Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Малая ядрышковая РНК U87 и ее ген-хозяин

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Малая ядрышковая РНК U87 и ее ген-хозяин"

Российская академия наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга

На правах рукописи

МАКАРОВА Юлия Алексеевна

МАЛАЯ ЯДРЫШКОВАЯ РНК Ш7 И ЕЕ ГЕН-ХОЗЯИН

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Лаборатории эволюции геномов эукариот Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук, профессор

Дмитрий Александрович Крамеров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор

Петр Михайлович Рубцов,

Институт молекулярной биологии РАН Доктор биологических наук, профессор

Галина Ефимовна Сулимова, Институт общей генетики РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 2/9>ср£111р(Х-ЛА 2006 г. в 12 ч на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан Я.Ц д^ау^. ЪОббг

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А&064

Актуальность проблемы

Значительная часть транскрибируемых последовательностей генома не кодирует белок В последние несколько лет интерес к таким последовательностям необычайно возрос благодаря обнаружению новых классов некодирующих РНК (нкРНК). Оказалось, что нкРНК выполняют в клетке удивительно широкий спектр функций с использованием неизвестных ранее механизмов Они вовлечены в регуляцию транскрипции и трансляции, репрессию мобильных генетических элементов и другие регуляторные пути - процессы, участие в которых считалось ранее прерогативой белков. Описанные на сегодняшний день нкРНК по самым разным оценкам представляют собой только вершину айсберга. Обнаружение и изучение новых нкРНК позволит выявить и исследовать неизвестные ранее механизмы работы клетки и представляет поэтому фундаментальный интерес.

Одним из классов нкРНК являются малые ядрышковые РНК (мякРНК, англ -small nucleolar RNAs, snoRNAs) Их функция была установлена совсем недавно и заключается в определении нуклеотидов рРНК, малых ядерных РНК и мРНК, которые будут модифицированы одним из двух способов- метилированием 2'-ОН группы рибозы или превращением урцдина в псевдоуридин. Это две самые распространенные модификации, число которых только в рРНК превышает сотню. В соответствии с видом модификации и наличием консервативных элементов в нуклеотцдной последовательности мякРНК делят на два семейства' СЮ и Н/АСА МякРНК семейства СЮ направляют 2'-0-метилирование и содержат консервативные элементы С (UGAUGA), D (CUGA) и их часто вырожденные копии С' и D' Помимо этого, в состав мякРНК семейства входит т.н. антисенс-элемент -последовательность длиной 10-20 н, полностью комплементарная соответствующей последовательности модифицируемой РНК и способная взаимодействовать с ней. 2'-0-метипированию подвергается остаток, входящий в образующуюся РНК/РНК спираль и отделённый четырьмя нуклеотидами от элемента D или D' Метилирование осуществляют белки СЮ мякРНП МякРНК позвоночных кодируются очень необычным способом' их гены расположены в интронах генов белков, так что мякРНК образуются в результате сплайсинга мРНК "гена-хозяина" Большинство известных генов-хозяев кодируют белки, необходимые для трансляции, или вовлеченные в функционирование ядрышка К настоящему моменту получен ряд данных о том, что нарушения экспрессии мякРНК могут иметь тяжелые последствия для организма Так, делеция гена обнаруженной недавно мякРНК (HBII-85) играет

существенную, если не ведущую роль в пат эгру^зед^ Прадера-Вилли

БИБЛИОТЕКА i С.Петев^г М \ ОЭ WfotcrfA/

наследственного заболевания человека (Ding, 2005) Поэтому обнаружение и изучение новых мякРНК может послужить первым шагом к лечению ряда тяжелых болезней, причины которых до последнего времени оставались неизвестными

К настоящему времени даже для картированных модифицированных нуклеотидов рРНК найдены не все мякРНК Кроме того, далеко не все модификации клеточных РНК известны Обнаружение новых мякРНК необходимо для создания полной картины работы клетки и для выяснения универсальности представления о том, что каждая модификация такого вида направляется мякРНК Помимо этого, обнаружение новых мякРНК может расширить наши представления о распространении и роли модификаций, а изучение разнообразия и функций генов-хозяев позволит ответить на фундаментальный вопрос о биологическом смысле кодирования мякРНК интронами генов и о том, случаен ли выбор гена-хозяина

Цели и задачи работы

Целью работы было изучение новой малой РНК U87 и ее гена-хозяина Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи'

1. Определить, к какому семейству малых РНК относится U87 РНК

2 Определить, кодируется ли U87 РНК независимым геном, интроном известного гена или интроном нового гена-хозяина В последнем случае планировалось определить, кодирует ли ген-хозяин белок или продуцирует нкРНК и исследовать локализацию транскрипта в клетке

3 Сравнить структуру и уровень консервативности нуклеотидной последовательности гена-хозяина U87 РНК и других генов-хозяев

Научная новизна и практическая ценность работы

Идентифицирована новая мякРНК C/D-семейства, способная направлять 2'-0-метилирование гуанилового остатка в положении 3468 (G-3468) 28S рРНК и названная U87 Обнаружено, что U87 мякРНК кодируется интроном нового гена, названного U87HG (host gene) Этот ген относится к 5'ТОР-семейству генов "домашнего хозяйства" и у грызунов, в отличие от гена человека, имеет множественные старты транскрипции Показано, что сплайсированная и полиаденилированная U87HG РНК не способна кодировать белок из-за отсутствия длинных открытых рамок считывания и является, таким образом, некодирующей РНК Фракция U87HG РНК ассоциирована с рибосомами и потому является мишенью для механизма деградации, уничтожающего в ходе трансляции мРНК с

нонсенс-мутациями (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) Однако U87HG РНК слабо подвержена NMD, что резко отличает ее от другой некодирующей РНК - UHG Предложена модель, объясняющая такое разное поведение этих РНК

Показано, что нуклеотидная последовательность U87HG РНК млекопитающих заметно более консервативна по сравнению с последовательностями других некодирующих генов-хозяев мякРНК, что может указывать на наличие у U87HG функции помимо продуцирования U87 мякРНК.

Впервые прослежены тенденции изменчивое™ некодирующих генов-хозяев у разных классов позвоночных. В ходе этого анализа обнаружены три новые мякРНК C/D-семейства и предсказаны их функции

Полученные результаты расширяют имеющиеся данные о мякРНК, а также позволяют поставить под сомнение сложившееся представление о нефункциональности экзонных последовательностей некодирующих генов-хозяев мякРНК Кроме того, они вносят вклад в представление о тенденциях изменений гомологичных генов у позвоночных.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на XVI зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2004 г, на конференции "Advances in molecular cell biology", Москва, 2004 г и на VII международной конференции по молекулярной биологии им В А Энгельгардта, Суздаль, 2004 г По материалам диссертации опубликовано 4 статьи

Структура и объем диссертации

Диссертация содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список цитированной литературы, включающий^^источников Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит & таблиц и рисунков

Содержание работы

U87 - новая мякРНК семейства C/D

В ходе скрининга кДНК-библиотеки из тн альфа-РНП частиц печени крысы (Konstantinova, 1984) нами обнаружена неизвестная ранее малая РНК, названная U87 (асс no AF272707) Ее точный размер (72 н) и длина б'-концевой области определены соответственно с помощью ПААГ-электрофореза высокого разрешения и метода удлинения праймера Помимо этого, мы клонировали и секвенировапи Hindlll/EcoRI-фрагменты ДНК крысы и мыши длиной 3,0 и 3,5 т п н соответственно, содержащие ген U87 РНК (асс nos. AF396685, AF396686) В составе нуклеотидной последовательности U87 РНК обнаружены элементы, характерные для мякРНК семейства C/D' так называемые боксы С, С', D и D', а также участок длиной 11 н , полностью комплементарный нуклеотидам с 3466 по 3476 28S рРНК крысы (рис 1)

U87 МЯКРНК

28SpPHK

Ьокс С'

Рис. 1. 1187 мякРНК крысы.

Приведена нуклеотадная последовательность 1187 РНК вместе с прилежащими участками Концы мякРНК отмечены стрелками;

рамками выделены боксы С, О, С' и О", показано взаимодействие антисмыслового элемента 1)87 РНК с 28Э рРНК, 2'-ОМе-в - метилированный нуклеотид.

Исходя из структуры U87 РНК, можно ожидать, что она должна направлять метилирование 2'-ОН остатка рибозы G-3468 в 28S рРНК Действительно, 2'-0-метилирование этого нуклеотида картировано ранее (Maden, 1990) С помощью фракционирования клеточного содержимого показано, что U87 РНК выявляется в ядрышке, но не в цитоплазме или нуклеоплазме (рис 2) Таким образом, U87 РНК -это ядрышковая РНК семейства C/D, которая, очевидно, направляет 2'-0-метилирование G-3468 в 28S рРНК

Известно, что для ядрышковой локализации и нормального функционирования мякРНК необходим так называемый C/D-мотив (Samarsky, 1998). В него входят последовательности С, D и концевой двуспиральный участок длиной 3-7 п н, образующийся за счет комплементарных взаимодействий концов мякРНК

Рис. 2. Ядрышковая локализация U87 РНК С

помощью нозерн-тобридизации U87 РНК, U3 мякРНК и U1 мяРНК выявляли в цитоплазматической (1), нуклеоплазмагической (2) и ядрышковой (3) фракциях клеток HeLa. Ядрышковую U3 РНК и ядерную U1 РНК использовали для оценки чистоты выделенных фракций

Интересно, что концы U87 РНК не способны формировать C/D-мотав В то же время U87 РНК оказывается в ядрышке и, судя по всему, успешно там функционирует Разрешить это противоречие позволил анализ фланкирующих ген U87 РНК последовательностей, обнаружено, что они способны образовывать двуцепочечный фрагмент длиной 7 п.н. (рис 1) Таким образом, по крайней мере в предшественнике U87 РНК может образоваться полноценный C/D-мотив. Сходное явление описано для генов некоторых дрожжевых мякРНК, причем показано, что фланкирующие последовательности необходимы для нормального функционирования мякРНК (Villa, 2000) Исходя из этого, можно полагать, что и фланкирующие ген U87 РНК последовательности имеют то же значение.

U87 РНК кодируется интронои некодирукмцего белок гена

Большинство мякРНК позвоночных кодируется интронами генов белков, и только небольшая группа имеет самостоятельно транскрибирующиеся гены При анализе предполагаемой промоторной области гена U87 РНК не было обнаружено элементов, делающих возможной его независимую транскрипцию (например, САТ-бокс, ТАТА-бокс, инициаторы транскрипции или последовательности А и В, узнаваемые комплексом РНК-полимеразы III).

В то же время для крысы, мыши и человека в базе данных EST (Expressed Sequence Jag, GenBank) были обнаружены транскрипты, экспрессирующиеся с данного локуса, причем ген U87 РНК оказывался расположенным в одном из интронов неаннотированного гена, которому соответствовали эти ESTs Для точной идентификации структуры данного гена, названного нами U87HG (host gene - ген-хозяин U87 РНК), мы клонировали для крысы 5' и 3'- части его кДНК, причем эти две части кДНК перекрывались (асс. no AY264286).

1 2 3

4Р U87

Щ из

юо

человек собака мышь крыса

Рис.3. Выравнивание нуклеотидных последовательностей Ш7НС РНК человека, собаки, мыши и крысы. Границы экзонов отмечены стрелками, сигналы полиаденилирования Ш7НО РНК человека (ч), собаки (с), мыши (м) и крысы (к) подчеркнуты Треугольником отмечено место интеграции ретропозона В2, удаленного из РНК крысы для более компактного представления выравнивания.

а

В отличие от крысы, для и87ЬЮ РНК человека имелся большой набор ЕБТв Тем не менее, для точной локализации 5' и З'-концов 1187НС РНК человека, ее З'-концевая часть была клонирована, а 5'-конец охарактеризован с помощью метода удлинешя праймера (асс. по АУ264285) Последовательность 1)87НС РНК мыши установили с помощью выравнивания геномных последовательностей мыши с и87НС РНК крысы и с использованием ЕЭТб мыши Аналогично установили последовательность 1)87НС РНК собаки (использовали ЕБТв собаки и выравнивание с 1)87НС РНК человека) 5'-концы РНК мыши и крысы были дополнительно охарактеризованы с помощью метода удлинения праймера. У всех четырех видов ген 1)87НС состоит из четырех экзонов, и87 РНК кодируется вторым интроном 1)87НС РНК полиаденилирована, ее длина у человека, мыши, крысы и собаки составляет, соответственно, 472, 472, 659 и 446 н (рисЗ) Большая длина РНК крысы вызвана вставкой в четвертый экзон короткого ретропозона В2

По сравнению с последовательностями мРНК белок-кодирующих генов, и87НЮ РНК удивительно низкоконсервативна. Для того чтобы лучше охарактеризовать уровень ее консервативности, мы построили парные выравнивания 1187НС РНК человека, мыши, крысы и собаки и оценили уровень сходства (Табл 1) Видно, что уровень сходства последовательностей 1)87НС РНК сопоставим с таковым 3'-нетранслируемых областей (З'НТО) и выше, чем у селективно нейтральных последовательностей.

Таблица 1. Сходство нуклеотидных последовательностей (%) и87Нв РНК

мышь крыса собака

человек 68/68/44 72/67/43 75/76/73

мышь - 83/66/81 71/64/53

крыса - - 69/б2/пс!ь

a) Для 1187НС РНК указанных видов были построены парные выравнивания и определен уровень сходства последовательностей (%, дано жирным шрифтом, делеции и вставки при подсчете не учитывали) Для сравнения курсивом приведены средние значения сходства З'НТО мРНК этих видов (Х|е, 2005), а также значения сходства нейтральных последовательностей, определенные с помощью Кв - числу замен в синонимичных сайтах (О^Ьэ, 2004; Югкпезэ, 2003)

b) пс) - не определено

1)87НО РНК человека, мыши, крысы и собаки содержит множественные стоп-кодоны во всех трех рамках считывания (рис 4) Размер наиболее длинного пегтгцда,

кодируемого и87НС РНК, составляет 30, 54, 44 и 30 остатков для человека, мыши,

крысы и собаки соответственно Все короткие пептиды, закодированные в 1)87НС РНК,

не консервативны, и ни для одного из них не

найдены гомологи в базах данных

Рис.4. и87Нв РНК не содержит длинных открытых рамок считывания (ОРС). Для трех рамок считывания ОРС обозначены черными прямоугольниками Для каждого вида указана длина РНК

Аналогичные результаты получены при исследовании ОРС, начинающихся с альтернативных кодонов (GUG, UUG, CUG и ACG) Поэтому представляется крайне маловероятным, что U87HG РНК кодирует функционально значимый пептид или пептиды. Очевидно, ген U87HG продуцирует две некодирующие РНК.

Гей U87HG принадлежит к 5'ТОР-семейству генов домашнего хозяйства

Данные, полученные с помощью метода удлинения праймера, и анализ кластеров ESTs, соответствующих транскриптам гена U87HG человека, мыши и крысы, свидетельствуют о том, что этот ген экспрессируется более чем в полутора десятках тканей и на этом основании (Lercher, 2002) может быть отнесен к генам "домашнего хозяйства".

Метод удлинения праймера был использован также для характеристики 5-концов U87HG РНК. Показано, что транскрипция U87HG человека начинается с двух соседних цитидиловых остатков Неожиданно, у мыши и крысы, помимо цитидилового старта, который соответствует началу кДНК, обнаружено много других точек инициации транскрипции (рис.5).

Подобно другим генам домашнего хозяйства (Smale, 2003), промоторная область U87HG у всех исследованных видов расположена в CpG - островке и содержит сайты связывания фактора транскрипции Sp1 (рис 5) Одна из характерных черт многих генов этой группы - наличие множественных стартов транскрипции, в результате чего образуется семейство мРНК с гетерогенным 5'-концом U87HG, насколько нам известно, служит первым примером гена с двумя расположенными рядом стартами у одного вида млекопитающих и множественными стартами - у двух других видов

20

ШШЩстссс----

-сДДте------------АЕ^^ЩАС

60

свстасо&;ССССС

100

87 100 87 86

Рис.5. Выравнивание промоториой области гена 1187НС. Линиями показаны участки связывания транскрипционного фактора 8р1, предсказанные для человека (ч), собаки (с), мыши (м) и крысы (к). Начало Ш7ЬЮ РНК, установленное с использованием кДНК, обозначено стрелкой (черной -человек и белой -крыса) над выравниванием. Старты транскрипции Ш7НО человека (ч), мыши (м) и крысы (к), определенные с помощью метода удлинения праймера, отмечены стрелками под выравниванием.

в

Большинство мРНК начинается с пуринового нуклеотида U87HG РНК человека, мыши и крысы начинаются с цитидиловых остатков, расположенных внутри пиримидиновой последовательности, за которой следует GC-богатая область Такое необычное строение 5-концевой области характерно для тн 5ТОР-семейства (terminal olygoßyrimidine) генов домашнего хозяйства, в состав которого входят гены рибосомных белков и гены некоторых факторов трансляции (Amaldi, 1997)

U87HG РНК стабильна

Согласно установившемуся представлению, единственным функциональным продуктом некодирующих генов-хозяев являются мякРНК, образующиеся из их интронов, а транскрипты генов-хозяев быстро деградируют в цитоплазме (см, например, Smith, 1998) С помощью фракционирования клеточного содержимого мы установили, что U87HG РНК локализована почти исключительно в цитоплазме Чтобы определить, является ли U87HG РНК тоже быстро деградирующей, мы обрабатывали клетки HeLa ингибитором транскрипции актиномицином D Помимо U87HG РНК, детектировали UHG РНК - еще одну некодирующую РНК Подобно U87HG РНК, интроны гена UHG содержат гены мякРНК Обнаружено, что, в отличие от быстро деградировавшей контрольной мРНК H1F1, U87HG РНК весьма стабильна (рис 6)

Рис. 6. Оценка стабильности U87HG РНК. Клетки HeLa обрабатывали ингибитором

транскрипции актиномицином D (5 мкг/мл) в течение указанного времени Суммарную РНК подвергали нозерн-гибридизации с четырьмя разными зондами В качестве контролей использовали короткоживущую мРНК гистона H1F1 и стабильную мРНК GAPDH

UHG РНК, которая, как сообщалось ранее (Tycowski, 1996), распадается в присутствии актиномицина D, неожиданно оказалась приблизительно такой же стабильной, как U87HG РНК Аналогичные результаты получены на клетках человека MCF-7, клетках мыши SC1 и клетках крысы Rati

_Актиномицин D_

0 1 4 8 22 время (ч)

U87HG РНК ассоциирована с рибосомами

U87HG РНК обладает характерными чертами мРНК за исключением протяженных ОРС Поэтому мы исследовали, ассоциирована ли она с рибосомами Для этого цитоплазматические экстракты клеток HeLa анализировали на сахарозных градиентах Поскольку U87HG РНК содержит только короткие ОРС, можно ожидать, что она будет связана преимущественно с моносомами Поэтому, чтобы лучше разделить связанную с рибосомами и свободную U87HG РНК, были использованы 10-50% сахарозные градиенты и продолжительное время центрифугирования Большая часть U87HG РНК седиментировала вместе с легкими мРНП, однако значительная ее фракция коседиментировала с рибосомами (рис. 7). Эта фракция переставала быть ассоциированной с рибосомами после обработки экстрактов ЭДТА, приводящей к диссоциации рибосом, а также после обработки клеток ингибитором инициации трансляции фторидом калия (KF), (рис. 7)

80S 40S U87HG 4 \

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617 181920 ДНО

Рис. 7. Распределение 1)87НС РНК на сахарозном градиенте после центрифугирования цитоплазматических экстрактов клеток Не1_а. На сахарозных градиентах (10-50%) разделяли цитоплазматические экстракты, выделенные из 107 клеток Не1_а ничем не обработанных (контроль), обработанных циклогексимидом низкой концентрации (0,05 мкг/мл) в течение 30 мин (цикло) или фторидом калия (30 тМ) в течение 30 мин (КР) Такое же количество цитоплазматического экстракта контрольных клеток обрабатывали 10тМ ЭДТА (ЭДТА) Из фракций выделяли РНК и подвергали нозерн-гибридизации с зондом к и87НС РНК Фракция № 1 соответствует осадку на дне пробирки РНК из фракций 1-9 считали ассоциированной с рибосомами Стрелками отмечено положение моносом и 40в субъединиц

При обработке данных с помощью фосфоимиджера обнаружено, что с рибосомами ассоциировано 24% и87НС РНК Таким образом, и87НС РНК, видимо,

транслируется, хотя и не очень эффективно Аналогичное поведение характерно и для других 5ТОР РНК, значительная часть которых обнаруживается в составе нетранслируемых мРНП-комплексов (Amaldi, 1997) Ранее было показано, что обработка клеток низкими концентрациями (0,05 мкг/мл) ингибитора элонгации трансляции циклогексимида приводит к увеличению фракции 5ТОР мРНК, связанной с рибосомами (на активно транслируемые мРНК, не принадлежащие к 5ТОР-семейству, этот эффект не распространяется) (Agrawal,1987; Pierandrei-Amaldi,1991) Мы инкубировали клетки HeLa в присутствии 0,05 мкг/мл циклогексимида в течение 0,5 ч Действительно, после такой обработки фракция U87HG РНК, коседиментирующая с рибосомами, возрастала до 35%. Аналогичный результаты были получены для клеток мыши SC1 (17 и 30%, соответственно) Такой эффект низкие концентрации циклогексимида оказывают на матрицы, инициация трансляции которых происходит достаточно редко (Waiden, 1987) Таким образом, U87HG РНК, подобно прочим 5ТОР РНК, является достаточно низкоэффективной матрицей

Влияние ингибиторов трансляции на концентрацию U87HG РНК

Для деградации мРНК с нонсенс-мутациями в клетке существует специальный механизм, названный NMD (nonsense mediated decay) Для осуществления такой деградации необходима трансляция аберрантных мРНК (Maquat, 2004) Поскольку U87HG РНК содержит множественные стоп-кодоны и ассоциирована с рибосомами, можно ожидать, что она будет подвержена NMD Известно, что ингибирование трансляции в клетках приводит к увеличению концентрации мРНК, деградируемых этим способом Чтобы определить, служит ли U87HG РНК мишенью NMD, мы обработали клетки HeLa ингибиторами элонгации трансляции пуромицином и цикпогексимидом.

Помимо U87HG РНК, детектировали UHG РНК, которая, как было показано, накапливается после обработки цикпогексимидом, ассоциирована с рибосомами и поэтому, как считается, деградирует с помощью NMD (Tycowski, 1996)

Однако неожиданно оказалось, что после ингибирования трансляции концентрация U87HG РНК, в отличие от UHG РНК, возрастала незначительно (рис 8) Аналогичные данные получены на клетках человека MCF-7, клетках мыши SC1 и клетках крысы Rati Такие результаты свидетельствуют в пользу того, что U87HG РНК подвергается NMD менее эффективно, чем UHG РНК На первый взгляд, подверженность обеих РНК NMD, хотя и очень разная, противоречит их стабильности, продемонстрированной с использованием акгиномицина D

Рис. 8. Влияние ингибиторов трансляции на количество U87HG и UHG РНК. Клетки HeLa обрабатывали в течение 4 ч циклогекси мид ом (20 мкг/мл, цикло) или пуромицином (200 мкг/мл, пуро) Суммарную РНК анализировали с помощью нозерн-гибридизации с указанными зондами Количество U87HG и UHG РНК нормировали по количеству РНК GAPDH. Цифры указывают увеличение гибридизационного сигнала по сравнению с контролем.

Однако ранее было показано (Kessler, 1996), что обработка клеток актиномицином D блокирует NMD Результаты обоих экспериментов, взятые вместе, могут свидетельствовать о том, что NMD является основным путем деградации обеих РНК.

Различный уровень ассоциации U87HG РНК и UHG РНК с рибосомами вносит вклад в их разную подверженность NUD

Чтобы определить, может ли разное накопление U87HG и UHG РНК при ингибировании трансляции быть связано с разным уровнем их ассоциации с рибосомами, мы выяснили, какая часть UHG РНК коседиментирует с рибосомами в сравнении с U87HG РНК Мы также выясняли, действительно ли U87HG и UHG РНК, накапливающиеся после инкубирования клеток с циклогексимидом, ассоциированы с рибосомами Для этого клетки HeLa обрабатывали циклогексимидом в течение 4 ч и фракционировали цитоплазматические экстракты на сахарозных градиентах В данном случае использовали высокую концентрацию циклогексимида (20 мкг/мл), эффективно ингибирующую элонгацию трансляции и NMD (Rajavel, 2001).

Количество обеих РНК после обработки циклогексимидом увеличилось только во фракциях, ассоциированных с рибосомами, причем для UHG РНК это увеличение выражено сильнее (рис 9).

После обработки циклогексимидом доля U87HG РНК, связанной с рибосомами, увеличилась в 3 раза (с 22% до 61%), хотя ее суммарное количество возросло незначительно Такое увеличение вызвано главным образом перераспределением между свободной и связанной с рибосомами U87HG РНК (рис 9) Таким образом, фракция свободной U87HG РНК не является необратимо изъятой из процесса трансляции.

/уу

U87H6

1 1.5 1.6 1 4.5 4.9

GAPDH U87

В контрольных клетках с рибосомами ассоциирован 41% UHG РНК После обработки циклогексимидом эта величина увеличилась до 76%, причем вся UHG РНК, которая накапливается за 4 ч, обнаруживается в связи с рибосомами (рис 9) Это согласуется с существующим представлением о том, что обработка циклогексимидом вызывает прекращение трансляции и сопряженной деградации мишеней NMD

По сравнению с большинством мРНК, и U87HG РНК, и UHG РНК транслируются не очень эффективно Тем не менее, в контрольных клетках доля U87HG РНК, коседиментирующей с рибосомами, в 2 раза меньше, чем доля UHG РНК Такие данные свидетельствуют о том, что U87HG РНК по сравнению с UHG РНК транслируется менее эффективно Эта разница в интенсивности трансляции, очевидно, вносит вклад в то, что после ингибирования трансляции U87HG РНК накапливается в гораздо меньшей степени, чем UHG РНК

Рис. 9. С рибосомами ассоциировано разное

количество U87HG и UHG РНК.

Цитогшазматические экстракты выделяли из клеток HeLa контрольных (контроль) и обработанных высокой

концентрацией циклогексимида (20 мкг/мл) в течение 4 ч (цикло) После разделения на сахарозных градиентах, РНК из индивидуальных фракций

подвергали нозерн-

гибридизации с указанными зондами GAPDH РНК использовали в качестве контроля, как типичную мРНК. РНК из фракций 1-8 считали ассоциированной с рибосомами Остальные обозначения как на рис 7

дно

Круг распространения U87 РНК

В самое последнее время стали доступны нуклеотидные последовательности геномов и мРНК достаточно большого количества видов Это позволило нам провести невозможные ранее исследования и изучить распространение U87 РНК и ее гена-хозяина у представителей разных систематических групп Мы обнаружили U87 РНК у всех млекопитающих, геном которых секвенирован достаточно полно у шимпанзе (Pan troglodytes), макаки-резуса (Macaca mulatta), свиньи (Sus scrofa), коровы (Sos taurus), a

80S 40S U87HG I »

UHG

,-m Ilipi I II-* mrnm ■*

Контроль

Цикло

ЭДТА

Контроль

Цикло

ЭДТА

2 .1 4 S 6 7 8 » 1в 11121314 IS 161718 19 20

также у относящегося к более примитивному отряду сумчатых опоссума (Monodelphis domestica) U87 РНК найдена нами и у представителей других классов позвоночных-птиц (Gallus gallus), амфибий (Xenopus tropicalis) и рыб (Takifugu rubripes, Tetraodon nigrovirídis, Danto reno). U87PHK отсутствует в геномах дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и растений (Arabidopsis thaliana)

Нуклеотид, 2'-0-метилирование которого направляет U87 РНК, модифицирован у человека и X. /aew's, но не у дрожжей (S cerevisiae) и арабидопсиса (А thaliana) (Maden, 1990; Brown, 2001). Для других организмов подобные сведения пока отсутствуют. Тем не менее, на основании имеющихся данных можно заключить, что сайт метилирования, определяемый U87 РНК, является таксон-специфичным, присутствует у позвоночных и отсутствует у дрожжей и растений.

Экзон-интронная структура U87HG постоянна только у млекопитающих

Мы исследовали структуру гена-хозяина U87 РНК у описанных видов позвоночных Нуклеотидная последовательность U87HG РНК была воссоздана с помощью ESTs Как и у четырех описанных выше млекопитающих, U87HG РНК остальных видов низкоконсервативна и не содержит протяженных открытых рамок считывания.

Количество экзонов U87HG и копий U87 РНК постоянно только у млекопитающих У представителей других классов число копий гена U87 РНК увеличивается, и одновременно наблюдается тенденция к увеличению количества экзонов U87HG Тем не менее, в каждом случае число интронов больше, чем количество генов U87 РНК (рис. 10).

п-с*»сэ—ел H.sapiens 3613/472

и-а-ш—а—ш—...............G.gallus 3422/687

а—а-ш-п-а-™-ач ш—адх.tropicalis 4856/971

Рис. 10. Структура гена U87HG у представителей разных классов позвоночных.

Экзоны U87HG отмечены серыми цилиндрами, гены U87 РНК - черными прямоугольниками Ген U87 РНК, содержащий мутации, отмечен стрелкой Сигналы полиаденилирования обозначены вертикальными линиями Для каждого вида указан размер гена U87HG/длина U87HG РНК (н)

T.rubripes 2019/542 T.nigroviridis 2365/622 D.rerio 3022/569

Нуклеотидная последовательность генов и87 РНК позволяет заключить, что все они способны продуцировать функциональные молекулы (единственное исключение -сильно мутировавшая копия гена у О /его) Однако различия в длине концевого двуспирального участка, который входит в состав СЮ-мотива, предполагают различную стабильность транскриптов.

Следует отметить, что у О гепо в третьем иктроне и87НО присутствуют сразу две копии гена 1187 РНК. Одна из них содержит мутации в консервативных боксах и в антисенс-элементе, а также расположена вплотную к четвертому экзону, что скорее всего делает невозможным образование полноценной 1187РНК Однако для позвоночных до сих пор не было отмечено случаев таццемной организации генов мякРНК, даже если функциональность одного из них является сомнительной Описанный случай является первым примером такой организации

Другие некодирующие гены-хозяева изменяются сходным образом

Чтобы выяснить, являются ли тенденции изменения гена 1)87НС более общими, мы провели аналогичный анализ двух других некодирующих генов-хозяев мякРНК' инэ и даэб Интроны этих генов кодируют набор СЮ мякРНК, а экзоны не содержат протяженных ОРС и неконсервативны Такой анализ проводится впервые, поскольку соответствующие геномные последовательности до последнего времени не были известны.

U25 U26

UHG

U74 gas5

U28 U22

U27 NMS1

U 29

U31.1

NMS2 U30 U31.2

U79.1

U76

U80.1 U44 U78

U75 U80.2 NMS3 U47.1 U79.2 U80.3 U47.2 U81

Рис. 11. Структура генов UHG и gas5 у X. tropicalis Новые мякРНК названы NMS1-NMS3 (non-mammalian specific) Остальные обозначения как на рис 10

Показано, что экзон-интронная структура этих генов отличается у разных видов позвоночных, причем ряд изменений напоминают таковые для U87HG Подобно U87HG, только у млекопитающих количество экзонов и распределение мякРНК по интронам относительно постоянно У представителей других классов количество экзонов обычно увеличивается на 2-3, а также значительно изменяется порядок расположения мякРНК в интронах. Как и в случае U87 РНК, число копий некоторых мякРНК увеличивается если в интронах UHG и gas5 млекопитающих ген каждой

мякРНК представлен только одной копией, то у представителей других классов некоторые мякРНК представлены двумя или даже тремя копиями (рис. 11) Обнаружено также, что некоторые гены мякРНК покидают интроны UHG и gas5 Наконец, у не-млекопитающих в интронах этих генов нами обнаружены последовательности трех новых мякРНК C/D-семейства и предсказаны их функции (рис. 11,12).

T-2S2 ■ 19S рРЮС 3'-ATCTCA0TGOl¥rCeCC6;-5'

8-3924 • 2«S рРЯК 3'_ОСТОСМ<^№ПСТТ-5'

qGOqT<gCCA4r^TGjkTCATCCACTATACCCT<W3 ▼

3' .3GTCTTMTCCAGCAG 5' 04004 • 28S рРНК

тст^ААл^АтейтглттсаАтстцст

Рис.12. Новые C/D мякРНК из нитронов генов UHG и gas5. Приведены последовательности генов мякРНК NMS1-NMS3 для X tropicalis. Нуклеотиды рРНК, для которых предсказанные сайты 2'-0-метилирования картированы (Maden, 1990), выделены черными треугольниками Нуклеотид, 2'-0-метилирование которого не обнаружено, отмечен белым треугольником. Комплементарные участки на концах молекул мякРНК отмечены стрелками Остальные обозначения как на рис 1

МякРНК NMS2 обнаружена только у X tropicalis, тогда как мякРНК NMS1 и NMS3 найдены также у остальных исследованных не-млекопитающих Сайты 2'-0-метилирования, которые определяют новые мякРНК, картированы у X laevis, но не у человека (Maden, 1990) Таким образом, обнаруженные нами мякРНК вносят вклад в тонкие различия паттернов модификаций рРНК разных классов позвоночных

Отсутствие метилирования Т-252 в 18S рРНК может отражать неполноту существующего перечня модификаций рРНК или свидетельствовать о том, что мякРНК NMS1 не направляет метилирование, а является РНК-шапероном, подобно нескольким другим мякРНК (Gerbi, 2003)

Обсуждение результатов Новая мякРНК U87 кодируется интроном некодирующего белок гена U87HG

В данной работе описана новая малая ядрышковая РНК СГО-семейства, названная U87 Она присутствует у всех исследованных позвоночных и отсутствует у растений и дрожжей Нуклеотид, метилирование которого она направляет (G-3468 в 28S рРНК), находится в консервативном участке рРНК - в месте контакта субъединиц.

Интересно, что почти все известные сайты модификаций тоже находятся в консервативных участках рРНК (Maden, 1990) Данная модификация является таксонспецифичной' как и U87 РНК, она присутствует у позвоночных и отсутствует у растений и дрожжей Показано, что у всех исследованных позвоночных U87 РНК кодируется интроном нового гена, названного U87HG, экзоны которого не способны кодировать белок Обнаружено, что у не-млекопитающих наблюдается увеличение количества экзонов U87HG и количества копий U87PHK в интронах Сходная тенденция продемонстрирована для двух других некодирующих генов-хозяев мякРНК' UHG и gas5 При этом в их интронах обнаружены гены трех новых мякРНК C/D-семейства и предсказаны их функции

Экспрессия в широком спектре тканей и особенности строения 5'-концевой области позволяют отнести U87HG к 5ТОР-семейству генов домашнего хозяйства. Как и прочие транскрипты генов этого семейства, U87HG РНК транслируется не очень эффективно' с рибосомами в клетках HeLa ассоциировано 24% U87HG РНК Для других 5ТОР РНК эта величина составляет 25-65% (Amaldi, 1997)

Интересно, что у U87HG РНК грызунов, в отличие от человека, обнаружены множественные старты транскрипции В принципе, наличие многих точек инициации транскрипции характерно для генов, промоторы которых, как и промотор U87HG, локализованы в CpG-островках (Smale, 2003) Однако U87HG, насколько нам известно, служит первым примером гена с двумя расположенными рядом стартами у одного вида млекопитающих и множественными стартами - у двух других видов

Малая подверженность U87HG РНК деградации может быть связана не только с низкой интенсивностью трансляции

Известно, что после сплайсинга за 20-24 н. до границ экзонов на мРНК остаются белковые комплексы - так называемые exon-junction complexes, EJCs. В ходе первого раунда трансляции они удаляются рибосомами Однако если мРНК содержит нонсенс-мутацию, то трансляция терминируется преждевременно, и один или несколько EJCs остаются связанными с мРНК РНК с такими комплексами узнается белками системы NMD (nonsense-mediated mRNA decay), часть которых связана с пост-терминировавшей 40S субчастицей, и деградирует Как правило, деградацию вызывают только стоп-кодоны, расположенные более чем за 50-55 н до границы экзонов. В противном случае аберрантная мРНК оказывается иммунной к NMD. Обработка клеток ингибиторами трансляции делает работу системы NMD

невозможной. Поэтому подверженные NMD РНК накапливаются, когда трансляция ингибирована (Maquat, 2004).

Поскольку U87HG РНК содержит множественные стоп-кодоны и связана с рибосомами, она должна быть подвержена NMD и, соответственно, ее количество должно возрастать после остановки трансляции Однако значительного накопления U87HG РНК после ингибирования трансляции не происходит В то же время уровень UHG РНК, которая так же, как и U87HG РНК, транслируется, сильно возрастает, как сообщалось и ранее (Tycowski, 1996) Такое разное поведение этих двух РНК может быть вызвано либо тем, что UHG более интенсивно транслируется, либо тем, что U87HG РНК при трансляции меньше подвержена NMD

Мы показали, что фракция U87HG РНК, ассоциированная с рибосомами, в два раза меньше аналогичной фракции UHG РНК Таким образом, U87HG РНК по сравнению с UHG РНК транслируется менее эффективно Эта разница в интенсивности трансляции, очевидно, вносит вклад в то, что после ингибирования трансляции U87HG РНК накапливается в гораздо меньшей степени, чем UHG РНК

Как было отмечено выше, мРНК с нонсенс-мутациями уничтожаются NMD после первого раунда трансляции Скорость трансляции достаточно велика у эукариот в ходе элонгации кодон прочитывается за 0,1-0,5 с (Spinn, 1999) Таким образом, все молекулы U87HG РНК (так же, как и UHG РНК), присутствующие в клетке в данный момент, должны подвергнуться трансляции за время значительно меньшее, чем 4ч Поэтому после ингибирования трансляции в течение 4 ч можно ожидать многократного увеличения концентрации U87HG РНК Однако уровень U87HG РНК изменяется незначительно Вероятным объяснением может служить то, что низкая чувствительность U87HG РНК к NMD вызвана не только относительно низким уровнем ее трансляции

Меньшая подверженность U87HG РНК NMD может быть связана с реинициацией трансляции на следующих за первой ОРС рамках Показано, что реинициация трансляции способна нивелировать эффект NMD (Zhang, 1997) Вообще реинициация трансляции у эукариот не является редким событием около 40% клеточных мРНК содержат одну или несколько коротких ОРС, за которыми следует основная рамка (Yamashita, 2003) Эффективность реинициации в большой степени зависит от так называемого контекста, в котором расположены старт-кодоны открытых рамок (Kozak, 1986) Сильный контекст содержит R в позиции -3 и G в позиции +4 относительно старт-кодона. Субоптимальный контекст содержит только один из этих нуклеотидов, а слабый лишен обоих Слабые и в меньшей степени субоптимальные контексты

первого кодона AUG позволяют рибосомам инициировать трансляцию не только на первом, но и на втором и нередко последующих AUG Это связано с тем, что инициаторный комплекс не всегда узнает неоптимальные контексты (тн "leaky-scanning") (Meijer, 2002)

В U87HG РНК за первой ОРС длиной 78 н. следуют друг за другом две рамки длиной 90 и 27 н Часть рибосом после трансляции первой ОРС, возможно, реинициирует на этих двух рамках (рис 13). Показано, что после трансляции ОРС похожей длины - 84 н - эффективность реинициации составила 50% (Luukkonen, 1995). Эффективность трансляции второй и третьей ОРС может дополнительно усиливаться за счет "leaky-scanning", поскольку первая рамка находится в субоптимапьном контексте, а вторая - в слабом В результате после трансляции третьей рамки рибосому от последнего стыка экзонов отделяют 25 н Поскольку для деградации NMD рибосома должна прекратить трансляцию не менее, чем за 50-55 н. до границы экзонов, U87HG РНК оказывается устойчивой к NMD (рис.13) Однако, так как реинициация трансляции не очень эффективный процесс, часть молекул U87HG РНК будет все же подвергаться NMD

ОРС

1 EJC

в рибосома

U87HG РНК UHG РНК

QI-*—I Г-*-!г4 1-1 Г—I Qtl 1 |Н I i 1 I П

_1-"-'ГУ"1 __I II I' i к i ág ,j И

° О

нет EJCs, нет NMD EJCs остаются, NMD происходит

Рис.13. Разная подверженность U87HG и UHG РНК деградации с помощью NMD может объясняться различиями в паттернах их ОРС. Во время трансляции все белковые комплексы (EJSc) могут быть удалены с U87HG РНК но не с UHG РНК Оставшиеся на UHG РНК EJSc узнаются системой деградации мРНК (Qonsence-mediated mRNA decay system, NMD) Подробнее см текст

У UHG РНК первая и вторая ОРС имеют такие же контексты, как в U87HG РНК. Однако первая рамка UHG РНК длиннее 129 н Было показано (Luukkonen, 1995), что ОРС похожей длины - 120 н - практически полностью блокирует трансляцию следующей рамки Поэтому можно ожидать, что эффективность реинициации после трансляции первой рамки UHG будет очень низкой Кроме того, если реинициация все же произойдет, после трансляции второй ОРС 40S субчастицу на участке длиной 160 н , не содержащем открытых рамок, будут ожидать еще четыре EJCs (рис.13). Таким образом, можно предполагать, что UHG РНК должна подвергаться NMD гораздо более

эффективно, чем U87HG РНК Такое предположение согласуется с экспериментальными данными

Функциональность некодирующих генов-хозяев: pro et contra

На сегодняшний день известно всего 5 генов, похожих на U87HG UHG, U17HG, U19H, gas5 и U50HG (Tycowski, 1996, Pelczar, 1998, Bortolin, 1998, Smith, 1998, Tanaka, 2000) Последний ген не был достаточно подробно изучен даже у человека В интронах этих генов закодированы мякРНК, а сппайсированные и полиаденилированные РНК не способны кодировать белок Только два из них (UHG и gas5) представляют собой самостоятельные транскрипционные единицы, тогда как часть транскриптов U17HG и U19H входит в состав мРНК генов RCC1 и matrin Поэтому в данном исследовании эти два гена, а также практически неизученный U50HG не рассматривались Низкая консервативность последовательностей экзонов всех некодирующих генов-хозяев породила представление о том, что их единственная функция заключается в продуцировании мякРНК. С этим взглядом согласуется наличие гена мякРНК в каждом интроне этих генов (за единственным исключением), а также быстрая деградация транскриптов генов-хозяев В случае U87HG эту гипотезу поддерживает увеличение количества экзонов у холоднокровных, коррелирующее с ростом числа копий гена U87 РНК - создается впечатление, что новые экзоны используются для поддержания новых интронов, кодирующих мякРНК В пользу отсутствия у экзонов отдельной функции свидетельствует и отсутствие консервативности транскриптов U87HG разных классов позвоночных

Впрочем, по поводу последнего положения нужно отметить следующее' по сравнению с генами белков, на некодирующие функциональные последовательности генома в большинстве случаев налагаются менее жесткие требования, так что их консервативность может меняться в достаточно широких пределах. Исследователя некодирующих РНК иногда уподобляют Одиссею, который должен провести свой корабль между Сциллой и Харибдой (Boffelli, 2004) если выбрать для сравнения слишком близкие виды, то из-за высокого сходства геномов узнать функциональные последовательности будет непросто Если взять слишком далекие, то разница в их биологии может привести к изменениям гомологичных регуляторных участков до неузнаваемости В случае позвоночных золотой серединой часто оказывается таксон ранга класса (Boffelli, 2004) В данном исследовании мы пошли именно по этому пути, поскольку достоверная консервативность U87HG ограничивается классом млекопитающих.

В пределах этого класса U87HG РНК является более консервативной по сравнению с нейтральными последовательностями (Таблица 1) и по сравнению с транскриптами UHG и gas5- во множественных выравниваниях U87HG, gas5 и UHG РНК человека, собаки, мыши и крысы доля нуклеотидов, совпадающая у всех четырех видов, составляет 42%, 24% и 15 %, соответственно

В отличие от UHG и gas5, среди всех классов позвоночных у U87HG поддерживаются некодирующие экзоны, соседствующие с некодирующими интронами (при этом в некодирующих интронах U87HG не было найдено последовательностей других мякРНК, микроРНК, а также консервативных первичных и вторичных структур) Все изложенное, а также более высокая стабильность U87HG РНК в клетке, служит доводом в пользу наличия у нее самостоятельной функции

Нужно отметить, что многие нкРНК с известной функцией обладают сходной консервативностью Например, у BIC РНК, продуцирующей miR-155 микроРНК, уровень сходства гомологов человека и мыши составляет 72% Имеются и другие примеры (Mattick, 2005) С другой стороны, U87HG РНК имеет такой же уровень сходства, как З'НТО белок-кодирующих генов (Таблица 1) и, подобно им, содержит много участков с высоким сходством, чередующихся с участками низкого сходства Как и у З'НТО, эти участки высокого сходства могут бьпгь функционально значимыми Помимо этого, неконсервативные видоспецифичные последовательности также могут быть важны для функционирования U87HG РНК В связи с этим интересно отметить, что для обнаруженной недавно нкРНК, являющейся репрессором транскрипционного фактора NFAT, предложен принцип действия, сходный с НТО эта РНК может служить сборной площадкой для белков, вовлеченных в регуляцию транспорта NFAT из цитоплазмы в вдро, открывая неизвестную ранее возможность пространственной организации белков (VWlingham, 2005). Такой сценарий подразумевает наличие многих коротких участков связывания белков, которые могут чередоваться с менее консервативными последовательностями - похожая картина наблюдается и у U87HG РНК U87HG РНК, возможно, вовлечена в процесс трансляции или в его регуляцию, поскольку связана с рибосомами, а ее ген принадлежит к 5ТОР-семейству, большинство членов которого кодируют компоненты трансляционного аппарата

По поводу остальных, менее консервативных генов-хозяев нужно отметить следующее В последнее время все чаще оказывается, что и при отсутствии консервативности нкРНК могут быть функциональными (Mattick, 2005) Такие РНК стали открывать в самое последнее время, во многом потому, что раньше никто не

пытался искать гены среди неконсервативных последовательностей Можно ожидать, что в ближайшее время список таких РНК будет стремительно расти

Таким образом, утвердившееся представление о том, что экзоны некодирующих генов-хозяев не несут самостоятельной нагрузки, следует признать по меньшей мере не окончательным Разработка и первое успешное применение методов, позволяющих определять функции нкРНК (Willingham, 2005), дают основание надеяться на скорое решение вопроса о функциях некодирующих генов-хозяев мякРНК

Выводы:

1 Описана новая малая ядрышковая РНК C/D-семейства, названная U87 мякРНК Анализ нуклеотадной последовательности U87 РНК свидетельствует о том, что она вовлечена в 2'-0-метилирование G-3468 28S рРНК.

2 U87 мякРНК кодируется интроном некодирующего белок гена-хозяина, названного U87HG U87HG относится к 5ТОР-семейству генов "домашнего хозяйства" В отличие от гена человека, U87HG грызунов имеет множественные старты транскрипции.

3 Значительная часть молекул U87HG РНК, несмотря на отсутствие протяженных открытых рамок считывания, ассоциирована с рибосомами, однако слабо подвержена зависимой от трансляции деградации

4 Нуклеотидная последовательность U87HG РНК млекопитающих более консервативна по сравнению с известными последовательностями некодирующих генов-хозяев мякРНК, что может указывать на наличие у U87HG функции помимо продуцирования U87 мякРНК

5 U87HG и два других аналогичных некодирующих гена-хозяина (UHG и gas5) изменяются сходным образом у разных классов позвоночных В частности, у млекопитающих наблюдается тенденция к уменьшению числа копий генов мякРНК в интронах

6 В интронах некодирующих генов-хозяев UHG и gas5 позвоночных обнаружены гены трех новых мякРНК семейства C/D и предсказаны их функции

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи

1 Gogolevskaya IK, Makarova JA, Gause LN, Kuhchkova VA, Konstantinova IM, Kramerov DA U87 RNA, a novel C/D box small nucleolar RNA from mammalian cells.// Gene, 2002, 292 199-204.

2 Makarova J.A., Kramerov DA U87 snoRNA is encoded within an intron of a non-protein-coding gene II in "Avarices in Molecular Cell Biology", 2004, 119-125, Maks-Press, Moscow

3 Макарова Ю.А., Крамеров Д А Малая ядрышковая РНК U87 млекопитающих и ее ген-хозяин.// Молекулярная биология, 2005, 39.655-663

4 Makarova J.A., Kramerov DA Noncoding RNA of U87 host gene is associated with ribosomes and is relatively resistant to nonsense-mediated decay// Gene, 2005, 363 5160.

Тезисы конференций Макарова Ю.А. Новая ядрышковая РНК U87 образуется из интрона не кодирующего белок гена //XVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 2004г, тезисы докладов, с 5

Отпечатано с готового оригинал-макета

ООО «Копировальный мир» Г.Москва, Ленинский проспект дом 6Д. http //copvmir ru. E-mail: info@copymir ru Телефон: 955-00-76, 230-44-62, 778-03-48 Заказ № 0001, тираж 100 экз, подписано в печать 13.01.2006 г.

Л??-

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макарова, Юлия Алексеевна

Основные обозначения и сокращения.

Введение.

1. Обзор литературы

Малые ядрышковые РНК.

1.1. C/D-семейство мякРНК.

1.2. Н/АСА-семейство мякРНК.

1.3. Малые РНК из телец Кахаля.

1.4. РНКаза Р и РНКаза MRP: эндонуклеазы, содержащие РНК.1В

1.4.1. РНКазаР.

1.4.2. РНКаза MRP.

1.5. Номенклатура мякРНК.

1.6. Гены мякРНК.

1.6.1. Гены мякРИОК позвоночных.

1.6.2. Гены мякРНК дрожжей.

1.6.3. Гены мякРНК растений.

1.6.4. Гены мякРИОК простейших.

1.6.5. Гены мякРИОК дрозофилы.

1.6.6. Гены мякРИОК архебактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Малая ядрышковая РНК U87 и ее ген-хозяин"

Значительная часть транскрибируемых последовательностей генома не кодирует белок. В последние несколько лет интерес к таким последовательностям необычайно возрос благодаря обнаружению новых классов некодирующих РНК (нкРНК). Оказалось, что нкРНК выполняют в клетке удивительно широкий спектр функций с использованием неизвестных ранее механизмов. Они вовлечены в регуляцию транскрипции и трансляции, репрессию мобильных генетических элементов и другие регуляторные пути - процессы, участие в которых считалось ранее прерогативой белков. Описанные на сегодняшний день нкРНК по самым разным оценкам представляют собой только вершину айсберга. Обнаружение и изучение новых нкРНК позволит выявить и исследовать неизвестные ранее механизмы работы клетки и представляет поэтому фундаментальный интерес.

Одним из классов нкРНК являются малые ядрышковые РНК (мякРНК, англ. - small nucleolar RNAs, snoRNAs). Их функция была установлена совсем недавно и заключается в определении нуклеотидов рРНК, малых ядерных РНК и мРНК, которые будут модифицированы одним из двух способов: метилированием 2'-ОН группы рибозы или превращением уридина в псевдоуридин. Большинство мякРНК позвоночных кодируется очень необычным способом: их гены расположены в интронах генов белков, так что мякРНК образуются в результате сплайсинга мРНК "гена-хозяина".

К настоящему моменту получен ряд данных о том, что нарушения экспрессии мякРНК могут иметь тяжелые последствия для организма. Так, делеция генов обнаруженных недавно мякРНК (HBII-52 и HBII-85) играет существенную, если не ведущую роль в патогенезе т.н. синдрома Прадера-Вилли - наследственного заболевания человека. Поэтому обнаружение и изучение новых мякРНК может послужить первым шагом к лечению ряда тяжелых болезней, причины которых до последнего времени оставались неизвестными.

На сегодняшний день даже для картированных модифицированных нуклеотидов рРНК найдены не все мякРНК. Кроме того, далеко не все модификации клеточных РНК известны. Обнаружение новых мякРНК необходимо для создания полной картины работы клетки и для выяснения универсальности представления о том, что каждая модификация такого вида направляется мякРНК. Помимо этого, обнаружение новых мякРНК может расширить наши представления о распространении и роли модификаций, а изучение разнообразия и функций генов-хозяев позволит ответить на фундаментальный вопрос о биологическом смысле кодирования мякРНК интронами генов и о том, случаен ли выбор гена-хозяина.

Отправной точкой для данной работы послужило исследование созданной в нашей лаборатории кДНК-библиотеки малых РНК из альфа-РНП частиц печени крысы. Эти частицы были впервые обнаружены как компонент кислоторастворимых белков хроматина (IConstantinova et al., 1984). К настоящему времени показано, что альфа-РНП содержат ряд протеасомных антигенов и, очевидно, представляют собой РНК-содержащие ядерные протеасомы (Konstantinova et al., 1999). Препарат альфа-РНК был любезно предоставлен лабораторией И.М. Константиновой (Институт цитологии РАН). В составе альфа-РНК, помимо транскриптов короткого ретропозона Ш, генов 4,5Si и 4,5Sh РНК, родственных SINEs, нами была обнаружена новая РНК, названная U87.

Целью данной работы было изучение РНК U87 и ее гена-хозяина.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить, к какому семейству малых РНК относится U87 РНК.

2. Определить, кодируется ли U87 РНК независимым геном, интроном известного гена или интроном нового гена-хозяина. В последнем случае планировалось определить, кодирует ли ген-хозяин белок или продуцирует нкРНК и исследовать локализацию транскрипта в клетке.

3. Сравнить структуру и уровень консервативности нуклеотидной последовательности гена-хозяина U87 РНК и других генов-хозяев.

В результате проведенного исследования идентифицирована новая мякРНК C/D-семейства, способная направлять 2'-0-метилирование гуанилового остатка в положении 3468 28S рРНК и названная U87. Обнаружено, что U87 мякРНК кодируется интроном нового гена, названного U87HG (host gene). Этот ген относится к 5'ТОР-семейству генов "домашнего хозяйства" и у грызунов, в отличие от гена человека, имеет множественные старты транскрипции. Показано, что сплайсированная и полиаденилир о ванная U87HG РНК не способна кодировать белок из-за отсутствия длинных открытых рамок считывания и является, таким образом, некодирующей РНК. Фракция U87HG РНК ассоциирована с рибосомами и потому является мишенью для механизма деградации, уничтожающего в ходе трансляции мРНК с нонсенс-мутациями (nonsense-mediated mRNA decay, NMD). Однако U87HG РНК слабо подвержена NMD, что резко отличает ее от другой некодирующей РНК -UHG. Предложена модель, объясняющая такое разное поведение этих РНК.

Показано, что нуклеотидная последовательность U87HG РНК млекопитающих заметно более консервативна по сравнению с последовательностями других некодирующих генов-хозяев мякРНК, что может указывать на наличие у U87HG функции помимо продуцирования U87 мякРНК.

Впервые прослежены тенденции изменчивости некодирующих генов-хозяев у разных классов позвоночных. В ходе этого анализа обнаружены три новые мякРНК C/D-семейства и предсказаны их функции.

Полученные результаты расширяют имеющиеся данные о мякРНК, а также позволяют поставить под сомнение сложившееся представление о нефункциональности экзонных последовательностей некодирующих генов-хозяев мякРНК. Кроме того, они вносят вклад в представление о тенденциях изменений гомологичных генов у позвоночных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МАЛЫЕ ЯДРЫШКОВЫЕ РНК

Малые ядрышковые РНК (мякРНК, англ. - small nucleolar RNAs, snoRNAs) впервые описаны в конце 60-х годов в клетках млекопитающих, однако существенный прогресс в данной области достигнут только к середине 90-х благодаря развитию адекватных экспериментальных подходов. К настоящему времени известно более 100 видов мякРНК, и этот список продолжает расти. Круг распространения мякРНК очень широк: они присутствуют у всех эукариот и даже у архебактерий, где, видимо из-за отсутствия ядрышка, были названы sRNAs (sno-like).

МякРНК относятся к стремительно растущей группе некодирующих РНК, которые выполняют в клетке удивительно широкий спектр функций. МякРНК локализованы в ядрышке, количество их разновидностей и копий таксонспецифично. Например, у позвоночных видов этих РНК примерно в два раза больше, чем у дрожжей. Кроме того, в клетке позвоночных число молекул каждого вида лежит в диапазоне от 104 до 105 , а у дрожжей от 102 до 103 (Maxwell & Fournier, 1995).

Почти все известные мякРНК необходимы для процессинга pPHK. 18S, 5.8S и 25/28S рРНК транскрибируются в ядрышке в составе пре-рРНК. При созревании в этот предшественник вносится несколько разрывов, в результате чего удаляются внешние и внутренние транскрибируемые спейсеры и высвобождаются молекулы рРНК. Одновременно с транскрипцией начинаются модификации нуклеотидов рРНК, происходящие, за единичными исключениями (Lapeyre & Pumshothaman, 2004), на стадии пре-рРНК, еще до завершения транскрипции (Bachellerie & Cavaille, 1997). Интересно, что модификации полностью отсутствуют в транскрибируемых спейсерах (Bachellerie & Cavaille, 1997). Две наиболее распространенные модификации - метилирование остатков рибозы по 2'-ОН и превращение уридина в псевдоуридин. Количество таких модифицированных нуклеотидов различно у разных таксонов: например, у позвоночных насчитывается примерно 100 участков модификаций каждого вида, а у дрожжей - около 50 (Weinstein & Steitz, 1999). Почти все мякРНК определяют сайты модификации рРНК, а также участвуют в разрезании пре-рРНК.

Нуклеотидные последовательности мякРНК обладают рядом консервативных элементов. В соответствии с этим практически все мякРНК входят в состав одного из двух семейств:

- C/D-семейства (box C/D snoRNAs), к которому относятся мякРНК, содержащие консервативные последовательности С и D; большинство этих РНК вовлечено в метилирование рибозы;

Н/АСА-семейства (box Н/АСА snoRNAs), в состав которого входят мякРНК, содержащие консервативные последовательности Н и АСА; почти все РНК этого семейства направляют псевдоуридилирование;

К мякРНК также относят РНК, входящую в состав РНКазы MRP и иногда похожую на нее РНК РНКазы Р.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Макарова, Юлия Алексеевна

Выводы:

1. Описана новая малая ядрышковая РНК C/D-семейства, названная U87 мякРНК. Анализ нуклеотидной последовательности U87 РНК свидетельствует о том, что она вовлечена в 2'-0-метилирование G-3468 28S рРНК.

2. U87 мякРНК кодируется интроном некодирующего белок гена-хозяина, названного U87HG. U87HG относится к 5'ТОР-семейству генов "домашнего хозяйства". В отличие от гена человека, U87HG грызунов имеет множественные старты транскрипции.

3. Значительная часть молекул U87HG РНК, несмотря на отсутствие протяженных открытых рамок считывания, ассоциирована с рибосомами, однако слабо подвержена зависимой от трансляции деградации.

4. Нуклеотидная последовательность U87HG РНК млекопитающих более консервативна по сравнению с известными последовательностями некодирующих генов-хозяев мякРНК, что может указывать на наличие у U87HG функции помимо продуцирования U87 мякРНК.

5. U87HG и два других аналогичных некодирующих гена-хозяина (UHG и gas5) изменяются сходным образом у разных классов позвоночных. В частности, у млекопитающих наблюдается тенденция к уменьшению числа копий генов мякРНК в интронах.

6. В интронах некодирующих генов-хозяев UHG и gas5 позвоночных обнаружены гены трех новых мякРНК семейства C/D и предсказаны их функции.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю, Д.А. Крамерову, за обучение навыкам, необходимым для выполнения данной работы, а также за бесконечное терпение. Автор благодарит И.К. Гоголевскую (ИМБ РАН) за ценный вклад в экспериментальную работу на начальном этапе, JI.H. Гаузе (ИБР РАН), В.А. Куличкову и И.М. Константинову (ИЦ РАН) за предоставление препаратов альфа-РНК печени крысы, М. Ростовскую, Д. Иванова и B.C. Прасолова (ИМБ РАН) за помощь в работе с клеточными культурами, а также А.С. Кондрашова (NIH, USA) за плодотворное обсуждение результатов.

1.6.7. Заключение

Обычно у крупных таксонов, например, у позвоночных и растений, одна и та же мякРНК кодируется разными способами. Однако в пределах такого таксона мякРНК, как правило, кодируется одним способом. Например, мякРНК U23 кодируется 12 интроном гена нуклеолина у всех классов позвоночных. Тем не менее нередки случаи, когда мякРНК меняет генов-хозяев. Так, мякРНК U15 у человека кодируется интронами гена рибосомного белка S3, а у X. laevis — интронами гена рибосомного белка S1. Кроме того, мякРНК, подобно U14 мякРНК X. laevis, может иметь разных генов-хозяев у одного вида (Maxwell & Fournier, 1995). Такие данные позволили предположить, что мякРНК произошли от мобильных элементов. Однако у генов мякРНК отсутствуют предсказываемые таким сценарием концевые повторы (Maxwell & Fournier, 1995).

Возникает еще один вопрос: почему в пределах одного организма разные мякРНК кодируются различными способами. Ответ пока кажется очевидным только для независимо экспрессирующихся генов: так, у позвоночных все независимые гены кодируют мякРНК, участвующие в разрезании рРНК и потому жизненно необходимые. Хотя даже в этом случае все не так очевидно: у позвоночных две обнаруженных недавно мякРНК, кодируемых независимыми генами, направляют метилирование мяРНК (Tycowski et al., 2004), а у дрожжей большинство генов мякРНК независимые. Неясно также, в чем заключается биологический смысл (если он существует), того, что многие ортологичные мякРНК кодируются в разных крупных таксонах по-разному. Самым простым было бы предположение о том, что выбор способа кодирования случаен, однако оно не согласуется с наблюдаемым для мякРНК позвоночных феноменом: большинство генов-хозяев так или иначе вовлечены в трансляцию (см. раздел 1.7.). Непонятно, наконец, с чем вообще связано такое разнообразие организации генов мякРНК - среди других групп генов на сегодняшний день неизвестно ничего похожего.

Известно, что полицистронная организация генов позволяет координировано регулировать их экспрессию. У растений мякРНК организованы в кластеры, а у позвоночных локализованы в интронах генов, кодирующих в основном белки трансляционного аппарата. Эти гены, таким образом, тоже кодируют несколько продуктов, и поэтому тоже в некотором роде являются полицистонными. Похоже, что проблема координированной экспрессии функционально связанных генов у этих таксонов решается по-разному. Следует отметить, что для успешного процессинга почти всех генов мякРНК позвоночных необходим сплайсинг, тогда как у растений процессинг мякРНК не зависит от сплайсинга, что позволяет разнообразить организацию генов мякРНК. В условиях, когда сплайсинг угнетен, (например, при тепловом шоке (Bond, 1988)) мякРНК растений продолжают образовываться. Возможно, такая повышенная по сравнению с позвоночными устойчивость продуцирования мякРНК связана с тем, что растения в гораздо большей степени, чем животные, подвержены экстремальным нагрузкам.

1.7. Гены- хозяева мякРНК позвоночных

Большинство генов, из интронов которых образуются мякРНК, кодируют белки, необходимые для трансляции (факторы инициации и элонгации, белки рибосом и т.д.), или вовлеченные в функционирование ядрышка. Такое расположение представляется неслучайным и необходимо, вероятно, для координации экспрессии транскриптов РНК-полимераз I и II: интенсивность транскрипции рРНК и в конечном итоге образование рибосом оказываются связанными с уровнем транскрипции мРНК (Maxwell & Fournier, 1995).

Почти все гены-хозяева мякРНК позвоночных принадлежат к так называемому 5'ТОР семейству (5'- terminal oligopyrimidine) генов домашнего хозяйства (Pelczar & Filipowicz, 1998). К этому семейству относятся гены рибосомных белков и факторов транскрипции. Первым нуклеотидом в их мРНК является цитозин, за которым следует короткий (4-13 н.) тракт пиримидиновых остатков. Такое строение в сочетании со специфическими последовательностями, входящими в 5'-нетранслируемую область мРНК, позволяет координирование экспрессировать гены семейства в ответ на внешние сигналы (например, ростовые факторы). В результате происходит увеличение интенсивности трансляции (Amaldi & Pierandrei-Amaldi, 1997).

Интересно, что обнаружено несколько относящихся к 5-ТОР семейству генов-хозяев мякРНК (UHG, U17HG, U19H, gas5 и U50HG), экзоны которых содержат на всем протяжении множественные стоп-кодоны и поэтому не способны кодировать белок (Tycowski et al., 1996; Bortolin & Kiss, 1998; Pelczar & Filipowicz, 1998; Smith & Steitz, 1998; Tanalca et al., 2000). В ходе транскрипции из интронов образуются мякРНК, а некодирующий транскрипт гена-хозяина полиаденилируется и либо остается в ядре (U19H РНК), либо выходит в цитоплазму. Для двух транскриптов (UHG и gas5) показана ассоциация с рибосомами. Эти "мРНК" подвергаются быстрой деградации, зависимой от активности трансляционного аппарата. Это не единственный пример, когда гены мякРНК локализованы в интронах некодирующих генов, хотя таких случаев известно немного. Так, мякРНК RBII-36 крысы, экспрессирующаяся только в мозге и лишенная участков, комплементарных рРНК или мяРНК, кодируется интроном некодирующей РНК Bsr, экспрессирующейся только в нервной системе (Cavaille et al., 2001). Другим примером служит подверженный импринтингу ген SNURF-SNURPN, экспрессирующийся с отцовского аллеля во всех тканях (Gray et al., 1999). Его длина составляет около 450 Icb, а количество экзонов превышает 150. В дицистронной мРНК последовательно закодированы белок SNURF (англ. SNRPN upstream reading frame (экзоны 1-3) и сплайсосомный белок SmN (экзоны 4-10). Все оставшиеся экзоны некодирующие, а в их интронах расположены гены мякРНК, по одному гену на интрон: интроны 21- 52 содержат 27 копий мякРНК HBII-85, а интроны 63- 142 содержат 47 копий мякРНК HBII-52. Еще пять мякРНК, представленные меньшим числом копий, присутствуют в других интронах. Все эти мякРНК лишены участков, комплементарных рРНК или мяРНК и экспрессируются преимущественно или исключительно в головном мозге. 3'-концевая некодирующая часть гигантского транскрипта служит антисенс-РНК для транскрибирующегося в противоположном направлении белкового гена UBE3A (Runte et al., 2001). Делеция гена SNUIIP-SNTJRPN вместе со всеми некодирующими экзонами и мякРНК служит причиной большинства случаев (Ohta et al., 1999) т.н. синдрома Прадера-Вилли (Prader-Willi syndrome) - тяжелого наследственного заболевания, характеризующегося умственной отсталостью, ожирением, гипотонией мышц и рядом других признаков. В последнее время получен ряд данных о том, что делеция мякРНК, в частности, HBII-85 играет существенную, если не ведущую роль в патогенезе этого заболевания (см., например, (Ding et al., 2005, Schule et al., 2005)).

Еще одна кодируемая этим геном мякРНК, HBII-52/MBII-52 (даны названия гомологов у человека/мыши), содержит протяженный участок (18 н.), полностью комплементарный фрагменту экспрессирующейся только в головном мозге мРНК гена серотонинового рецептора 5-НТ2С (Cavaille et al., 2000). Интересно, что гены и MBII-52, и 5-НТ2С экспрессируются в мозге, но совместная их экспрессия наблюдается только в некоторых отделах. Потенциальной мишенью 2'-0-метилирования, которое могла бы направлять мякРНК HBII-52/MBII-52, служит адениловый остаток, который обычно подвергается редактированию и превращается в инозин (I). Совсем недавно (Vitali et al., 2005) для мыши получены убедительные свидетельства того, что MBII-52 действительно осуществляет такое метилирование и что при этом существенно снижается эффективность дезаминирования A-I. То есть 2'-0-метилирование снижает эффективность редактирования. При трансляции I прочитывается как G. Вероятно, таким образом осуществляется тонкая регуляция взаимодействия серотонинового рецептора с G-белком. Интересно, что мыши, нокаутные по гену 5-НТ2С, имеют дефекты, похожие на наблюдаемые при PWS.

В самое последнее время обнаружено следующее. Известно, что в результате альтернативного сплайсинга образуются две изоформы мРНК 5-НТ2С. Они отличаются размером пятого и шестого экзонов. Только длинная форма мРНК способна продуцировать функциональный рецептор. Во второй части пятого экзона (Vb, рис. 8) расположена последовательность (сайленсер), которая препятствует включению Vb в состав мРНК и, соответственно, происходит образование короткой формы мРНК 5-НТ2С. В составе Vb расположены 5 нуклеотидов, которые подвергаются редактированию. Редактирование обеспечивает включение Vb в состав мРНК. и в результате образуется полноразмерная форма. а

AUG ш И И ♦

5' - GGATJCG AUGUAGCA U.'.CGU УССР

А в ЕС

3' -СС

UAA(D)

IAGCC.

5-HT2CR нРНК

-5'

HBII-52

Рис. 8. МякРНК HBII-52 и мРНК серотонинового реценгора 5-НТ2С способны к комплементарным взаимодействиям, (а). Структура мРНК рецептора 5-ИТ2С человека, Р и D - проксимальный и дистальный сайты сплайсинга. IJAA{P) и UAA(D)- стоп кодом ы. используемые при альтернативном сплайсинге. Экзоны обозначены прямоугольниками (белый соответствует подверженному альтернативному сплайсингу экзону Vb). Номера экзонов даны римскими цифрами. Показаны образующиеся изоформы мРНК и соответствующие им белки. Обозначены кодируемые последовательностью Vb аминокислоты, расположенные во второй внутриклеточной петле рецептора, (б). Комплементарные взаимодействия между мякРНК HBII-52 и мРНК 5-IIT2C. Пять нуклеотидов (сайты А Е), подверженных редактированию (происходит дезаминирование А с образованием I), обозначены черными стрелками. Белой стрелкой отмечен проксимальный сайт сплайсинга (Р). Ьокс Г) выделен прямоугольником. По (Kishore & Stamm, 2006).

Однако редактирование снижает чувствительность рецептора 5-НТ2С к серотоннну в 10-100 раз. Обнаружено, что мякРНК HB1I-52/MBI1-52, антисенс-элемент которой комплементарен фрагменту Vb, обеспечивает включение Vb и соответственно образование длинной формы мРНК НВП-52/МВП-52 независимо от редактирования (Kishore & Stamm, 2006). Продукт такой нередактированной мРНК обладает высокой чувствительностью к серотонину. В норме клеточная популяция мРНК 5-НТ2С содержит как редактированные, так и нередактированиые формы. Очевидно, это необходимо для регуляции чувствительности нервных клеток к серотонину. В мозге людей, больных PWS, не только отсутствует мякРНК HBII-52, но и значительно снижено количество мРНК 5-НТ2С с нередактированной последовательностью Vb (Kishore & Stamm, 2006). Последнее обстоятельство, очевидно, вносит вклад в патогенез PWS. Благодаря проведенным исследованиям открывается путь для поиска стратегии лечения этой тяжелой болезни.

1.8. Транскрипция генов мякРНК

Транскрипцию самостоятельных генов осуществляют РНК-полимераза II (например, U3, U8 и U13PHK) и РНК-полимераза III (РНК РНКазы MRP, U3 РНК растений). 5'- концы транскриптов имеют 2,2,7-триметилгуанозиновый кэп или у-монометилфосфат, соответственно. МякРНК, кодирующиеся в интронах или экпрессирующиеся в составе полицистронного транскрипта, имеют немодифицированные 5'-концы. Такие мякРНК вырезаются из предшественника, после чего их концы формируются с участием экзонуклеаз.

3'- конец всех известных мякРНК не модифицирован (Maxwell & Fournier, 1995). .

1.9. Созревание и транспорт мякРНК

Существует несколько путей созревания мякРНК. Это связано прежде всего с различной организацией их генов, транскрибирующихся независимо в виде моно- и полицистроиных транскриптов или локализованных в интронах. В любом случае в предшественнике мякРНК после действия специфических эндонуклеаз или после разрезания последовательности нитрона в точке ветвления образуются свободные 5'- и 3'-концы. Они подвергаются атаке 5'- 3' и 3-5' экзонуклеаз, в результате активности которых формируются концы зрелых мякРНК. Полной экзонуклеолитической деградации мякРНК препятствует связывание с ними коровых белков.

Начальные стадии процессинга независимо транскрибирующихся генов осуществляют эндонуклеазы. У дрожжей большинство генов мякРНК именно такие и входят в состав моно-и полицистроиных транскриптов. Большинство этих транскриптов содержит сайты узнавания эндорибонуклеазы Rntlp (Chanfreau et al., 1998), рис. 6. Rntlp обладает эндонуклеазной активностью по отношению к двуцепочечной РНК и по этому признаку относится к семейству, объединяющему белки с общим названием РНКазы III (Elela et al., 1996). РНКазы этого семейства присутствуют у всех живых организмов и участвуют в процессинге рРНК, тРНК, мРНК, микроРНК, а также могут инициировать деградацию мРНК (Carmell & Hannon, 2004). Помимо мякРНК, Rntlp осуществляет процессинг рРНК и некоторых мяРНК (U5 и U2) (Abou Elela & Ares, 1998, Chanfreau et al., 1998). В ходе процессинга мякРНК Rntlp нарезает как полицистронные транскрипты (Chanfreau et al.,

1998), так и моноцистронные транскрипты (Kufel et al., 2000), рис. б. После ее действия остаются свободные концы незрелой мякРНК, которые укорачиваются экзонуклеазами: 5'-коцевая область подвергается атаке 5-3' экзонуклеаз Ratlp и Xrnlp (Petfalsld et al., 1998), a3'-концевая часть процессируется экзосомой, в частности, ее компонентом Rrp6p (Allmang et al., 1999). Экзосомы представляют собой комплексы большого числа (не менее 10) клеточных 3'-5' экзонуклеаз; они присутствуют как в ядре, так и в цитоплазме (van Hoof & Parker, 1999) и осуществляют формирование 3'-концов концов многих клеточных РНК, деградацию мРНК в цитоплазме и деградацию межцистронных последовательностей пре-рРНК (Butler, 2002).

Некоторые мякРНК дрожжей не содержат последовательностей, узнаваемых Rntlp. Формирование свободных 5'- и З'-концов у предшественников таких РНК осуществляют белки, которые вносят разрыв в РНК при разрезании/полиаденилировании мРНК (Fatica et al., 2000).

Процессинг мякРНК, кодируемых интронами, осуществляется двумя способами. Для созревания большей части мякРНК необходим сплайсинг и последующий гидролиз 2'-5' фосфодиэфирной связи в точке ветвления. Образовавшийся продукт (мякРНК с прилегающими к ней последовательностями) подвергается атаке экзонуклеаз и в результате формируется зрелая мякРНК (Kiss & Filipowicz, 1995), рис.б. Процессинг небольшого числа интронных мякРНК, в том числе у позвоночных (Caffarelli et al., 1994), не зависит от сплайсинга: сайты для экзонуклеаз образуются в результате действия на несплайсированную пре-мРНК эндонуклеаз (рис.б). Например, у дрожжей в этом процессе участвует Rntlp, которая вносит разрывы в стебель, формируемый интронными последовательностями, фланкирующими ген мякРНК, а экзонуклеолитическая деградация осуществляется, как и в случае независимых генов, Rati, Xrnl (Petfalsld et al., 1998) и экзосомой (Allmang et al.,

1999). В этом случае образование мякРНК и мРНК являются альтернативными путями, и возникает вопрос, каким образом осуществляется выбор между ними. Для дрожжей, где почти все немногочисленные интронные мякРНК процессируются таким образом, показано, что 5 из б этих мякРНК лишены концевого стебля. Фланкирующие их последовательности способны к комплементарному взаимодействию, однако в результате образуется неканонический субстрат для Rntlp, так что узнавать она его может только в присутствии белка мякРНП Noplp (см. раздел 1.10.1). Таким образом, процессинг мякРНК происходит только при наличии белков мякРНП, в противном случае происходит сплайсинг и образуется мРНК гена-хозяина (Giorgi et al., 2001). Другие эксперименты также свидетельствуют о том, что коровые белки мякРНП могут принимать активное участие в процессинге (Filipowicz & Pogacic, 2002).

Созревание интронных мякРНК происходит рядом с их генами (Samarsky et al., 1998), тогда как продессинг полицистронных транскриптов может происходить в тельцах Кахаля и в ядрышке (Shaw et al., 1998).

После созревания мякРНК и присоединения ряда белков образовавшийся РНП комплекс направляется в ТК (Narayanan et al., 19996). Там продолжается сборка и созревание некоторых мякРНП, например, U3 (Gerbi et al., 2003), и некоторых мякРНК растений (Filipowicz & Pogacic, 2002). Кроме того, в ТК удерживаются дефектные мякРНП (Narayanan et al., 19996). Наконец, собранные мякРНП транспортируются в ядрышко, хотя некоторые этапы созревания могут проходить и в нем (Filipowicz & Pogacic, 2002).

1.10. Формирование РНП

МякРНК in vivo всегда обнаруживаются в комплексе с белками, образуя т.н. малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы (мякРНП). Часть мякРНП ассоциирована с созревающими рРНК (коэффициент седиментации комплекса - 70-90S), часть находится в свободном виде (10-15S) (Maxwell & Fournier, 1995).

1.10.1. Белки C/D мякРНП

Зрелые C/D мякРНК образуют стабильный комплекс с четырьмя консервативными белками, каждый из которых необходим для роста дрожжей (Filipowicz & Pogacic, 2002) (здесь и далее через слеш даны названия белка позвоночных и белка дрожжей): 15,5 кДа белком/8пи13р, NOP56/Nop56p, NOP58/Nop58p и с фибрилларином/Noplp (рис.9).

Все эти белки связываются с C/D-мотивом, стабилизируя мякРНК и предохраняя их концы от деградации экзонуклеазами (Kiss, 2004). Кроме того, эти белки необходимы для ядрышковой локализации C/D мякРНП, хотя эффекты, наблюдаемые при отсутствии каждого из них, несколько различны: удаление белков Noplp или Snul3p нарушает ядрышковую локализацию сильнее, чем удаление Nop56p или Nop58p (Verheggen et al., 2001).

Белок 15,5 кДа/ЭшйЗр относится к семейству РНК-связывающих белков, в состав которого входят также несколько рибосомных белков и белок NHP2, ассоциированный с Н/АСА мякРНП. Помимо C/D мякРНП, Snul3p, обнаружен в сплайсосомном комплексе, образованном U4/U6-U5 мяРНП, где, как и в C/D мякРНК. тоже связывается с K-turn мотивом (см. раздел 1.1.) U4 мяРНК (Watkins el al., 2000; Klein et al., 2001). фибрилл api

NOP58 (фибрилларин дискерин дискерин

15,5кДа

CAR1

GAR1

ANANNA

Бокс С

5'3' С/ОмякРНП

Бокс Н Бокс АСА

Н/АСА мякРНП

Рис.9. Строение СУП и Н/АСА мякРНП. Показано взаимодействие консервативных последовательностей мякРНК с белками и антисенс-элементов с рРНК, но (Brown et al., 2003) с изменениями.

Два других белка C/D мякР11П, NOP56/Nop56p и NOP58/Nop58p, являются гомологами (Gaulicr el al., 1997), рис. 10 и имеют сходство с белком 61кДа/Ргр31р, также входящим в состав U4/U6-U5 комплекса мяР1 III (Watkins et al., 2000).

В настоящее время неясно, имеет ли структурное сходство C/D- и мяРНП функциональное значение. Возможно, что после сплайсинга мРНК гена-хозяина Snul3p перемещается из сплайсосомы в формирующийся мякРНП комплекс. В связи с этим интересно отметить, что расстояние от конца гена мякРНК до точки ветвления является критическим для образования мякР1 IK (Iiirose & Steitz, 2001).

Реакцию метилирования осуществляет, очевидно, фибрилларин/Noplp, хотя ни для животных, ни для дрожжей это не было прямо показано (Filipowicz & Pogacic, 2002). Фибрилларин содержит домен, связывающий S-аденозилметионин, который служит донором метальных групп. Кроме того, аминокислотная последовательность и третичная структура фибрилларина имеет сходство с известными мети лтрансфе разам и. Наконец, демонстрация метилтрансферазной активности гомолога фибрилларина у архебактерий служит убедительным доводом в пользу аналогичной активности фибрилларина у эукариот (Omer et al., 2002).

1.10.2. Сборка C/D мякРНП

Для того чтобы началась сборка C/D мякРНП, в ходе сворачивания предшественника мякРНК должен образоваться C/D-мотив. Затем с C/D-мотивом связывается белок 15,5 кДа/SnulSp, который, видимо, взаимодействует непосредственно с петлей K-turn-мотива (Watlcins et al., 2000). Для связывания этого белка необходима целостность обеих двуцепочечных участков C/D- мотива, а их нуклеотидная последовательность не важна (Watlcins et al., 2002). Вероятно, связывание белка 15,5 кДа/8пи13р вызывает конформационные изменения мякРНК, так что она становится способной связывать остальные белки мякРНП (Watlcins et al., 2002). Таким образом, сборка C/D мякРНП является иерархическим процессом, включающим в себя несколько этапов.

Для мякРНК позвоночных, кодируемых интронами, показано, что связывание 15,5 кДа белка происходит во время сплайсинга, а именно, в течение так называемой стадии комплекса С1, когда с пре-мРНК связаны только U2, U5 и U6 мяРНП. Вероятно, белки сплайсосомы рекрутируют 15,5 кДа белок или убирают какие-то факторы, препятствовавшие его связыванию. Показано, что связывание 15,5 кДа белка и последующая сборка мякРНК происходят только тогда, когда мякРНК находится на оптимальном расстоянии (около 70 н.) от точки ветвления. Вероятно, это связано с тем, что при слишком близком расположении (50 и. и меньше) от точки ветвления белки мякРНП конкурируют за сайты связывания с белками сплайсосомы, а при слишком большом расстоянии (200 н. и больше), вероятно, сплайсосома уже не в состоянии рекрутировать 15,5 кДа белок (Hirose et al, 2003).

Интересно, что некоторые мякРНК расположены очень далеко (около 300 н.) от точки ветвления, но несмотря на это их процессинг проходит нормально (Hirose & Steitz, 2001). Оказалось, что последовательности, фланкирующие гены всех этих РНК, способны образовывать особенно длинные двуцепочечные участки длиной 12 п.н. и более. С предшественником мякРНК, стабилизированным такой структурой, 15,5 кДа белок и, очевидно, прочие коровые белки C/D РНП, могут связываться даже в отсутствие сплайсинга, хотя образования мяк РНК, естественно, не происходит. Таким образом, протяженный двуцепочечный участок, образуемый предшественником мякРНК, компенсирует неоптимальное положение мякРНК в интроне (Hirose et al., 2003).

Для связывания остальных трех белков C/D мякРНП с мякРНК абсолютно необходима не только целостность двуцепочечных участков C/D-мотива, но и нуклеотидная последовательность спирали 2, включающей в себя элементы С и D (рис. 26): любые изменения в ней, даже сохраняющие комплементарные взаимодействия, приводят к практически полной потере способности этих белков мякРНП связываться с мякРНК. Таким образом, последовательности С и D, формирующие спираль 2, необходимы для связывания остальных коровых белков мякРНП.

Детали процесса ассоциации этих белков с мякРНК все еще до конца не ясны, однако известно, что фибрилларин связывается с последовательностью D, a NOP58 - с последовательностью С, причем их связывание происходит независимо друг от друга (Cahill et al., 2002). Ассоциация фибрилларина с последовательностью D согласуется с его ролью метилтрансферазы, поскольку сайт метилирования определяется расстоянием именно от последовательности D. Связывание NOP56, который, как показано, не необходим для стабильности мякРНП, происходит только после связывания фибрилларина (Lafontaine & Tollervey, 2000), причем непосредственного взаимодействия NOP56 с C/D-мотивом не обнаружено (Cahill et al., 2002). Очевидно, NOP56 ассоциирует с C/D-мотивом за счет белок-белковых взаимодействий.

Следует отметить, что C/D мякРНК помимо последовательностей С и D содержат последовательности С1 и D', расположенные в центральной части молекулы и часто сближенные за счет образования шпильки (см. раздел 1.1). В связи с этим разумным выглядело бы предположение о том, что C/D мякРНК содержат две копии C/D-мотива и связывают два набора белков, обладая, таким образом, модульной структурой. Это предположение поддерживалось тем, что многие мякРНК обладают двумя антисенс-элементами, или только одним, но расположенным около элемента D'. Следовательно, предполагаемый C'/D'-мотив должен направлять реакцию метилирования, что и было продемонстрировано (Kiss-Laszlo et al., 1998). Однако C'/D'-мотив значительно менее консервативен по сравнению с C/D-мотивом: элементы С', D' и фланкирующие последовательности обычно вырождены и не способны формировать K-turn-мотив, необходимый для связывания белка 15,5 кДа/SnulBp и последующего формирования РНП. Действительно, показано, что 15,5 кДа белок взаимодействует только с C/D-мотивом, но не с C'/D'-мотивом (Szewczak et al., 2002). Не обнаружено и связывания с C'/D'-мотивом белка NOP58 (Cahill et al., 2002). Только NOP56 и фибрилларин способны связываться с C'/D'-мотивом: NOP56 - с элементом С', а фибрилларин - с С' и D' (Cahill et al., 2002). Таким образом, C/D мякРНП имеют асимметричную структуру (рис.9).

Интересно, что даже когда внутренние последовательности мякРНК способны формировать полноценный C'/D'-мотив, 15, 5 кДа белок все равно не может связаться с ним (Szewczak et al., 2002). Возможно, это связано с тем, что фибрилларин и Nop56 взаимодействуют в том числе с теми нуклеотидами C'/D'-мотива, которые необходимы для связывания 15, 5 кДа белка и таким образом перекрывают доступ 15,5 кДа белку к сайту связывания (Henras et al., 2004). Поскольку непосредственно в метилировании участвует только фибрилларин, для осуществления модификации, возможно, не требуется стабильного связывания всех коровых белков с C'/D'-мотивом. Фибрилларин же связан и с C/D, и с C'/D'-мотивом, так что C/D мякРНП скорее всего содержат две молекулы фибрилларина (Cahill et al., 2002).

Таким образом, к C/D и C'/D'-мотивам предъявляются, очевидно, разные требования: C'/D'-мотив должен только направлять метилирование, тогда как C/D-мотив обеспечивает еще и стабильность и ядрышковую локализацию мякРНП. Вероятно, такое распределение функций обусловливает асимметричное строение C/D мякРНП.

Эта ситуация удивительным образом контрастирует с наблюдаемой в архебактериях, где и с C/D, и с C'/D'-мотивами связывается по полному набору белков C/D мякРНП. Следует отметить, что у архебактерий боксы С' и D' почти никогда не бывают вырожденными (Henras et al., 2004).

1.10.3. Белки Н/АСА мякРНП

Как и C/D мякРНК, зрелые Н/АСА мякРНК тоже ассоциированы с четырьмя консервативными белками (Watkins et al., 1998; Henras et al., 1998): GARl/Garlp, дискерином (dyskerin)/Cbf5p, NHP2/Nhp2p и NOPlO/NoplOp (рис. 9) Все они прямо взаимодействуют с мякРНК (Dragon et al., 2000), необходимы для роста дрожжей и, за исключением GARl/Garlp, необходимы для стабильности мякРНК (Meier, 2005).

Центральный домен GARl/Garlp) прямо связывает мякРНК, а концевые домены, содержащие Gly/Arg повторы, благодаря которым белок получил свое название (Girard et al., 1992), стабилизируют связывание мякРНК с пре-рРНК и вовлечены в белок-белковые взаимодействия (Lafontaine & Tollervey, 1998). Удаление GAR1 ингибирует псевдоуридилирование (Bousquet-Antonelli et al., 1997), однако не влияет на аккумуляцию мякРНП.

Дискерин (NAP57)/Cbf5p является, очевидно, псевдоуридин-синтазой^ хотя, как и в случае с фибрилларином, прямо это показано не было. Дискерин содержит два мотива, присутствующих в большинстве псевдоуридин-синтаз (рис. 10) и имеет на протяженном участке 34% гомологию с псевдоуридин-синтазой E.coli TruB (Meier, 2005). Кроме того, при точечных мутациях этого белка уровень псевдоуридилирования рРНК резко снижается (нокаут у дрозофил и мышей приводит к эмбриональным деталям). Мутации в нем вызывают синдром преждевременного старения (dyskeratosis congenita) - наследственную болезнь, сопровождающуюся пойкилодермией (дистрофическим изменением кожи), дистрофией ногтей и рядом других симптомов (Mason el al., 2005).

Роль еще двух небольших основных коровых белков - NHP2/Nhp2p и NOPlO/NoplOp - до сих пор не вполне ясна, хотя оба необходимы для функционирования Н/АСА мякРНП. NHP2 впервые был выделен как связанный с хроматином негистоновый белок (Meier, 2005) и является гомологом 15,5 кДа белка C/D мякРНП, а также рибосомного белка L30. NOPIO (Henras et al„ 1998), хотя консервативен подобно прочим коровым белкам мякРНП, не содержит известных мотивов, не имеет гомологов среди коровых белков мякРНП и имеет длину всего 64 ак.

Интересно, что в составе C/D и Н/АСА мякР1 III присутствуют белки, содержащие одни и те же домены и даже гомологичные белки (рис. 10).

15.5К

NOP58 NOP56

Белки C/D мякРНП ш

Белки Н/АСА мякРНП

NHP2 NAP571

ТОО 200 МО 400 500 фибриппарин нет ил трансферам

GAR1

NOP1QI

Рис.10. Схема аминокислотных последовательностей белков C/D и Н/АСА мякРНП. Участки, обогащенные лизином, обозначены буквой К на зеленом фоне. RGG -глицин-аргинин-богатый домен. Желтым отмечен домен, характерный для метилтрансфераз. ¥ на красном фоне обозначены два серииовых кластера — мотивы, присутствующие в большинстве псевдоуридилаз. PUA - домен, общий у псевдоуридилаз и некоторых трансгликозилаз. Для белков NOP56 и NOP58, а также NHP2 и 15, 5 кДа белка приведены величины попарного сходства последовательностей, %. Масштаб, в котором нарисованы все последовательности, указан под последовательностью дискерина (NAP57). По (Meier, 2005).

Общие домены имеют псевдоуридин-синтаза дискерин (NAP57) и белки C/D РНП NOP56 и NOP58, а также метилтрансфераза фибрилларин и GAR1, Наиболее интересным представляется сходство белка NI1P2 с 15,5 кДа белком C/D мякРНП, который связывается с K-turn мотивом. Эти белки имеют ортолога в архебактериях - рибосомный белок L7Ae, который является коровым белком архебактериальных C/D и П/АСА мякРПГ! (Meter, 2005). Предположение о том, что в составе Н/АСА мякРНК тоже присутствует К-turn-мотив, ожидает своей проверки.

1.10.4. Сборка Н/АСА мякРНП

В отличие от C/D мякРНП, сборка которых проходит в несколько этапов, белки II/ACA мякРНП могут ассоциировать друг с другом в отсутствие РНК (Henras et а)., 2004): GAR1 и

NOP 10 способны связывать днскерин независимо друг от друга, а для связывания NHP2 дискерин должен предварительно ассоциировать с NOP 10. Для связывания Н/АСА РНК и у позвоночных, и у дрожжей достаточно тримера дискерин/NOP 10/NHP2 (Meier, 2005).

Как видно на электронных микрофотографиях очищенных дрожжевых Н/АСА мякРНП, каждая Н/АСА РНК ассоциирована с двумя наборами белков - очевидно, с каждой шпилькой связано по четыре коровых белка (Watkins et al., 1998).

1.10.5. Белки, участвующие в биогенезе C/D и Н/АСА мякРНП

Сборка мякРНП происходит котранскрипционно (Ballarino et al., 2005). И в сборку, и в транспорт мякРНП вовлечены вспомогательные белки, которые не связаны со зрелыми мякРНП и не необходимы для их функционирования. Пока известно менее десяти таких белков (Meier, 2005), наиболее изученные описаны ниже.

С мякРНК C/D-семейства слабо ассоциированы два структурно родственных нуклеоплазматических белка: TIP48 (известный также как TIP49b, RUVBL2, р50, ТАР54В и Reptin42) и TIP49 (известный также как TIP49a, RUVBL1, р55 и ТАР54) (Filipowicz & Pogacic, 2002). Эти белки обладают ДНК-хеликазной активностью и вовлечены в большое количество процессов, в частности, в репарацию и транскрипцию (Newman et al., 2000). Кроме того, они вовлечены в сборку и транспорт мякРНП. В частности, дрожжевой ортолог ТГР48 необходим для аккумуляции C/D и Н/АСА мякРНК, а также для ядрышковой локализации белков Noplp и Garlp - коровых компонентов мякРНП (Filipowicz & Pogacic, 2002).

В ядрышке и тельцах Кахаля присутствует белок Noppl40, который курсирует между этими органеллами и между ядрышком и цитоплазмой. Он взаимодействует с C/D и Н/АСА мякРНП и, видимо, участвует в их сборке и транспорте. По крайней мере, в дрожжах его гомолог необходим для аккумулирования Н/АСА РНК и для удержания C/D РНК в ядрышке (Filipowicz & Pogacic, 2002).

Белок SMN (survival of motoneurons), мутации в котором вызывают спинальную мышечную атрофию (spinal muscular atrophy), взаимодействует с коровыми белками C/D и Н/АСА мякРНП, фибрилларином и GAR1, и, вероятно, вовлечен в сборку мякРНП. Помимо этого SMN является одним из важнейших белков, вовлеченных в сборку РНП, которые участвуют в биогенезе рибосом, а также в сплайсинге и транскрипции (Filipowicz & Pogacic, 2002). Следует отметить, что этот такой важный для высших эукариот белок отсутствует в дрожжах: по крайней мере, его гомолог у них не обнаружен (Meier, 2005).

В отличие от мякРНК, направляющих модификации нуклеотидов, мякРНК, участвующие в процессинге рРНК обычно ассоциированы с более многочисленным набором белков. Например, U3 РНП, участвующий в образовании 18S рРНК из предшественника, помимо четырех обычных коровых белков содержит еще один дополнительный, и некоторую часть времени связан еще по меньшей мере с семью другими белками (Filipowicz & Pogacic, 2002).

1.11. Модификации рРНК и их роль

1.11.1. Виды модификаций РНК у разных таксонов

Модификации нуклеотидов РНК разнообразны и нередко встречаются в клетке. Наибольшее количество модифицированных нуклеотидов содержится в тРНК, в рРНК и в мяРНК, хотя встречаются они и в мРНК - например, инозин, образующийся из аденина в результате редактирования, и 2'-0-метилированные нуклеотиды. По сравнению с бактериями, у эукариот модифицированные нуклеотиды, в частности, в рРНК, встречаются значительно чаще (Таблица 2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарова, Юлия Алексеевна, Москва

1. Abou Elela S, Ares M, Jr. 1998. Depletion of yeast RNase III blocks correct U2 3' end formationand results in polyadenylated but functional U2 snRNA. Embo J17:3738-3746.

2. Accardo MC, Giordano E, Riccardo S, Digilio FA, Iazzetti G, Calogero RA, Furia M. 2004. Acomputational search for box C/D snoRNA genes in the Drosophila melanogaster genome. Bioinformatics 20:3293-3301.

3. Agrawal MG, Bowman LH. 1987. Transcriptional and translational regulation of ribosomalprotein formation during mouse myoblast differentiation. J Biol Chem 262:4868-4875.

4. Allmang C, Kufel J, Chanfreau G, Mitchell P, Petfalski E, Tollervey D. 1999. Functions of theexosome in rRNA, snoRNA and snRNA synthesis. Embo J /5:5399-5410.

5. Amaldi F, Pierandrei-Amaldi P. 1997. TOP genes: a translationally controlled class of genesincluding those coding for ribosomal proteins. Prog Mol Subcell Biol /5:1-17.

6. Atzorn V, Fragapane P, Kiss T. 2004. U17/snR30 is a ubiquitous snoRNA with two conservedsequence motifs essential for 18S rRNA production. Mol Cell Biol 24:1769-1778.

7. Bachellerie JP, Cavaille J. 1997. Guiding ribose methylation of rRNA. Trends Biochem Sci22:257-261.

8. Badis G, Fromont-Racine M, Jacquier A. 2003. A snoRNA that guides the two most conservedpseudouridine modifications within rRNA confers a growth advantage in yeast. Rnci 9:771779.

9. Balakin AG, Smith L, Fournier MJ. 1996. The RNA world of the nucleolus: two major familiesof small RNAs defined by different box elements with related functions. Cell 56:823-834.

10. Ballarino M, Morlando M, Pagano F, Fatica A, Bozzoni I. 2005. The cotranscriptional assemblyof snoRNPs controls the biosynthesis of H/ACA snoRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 25:5396-5403.

11. Blanchard SC, Puglisi JD. 2001. Solution structure of the A loop of 23S ribosomal RNA. Proc

12. Natl Acad Sci USA 95:3720-3725.

13. Boffelli D, Nobrega MA, Rubin EM. 2004. Comparative genomics at the vertebrate extremes.1. Nat Rev Genet 5:456-465.

14. Bond U. 1988. Heat shock but not other stress inducers leads to the disruption of a sub-set ofsnRNPs and inhibition of in vitro splicing in HeLa cells. Embo J 7:3509-3518.

15. Bonnerot C, Pintard L, Lutfalla G. 2003. Functional redundancy of Spblp and a snR52dependent mechanism for the 2'-0-ribose methylation of a conserved rRNA position in yeast. Mol Cell /2:1309-1315.

16. Bortolin ML, Ganot P, Kiss T. 1999. Elements essential for accumulation and function of smallnucleolar RNAs directing site-specific pseudouridylation of ribosomal RNAs. Em bo J 75:457-469.

17. Bortolin ML, Kiss T. 1998. Human U19 intron-encoded snoRNA is processed from a longprimary transcript that possesses little potential for protein coding. Rna 4:445-454.

18. Bousquet-Antonelli C, Henry Y, G'Elugne J P, Caizergues-Ferrer M, Kiss T. 1997. A smallnucleolar RNP protein is required for pseudouridylation of eukaryotic ribosomal RNAs. EmboJ16:4770-4776.

19. Brennan CM, Steitz JA. 2001. HuR and mRNA stability. Cell Mol Life Sci 55:266-277.

20. Brown JW, Clark GP, Leader DJ, Simpson CG, Lowe T. 2001. Multiple snoRNA gene clustersfrom Arabidopsis. Rna 7:1817-1832.

21. Brown JW, Echeverria M, Qu LH. 2003. Plant snoRNAs: functional evolution and new modesof gene expression. Trends Plant Sci 5:42-49.

22. Bugl H, Fauman EB, Staker BL, Zheng F, Kushner SR, Saper MA, Bardwell JC, Jakob U. 2000.

23. RNA methylation under heat shock control. Mol Cell 6:349-360.

24. Burge C, Karlin S. 1997. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J Mol1. Biol 268:78-94.

25. Butler JS. 2002. The yin and yang of the exosome. Trends Cell Biol 12:90-96.

26. Caetano-Anolles G. 2002. Tracing the evolution of RNA structure in ribosomes. Nucleic Acids1. Res 30:2575-2587.

27. Caffarelli E, Arese M, Santoro B, Fragapane P, Bozzoni I. 1994. In vitro study of processing ofthe intron-encoded U16 small nucleolar RNA in Xenopus laevis. Mol Cell Biol 14:29662974.

28. Cahill NM, Friend K, Speckmann W, Li ZH, Terns RM, Terns MP, Steitz JA. 2002. Sitespecific cross-linking analyses reveal an asymmetric protein distribution for a box C/D snoRNP. Embo /27:3816-3828.

29. Carmell MA, Harmon GJ. 2004. RNase III enzymes and the initiation of gene silencing. Nat

30. Struct Mol Biol 77:214-218.

31. Carmo-Fonseca M. 2002. New clues to the function of the Cajal body. EMBO Rep 3:126-121.

32. Cavaille J, Buiting K, Kiefmann M, Lalande M, Brannan CI, Horsthemke B, Bachellerie JP,

33. Brosius J, Huttenhofer A. 2000. Identification of brain-specific and imprinted smallnucleolar RNA genes exhibiting an unusual genomic organization. Proc Natl Acad Sci U S A 97:14311-14316.

34. Cavaille J, Vitali P, Basyulc E, Huttenhofer A, Bachellerie JP. 2001. A novel brain-specific box

35. C/D small nucleolar RNA processed from tandemly repeated introns of a noncoding RNA gene in rats. J Biol Chem 276:26374-26383.

36. Chanfreau G, Legrain P, Jacquier A. 1998. Yeast RNase III as a key processing enzyme in smallnucleolar RNAs metabolism. J Mol Biol 284:975-988.

37. Chanfreau G, Rotondo G, Legrain P, Jacquier A. 1998. Processing of a dicistronic smallnucleolar RNA precursor by the RNA endonuclease Rntl. Embo J17:3726-3737.

38. Chang DD, Clayton DA. 1987. A mammalian mitochondrial RNA processing activity containsnucleus-encoded RNA. Science 235:1178-1184.

39. Charette M, Gray MW. 2000. Pseudouridine in RNA: what, where, how, and why. IUBMB Life49:341-351.

40. Chen CL, Liang D, Zhou H, Zhuo M, Chen YQ, Qu LH. 2003. The high diversity of snoRNAsin plants: identification and comparative study of 120 snoRNA genes from Oryza sativa. Nucleic Acids Res 57:2601-2613.

41. Cheng J, Belgrader P, Zhou X, Maquat LE. 1994. Introns are cis effectors of the nonsensecodon-mediated reduction in nuclear mRNA abundance. Mol Cell Biol 14:6311-6325.

42. Child SJ, Miller MK, Geballe AP. 1999. Translational control by an upstream open readingframe in the HER-2/neu transcript. J Biol Chem 274:24335-24341.

43. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162:156-159.

44. Darzacq X, Jady BE, Verheggen C, Kiss AM, Bertrand E, Kiss T. 2002. Cajal body-specificsmall nuclear RNAs: a novel class of 2'-0-methylation and pseudouridylation guide RNAs. Embo J 21:2146-2156.

45. Davis DR, Poulter CD. 1991. 1H-15N NMR studies of Escherichia coli tRNA(Phe) from hisTmutants: a structural role for pseudouridine. Biochemistry 50:4223-4231.

46. Decatur WA, Fournier MJ. 2002. rRNA modifications and ribosome function. Trends Biochem1. Sci 27:344-351.

47. Dennis PP, Omer A, Lowe T. 2001. A guided tour: small RNA function in Archaea. Mol1. Microbiol 40:509-519.

48. Ding F, Prints Y, Dhar MS, Johnson DIC, Garnacho-Montero C, Nicholls RD, Francke U. 2005.1.ck of Pwcrl/MBII-85 snoRNA is critical for neonatal lethality in Prader-Willi syndrome mouse models. Mamm Genome 76:424-431.

49. Dostie J, Dreyfuss G. 2002. Translation is required to remove Y14 from mRNAs in thecytoplasm. Curr Biol 72:1060-1067.

50. Dragon F, Pogacic V, Filipowicz W. 2000. In vitro assembly of human H/ACA small nucleolar

51. RNPs reveals unique features of U17 and telomerase RNAs. Mol Cell Biol 20:3037-3048.

52. Elela SA, Igel H, Ares M, Jr. 1996. RNase III cleaves eukaryotic preribosomal RNA at a U3snoRNP-dependent site. Cell 55:115-124.

53. Etheridge KT, Banik SS, Armbmster BN, Zhu Y, Terns RM, Terns MP, Counter CM. 2002.

54. The nucleolar localization domain of the catalytic subunit of human telomerase. J Biol Chem 277:24764-24770.

55. Fatica A, Morlando M, Bozzoni I. 2000. Yeast snoRNA accumulation relies on a cleavagedependent/polyadenylation-independent З'-processing apparatus. Embo J 79:6218-6229.

56. Filipowicz W, Pogacic V. 2002. Biogenesis of small nucleolar ribonucleoproteins. Curr Opin1. Cell Biol 14:319-327.

57. Filippini D, Renzi F, Bozzoni I, Caffarelli E. 2001. U86, a novel snoRNA with anunprecedented gene organization in yeast. Biochem Biophys Res Commun 288:16-21.

58. Freeman JE, Stirling D, Russell AL, Wolf CR. 1992. cDNA sequence, deduced amino acidsequence, predicted gene structure and chemical regulation of mouse Cyp2el. Biochem J 281 (Pt3):689-695.

59. Gall JG. 2000. Cajal bodies: the first 100 years. Annu Rev CellDev Biol 76:273-300.

60. Gall JG, Bellini M, Wu Z, Murphy C. 1999. Assembly of the nuclear transcription andprocessing machinery: Cajal bodies (coiled bodies) and transcriptosomes. Mol Biol Cell 70:4385-4402.

61. Ganot P, Bortolin ML, Kiss T. 1997. Site-specific pseudouridine formation in preribosomal

62. RNA is guided by small nucleolar RNAs. Cell 5P:799-809.

63. Gautier T, Berges T, Tollervey D, Hurt E. 1997. Nucleolar KKE/D repeat proteins Nop56p and

64. Nop58p interact with Noplp and are required for ribosome biogenesis. Mol Cell Biol 77:7088-7098.

65. Gerbi SA, Borovjagin AV, Lange TS. 2003. The nucleolus: a site of ribonucleoproteinmaturation. Curr Opin Cell Biol 75:318-325.

66. Gibbs RA et al. 2004. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights intomammalian evolution. Nature 428:493-521.

67. Giordano E, Peluso I, Senger S, Furia M. 1999. minifly, a Drosophila gene required forribosome biogenesis. J Cell Biol /44:1123-1133.

68. Giorgi C, Fatica A, Nagel R, Bozzoni I. 2001. Release of U18 snoRNA from its host intronrequires interaction of Noplp with the Rntlp endonuclease. Embo J20:6856-6865.

69. Girard JP, Lehtonen H, Caizergues-Ferrer M, Amalric F, Tollervey D, Lapeyre B. 1992. GAR1is an essential small nucleolar RNP protein required for pre-rRNA processing in yeast. Embo J 11:673-682.

70. Gray ТА, Saitoh S, Nicholls RD. 1999. Ал imprinted, mammalian bicistronic transcript encodestwo independent proteins. Proc Natl Acad Sci USA 96:5616-5621.

71. Green R, Noller HF. 1996. In vitro complementation analysis localizes 23S rRNAposttranscriptional modifications that are required for Escherichia coli 50S ribosomal subunit assembly and function. Rna 2:1011-1021.

72. Green R, Noller HF. 1999. Reconstitution of functional 50S ribosomes from in vitro transcriptsof Bacillus stearothermophilus 23S rRNA. Biochemistry 35:1772-1779.

73. Greenwood SJ, Schnare MN, Gray MW. 1996. Molecular characterization of U3 smallnucleolar RNA from the early diverging protist, Euglena gracilis. Curr Genet 30:338-346.

74. Hartmann E, Hartmann RK. 2003. The enigma of ribonuclease P evolution. Trends Genet19:561-569.

75. Hellmann I, Zollner S, Enard W, Ebersberger I, Nickel B, Paabo S. 2003. Selection on humangenes as revealed by comparisons to chimpanzee cDNA. Genome Res /3:831-837.

76. Henras A, Henry Y, Bousquet-Antonelli C, Noaillac-Depeyre J, Gelugne JP, Caizergues-Ferrer

77. M. 1998. Nhp2p and Nop 1 Op are essential for the function of H/ACA snoRNPs. Embo J /7:7078-7090.

78. Henras AK, Capeyrou R, Henry Y, Caizergues-Ferrer M. 2004. Cbf5p, the putativepseudouridine synthase of H/ACA-type snoRNPs, can form a complex with Garlp and NoplOp in absence of Nhp2p and box H/ACA snoRNAs. Rna /0:1704-1712.

79. Henras AK, Dez C, Henry Y. 2004. RNA structure and function in C/D and H/ACA s(no)RNPs.

80. Curr Opin Struct Biol /4:335-343.

81. Higgins DG, Bleasby AJ, Fuchs R. 1992. CLUSTAL V: improved software for multiplesequence alignment. Comput Appl Biosci 8:189-191.

82. Hinnebusch AG. 1997. Translational regulation of yeast GCN4. A window on factors thatcontrol initiator-trna binding to the ribosome. J Biol Chem 272:21661-21664.

83. Hirose T, Shu MD, Steitz JA. 2003. Splicing-dependent and -independent modes of assemblyfor intron-encoded box C/D snoRNPs in mammalian cells. Mol Cell 12:113-123.

84. Hirose T, Steitz JA. 2001. Position within the host intron is critical for efficient processing ofbox C/D snoRNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 95:12914-12919.

85. Huang ZP, Zhou H, Liang D, Qu LH. 2004. Different expression strategy: multiple intronicgene clusters of box H/ACA snoRNA in Drosophila melanogaster. J Mol Biol 341:669-683.

86. Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids. Gene 96:23-28.

87. Jady BE, Bertrand E, Kiss T. 2004. Human telomerase RNA and box H/ACA scaRNAs share acommon Cajal body-specific localization signal. J Cell Biol 164:647-652.

88. Jady BE, Kiss T. 2001. A small nucleolar guide RNA functions both in 2'-0-ribose methylationand pseudouridylation of the U5 spliceosomal RNA. Embo J 20:541-551.

89. Jarrous N. 2002. Human ribonuclease P: subunits, function, and intranuclear localization. Rna5:1-7.

90. Jiang W, Middleton K, Yoon HJ, Fouquet C, Carbon J. 1993. An essential yeast protein,

91. CBF5p, binds in vitro to centromeres and microtubules. Mol Cell Biol 13:4884-4893.

92. Kessler O, Chasin LA. 1996. Effects of nonsense mutations on nuclear and cytoplasmic adeninephosphoribosyltransferase RNA. Mol Cell Biol 16:4426-4435.

93. Khaitovich P, Tenson T, Kloss P, Mankin AS. 1999. Reconstitution of functionally active

94. Thermus aquaticus large ribosomal subunits with in vitro-transcribed rRNA. Biochemistry 35:1780-1788.

95. King TH, Liu B, McCully RR, Fournier MJ. 2003. Ribosome structure and activity are alteredin cells lacking snoRNPs that form pseudouridines in the peptidyl transferase center. Mol Cell 11:425-435.

96. Kirloiess EF, Bafna V, Halpern AL, Levy S, Remington K, Rusch DB, Delcher AL, Pop M,

97. Wang W, Fraser CM, Venter JC. 2003. The dog genome: survey sequencing and comparative analysis. Science 307:1898-1903.

98. Kishore S, Stamm S. 2006. The snoRNA HBII-52 regulates alternative splicing of the serotoninreceptor 2C. Science 311:230-232.

99. Kiss-Laszlo Z, Henry Y, Kiss T. 1998. Sequence and structural elements of methylation guidesnoRNAs essential for site-specific ribose methylation of pre-rRNA. Embo J17:797-807.

100. Kiss AM, Jady BE, Bertrand E, Kiss T. 2004. Human box H/ACA pseudouridylation guide

101. RNA machinery. Mol Cell Biol 24:5797-5807.

102. Kiss AM, Jady BE, Darzacq X, Verheggen C, Bertrand E, Kiss T. 2002. A Cajal body-specificpseudouridylation guide RNA is composed of two box H/ACA snoRNA-like domains. Nucleic Acids Res 30:4643-4649.

103. Kiss Т. 2004. Biogenesis of small nuclear RNPs. J Cell Sci 117:5949-5951.

104. Kiss T, Filipowicz W. 1995. Exonucleolytic processing of small nucleolar RNAs from premRNA introns. Genes Dev 9:1411-1424.

105. Kiss T, Marshallsay C, Filipowicz W. 1991. Alteration of the RNA polymerase specificity of

106. U3 snRNA genes during evolution and in vitro. Cell 65:517-526.

107. Klein DJ, Schmeing TM, Moore PB, Steitz ТА. 2001. The kink-turn: a new RNA secondarystructure motif. Embo J 20:4214-4221.

108. Konstantinova IM, Kulichkova VA, Evteeva IN, Mittenberg AG, Volkova IV, Ermolaeva JB,

109. Gause LN. 1999. The specific endoribonuclease activity of small nuclear and cytoplasmic alpha-RNPs. FEBS Lett 4(52:407-410.

110. Konstantinova IM, Turoverova LV, Petukhova OA, Vorob'ev VI. 1984. Cortisone-inducedsmall RNP tightly bound to chromatin. FEBSLett 177:241-245.

111. Korf I, Flicek P, Duan D, Brent MR. 2001. Integrating genomic homology into gene structureprediction. Bioinformcitics 17 Suppl i:S140-148.

112. Kozak M. 1986. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon thatmodulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44:283-292.

113. Kozak M. 1987. Effects of intercistronic length on the efficiency of reinitiation by eucaryoticribosomes. Mol Cell Biol 7:3438-3445.

114. Kozak M. 2001. Constraints on reinitiation of translation in mammals. Nucleic Acicls Res29:5226-5232.

115. Kruszka K, Barneche F, Guyot R, Ailhas J, Meneau I, Schiffer S, Marchfelder A, Echeverria

116. M. 2003. Plant dicistronic tRNA-snoRNA genes: a new mode of expression of the small nucleolar RNAs processed by RNase Z. Embo J22:621-632.

117. Kuersten S, Goodwin EB. 2003. The power of the 3' UTR: translational control anddevelopment. Nat Rev Genet 4:626-637.

118. Kufel J, Allmang C, Chanfreau G, Petfalski E, Lafontaine DL, Tollervey D. 2000. Precursorsto the U3 small nucleolar RNA lack small nucleolar RNP proteins but are stabilized by La binding. Mol Cell Biol 20:5415-5424.

119. Lafontaine DL, Bousquet-Antonelli C, Henry Y, Caizergues-Ferrer M, Tollervey D. 1998. Thebox H + АСА snoRNAs carry Cbf5p, the putative rRNA pseudouridine synthase. Genes Dev 12:527-537.

120. Lafontaine DL, Tollervey D. 1998. Birth of the snoRNPs: the evolution of the modificationguide snoRNAs. Trends Biochem Sci 23:383-388.

121. Lafontaine DL, Tollervey D. 2000. Synthesis and assembly of the box C+D small nucleolar

122. RNPs. Mol Cell Biol 20:2650-2659.

123. Lapeyre B, Purushothaman SK. 2004. Spblp-directed formation of Gm2922 in the ribosomecatalytic center occurs at a late processing stage. Mol Cell 16:663-669.

124. Le Hir H, Izaurralde E, Maquat LE, Moore MJ. 2000. The spliceosome deposits multipleproteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions. Embo J 19:6860-6869.

125. Lee SY, Rasheed S. 1990. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid

126. DNA. Biotechniques 9:616-619.

127. Lemieux R, Beaud G. 1982. Expression of vaccinia virus early mRNA in Ehrlich ascites tumorcells. 2. Part of the polysomes at an early stage of virus infection are not bound to the cytoskeleton. Eur J Biochem 129:213-219.

128. Lercher MJ, Urrutia AO, Hurst LD. 2002. Clustering of housekeeping genes provides a unifiedmodel of gene order in the human genome. Nat Genet 37:180-183.

129. Li SG, Zhou H, Luo YP, Zhang P, Qu LH. 2005. Identification and functional analysis of 20

130. Box H/ACA small nucleolar RNAs (snoRNAs) from Schizosaccharomyces pombe. J Biol Chem 280:16446-16455.

131. Liang XH, Uliel S, Hury A, Barth S, Doniger T, Unger R, Michaeli S. 2005. A genome-wideanalysis of C/D and H/ACA-like small nucleolar RNAs in Trypanosoma brucei reveals a trypanosome-specific pattern of rRNA modification. Rna 77:619-645.

132. Lincoln AJ, Monczak Y, Williams SC, Johnson PF. 1998. Inhibition of CCAAT/enhancerbinding protein alpha and beta translation by upstream open reading frames. J Biol Chem 273:9552-9560.

133. Lowe TM, Eddy SR. 1999. A computational screen for methylation guide snoRNAs in yeast.1. Science 253:1168-1171.

134. Lukowiak AA, Narayanan A, Li ZH, Terns RM, Terns MP. 2001. The snoRNA domain ofvertebrate telomerase RNA functions to localize the RNA within the nucleus. Rna 7:18331844.

135. Luukkonen BG, Tan W, Schwartz S. 1995. Efficiency of reinitiation of translation on humanimmunodeficiency virus type 1 mRNAs is determined by the length of the upstream open reading frame and by intercistronic distance. J Virol 69:4086-4094.

136. Maden BE. 1990. The numerous modified nucleotides in eukaryotic ribosomal RNA. Prog

137. Nucleic Acid Res Mol Biol 39:241-303.

138. Makalowski W, Boguski MS. 1998. Evolutionary parameters of the transcribed mammaliangenome: an analysis of 2,820 orthologous rodent and human sequences. Proc Natl Acad Sci USA 95:9407-9412.

139. Maquat LE. 2004. Nonsense-mediated mRNA decay: splicing, translation and mRNPdynamics. Nat Rev Mol Cell Biol 5:89-99.

140. Mason PJ, Wilson DB, Bessler M. 2005. Dyskeratosis congenita ~ a disease of dysfunctionaltelomere maintenance. Curr Mol Med 5:159-170.

141. Mathews DH, Sabina J, Zuker M, Turner DH. 1999. Expanded sequence dependence ofthermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J Mol Biol 255:911-940.

142. Mattick JS. 2005. The functional genomics of noncoding RNA. Science 309:1527-1528.

143. Maxwell ES, Fournier MJ. 1995. The small nucleolar RNAs. Annu Rev Biochem 64:Ю1-9ЪА.

144. Mazumder B, Seshadri V, Fox PL. 2003. Translational control by the З'-UTR: the ends specifythe means. Trends Biochem Sci 28:91-98.

145. Meier UT. 2005. The many facets of Н/АСА ribonucleoproteins. Chromosoma 114:1-14.

146. Meijer HA, Thomas AA. 2002. Control of eukaryotic protein synthesis by upstream openreading frames in the 5'-untranslated region of an mRNA. Biochem J 367:1-11.

147. Menon KP, Neufeld EF. 1994. Evidence for degradation of mRNA encoding alpha-Liduronidase in Hurler fibroblasts with premature termination alleles. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 40:999-1005.

148. Mishra RK, Eliceiri GL. 1997. Three small nucleolar RNAs that are involved in ribosomal

149. RNA precursor processing. Proc Natl Acad Sci USA 94:4972-4977.

150. Mitchell JR, Cheng J, Collins K. 1999. A box H/ACA small nucleolar RNA-like domain at thehuman telomerase RNA 3' end. Mol Cell Biol 79:567-576.

151. Morris DR, Geballe AP. 2000. Upstream open reading frames as regulators of mRNAtranslation. Mol Cell Biol 20:8635-8642.131. (a) Narayanan A, Lukowiak A, Jady BE, Dragon F, Kiss T, Terns RM, Terns MP. 1999.

152. Newby MI, Greenbaum NL. 2001. A conserved pseudouridine modification in eukaryotic U2snRNA induces a change in branch-site architecture. Rna 7:833-845.

153. Newman DR, ICuhn JF, Shanab GM, Maxwell ES. 2000. Box C/D snoRNA-associatedproteins: two pairs of evolutionarily ancient proteins and possible links to replication and transcription. Rna (5:861-879.

154. Newton K, Petfalski E, Tollervey D, Caceres JF. 2003. Fibrillarin is essential for earlydevelopment and required for accumulation of an intron-encoded small nucleolar RNA in the mouse. Mol Cell Biol 23:8519-8527.

155. Noensie EN, Dietz HC. 2001. A strategy for disease gene identification through nonsensemediated mRNA decay inhibition. Nat Biotechnol /9:434-439.

156. Noon ICR, Bruenger E, McCloskey JA. 1998. Posttranscriptional modifications in 16S and 23SrRNAs of the archaeal hyperthermophile Sulfolobus solfataricus. J Bacteriol 180:28832888.

157. Ofengand J, Malhotra A, Remme J, Gutgsell NS, Del Campo M, Jean-Charles S, Peil L, Kaya

158. Y. 2001. Pseudouridines and pseudouridine synthases of the ribosome. Colcl Spring Harb Symp Quant Biol (5(5:147-159.

159. Ogurtsov AY, Roytberg MA, Shabalina SA, ICondrashov AS. 2002. OWEN: aligning longcollinear regions of genomes. Bioinformatics 75:1703-1704.

160. Ohta T, Gray ТА, Rogan PIC, Buiting K, Gabriel JM, Saitoh S, Muralidhar B, Bilienska B,

161. Krajewska-Walasek M, Driscoll DJ, Horsthemke B, Butler MG, Nicholls RD. 1999. Imprinting-mutation mechanisms in Prader-Willi syndrome. Am J Hum Genet (54:397-413.

162. Omer AD, Lowe TM, Russell AG, Ebhardt H, Eddy SR, Dennis PP. 2000. Homologs of smallnucleolar RNAs in Archaea. Science 288:517-522.

163. Omer AD, Ziesche S, Ebhardt H, Dennis PP. 2002. In vitro reconstitution and activity of a C/Dbox methylation guide ribonucleoprotein complex. Proc Natl Acad Sci USA 99:5289-5294.

164. Parker R, Simmons T, Shuster EO, Siliciano PG, Guthrie C. 1988. Genetic analysis of smallnuclear RNAs in Saccharomyces cerevisiae: viable sextuple mutant. Mol Cell Biol 5:31503159.

165. Peculis B. 1997. RNA processing: pocket guides to ribosomal RNA. Curr Biol 7:R480-482.

166. Pelczar P, Filipowicz W. 1998. The host gene for intronic U17 small nucleolar RNAs inmammals has no protein-coding potential and is a member of the 5'-terminal oligopyrimidine gene family. Mol Cell Biol 75:4509-4518.

167. Peri S, Pandey A. 2001. A reassessment of the translation initiation codon in vertebrates.1. Trends Genet 77:685-687.

168. Pesole G, Liuni S, Grillo G, Licciulli F, Mignone F, Gissi C, Saccone C. 2002. UTRdb and

169. UTRsite: specialized databases of sequences and functional elements of 5' and 3' untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Update 2002. Nucleic Acids Res 50:335-340.

170. Petfalsld E, Dandekar T, Henry Y, Tollervey D. 1998. Processing of the precursors to smallnucleolar RNAs and rRNAs requires common components. Mol Cell Biol 75:1181-1189.

171. Pierandrei-Amaldi P, Campioni N, Cardinali B. 1991. Experimental changes in the amount ofmaternally stored ribosomes affect the translation efficiency of ribosomal protein mRNA in Xenopus embryo. Cell Mol Biol 37:221-238.

172. Poyry ТА, Kaminski A, Jackson RJ. 2004. What determines whether mammalian ribosomesresume scanning after translation of a short upstream open reading frame? Genes Dev 18:6275.

173. Qu LH, Henras A, Lu YJ, Zhou H, Zhou WX, Zhu YQ, Zhao J, Henry Y, Caizergues-Ferrer

174. M, Bachellerie JP. 1999. Seven novel methylation guide small nucleolar RNAs are processed from a common polycistronic transcript by Ratlp and RNase III in yeast. Mol Cell Biol 19:1144-1158.

175. Rajavel ICS, Neufeld EF. 2001. Nonsense-mediated decay of human HEXA mRNA. Mol Cell1. Biol 21:5512-5519.

176. Raska I, Andrade LE, Ochs RL, Chan EK, Chang CM, Roos G, Tan EM. 1991. Immunologicaland ultrastructural studies of the nuclear coiled body with autoimmune antibodies. Exp Cell Res 195:21-31.

177. Renalier MH, Joseph N, Gaspin C, Thebault P, Mougin A. 2005. The Cm56 tRNAmodification in archaea is catalyzed either by a specific 2'-0-methylase, or a C/D sRNP. Rna 77:1051-1063.

178. Richard P, Darzacq X, Bertrand E, Jady BE, Verheggen C, Kiss T. 2003. A common sequencemotif determines the Cajal body-specific localization of box H/ACA scaRNAs. Embo J 22:4283-4293.

179. Runte M, Huttenhofer A, Gross S, Kiefmann M, Horsthemke B, Buiting К 2001. The IC

180. SNURF-SNRPN transcript serves as a host for multiple small nucleolar RNA species and as an antisense RNA for UBE3A. Hum Mol Genet 70:2687-2700.

181. Russell AG, Schnare MN, Gray MW. 2004. Pseudouridine-guide RNAs and other Cbf5passociated RNAs in Euglena gracilis. Rna 70:1034-1046.

182. Ryskov AP, Ivanov PL, Kramerov DA, Georgiev GP. 1983. Mouse ubiquitous B2 repeat inpolysomal and cytoplasmic poly(A)+RNAs: uniderectional orientation and 3'-end localization. Nucleic Acids Res 77:6541-6558.

183. Samarsky DA, Balakin AG, Fournier MJ. 1995. Characterization of three new snRNAs from

184. Saccharomyces cerevisiae: snR34, snR35 and snR36. Nucleic Acids Res 23:2548-2554. 160.Samarsky DA, Fournier MJ. 1999. A comprehensive database for the small nucleolar RNAs from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 27:161-164.

185. Samarsky DA, Fournier MJ, Singer RH, Bertrand E. 1998. The snoRNA box C/D motif directsnucleolar targeting and also couples snoRNA synthesis and localization. Embo J 77:37473757.

186. Schramm L, Hernandez N. 2002. Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters.1. Genes Dev 16:2593-2620.

187. Shaw PJ, Beven AF, Leader DJ, Brown JW. 1998. Localization and processing from apolycistronic precursor of novel snoRNAs in maize. J Cell Sci 111 (Pt 15): 2121-2128.

188. Sirum-Connolly K, Peltier JM, Crain PF, McCloskey JA, Mason TL. 1995. Implications of afunctional large ribosomal RNA with only three modified nucleotides. Biochimie 77:30-39.

189. Smale ST, Kadonaga JT. 2003. The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem72:449-479.

190. Smith CM, Steitz JA. 1998. Classification of gas5 as a multi-small-nucleolar-RNA (snoRNA)host gene and a member of the 5'-terminal oligopyrimidine gene family reveals common features of snoRNA host genes. Mol Cell Biol 75:6897-6909.

191. Smith NG, Eyre-Walker A. 2003. Human disease genes: patterns and predictions. Gene375:169-175.

192. Solovyev VV, Salamov AA, Lawrence CB. 1995. Identification of human gene structure usinglinear discriminant functions and dynamic programming. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol 3:367-375.

193. Speckmann WA, Terns RM, Terns MP. 2000. The box C/D motif directs snoRNA 5'-caphypermethylation. Nucleic Acids Res 28:4467-4473.

194. Spirin, A S. 1999. Initiation of translation. In Ribosomes, p.237, Kluwer Academic Pub.

195. Starostina NG, Marshburn S, Johnson LS, Eddy SR, Terns RM, Terns MP. 2004. Circular box

196. C/D RNAs inPyrococcus furiosus. Proc Natl Acacl Sci USA 707:14097-14101.

197. Szewczak LB, DeGregorio SJ, Strobel SA, Steitz JA. 2002. Exclusive interaction of the 15.5kD protein with the terminal box C/D motif of a methylation guide snoRNP. Chem Biol 9:1095-1107.

198. Takai D, Jones PA. 2002. Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21and 22. Proc Natl Acacl Sci USA 99:3740-3745.

199. Tanalca R, Satoh H, Moriyama M, Satoh K, Morishita Y, Yoshida S, Watanabe T, Nakamura

200. Y, Mori S. 2000. Intronic U50 small-nucleolar-RNA (snoRNA) host gene of no protein-coding potential is mapped at the chromosome breakpoint t(3;6)(q27;ql5) of human B-cell lymphoma. Genes Cells 5:277-287.

201. Thermann R, Neu-Yilik G, Deters A, Frede U, Wehr K, Hagemeier C, Hentze MW, Kulozik

202. AE. 1998. Binary specification of nonsense codons by splicing and cytoplasmic translation. Embo J17:3484-3494.

203. Tollervey D. 1996. Small nucleolar RNAs guide ribosomal RNA methylation. Science273:1056-1057.

204. Tollervey D, Kiss T. 1997. Function and synthesis of small nucleolar RNAs. Curr Opin Cell1. Biol 9:337-342.

205. Tollervey D, Lehtonen H, Jansen R, Kern H, Hurt EC. 1993. Temperature-sensitive mutationsdemonstrate roles for yeast fibrillarin in pre-rRNA processing, pre-rRNA methylation, and ribosome assembly. Cell 72:443-457.

206. Туе K, Steitz JA. 1989. U3, U8 and U13 comprise a new class of mammalian snRNPslocalized in the cell nucleolus. Embo J8:3113-3119.

207. Tycowski KT, Aab A, Steitz JA. 2004. Guide RNAs with 5' caps and novel box C/D snoRNAlike domains for modification of snRNAs in metazoa. Curr Biol 74:1985-1995.

208. Tycowski KT, Shu MD, Steitz JA. 1996. A mammalian gene with introns instead of exonsgenerating stable RNA products. Nature 379:464-466.

209. Tycowski KT, Steitz JA. 2001. Non-coding snoRNA host genes in Drosophila: expressionstrategies for modification guide snoRNAs. Eur J Cell Biol 80:119-125.

210. Tycowski KT, You ZH, Graham PJ, Steitz JA. 1998. Modification of U6 spliceosomal RNA isguided by other small RNAs. Mol Cell 2:629-638.

211. Verheggen С, Mouaikel J, Thiry M, Blanchard JM, Tollervey D, Bordonne R, Lafontaine DL,

212. Bertrand E. 2001. Box C/D small nucleolar RNA trafficking involves small nucleolar RNP proteins, nucleolar factors and a novel nuclear domain. Embo J20:5480-5490.

213. Villa T, Ceradini F, Bozzoni I. 2000. Identification of a novel element required for processingof intron-encoded box C/D small nucleolar RNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 20:1311-1320.

214. Vision TJ, Brown DG, Tanlcsley SD. 2000. The origins of genomic duplications in

215. Arabidopsis. Science 290:2114-2117.

216. Vitali P, Basyulc E, Le Meur E, Bertrand E, Muscatelli F, Cavaille J, Huttenhofer A. 2005.

217. ADAR2-mediated editing of RNA substrates in the nucleolus is inhibited by C/D small nucleolar RNAs. J Cell Biol 169:145-153.

218. Vitali P, Royo H, Seitz H, Bachellerie JP, Huttenhofer A, Cavaille J. 2003. Identification of 13novel human modification guide RNAs. Nucleic Acids Res 37:6543-6551.

219. Wagner E, Lylclce-Andersen J. 2002. mRNA surveillance: the perfect persist. J Cell Sci115:3033-3038.

220. Walden WE, Godefroy-Colbum T, Thach RE. 1981. The role of mRNA competition inregulating translation. I. Demonstration of competition in vivo. J Biol Chem 256:1113911746.

221. Wang XQ, Rothnagel JA. 2004. 5'-untranslated regions with multiple upstream AUG codonscan support low-level translation via leaky scanning and reinitiation. Nucleic Acids Res 32:1382-1391.

222. Watlcins NJ, Dickmanns A, Luhrmann R. 2002. Conserved stem II of the box C/D motif isessential for nucleolar localization and is required, along with the 15.5K protein, for the hierarchical assembly of the box C/D snoRNP. Mol Cell Biol 22:8342-8352.

223. Watlcins NJ, Gottschalk A, Neubauer G, ICastner B, Fabrizio P, Mann M, Luhrmann R. 1998.

224. Cbf5p, a potential pseudouridine synthase, and Nhp2p, a putative RNA-binding protein, are present together with Garlp in all H BOX/ACA-motif snoRNPs and constitute a common bipartite structure. Rna 4:1549-1568.

225. Watlcins NJ, Segault V, Charpentier B, Nottrott S, Fabrizio P, Bachi A, Wilm M, Rosbash M,

226. Branlant C, Luhrmann R. 2000. A common core RNP structure shared between the small nucleoar box C/D RNPs and the spliceosomal U4 snRNP. Cell 703:457-466.

227. Weinstein LB, Steitz JA. 1999. Guided tours: from precursor snoRNA to functional snoRNP.

228. Curr Opin Cell Biol 77:378-384.

229. Widerak M, Kern R, Mallei A, Richarme G. 2005. U2552 methylation at the ribosomal A-siteis a negative modulator of translational accuracy. Gene 347:109-114.

230. Wilkie GS, Dickson KS, Gray NK. 2003. Regulation of mRNA translation by 5'- and З'-UTRbinding factors. Trends Biochem Sci 28:182-188.

231. Willingham AT, Orth AP, Batalov S, Peters EC, Wen BG, Aza-Blanc P, Hogenesch JB,

232. Schultz PG. 2005. A strategy for probing the function of noncoding RNAs finds a repressor ofNFAT. Science 309:1570-1573.

233. Xiao S, Scott F, Fierke CA, Engelke DR. 2002. Eukaryotic ribonuclease P: a plurality ofribonucleoprotein enzymes. Annu Rev Biochem 71:165-189.

234. Xie X, Lu J, Kulbokas EJ, Golub TR, Mootha V, Lindblad-Toh 1С, Lander ES, Kellis M. 2005.

235. Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3' UTRs by comparison of several mammals. Nature 434:338-345.

236. Yamashita R, Suzuki Y, Nakai K, Sugano S. 2003. Small open reading frames in 5'untranslated regions of mRnas. CR Biol 326:981-991.

237. Yang CY, Zhou H, Luo J, Qu LH. 2005. Identification of 20 snoRNA-like RNAs from theprimitive eukaryote, Giardia lamblia. Biochem Biophys Res Commun 328:1224-1231.

238. Yu YT, Shu MD, Steitz JA. 1998. Modifications of U2 snRNA are required for snRNPassembly and pre-mRNA splicing. Embo J 17:5183-5195.

239. Zambetti G, Wilming L, Fey EG, Penman S, Stein J, Stein G. 1990. Differential association ofmembrane-bound and non-membrane-bound polysomes with the cytoskeleton. Exp Cell Res 191:246-255.

240. Zebarjadian Y, King T, Fournier MJ, Clarke L, Carbon J. 1999. Point mutations in yeast CBF5can abolish in vivo pseudouridylation of rRNA. Mol Cell Biol 19:1461-1412.

241. Zhang J, Maquat LE. 1997. Evidence that translation reinitiation abrogates nonsense-mediatedmRNA decay in mammalian cells. Embo J16:826-833.

242. Zhu Y, Tomlinson RL, Lukowiak AA, Terns RM, Terns MP. 2004. Telomerase RNAaccumulates in Cajal bodies in human cancer cells. Mol Biol Cell 75:81-90.

243. Zuker M. 2003. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.

244. Nucleic Acids Res 31:3406-3415.

245. Рэфф P, Кофмен Т. 1986. Эмбрионы, гены и эволюция, с.317. Москва: "Мир".

246. У U 2 X D1 о 2 X у и 2 X У и 21. X ^ ф го ф гош id го ш X гоо го л О О го л ис; о а з с; о а 3ф 0 а а ф о а о3* и 2 и у и 2 И1. X 1. Ф гош X гоо го л ис; о а зф о а о,1. У и 2 х