка. Тем не менее, коэффициент корреляции для цитохрома 2Ь4 в смеси по четырем пептидам составлял 0,91 ( 2Ь4 изолированный белок - 0,93), цитохром с 0,89 (против 0,9 в чистом препарате), БСА - 0,92 (против 0,907 в чистом препарате). Эти данные указывают на то, что линейность зависимости нормированной интенсивности от концентрации на начальных этапах формирования определяется не
9,00
3 8,00
5 7.00
I 5.00 т
5 5,00
I
г «¡.со
х
* 3,00
с 5
§ ¿.00 1 1,00
I 0,01 0,03 0,05 0,1 0,3
концентрация, мкМ
я бычий сывороточный альбумин о смеси В и бычий сывороточный альбумин ч.препарат
качественным составом пептидной смеси, а количеством уникальных идентифицированных пептидов.
4. Влияние скорости потока наноэлектроспрея па лпвейность зависимости масс-спекгтрометрического сигнала от концентрации анализируемого белка.
В нашей работе были проведены эксперименты для определения влияния скорости потока наноэлектроспрея на линейность зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации пептидов модельных белков. В данных экспериментах мы варьировали показатель скорости потока наноэлектроспрея, используя пять режимов: 0,10 мкл/мин, 0,15 мкл/мин, 0,20 мкл/мин, 0,45 мкл/мин и 0,60 мкл/мин. Полученные данные показателей нормированной интенсивности сравнивали с теми, что были получены при скорости 0,30 мкл/мин, которую использовали как контрольную. Как показано на рисунке 5, снижение скорости потока наноэлектроспрея приводило к росту масс-спектральной интенсивности пептидов. Однако, рост в различных точках концентрационного диапазона неодинаков. В среднем, интенсивность увеличивается в 6,8 раза в интервале от 1 нМ до 200 нМ и в 7,4 раза на участке 0,200-1 мкМ. Такая тенденция проявляется для всех модельных белков без исключения (рисунок 5).
Обратную ситуацию наблюдали при повышении скорости потока наноэлектроспрея. При потоках 0,45-0,60 мкл/мин значения масс-спектральной интенсивности снижались равномерно на протяжении всего концентрационного диапазона. При этом линейность зависимости, как правило, остается характерной для потоков 0,10-0,20 мкл/мин. Таким образом, оптимальной скоростью потока наноэлектроспрея, при котором коэффициент линейной корреляции достигает уровня 0,96 0,99 является 0,3 мкл/мин.
Таким образом, скорость потока наноэлектроспрея определяет границы масс-спектральной интенсивности, в которых зависимость становится линейной. При этом, зная особенности зависимости интенсивности от концентрации при известной скорости потока, экстраполяция концентрации пептидов белка становится более точной. Однако чем больше скорость потока отклоняется от оптимальной (0,3 мкл/мин), тем меньше достоверность регистрируемых значений интенсивности, особенно при концентрациях выше 200-400 нМ, и тем больше стандартное отклонение нормированной интенсивности. С изменением скорости потока наноэлектроспрея участок нелинейности может достигать 0,6 - 0,8 мкМ. При скорости потока 0,10 -0,15 мкл/мин зависимость масс-спектральной интенсивности от концентрации выходила на плато уже после 500600 нМ, а при скоростях 0,45-0,60 мкл/мин заметного изменения значений интенсивности масс-спектрального сигнала с ростом концентрации не наблюдали уже после 300 нМ.
s
I
i 4,5
R! = 0,9132 R' = 0,9387
3,5
3 i
2,5
1,5
0,5
R' = 0,7253
R* = 0,8933
0,2
0,8
0,4 0,6
концентрация, мкМ
'ОД мкл/мин -----0,15 мкл/мин — — 0,2мкл/мин - 0,45 мкл/мин — •• 0,6 мкл/мин --—0,3 мкл/мин
- без ICC
Рисунок 5. Изменение значений масс-спестралыюй интенсивности и линейности корреляции интенсивности от концентрации в зависимости от скорости потока наноэлектроспрея на примере цитохрома с. Кривые построены по сумме всех идентифицированных пептидов цитохрома С при определенной скорости потока наноэлектроспрея: для скорости 0,1 мкл/мин - 11 пептидов; 0,15 мкл/мин - 11 пептидов; 0,2 мкл/мин - 10 пептидов; 0,3 мкл/мин - 13 пептидов; 0,45 мкл/мин - 13 пептидов; 0,6 мкл/мин -12 пептидов. Во всех случаях сканирование и идентификацию пептидов в MS/MS режиме проводили при усреднение по не менее двум пикам интенсивностью не менее 1,5*105 при условии накопления не менее 25000 пептидных ионов за 50 мсек.
Для объяснения зависимости линейности от скорости потока наноэлектроспрея, мы выдвинули следующее предположение: если сделать допущение, что растворимость пептидов, элюируемых с колонки бесконечно велика Ит4_ю п и, при прочих равных условиях, число пептидов, способных раствориться в 0,1 мкл и в объеме большем в п раз одинаково, то, тем не менее, концентрация пептидов в капле остается бесконечно малой. Тогда, концентрация пептидов в 0,1 мкл составляет Ct = п х с0 . При разной скорости потока наноэлектроспрея за единицу времени с колонки элюируют приблизительно одинаковое число пептидов в различном объеме, n(v() = ii(vi.1). При этом, скорость испарения капли элюента при разных скоростях потока неодинакова и будет тем меньше, чем выше скорость потока наноэлектроспрея. Значит число пептидов, попавших для анализа в масс-спектрометр, за одинаковый интервал времени будет больше,
K(v,0 > ViV^) ■
-,t = const
Количество ионов, которое должно аккумулироваться за определенный интервал времени перед фрагментацией является еще одним фактором, определяющим
линейность зависимости интенсивности от концентрации. Этот параметр регулируются приборно в режиме ICC (ion current control) при проведении масс-спектрометрических измерений. Изменение времени накопления ионов с 50 до 5 миллисекунд и снятие ограничения по количеству ионов со 100000 при контрольной скорости потока 0,3 мкл/мин приводит к значительному росту масс-спекгральной интенсивности на всем интервале концентраций. В сравнении с активным режимом ICC при той же скорости потока, рост интенсивности превосходил наблюдаемый даже при малых скоростях (0,10 - 0,20 мкл/мин) приблизительно в 1,6 раза.
5. Сравнение безметкового метода количественной оценки содержания белков в биологических пробах с общепринятыми методами количественной протеомики.
Проверку разработанного безметкового метода количественной оценки содержания белков в биологических пробах осуществляли с помощью сравнительного анализа с методом AQUA и методом изотопного замещения двух атомов кислорода [1бО] на [180] на С-конце пептидов в ходе реакции расщепления, катализируемой трипсином. Результаты измерений параллельно сравнивали с содержанием белка в пробе, оценку которого проводили безметковым методом.
Метод абсолютной количественной оценки белка AQUA (Absolute QUAntification) основан на сравнении площади пиков выбранных пептидов белка с идентичными пептидами с аминокислотными остатками с тяжелыми изотопами [2Н], [13С] или [l5N] -внутренними стандартами. Нативные и синтетические пептиды с одинаковой аминокислотной последовательностью характеризуются синхронностью во времени удержания на колонке.
В смесь пептидов исходного препарата белка добавляли 10 и 50 нмолей синтезированных пептидов с изотопной меткой, и далее по масс-спектрам проводили оценку количества белка по внутренним стандартам. Для данной работы в качестве модельного белка выбрали 3-ю изоформу MUP (Major Urinary Protein) мыши, который встречается при протеомном профилировании белкового состава фракции микросом печени. Из числа идентифицированных пептидов для данного белка отбирали уникальные пептиды, индекс достоверности идентификации которых составлял не ниже 8,0 и покрытие не менее 85%. Из полученного пула пептидов отбирали те, длина которых не превышала 15 аминокислотных остатков, так как большая длина в значительной степени усложняет химический синтез пептидов. При этом пептиды не содержали в своем составе модифицированных аминокислотных остатков и при анализе формировали пептидные ионы с зарядом не выше +3. Всего в составе MUP3 белка было проанализировано 18 пептидов с молекулярными массами от 563 до 2238 Да.
•US. 23.6-24 0^in I2241-I225S
A
*H3N - ENIIDLSNANR'T - COO' 1267.463 = [M+2H*]!*
'USKSie.Si, I. i ,
V} SNANR
y.NANR
y£ LSNANR
v, idl5nanr
■4-
Рисунок 6. Масс-спектры пептидных двухзарядпых ионов 1267 (А - MS-спектр, Б - MS/MS-спектр распада иона 1267) и 1258 (В - MS-спектр, Г - MS/MS спектр распада иона 1258).
Калибровочную кривую в интервале концентраций от 1 нМ до 1 мкМ для MUP3 белка строили по трем синтетическим пептидам (1258 Да, 1300 Да и 1045 Да) полностью
соответствующие по молекулярной массе и аминокислотному составу нативным триптическим пептидам. Методом AQUA проводили количественный анализ белка MUP3 в контрольной и опытной (мышей, инъецированных 3-метилхлорантреном) пробах микросом печени мыши. Содержания белка рассчитывали по отношению площадей пиков пептидов с включением изотопов атомов углерода и азота и нативных пептидов, полученных после трипсинолиза. Было показано, что в опытной пробе содержание белка оставило 85нМ, что в 8,31 раз превышало содержание в контрольной пробе - 10,22 нМ. По калибровочной кривой безметкового метода определили, что содержание MUP3 в контрольной пробе составило 10,5 нМ, а в опытной пробе - в 94 нМ, то есть отличие в 9 раз. Сравнение эффективности двух методов продемонстрировало хорошее совпадение результатов в 84-88%, что укладывалось в рамки относительного стандартного отклонения а = 15% для нашего метода. Данные об уровне экспрессии MUP3, полученные сравнительным анализом AQUA и безметкового метода, согласуются с цифрами, обозначенными ранее (Zgoda V. et al, 2006, Proteomics, 6, 466270), где авторы проводили количественную оценку MUP3 с использованием дифференциальных двумерных электрофорезов.
нормированная интенсивность анализируемых и стандартных петгидов
О 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
8000
; гм 7000
5 8
! | 6000 i ¡ §
¡ «Г с 5000
4000 3000 2000 1000
О 20 40 60 80 100
Bsssssa пептпдйм t>asoгм концентрация нМ
ышжа r>GIiTHAliööDi контроль Еагяжж- мптяИЬэан löfM
кие гитиигяо» ä-мс
яшшшш nemiifllZSSfta K&mpwit. Ежшааозй ПЙПГИДЛ >6? Ca 50 fM ияйааяжг ncnriifli >67 Гч iofM
*——»-суммарная кривая ?.аип. nu^cTitni гниде ei25S. liöö н IS3Ö üa —----- Л1шййная(суаиарная кривая 53инс»м»стипАгт|ДОВ ¿258. 1Ш и 1630 i>*]
8000 1
Рисунок 7. Диаграмма для сравнения интенсивностей пептидов 1300 и 1258 Да в смеси белков контрольной и анализируемой проб микросом печени мыши со значениями изотоп-содержащих пептидов 1309 и 1268 Да по калибровочной кривой М№3 белка в точках 10 нМ и 50 нМ.
Количественный анализ трех модельных белков в смеси (цитохром с, алкогольдегидрогеназа и пероксидаза) проводили методом включения атомов кислорода [180] на С-конец пептидов в ходе реакции гидролитического расщепления. Оценивали
содержанием меченых белков и белков контрольной группы (с изотопами кислорода [(60]) в соотношениях 1 : 1, 1 : 3 и 1 : 5 по мольным долям в прямом и обратном экспериментах, где одна мольная доля составила 10 нМ.
В таблице 5 представлены результаты измерения масс-спектралыюй интенсивности пептидов в смеси [,80]- и [1бО]-пептидов цитохрома с, алкогольдегидрогеназы и пероксидазы после трипсинолиза. Количественный анализ проводили, оценивая соотношение площадей масс-спектрометрических пиков пептидов в паре [160]/[180] с учетом вклада доли немеченых пептидов в 180-препарате.
Таблица 5. Количественная оценка содержания пептидов цитохрома с, пероксидазы и
Пептид ! № | Белок Мольная доля в прямом эксперименте, нМ Мольная доля в обратном эксперименте. нМ
(11)ТРТ1Р01ЧК(У) 1 ! цитохромС 8,210,12 7,9±0,03
(Я)М5М1ТР1ТСТОС<31Л|1) 2 | цитохром С 8,5±0Д0 8,1±0,07
(К)ЕКО]УСАУЦ<(А) 3 | алкогольдегидрогеназа 8,7±0,06 8,7±0,02
(Я)У16106СЕеКЕЕ1РК(Я | 4 цитохром С 8,2+0,17 7,910,10
(кугеоАРерзэтоАмкм 5 лероксидаза ) а,5±о,об 8,1+0,09
(К)ОТЕЕМПГЕЕНО(К) 6 алкогольдегидрогеназа ! 8,5±о.п 8,110,15
(1ЧТНЕК01!НА05АУ0(Г1) 7 лероксидаза ] 8,з±о,од 8,310,12
стандартное отклонение
0,286 (17%)
Для отношения 1 : 1 среднее значение [180]/[160] составило 1,161, стандартное отклонение 0,049. На основании полученных результатов для отношений 1 : 3 и 1 : 5 в прямом и реципрокном экспериментах и формальных статистических критериев (г-, 0-критерий, Р-тест), мы объединяли выборки по соответствующим отношениям в одну генеральную совокупность. В результате получили, что для 1 : 3 среднее отношение площадей пиков составляет 3,295 со стандартным отклонением 0,272, а для 1 : 5 среднее равно 5,332 со стандартным отклонением 0,261. При сравнительном анализе по значениям нормированной интенсивности калибровочной кривой для цитохрома с, было показано, что одна мольная доля соответствую 8,2 нМ в прямом и 7,9 нМ в реципрокном экспериментах; для алкогольдегидрогеназы - 8,7 нМ и 8,3 нМ соответственно. Для пероксидазы количественное содержание определили как 8,4 нМ и 8,3 нМ. В общем случае, средняя концентрация одной мольной доли, рассчитанной по безметковому методу, составила 8,28 нМ со стандартным отклонением в 0,286; в процентном выражении отклонение расчетной величины от известной концентрации составило в 17%. Это значение укладывается в рамки погрешностей, которые были определены для белков в виде чистого препарата и в смеси.
Таким образом, результаты сравнительного анализа безметкового метода с данными традиционных методов относительной и абсолютной количественной протеомики указывают на высокую точность измерений, подтверждая существование зависимости масс-спектрометрического сигнала от концентрации.
С использованием 8 модельных белков выявлено наличие зависимости масс-спектралыюй интенсивности их трипсиновых пептидов от концентрации белков в исходном образце. Данная зависимость определяется линейным характером с коэффициентом корреляции Пирсона от 0,96 до 0,99. Границы линейной зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации белка находятся в пределах от 1 нМ до 1 мкМ при использовании электроспрейной ионизации и ионной ловушки в качестве детектора. Линейность зависимости справедлива для изолированных белков и для белков в смесях.
Для соблюдения линейной зависимости между концентрацией белков и масс-спектральной интенсивностью их трипсиновых пептидов необходимо выполнения условия регистрации спектров четырех уникальных пептидов, принадлежащих одному белку. Присутствие таких пептидов должно прослеживаться на протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона.
Скорость потока наноэлектроспрея и ICC (контроль потока ионов) воздействуют на свойства зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации. Оптимальной скоростью потока для поддержания линейной зависимости в диапазоне 0,001-1 мкМ является 0,3 мкл/мин. Эффективность безметкового метода количественной оценки содержания белков была подтверждена альтернативными методами количественной протеомики. При сравнении с методом AQUA (абсолютная количественная оценка) совпадение результатов количественной оценки белка MUP3 в микросомах печени мыши составляет 87-92 %. При сравнении результатов безметкового количественного анализа с результатами, полученными методом количественной оценки с использованием изотопов атомов [180], совпадение результатов составляет 84-88 %.
ПУБЛИКАЦИИ
1. Н.А.Петушкова, А.В.Лисица, И.И.Карузина, В.Г.Згода, Г.Ф.Шереметьева, Н.Ф.Саменкова, И.П.Никитин, Т.А.Сахарова, А.Т.Копылов, А.И.Арчаков. Идентификация цитохромов Р450 микросом клеток печени человека с помощью масс-спектрометрии //Биомедицинская химия. -2007. - Т.53, №4. - С. 400-411.
2. Копылов А.Т., Мельник С.А. Комплексная клиническая и лабораторная диагностика заболеваний // Сборник докладов VII Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов по приоритетному направлению «Живые системы». - 2007. - Москва-Звенигород, Россия. - С. 38
3. Копылов А.Т., Згода В.Г. Количественная оценка влияния 3-метилхлорантрена и фенобарбитала на уровень экспрессии цитохромов Р450 методом масс-спектрометрии в фармакопротеомике II Сборник докладов XI Международной Пущинской конференции «Биология-наука XXI века». - 2007. - Пущино, Россия. -С. 255
4. Копылов А.Т., Згода В.Г. Методы количественной протеомики // Биомедицинская химия. -2008. -Т.53, №6. - С. 613-43
5. Kopylov А.Т., Zgoda V.G. Label-free quantitative analysis in mass-spectrometry // The 7th HUPO Annual Congress. - 2008. - Seoul, Korea. - P. 91
6. Michele Crumeyrolle-Arias, Olga Buneeva, Victor Zgoda, Arthur Kopylov, Ana Cardona, Marie-Claude Tournaire, Vladimir Pozdnev, Vivette Glover, Alexei Medvedev., Isatin binding proteins in rat brain: in situ imaging, quantitative characterization of specific 3[H]Isatin binding, and proteomic profiling // Journal of Neuroscience research. - 2009, Apr. 24. - Epub ahead of print
7. Копылов A.T., Згода В.Г., Арчаков А.И. Количественный масс-спектрометрический анализ содержания белков в биологических пробах без использования изотопных меток // Биомедицинская химия. - 2009. - Т.55, №2. -С.125-139
Подписано в печать: 13.05.2009
Заказ № 2033 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Копылов, Артур Тигранович
1 Определение и постановка цели и задач проводимой работы. 8 Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах
2 Литературный обзор по современным метолам и достижениям в 11 относительной и абсолютной количественной протеомике
2.1 Краткая история развития количественной протеомики, важность и 12 области применения количественного анализа (медицина, фармакология, криминалистика, наркология, диагностика заболеваний)
2.2 Химические методы изотопного мечения в количественной протеомики
2.2.1 ICAT (сайт-специфическое мечение по цистеинам)
2.2.2 ICROS (метионин- и цистеин специфичное мечение)Теория масс- 21 спектрометрического количественного анализа, его возможности, достоинства и недостатки
2.2.3 Гуанидирование (лизин-специфичное мечение)
2.2.4 Изотопное мечение по лизину и свободным NH2-rpynnaM
2.2.5 Твердофазное изотопное мечение (лейцин) SIT
2.3 Ферментативное С-концевое (160/18Ь) мечение белков.
2.4 Изотопное мечение белков в культуре клеток SILAC
2.4.1 SILAC с изотопными аминокислотами в культуральной среде 2.4.2 SILAC с изотопными атомами 14N/15N в культуральной среде
2.4.3 SILAC с изотопными атомами 12С/13С в культуральной среде
2.5 Метод количественной оценки на уровне MS/MS. iTRAQ (изобарное 36 аминомечение)
2.6 Количественная масс-спектрометрическая оценка посттрансляционных 38 модификаций белков
2.6.1 Фосфопротеомика
2.6.1.1 IMAC-металлоаффинная хроматография
2.6.1.2 Метод без использования изотопной метки. Мультипротеазный подход
2.6.2 Гликопротеомика
2.6.2.1 Дериватизация и изотопное мечение з[0]-аргинином
2.6.2.2 Твердофазное изотопное мечение (SIT)
2.6.2.3 Метод без использования изотопной метки. Изучение О- 47 сульфатированных форм серина и треонина
2.6.2.4 Фронтальная аффинная хроматография (FAC)
2.7 Абсолютый количественный анализ белков и фосфопротеинов методом 49 тандемной масс-спектрометрии
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток"
5.2 Необходимость безметковых методов количественной протеомики с 124 использованием масс-спектрометрии
5.3 Оптимизация приборно-измерительной базы и ограничения методов 125 количественной протеомики
5.4 Сложности в обработке данных количественной масс-спектрометрии 127
5.5 Линейность зависимости масс-спектрометрического сигнала от 128 концентрации пептидов и динамические диапазоны детекции
5.6 Верификация гипотезы о линейной зависимости между интенсивностью 134 масс-спектрометрического сигнала и концентрацией пептидов общепринятыми методами относительной количественной протеомики
6 Выводы 138
7 Заключение 139 Список цитируемой литературы 141 Приложение 156
1. ВВЕДЕНИЕ. Определение и постановка цели и задач проводимой работы.
Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах.
Протекание любого биологического процесса неразрывно сопровождается изменениями химического состава клетки и биологических жидкостей. Изучение таких динамических изменений в белковом составе является основной задачей протеомных исследований, оказывающих неоценимый вклад в фундаментальное понимание биологических процессов и применении новых методов в диагностике и лечении. Самое популярное решение этих вопросов протекает через сравнительный анализ белков в протеоме, содержание которых может меняться в ответ на какие-либо воздействия химического или физиологического характера. Именно такие изменения в клеточном составе представляют собой наибольший интерес для дальнейших исследований. С ростом потребности в этих результатов к протеомике все больше предъявляются требования количественно оценки изменений. Однако из-за значительных технических и методических ограничений масс-спектрометрия, которая является основным инструментарием современной протеомики, не способна осуществлять количественную оценку непосредственно. Для решения этой проблемы со временем были разработаны методы относительной количественной протеомики с использованием стабильных тяжелых изотопов кислорода, углерода, азота и дейтерия. Эти тяжелые атомы включались в состав пептидов или белков, либо замещали их легкие аналоги в некоторых случаях, тем самым смещая действительную молекулярную массу пептида в большую сторону. Сравнивая площади под пиками пептидов одинакового химического состава, но с различным содержанием тяжелых изотопов, ученые научились проводить количественную оценку белков в организмах различного состояния. С течением времени исследователи обнаруживали все больше недостатков в методах количественной оценки с использованием различных изотопов. Прежде всего, ограниченная специфичность меток: многие из них были направлены на связывание с тиольной группой аминокислотного остатка цистеина. Это вызывало дополнительные трудности и расходы, связанные с необходимостью максимально полного восстановления цистеинов в процессе пробоподготовки, что также увеличивало время всего эксперимента. Белки с малым содержанием цистеинов или их отсутствием в первичной цепи, или отсутствие цистеинов в доступных для протеолиза пептидах, полностью исключались из количественной оценки. Метод метаболического изотопного мечения был доступен только для использования в культуре клеток in vitro или для простейших организмов. Изотопное мечение тяжелыми атомами кислорода 180 в ходе реакции гидролитического расщепления трипсином требовало масс-спектрометров с высоким разрешением, чтобы не допустить перекрывания изотопного распределения с меткой. Все это не могло оставаться без внимания исследователей, так как дальнейшее развитие количественной оценки с использованием различных меток и внутренних стандартов все больше заводило в тупик.
Однако за последнюю декаду лет многие ученые стали обращать внимание на принципиально новый подход в количественной протеомике - без использования меток. Выявление и изучение закономерностей зависимости между сигналом масс-спектрометра и количеством измеряемого белка дали толчок бурному развитию двух основных направлений количественной протеомики без использования меток: более раннее из них, так называемый count-based, основан на корреляции суммарного индекса достоверности идентификации белка по всем зафиксированным в ходе эксперимента пептидам. Второе направление, более молодое, но более перспективное - intensity-based - основывается на существовании зависимости между уровнем усредненной суммы масс-спектрометрических сигналов пептидов, принадлежащих одному белку, и его содержанием в биологической пробе. В наши дни еще остается достаточно скептиков, утверждающих о невозможности корректной количественной оценки такими подходами. Но оба направления претерпевают бурное развитие и имеют все перспективы вытеснить в недалеком будущем количественные методы на основе использования тяжелых изотопных атомов.
Настоящей работой мы внесли вклад в развитие безметковой количественной протеомики с применением масс-спектрометрии. Нами была выявлена и доказано существование зависимости уровня ответного масс-спектрометрического сигнала от содержания белка в пробе, детально исследована математическая основа зависимости на индивидуальных белках и на белковых смесях; показаны особенности поведения кривой зависимости, связанные с числом индивидуальных пептидов одного белка и их сочетанием. Выявлены влияние скорости потока наноэлектроспрея на линейность кривой зависимости и на уровень интенсивности в отдельных точках и элементах кривой. На основе данных подходов разработан и охарактеризован новый метод количественного протеомного анализа без использования меток с включением изотопов атомов с применением масс-спектрометрии.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке метода количественной оценки содержания белков без использования меток.
1. Выявить наличие и характер зависимости между уровнем масс-спектрометрического сигнала и концентрацией растворов 8 индивидуальных белков и их смесей. Определить концентрационные интервалы, в рамках которых проявляется зависимость масс-спектральной интенсивности от концентрации.
2. Определить условия линейности зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации триптических пептидов анализируемого белка в пробе.
3. Выявить влияние скорости потока наноэлектроспрея на зависимость интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации для указанных белков виде чистого препарата и в смеси.
4. Оценить эффективность разработанного метода путем его использования для количественной оценки белка MUP3 в пробе микросом ткани печени мыши.
Научная новизна работы. В диссертации разработан и охарактеризован метод количественного протеомного анализа без использования меток с включением тяжелых изотопов. Для этого приведена подробная доказательная база существования линейной корреляции уровня ответного масс-спектрометрического сигнала от концентрации анализируемого белка. Показано, что границы корреляции для количественного анализа с использованием масс-спектрометра типа ионной ловушки составляют от 1 fM до 1 рМ. Показано, что данная зависимость сохраняет характеристики линейности в условиях чистого препарата и в смеси белков и не зависит от физико-химических свойств белка, его функциональной принадлежности и организма происхождения. Впервые показано, что для соблюдения линейности необходимо наличие минимум трех различных достоверно идентифицированных пептидов, принадлежащих одному белку, и присутствие которых прослеживается на протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона. Такие пептиды формируют интегрированную базовую кривую зависимости, свойства которой не зависят от сочетания базовых пептидов. Нами также были подобраны оптимальные условия скорости потока наноэлектроспрея применимые для поведения количественной оценки белков на ионных ловушках.
Практическая значимость работы. В работе показано, что разработанный нами метод позволяет эффективно решать поставленные проблемы в количественной протеомики для оценки содержания белковых компонентов в биологических пробах и в чистых препаратах без использования химических или метаболических меток, содержащих атомы тяжелых изотопов. Разработан общий подход к оптимизации условий метода количественной оценки белков с использованием масс-спектрометрии на примере ионной ловушки и нормализации и выравниванию данных для эффективного выявления линейности зависимости масс-спектрометрической интенсивности ответного сигнала от концентрации анализируемого белка в чистом препарате и в смеси белков.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Копылов, Артур Тигранович
6. выводы
В соответствии с поставленными задачами к разработке безметкового метода количественной оценки содержания белков в масс-спектрометрии по результатам работы нами были сделаны следующие выводы:
1. С использованием 8 модельных белков выявлено наличие зависимости масс-спектральной интенсивности их трипсиновых пептидов от концентрации белков в исходном образце. Данная зависимость определяется линейным характером с коэффициентом корреляции Пирсона от 0,96 до 0,99. Границы линейной зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации белка находятся в пределах от 1 нМ до 1 мкМ при использовании электроспрейной ионизации и ионной ловушки в качестве детектора. Линейность зависимости справедлива для изолированных белков и для белков в смесях
2. Для соблюдения линейной зависимости между концентрацией белков и масс-спектральной интенсивностью их трипсиновых пептидов необходимо выполнения условия регистрации спектров четырех уникальных пептидов, принадлежащих одному белку. Присутствие таких пептидов должно прослеживаться на протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона.
3. Скорость потока наноэлектроспрея и ICC (контроль потока ионов) воздействуют на свойства зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации. Оптимальной скоростью потока для поддержания линейной зависимости в диапазоне 0,001-1 мкМ является 0,3 мкл/мин.
4. Эффективность безметкового метода количественной оценки содержания белков была подтверждена альтернативными методами количественной протеомики. При сравнении с методом AQUA (абсолютная количественная оценка) совпадение результатов количественной оценки белка MUP3 в микросомах печени мыши составляет 87-92 %. При сравнении результатов безметкового количественного анализа с результатами, полученными методом количественной оценки с использованием изотопов атомов [180], совпадение результатов составляет 84-88 %.
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Подводя итоги всему вышесказанному и результатам проведенной работы, можно сказать, что в данной работе нами была подтверждена и проверена на практике возможность осуществления количественного анализа содержания белков в биологических пробах без использования меток, содержащих атомы изотопов, с применением масс-спектрометрии. В работе были детально изучены закономерность зависимости масс-спектральной интенсивности сигнала от концентрации белка в пробе, приведена доказательная база линейности корреляции. Многие эксперименты направлены на выявление факторов, способных оказывать возможное влияние на линейность зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации: скорость потока наноэлектроспрея, использование режима ICC, алгоритма нормирования данных, физико-химические свойства изучаемых экспериментальных белков. В работе также выяснены некоторые особенности поведения линейной зависимости на различных участках концентраций, определены пределы чувствительности, в рамках которых сохраняется линейность корреляции. Проведено сравнение эффективности безметкового метода для исследования чистых препаратов белков и белковых смесей.
Показано, что для соблюдения линейности зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации белка в пробе необходимо наличие как минимум четырех уникальных идентифицированных пептидов, принадлежащих одному белку, которые формируют базовую кривую зависимости масс-спектральной интенсивности сигнала от концентрации, характерную для общей совокупности всех пептидов данного белка, идентифицированных в ходе количественного анализа. При этом, данные пептиды должны прослеживаться на протяжении всего интересуемого диапазона предполагаемых концентраций и имеют ограничения по индексу достоверности идентификации - не менее 6,0 (Spectrum Mill Agilent) для каждого; это правило сохраняется как для белков в виде чистого препарата, так и для белковых смесей. Также показано, что каждый белок обладает характеристическим для него значением тангенса наклона зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации. Данная величина не зависит от присутствия сторонних белков в пробе и от природы самого белка и изменяется в незначительных пределах в условиях чистого препарата и белковой смеси. В литературных источниках отсутствуют упоминания о таких деталях линейности зависимости и особенностях поведения белков. Эти факты отличают данную работу своей новизной от всех остальных подобных исследований, посвященных тематике количественной протеомики без использования меток.
Актуальность количественной протеомики в современной науке неоспорима. Данные количественной протеомики необходимы в медицине, токсикологии, криминалистике и многих других исследованиях, охватывающих широкий спектр прикладной и фундаментальной науки. Утверждение безметковых методов количественной протеомики в своей достоверности и эффективности поможет в значительной степени облегчить условия исследований, снизить их стоимость, сократить время и трудоемкость экспериментальной работы. Результаты данной работы и сравнение данных с общепринятыми методами относительной и абсолютной количественной протеомики (AQUA, мечение атомами [180] в ходе трипсинолиза) свидетельствуют в пользу возможности осуществления количественной оценки белков в биологических пробах без использования химических меток, содержащих изотопные атомы. Динамические диапазоны концентраций, которые охватываются в данной работе, сопоставимы с таковыми для иммуноблоттинга, ELISA и многих методов относительной количественной протеомики с использованием масс-спектрометрии.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Копылов, Артур Тигранович, Москва
1. Patton, W.F. Detection technologies in proteome analysis. 11 J. Chromatography B.2002.- 771.-P.3-31.
2. Unlu, M., Morgan, E., Minden, J.S. Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts // Electrophoresis. -1997. -18. P.2071-2077.
3. Freeman, W.M., Hemby, S.E. Proteomics for protein expression profiling in neuroscience // Neurochem. Res. 2004. - 29. - P.1065-1089.
4. Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. // Proteomics. 2002. - 2 (1). - P.3-10.
5. Opitek, G.J., Ramirez, S.M., Jorgenson, J.W., Moseley, M.A. Comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed proteins and proteome mapping 11 Anal Biochem. 1998.- 258. - P.349-361.
6. Zhang, Z.L., Smith, D.L., Smith, J.B. Multiple separations facilitate identification of protein variants by mass spectrometry // Proteomics. 2001. -1. - P.1001-1009.
7. Feng, B.B., Patel, A.H., Keller, P.M., Slemmon, J.R. Fast characterization of intact proteins using a high-throughput eight-channel parallel liquid chromatography/mass spectrometry system // Rapid Commun. Mass Spectom. 2001. - 15. - P.821-826.
8. Krapfenbauer, К., Fountoulakis, M., Lubec, G. A rat brain protein expression map including cytosolic and enriched mitochondrial and microsomal fractions. // Electrophoresis. 2003. - 24. - P.1847-1870.
9. El Rassi, Z., Horvath, C. Tandem columns and mixed-bed columns in high-performance liquid chromatography of proteins // J. Chromatogr B. 1986. - 359. - P.255-264.
10. Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W., Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS // Proc. Nat Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, №12. - P.6940-6945.
11. Oda, Y., Huang, K., Cross, F.R., Cowburn, D., Chait, B.T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1999. 96. -P.6591-6596.
12. Gygi, S.P., Rist, В., Gerber, S.A., Turecek, F., Gelb, M.H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags// Nat.Biotechnol. -1999.- 17. P.994-999.
13. Wang, S., Regnier, F.E. Proteomics based on selecting and quantifying cysteine containing peptides by covalent chromatography // J. Chromatogr. A 2001. - 924. -P.345-357.
14. Flory, M.R., Griffin, T.J., Martin, D., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics using stable isotope tags // Trends in Biotechnology. 2002. - Vol. 20, №12. - P.S23-S29.
15. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics 11 Nature. 2003. - 422. -198-207.
16. Peng, J., Gygi, S.P Proteomics: the move to mixtures I I J Mass Spectro. 2001. - 36. -P.1083-1091.
17. Leither, A., Under, W. Predictive value of seven preoperative prognostic scoring systems for spinal metastases. // Proteomics. 2006. - 6. - P.5418-5434.
18. Hansen, К.С., Schmitt-Ulms, G., Chakley, F, Hirsch. Mass spectrometric analysis of protein mixtures at low levels using cleavable 13C-isotope-coded affinity tag and multidimensional chromatography // J. Mol. Cell. Proteomics. 2003. - 2. - P.299-314.
19. Li, J., Steen, H., Gygi, S.P. Protein profiling with cleavable isotope-coded affinity tag (cICAT) reagents: the yeast salinity stress response // J Mol. Cell. Proteomics, 2003. -2.-P.1198-1204.
20. Oda, Y., Owa, Т., Sato, Т., Boucher, B. Quantitative chemical proteomics for identifying candidate drug targets //Anal. Chem. 2003. - 75. - P.2159-2165.
21. Yu, L.-R., Conrads, T.P., Uo, Т., Isaaq, H.J. Evaluation of the acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagents: application to camptothecin-treated cortical neurons. // J. Proteome Res. -2004. 3. - P.469-477.
22. Parker, K.C., Pattern, D., Williamson, В., Marches, J. Depth of proteome issues: a yeast isotope-coded affinity tag reagent study. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.625-659.
23. Sethuraman, M., McComb, M.E., Heibeck, Т., Costello, C.E., Cohen, R.A. Isotope-coded affinity tag approach to identify and quantify oxidant-sensitive protein thiols. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.273-278.
24. Dunkley, T.P.J., Watson, R., Griffin, J.L., Dupree, P., Lilley, K.S. Localization of organelle proteins by isotope tagging (LOPIT) // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.1128-1134.
25. Li, K.W., Hornshaw, M.P., van Minnen, J., Smalla, K.-H. Proteomics of the injured rat sciatic nerve reveals protein expression dynamics during regeneration // Proteome Res. -2005.-4.- P.725-733.
26. Ranish, J.A., Yi, E.C., Leslie, D.M., Purvine, S.O., Goodlet, D.R. Eng, J., Aebersold, R. The study of macromolecular complexes by quantitative proteomics // Nature Genetics. -2003. Vol.33, №3. - P.349-355.
27. Wang, S., Regnier, F.E. Proteomics based on selecting and quantifying cysteine containing peptides by covalent chromatography // J. Chromatogr A. 2001. - 924. -P.345-357.
28. Zhou, H., Ranish, J.A., Watts, J.D., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and mass spectrometry // Nature Biotechnology. 2002. - 19.-P.512-515.
29. Zhang, H., Li, X.-J., Martin, D.B., Aebersold, R. Identification and quantification of relinked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry // Nature Biotechnology. 2003. - Vol 21, №6. - P.660-666.
30. Spirson, D.B., Rittenberg, D. // Nature. -1951. -167. p.484-484,
31. Desidero, D.M., Kai, M. Preparation of stable isotope-incorporated peptide internal standards for field desorption mass spectrometry quantification of peptides in biologic tissue // Biomed. Mass Spectrum. -1983. 10. - P.471-479.
32. Stewart, 1.1., Thomson, Т., Figeys, D. 180 labeling: a tool for proteomics //Rapid Comm. Mass Spectrom. 2001. - 15. - P.2456-2465.
33. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J, Dmitriev, P.A., Fenselau, C. Proteolytic 180 labeling for comparative proteomics: model studies with two serotypes of adenoviru // Anal Chem. -2001.-73.-P.2836-2842.
34. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 180 labeling: endoprotease-catalyzed 160-to-180 exchange of truncated peptide substrates // J. Proteome Res.2003.-2.-P.147-152.
35. Lopez-Ferrer, D., Ramos-Fernandes, A., Martinez-Bartolome, S., Garcia-Ruiz, P., Vaskez, J. // Proteomics. 2006. - 6. - P.S4-S11.
36. Zang, L„ Palmer, T.D., Hancock, W.S., Sgroi, D.C., Karger, B.L. 11 J. Proteome Res. 2004.3. P.604-612.
37. Bantscheff, M., Dumpelfeld, В., Kuster, B. Femtomol sensitivity post-digest (18)0 labeling for relative quantification of differential protein complex composition // Rapid Comm. Mass Spectrum. 2004. - 18. - P.869-876.
38. Staes, A., Demol, H., Van Damm, J., Martens, L. Global differential non-gel proteomics by quantitative and stable labeling of tryptic peptides with oxygen-18 // J. Proteome Res.2004.-3.- P.786-791.
39. Ong, S.-E., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative. // Nature Chem. Biology. 2005. - Vol. 1, №5. - P.252-262.
40. Julka, 5., Regnier, F.E. Benzoyl derivatization as a method to improve retention of hydrophilic peptides in tryptic peptide mapping // J. Proteome Res. 2004. - 3. - P.350-363.
41. Rao, K.C., Carruth, R.T., Miyagi, M. Proteolytic 180 labeling by peptidyl-Lys metalloendopeptidase for comparative proteomics. // J. Proteome Res. 2005. - 4. -P.507-514.
42. Hajkova, D., Rao, K.S.C., Miyagi, M. pH dependency of the carboxyl oxygen exchange reaction catalyzed by lysyl endopeptidase and trypsin //J. Proteome. Res. 2006. - 5. -P.1667-1673.
43. Brown, K.J., Fenselau, C. nvestigation of doxorubicin resistance in MCF-7 breast cancer cells using shot-gun comparative proteomics with proteolytic 180 labeling // J. Proteome Res. 2004. - 3. - P.455-462.
44. Chen, X., Cushman, S.W., Panel, L.K., Hess, S. Quantitative proteomic analysis of the secretory proteins from rat adipose cells using a 2D liquid chromatography-MS/MS approach //J. Proteome Res. 2005. - 4. - P.570-577.
45. Foster, L.J., de Hoog, C.L., Mann, M. Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors // Proceed. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, №10. - P.5813-5818.
46. Schlosser ,A., Amanchy ,R., Otto ,H. Identification of tyrosine-phosphorylation sites in the nuclear membrane protein emerin // FEBS. 2006. - 273. - P.3204-3215.
47. Everley, P.A., Krijgsveld, J., Zetter, B.R., Gygi, S.P. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.729-735.
48. Karimi-Busheri, F., Daly, G., Robins, P., Canas, В., Pappin, D.J., Sgouros, J., Miller, G.G., Fakhrai, H., Davis, E.M., Le Beau, M.M., Weinfeld, M. Molecular characterization of a human DNA kinase //J. Biol. Chem. -1999. 274. - P.24187-24194.
49. Hoss, M., Robins, P., Naven, T.J.P., Pappin, D.J.C., Sgorous, J., Lindahl, D.A. // 1999. -EMBOJ. 18. - P.3868-3875.
50. Mann, M., Jensen, O.N. Proteomic analysis of post-translational modifications // Nature Biotechnology. 2003. - Vol. 21, №3. - P.255-261.
51. Larsen, M.R., Larsen, P.M., Fay, S.J., Roepstoff, P. Characterization of differently processed forms of enolase 2 from Saccharomyces cerevisiae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry // Electrophoresis. 2001. - 22. -P.566-575.
52. Loyet, K.M., Stults, J.T., Arnott, D. Mass spectrometric contributions to the practice of phosphorylation site mapping through 2003: a literature review // Mol. Cell. Proteomics. -2005.- 4.-P.235-245.
53. Zubarev, R.A., Kelleher, N.L., McLafferty, F.W. Two-dimensional mass spectrometry of biomolecules at the subfemtomole level // Curr Opinion Mol Biol. 1998. -Vol.2, №5. -P.571-578.
54. Syka, J.E., Coon, J.J., Schroeder, M.J., Shabanowitz, J., Hunt, D.F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -101. - P.9528-9533.
55. Huang, S.-Y., Tsai, M.-L., Wu, C.-J., Hsu, J.-L., Ho, S.-H., Chen, S.-H. Quantitation of protein phosphorylation in pregnant rat uteri using stable isotope dimethyl labeling coupled with IMAC // Proteomics. 2006. - 6. - P.1722-1734.
56. Posewitz, M.C., Tempst, P. Immobilized gallium(lll) affinity chromatography of phosphopeptides 11 Anal Chem. -1999. 71. - P.2883-2892.
57. Huang, C.M., Foster, K.W., DeSilva, D., Zhang, J., Zhi, Z., Yusuf, N., Van Kampen, K.R., Elmets, C.A., Tang, D.C. Comparative proteomic profiling of murine skin //J. Investig. Dermatol. 2003. - 121. - P.51-64.
58. Takahashi, N., Nakagawa, H., Fujikawa, K.; Kawamura, Y., Tomiya, N. hree-dimensional elution mapping of pyridylaminated N-linked neutral and sialyl oligosaccharides. //Anal. Biochem. -1995. 226. - P.139-146.
59. Yamamoto, S., Hase, S., Fukuda, S., Sano, 0., Ikenaka, T, Structures of the sugar chains of interferon-gamma produced by human myelomonocyte cell line HBL-38 //J. Biochem .-1989.-105.-P.547-555.
60. Strott, C.A. Sulfonation and molecular action. // Endocr. Rev. 2002. - 23. - 703-732.
61. Robbins, P., Lippman, F. Enzymatic synthesis of adenosine-5'-phosphosulfate // J Biol Chem. 1958. - Vol.233, №3. - P.681-685.
62. Kasai, K, Ishii, S. Quantitative analysis of affinity chromatography of trypsin. A new technique for investigation of protein-ligand interaction. //J Biochem (Tokyo). 1975. -77. - P.261-264.
63. Zhang, B, Palcic, M.M, Schriemer, D.C, Alvarez-Manilla, G., Pierce, M., Hindsgaul, O. Frontal affinity chromatography coupled to mass spectrometry for screening mixtures of enzyme inhibitors //Anal Biochem. 2001. - 299. - P.173-182.
64. Hirabayashi, J., Arata, Y., Kasai, K. Reinforcement of frontal affinity chromatography for effective analysis of lectin-oligosaccharide interactions. // J Chromatogr A. 2000. -890. - P.261—271.
65. Gerber, S.A., Rush, J„ Stemmen, 0., Kirschner, M.W., Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, №12. - P.6940-6945.
66. Hase S., Ibuki Т., Ikenaka T. Reexamination of the pyridylamination used for fluorescence labeling of oligosaccharides and its application to glycoproteins // J Biochem (Tokyo). 1984. - 95. - P.197-203.
67. Fiehn O., Weckwerth W. Mass spectrometry: Quantitation // Meth in Mol Biol. 2006. -358. - P.3-18.
68. Stevenson S.E. Validation of gel-free, label-free quantitative proteomics approaches: application for seed allergen profiling // J. Prot. 2009. - Vol.72, №13. - P.555-566
69. Burks W. Peanut allergy: a growing phenomenon // J. Clin. Invest. 2003. - 111. -P.950—952.
70. Anderson N.L., Anderson N.G. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts and new words // Electrophoresis. 1998. - 19. - P.1853 -1861.
71. Jennie Lill Proteomics tools for quantitayion by mass spectrometry // Mass spectrometry Reviews. 2003. - 22. - P.182-194.
72. Hacket M. Science, Marketing and wishful thinking in quantitative proteomics // Proteomics. 2008. - 8. - P.4618-4623.
73. Mann M. Quantitative proteomics? // Nature Biotechnology. -1999. Vol. 17. - P.954-955.
74. Gygi, S. P., Rist, В., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., and Aebersold,R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. // Nat. Biotechnol. -1999. 17. - P.994-999
75. Li, X. J., Pedrioli, P. G., Eng, J., Martin, D., Yi, E. C., Lee, H., Aebersold,R. A tool to visualize and evaluate data obtained by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry Ц Anal Chem. 2004. - 76. - P.3856-3860
76. Ono M., Shitashige M., Honda К. Label-free quantitative proteomics using large peptide data sets generated by nanoflow liquid chromatography and mass spectrometry // Mol. Cel. Proteomics. 2006. - 5. - P.1338-1347.
77. Liu H., Sadygov R.G., Yates J.R. Amodel forrandom samplingandestimation of relative protein abundance in shotgun proteomics // Anal Chem. 2004. - 76. - P.4193-4201.
78. Lu P.; Vogel.C., Wang R., Yao X., Marcotte E.M. Absolute protein expression profiling estimates the relative contributions of transcriptional and translational regulation // Nat Biotechnol. 2007. - 25. - P.117-124.
79. Sardiu M.E. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. - Vol.105, №45.1. P.1454-1459.
80. Mann M. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy // Proc Natl Acad Sci USA. 2008.-Vol. 105, №47. - P.1832-1838.
81. Peng J., Gygi P. Proteomics: the move to mixture //7 Mass Spectrom. 2001. - 36. -P.1083-1091.
82. Comisarow M.B., Marshall A.G. The early development of Fourier transform ion resonance cyclotron spectroscopy // J Mass Spectrom. -1996. 31. - P.581-585.
83. Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high-performance technique of mass analysis // Anal Chem. 2000. - 72. - P.1156-1162.
84. Hu Q. The Orbitrap: A new mass spectrometer // J Mass Spectrom. 2005.-40. -P.430-443.
85. Panchaud A., Affolter M., Moreillon P. Experimental and computational approach to quantitative proteomics: Status Quo and outlook // J Proteomics. 2008. - 71. - P.19-33.
86. Pedrioli P.G., Eng J.K., Hubley R., Vogelzang M„ Deutsch E.W., Raught B. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research // Nat Biotechnol. 2004. - 22. - P.1459-1466.
87. Palagi P.M., Walther D., Quadroni M., Catherinet S., Burgess J., Zimmermann-lvol C.G. MSight: an image analysis software for liquid chromatography-mass spectrometry // Proteomics. 2005. - 5. - P.2381-2384.
88. Mueller L.N., Rinner O., Schmidt A., Letarte S., Bodenmiller В., BrusniakM.Y. SuperHirn— anovel tool forhighresolution LC-MS-based peptide/protein profiling // Proteomics.2007. Vol.7, №19. - P.3470-3480.
89. Leptos K.C., Sarracino D.A., Jaffe J.D., Krastins В., Church G.M. MapQuant: open-source software for large-scale protein quantification // Proteomics. 2006. - 6. - P.1770-1782.
90. Li X.J., Yi E.C., Kemp C.J., Zhang H., Aebersold R. A software suite for the generation and comparison of peptide arrays from sets of data collected by liquid chromatography-mass spectrometry // Mol Cell Proteomics. 2005. - 4. - P.1328-1340.
91. Matthiesen R., Bunkenborg J., StensballeA., Jensen O.N.,Welinder K.G., Bauw G.Database-independent, database-dependent, and extended interpretation ofpeptidemass spectra in VEMSV2.0 // Proteomics. 2004. - 4. - P.2583-2593.
92. Gruhler A.,Olsen J.V., Mohammed S. Quantitative Phosphoproteomics applied to yeast pheromone signaling pathways // Mol Cell Proteomics. 2005. - 4. - P.310-327.
93. Mann В., Madera В., Sheng Q., ProteinQuant Suit: a bundle of automated software tolls for label-free quantitative proteomics // Rapid Communication in Mass Spectrometry.2008.- 22. P.3823-3834.
94. Levin Y., Schwatrz E., Wang L. Label-free quantitative LC-MS/MS proteomics for large-scale biomarkers discovery in complex samples //J. Sep. Sci. 2007. - 30. -P.2198-2203.
95. Kuhn E., Wu J., Karl J., Liao H. Quantification of C-reactive protein in serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards // Proteomics. 2004. - 4. - P.1175-1186.
96. Korf U., Derdak S., Tresch A. Quantitative protein microarrays for time-resolved measurements of protein phosphorylation // Proteomics. 2008. - 8. - P.4603-4612.
97. Kirkpatrick D., Gerbes S., Gygi S. The absolute quantification strategy: a general procedure for the quantification for proteins and post-translation modifications // Methods. 2005. - 35. - P.265-273.
98. Cutillas P., Vanhaesebroeck B. Quantitative profile of five murine core proteomes using label-free functional proteomics // Mol Cell Proteomics. 2007. - 6. - P.1560-1573.
99. Steen H., Jebanathirajah J., Springer M. Stable isotope-free relative and absolute quantification for protein phosphorylation stochiometry by MS // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - Vol.102, №11. - P.3948-3953.
100. Ong S.-E., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative // Nature chemical biology. 2005. - 1. - P.252-262.
101. Old W.M., Meyer-Arendt K., Veline-Wolf L., Pierce K.G., Mendoza A., Sevinsky J.R., Resing K.A., Ahn N.G. Comparison of label-free methods for quantifying human proteins by shotgun proteomics // Mol Cell Proteomics. 2005. - 4. - P.1487-1502
102. Andreev V.P., Li L., Cao L., Gu Y., Rejtar T„ Wu S.-L. A New Algorithm Using Cross-Assignment for Label-Free Quantitation with LC/LTQ-FT MS // J Proteome research. -2007. 6. - P.2186-2194.
103. Bantscheff M., Dumpelfeld В., Kuster B. Femtomole sensitivity post-digest 180 labeling for relative quantification of different protein complex composition // Rapid Comm Mass Spec. 2004. - 18. - P.869-876.
104. Bantscheff M., Schirle M., Sweetman G., Rick J., Kuster B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review //Anal Bioanal Chem. 2007. - 389. -P.1017-1031.
105. Ischihama Y., Sato Т., Tabata T. Quantitative mouse brain proteomics using culture-derived isotope labeled tags as internal standatrds // Nat Biotech. 2005. - Vol. 23,№5. - P.617-621.
106. Oda Y., Huang K., Cross F.R., Chait B.T. Accurate quantification of protein expression and site-specific phosphorylation // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. - 96. - P.6591-6596.
107. Haqquani A., Kelly J.F., Stanimirovich D.B. // Quantitative proteins profiling by mass spectrometry using label-free proteomics. Chapter 17. P.241-56. - Springer, UK
108. Oeljeklaus S, Meyer HE, Warscheid B. Advancements in plant proteomics using quantitative mass spectrometry // J Prot. 2009. - Vol.72, №3. - P.545-554.
109. Yuzuru S., Sam D., Eugene C.Yi, Goodlett D.R., Aebersold R., Eisenman R.N. Quantitative proteomic analysis of Мус oncoprotein function // The EMBO. 2002. - Vol.19, №21. -P.5088-5096.
110. Fu C., Hu J., Liu Т., Ago Т., Sadoshima J., Li H. Quantitative Analysis of Redox-Sensitive Proteome with DIGE and ICAT// J Prot Res. 2008. - Vol. 7, №9. - P.3789-3802
111. Alterman M.A., Kornilyaev B, Duzhak Т., Yakovlev D. Quantitative analysis of cytochrome P450 isozymes by means of unique isozyme-specific tryptic peptides: a proteomic approach // Drug Metab. Dispos. 2005. - 33. - P.1399-1407.
112. Bamidge D.R., Dratz E.A., Martin Т., Bonilla L.E. Absolute quantification of the G protein-coupled receptor rhodopsin by LC/MS/MS using proteolitic product peptides and synthetic peptide standarts. //Anal. Chem. 2003. - 75. - P.445-451.
113. Ross P.L, Huang Y.N, Marchese J.N, Williamson D. Multiplexed protein quantification in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents //Mot Cell Proteomics. 2004. - 3. - P. 1154-1169.
114. Wang Y., Al-Gazzar A., Seibert C., Sharif A. Proteomic analysis of cytochromes P450: a mass-spectrometry approach // Biochem Soc Trans. 2006. - 34. - P.1246-1251.
115. Zhao Y., Lee W.N., Lim S., Go V.L., Xiao J., Cao R., Zhang H., Recker R.R., Xiao G.G. Quantitative Proteomics: Measuring Protein Synthesis Using (15)N Amino Acid Labeling in Pancreatic Cancer Cells // Anal Chem. 2009. - Vol. 81, №2. - P.764-771.
116. Simpson K.L., Whetton A.D., Dive C. Quantitative mass spectrometry-based techniques for clinical use: Biomarker identification and quantification //J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009. - Vol.877, №13. - P.1240-1249.
117. L. Vos and R. Van Grieken. Influence of ion source geometry in spark source mass spectrometric analysis // International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. Vol. 59, №3. - 1984. - P.221-229.
118. Huang M., Hirabayashi A., Okumara A. Matrix Effect on the Analysis of Oligonucleotides by Using a Mass Spectrometer with a Sonic Spray Ionization Source // Analyt Sci. 2001. -Vol. 17, №10.-P.1179.
119. Steven L. Cohen and Brian T. Chait, Influence of Matrix Solution Conditions on the MALDI-MS Analysis of Peptides and Proteins // Anal. Chem. -1996. 68. - .P31-37.
120. Kushnir M.M., Rockwood A.L., Nelson G.J., Terry A.H., Meikle A. W. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of urinary free Cortisol // Clin Chem. 2003. - 49. - P.965-967.
121. Zgoda V., Tikhonova O., Viglinskaya A., Serebriakova M., Lisitsa A., Archakov A. Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level // Proteomics. -2006. 6. -P. 4662-4670.
-
Копылов, Артур Тигранович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.04
- Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450
- Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В
- Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови
- Стабильные изотопы легких элементов в процессах контаминации и взаимодействия флюид-порода
- Изотопы гелия в алмазах из метаморфических пород Кокчетавского массива
