Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ И КИСЛОЙ ДНКАЗЫ В МАКРОФАГАХ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ IN VITRO С ВОЗБУДИТЕЛЕМ РОЖИ СВИНЕЙ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВР-2 ,

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЛОКАЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ И КИСЛОЙ ДНКАЗЫ В МАКРОФАГАХ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ IN VITRO С ВОЗБУДИТЕЛЕМ РОЖИ СВИНЕЙ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВР-2 ,"



Всесоюзный ордена Ленина институт

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ (ВНЭВ)~ Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственных наук им. В- И. Ленина (ВАСХНИЛ)

На правах рукописи

Аспирант АСТАШОВА Елена Александровна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ КИСЛОИ ФОСФАТАЗЫ И КИСЛОИ ДНКазы В МАКРОФАГАХ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ IN VITRO С ВОЗБУДИТЕЛЕМ / РОЖИ СВИНЕИ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВР-2 ,

•V (Электронноцитохнмкческое исследование) .

(03.00.07 — микробиология) " .

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

— 197!»

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ (Ш1ЭВ) Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственных _паук им. В- И. Ленина (ВАСХНИЛ)_

На правах рукописи

Аспирант АСТАШОВА Елена Александровна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ И КИСЛОЙ ДНКазы В МАКРОФАГАХ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ IN VITRO С ВОЗБУДИТЕЛЕМ РОЖИ СВИНЕИ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВР-2

(Элекгронноцнтохнмнческое исследование) (03,00.07 — микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

- '- j ' . ■"■nvncKa i

Москва — 1975

Работа выполнена й лаборатории биофизики Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (директор — заслуженный деятель науки РСФСР, академик ВАСХНИЛ, профессор Я. Р. Коваленко").

Материалы диссертации, излаженные на 168 страницах машинописного текста, содержат: введение — 4 страницы, обзор литературы — 38, собственные исследования — 73, обсуждение—21, выводы — 2; иллюстрированы 8 таблицами и 76 электронограммами. Список использованной литературы включает 274 работы, в том числе 141 иностранный источник,

Научный руководитель — кандидат медицинских наук В. С. Гуткин,

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель иауки РСФСР, доктор биологических наук, профессор П. И. Притулин;

доктор ветеринарных наук, профессор Н. И. Архипов.

Ведущее научное учреждение — Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия имени К. И- Скрябина.

Автореферат разослан « /6 ^ 1975 г_

Защита диссертации состоится « /В » ин>н# 1975 г. в 14 часов на заседании Ученого Совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии по адресу: 109472, Москва', Ж-472, Кузьминки, ВМЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь ВИЭВ, кандидат бнол. наук В. В. Калугин.

Одной КЗ наиболее актуальных задач современной иммунобиологии является глубокое изучение процессов, происходящих вскоре после контакта антигенных раздражителей с нм-мунокомпетентнымн клетками (Argiris, 1967; Unanue, Asko-nas, 1968; И. Я. Учитель, 1970; Р. В. Петров, 1973; А. Я. Фрн-денштейн, 1973; Hahy, 1974; Wacker, 1974 н др.).

После работ И- И. /Мечникова, посвященных важной роли фагоцитоза в защите макроорганнзма от инфекционных агентов, стало очевидно, что к формированию иммунитета непосредственное отношение имеет процесс внутриклеточного пищеварения в виде деятельности «цнтаэ». «Цнтазамн» оказались лнзосомы (Duve et а)., 1955, 19G4; Novikoff et al., 1956), которые, в связи с их гетерогенностью, трудно идентифицировать. Разработанный в последние годы метод электронной цитохимии позволяет не только выявлять внутриклеточную локализацию лпзосом, но н проводить сравнительную оценку активности кислых гпдролаз в этих ультраструктурах.

В настоящее время накопилось большое количество данных о функциональном значении лпзосом при различных патологических и физиологических процессах, в том числе при формировании иммунитета (А. И. Брауде, В. В. Роговин, 1964; Cohn, Benson, 1965; Uhr, Weissmann, 1968; Piearsall, Weiser, 1970; Б. В. Пннегнп, Б. С. Утешев, 1971; И. С. Френдлин, 1971; И. Я. Учитель, 1973, и др). Напряженность создаваемого вакцинами иммунитета зависит не только от количества н качества антигена н места его аппликации, но и от физиологического состояния всех органов и систем прививаемых животных (Я. Р. Коваленко, М. А. Сидоров, 1972; П. И. Прнтулин, 1972, п др.). Способность реагировать на какой-либо конкретный антиген, высота иммунного ответа, выраженность фагоцитоза, набор лнзосомальных ферментов, проницаемость мембран лпзосом генетически детерминированы (Р. В. Петров, 1966, 1973; К. И. Лебедев, 1969; И. Я. Учитель, Э. Л- Хаемагг, 1969; И. Н. Емельянепко, 1971; Gallily, Eliahn, 1974 и др.).

Согласно гипотезе Campbell н Garvey (1963) в лнзосомзх макрофагов, играющих важную роль в индукции иммунологического ответа, чужеродные агенты расщепляются до относительно простых веществ, утилизируются пли выводятся из клетки, а «неподдающиеся перевариванию» индуцируют енн-

тез антител как дополнительный механизм, направленный на удаление антигена. Следовательно, формирование иммунного ответа зависит от характера взаимодействия между микроорганизмами н макрофагами, в связи с чем последние оказались в центре событий, приводящих к формированию не только неспецифической резистентности, но и специфической иммунной реакции. Мнопге из относящихся сюда вопросов в последние годы решаются в модельных опытах на культуре клеток (Cohn, Wiener, 1963; Т. Н. Маслова, 1963; Cohn, 1968; Cohn, Fedorko, 1969; Р. В. Высокодворова, 1974; М. Р. Кроткова, 1974; Г. Ф. Майорова с соавт., 1974, и др.)-

Однако тонкие механизмы взаимодействия нммунокомпе-тентных клеток с различными возбудителями болезней сельскохозяйственных животных пока не изучены в достаточной степени. По существу не раскрыты ультрасгруктурные механизмы лизосомальной обработки макрофагами антигенного материала, не выявлена в полной мере динамика процессов в лнзосомальном аппарате макрофагов при взаимодействии с микробными раздражителями, не известны условия и причины активации лизосомальиых ферментов н т. д. Таким образом, не исследованы наиболее лажные, принципиальные вопросы обработки антигенного материала лизосомальными ферментами макрофагов.

Сказанным определяется актуальность исследования взаимодействия лизосомального аппарата макрофагов с различными микроорганизмами и, в частности, с вакцинным штаммом ВР-2 возбудителя рожи свиней, который широко используется для вакцинации против этого заболевания.

В связи с изложенным в работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ультраструктуру и выявить локализацию гидролизной активности в микробных клетках вакцинного штамма ВР-2 возбудителя рожи свиней в различном физическом состоянии (на примере живых, убитых и дезинтегрированных микроорганизмов).

2. Исследовать ультраструктурпые и ферментоцнтохимиче-ские особенности лизосомального аппарата культуры макрофагов от нитактпых н предварительно стимулированных мышей линии С57Вг и СЗН.

3. Изучить улырастуктурные. и ферментоцитохимпчеекпе особенности лизосомального аппарата макрофагов от нитактпых и предварительно стимулированных мышей при взаимодействии in vitro с живыми, убитыми и дезинтегрированными микробными клетками.

4. Выявить возможные межлинейные цитохимические раз-

лнчия лизосом макрофагов при взаимодействии с тем же антигенным материалом {штамм ВР-2 возбудителя рожи свиней) на клеточной модели макрофагов, полученных от мышей двух разных линий.

5- Проследить процесс внутриклеточного катаболизма живых, убитых н дезинтегрированных микроорганизмов под влиянием гидролитических ферментов лизосом макрофагов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Донорами пернтонеальных макрофагов служили мыши двух генетических линии (С57Вг н СЗН), самцы, средним весом 18—20г. Было проведено 12 серий экспериментов; в каждой серии было поставлено по 3—4 однотипных опыта. Всего использовано 344 мыши.

Предварительную стимуляцию животных проводили по методу Cohn (1968). Клеточную взвесь из брюшной полости нн-тактпых и стимулированных мышей инкубировали при 37е С в течение 30 мннут^ 2—3 раза отмывали средой 199, после чего макрофаги, прикрепившиеся к покровным стеклам, культивировали при 37° С в течение трех суток в среде 199 с 20% сывороткой крупного рогатого скота, ннактнвнропаниой при 56° С в течение 30 минут.

Трехсуточную культуру в виде монослоя клеток использовали как контроль исходного функционального состояния макрофагов при исследовании ультра структурных и фермсптоцн-тохпмнческих особенностей их лнзосо'мадьного аппарата,

В качестве тест-микроба использовали рожистые бактерии вакцинного штамма ВР-2. Однотонность при проведении всех экспериментов обеспечивалась хранением микробных клеток в Лиофильно-рысушенном состоянии (лиофнлизацию материала проводили в центробежной сублимационной установке Эдварде в течение 21 часов). Перед каждым опытом микроорганизмы реактивировали, контролируя количество жизнеспособных бактериальных клеток высевами на МПА. Выросшие па МПА колонии микробов вакцинного штамма ВР-2 рожи свиней использовали как контроль для сравнения с микробными клетками, ультраструктуру и цитохимию которых изучали сразу же после реактивации нз лнофильного состояния.

Убитые микроорганизмы получали выдерживанием реактивированных бактерий при 60** С в течение 30 минут, дезинтегрированные — ультразвуковым воздействием в дезинтеграторе MSE в течение 10 минут.

Контакт макрофагов с микробными раздражителями осуществляли путем добавления к культуре клеток мнкроорганпз-

мов в различном физическом состоянии из расчета 50—20 микробных тел на клетку. Через 30 минут монослой макрофагов отмывали от нефагоцитировапных микроорганизмов или их фрагментов и продолжали культивирование в свежей среде лрн 37° С. Взятие материала для электронномикроскопическо-го и электрошшпнтохимпческого исследования проводили через 5 минут, 1, 3, 6, 24, 72 часа от момента первоначального контакта- Параллельно с опытом ставили контроль, т. е. исследовали культуру пернтонеальиых макрофагов тем же методом, в те же сроки, но без добавления микроорганизмов или их фрагментов.

Для электронномпкроскоиического исследования культуру пернтонеальиых макрофагов ил» микробов префикснровалп 2% раствором глютарового альдегида, приготовленным на 0,05 М какодилатном буфере (рН 7,2), 5—6 раз отмывали от фиксатора 0,025 М какодллатным буфером (рН 7,2) и лост-фиксировали (% раствором четырехокисн осмия, приготовленным по Palade (1962) на 0,2 М веронал-ацетатном буфере (рН 7,2). Экспериментальный материал обезвоживали в этиловом спирте (30%, 50%, 70Г|/о), коитрастпрвалн в 2,5% растворе ура-нилацетата на 70% спирте, после чего продолжали дальнейшее обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации 80*U, 90%, 100%) и абсолютном ацетоне. Материал пропитывали смолами по Luff (¡96!) и заливали в эпон 812. Полимеризацию проводили при 45° С в течение трех суток.

Для снятия покровных стекол отвердевшие блоки погружали в жидкий азот. Срезы толщиной 300—500А (после прицельной ориентации блоков под световым микроскопом) получали на ультрамикротоме LKB-UI, контрастировали лимоннокислым свинцом по Reynolds (1963) п изучали с помощью электронного микроскопа JEM-7A.

Электрон иощ 1ТОХИ mi 1ч ее кие исследования проводили путем постановки ферментативных реакций после префиксации исследуемых биологических объектов. Была прослежена локализация и динамика активности двух маркерных ферментов лп-зоеом—кислой фосфатазы и кислой ДНКазы, атакующих фос-форно-эфирные связи.

Активность кислой фосфатазы выявляли но методу Gomori (1952, 1956), используя инкубационную среду следующего состава: ацетатный буфер 50 мМ, рН 5,2; р- глицерофосфат натрия 10 мМ; 4 мМ РЬг+. Среду выдерживали при 37° С в течение 40 минут, после чего фильтровали и в фильтрат добавляли сахарозу из расчета 75 мг/мл. Исследуемый материал инкубировали при 37° С 30 минут (для макрофагов) и 60 минут (для микробов или их фрагментов), отмывали 0,006 М какодилат-б

пым буфером (рН 7,2), постфнксировалн и проводили последующие этапы обработки материала по вышеописанно» методике, за исключением контрастирования срезов па сеточках, т. к. оно затеняет результаты цитохимической реакции в исследуемых объектах.

Активность кислой ДНКазы выявляли по методу УогЬго(Н (1961), используя инкубационную среду следующего состава; ацетатный буфер 50 мМ, рН 5,9; кислая фосфатаза 0,16 мг/мл; низкополимерная ДНК 0,4 мг/мл, 2 мМ РЬ2*. Среду выдерживали при 37° С в течение 20 минут, после чего фильтровали и в фильтрат добавляли сахарозу из расчета 50 мг/мл. Инкубацию макрофагов и микробов (пли их фрагментов) проводили в течение 1 или 2 часов соответственно при 37° С, отмывали 0,006 М какоднлатным буфером (рН 7,2) н далее проводили по вышеописанной методике-

Контроль на специфичность реакций ставили путем инкубации исследуемых объектов в инкубационных средах без субстратов (для кислой фосфатазы — без р-глпцерофосфата натрия, для кислой ДНКазы—без низкоиолпмериоп ДНК). Дальнейшая обработка материала не отличалась от ВЫШеНЗЛОЖСН-НОП.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ь Ультраструктура и электронная цитохимия микробной клетки рожи свиней вакцинного штамма ВР-2

Изучение взаимодействия культуры макрофагов с избранным тест-микробом требовало предварительного исследования ультраструктурных и цитохимических особенностей живых, убитых и дезинтегрированных бактериальных клеток, что могло бы явиться модельным отображением разных стадий процесса внутриклеточной деструкции живых микробов иод слиянием лизосомальных ферментов,

Субмнкроскопнческое строение вакцинного штамма ВР-2 возбудителя рожи свиней соответствовало ультраструктурной организации грамположптельных бактерий." Они были представлены клетками вытянутой формы длиной 0,9—2,3 мкм и толщиной 0,25—0,46 мкм. Их клеточная стенка образовывала на полюсах своеобразные «чехлнки», а цнтоплазматическая мембрана отличалась четкой трехконтурностью.

В центральной зоне цитоплазмы был хорошо различим нук-леонд с нитям я ДНК, ориентированными вдоль оси клетки. Высокая электронная плотность цитоплазмы объяснялась большим количеством рибоиуклеопротепдов (рибосом н полисом),

В микробной клетке штамма БР-2 идентифицировались мезосомы в в^де округлых мембранно-складчатых образований диаметром 0,10—0,14 мкм. Во время деления микроба мезосомы часто можно было наблюдать рядом с септой. Описанная ультраструктура реактивированных из лиофильного состоимся микробов не изменялась на протяжении всего времени исследования.

Сравнительное изучение ультраструктурной организации бактериальных клеток, реактивированных из лиофильного состояния ио мере проведении опытов в течение года (срок наблюдения) и выращенных па МПА, не выявило каких-либо субмикроскопмческнх различий, за исключением большей вариабельности размеров микробных клеток, выросших на МПА.

Субмнкроскопическая анатомия убитых микробов в основном не отличалась от вышеописанной, но наблюдаемые ультраструктуры были менее четкими, Фрагменты микробной клетки после дезинтеграции имел» вид цитоплазматнческих обрывков и микросфер.

При исследовании маркерных ферментов лизосом а живых, убитых и дезинтегрированных микроорганизмах была установлена неодинаковая их локализация, В живой микробной клетке продукт реакции на кислую фосфатазу и кислую ДНКазу располагался в цитоплазматнческих структурах около мембраны или в контакте с ней, а при делении, как правило, рядом с септой-

Эти цитоплазм этические структуры мы рассматриваем как аналоги лизосом, а не истинные лнзосомы, т. к. у них отсутствует характерная отграничивающая мембрана. В связи с тем, что аналоги лизосом имеют примерно одинаковую локализацию с мезосомамн н довольно близко совпадают с ними по размерам, можно думать, что мезосомы исследуемых микроорганизмов выполняют и лнзосомальную функцию.

Б убитых микробах электронноплотные отложения, помимо аналогов лизосом, наблюдались и в цнтоплазматической мембране по всей ее длине, а в дезинтегрированных — вокруг микробных фрагментов, что может свидетельствовать о солюбн-лизирующем влиянии температурного и ультразвукового воздействия.

2. Ультра структур а к электронная цитохимия культуры макрофагов

По сравнению с исходными, через 3 суток культивирования макрофаги, как правило, увеличивались в размерах н приобретали вытянутую форму. В таких клетках цитоплазма содер-8

жала большое количество органоидов (митохондрий, лнзосом, пузырьков Гольджк, рибосом, полисом). Аппарат Гольджл отличался полиморфизмом, цистерны эндоплазматнческого ре-тнкулума приобретали иную ориентацию. На цнтоплазматпче-ской мембране выявлялось большое количество микровыростов.

В культуре макрофагов, полученных от предварительно стимулированных доноров, вне зависимости от используемой генетической линии мышей, отмечалось увеличение полиморфизма -аппарата Гольджи, появление небольшого количества лнпидных включений, а также вторичных лнзосом (мультнве-зикулярных телец н аутофаглческих вакуолей). Наряду с этим в перитонеальных макрофагах от мышей линии С57Вг (как ин-тактных, так и предварительно-стимулированных) наблюдалось большее количество митохондрий, обширные поля со свободными рибосомами и полнсомамн и более высокое развитие лчзосомального аппарата, чем в макрофагах от мышей линии СЗН, что подтверждает мнение приведенных выше авторов о генетической предопределенности лпзосомальной функции макрофагов. При электронноцнтохнмическом сравнении макрофагов мышей этих лнннй.была выявлена большая активность кислой фосфатазы и кислой ДНКазы в клетках от мм-шей^лннни С57Вг но сравнению с макрофагами от мышеи. СЗН, причем предварительная стимуляция животных повышала активность этих ферментов в клетках обоих линий, по не сглаживала отмеченные выше межлинейные различия исходной ферментативной активности.

На основании электронноцитохимического изучения лпзосомальной. функции макрофагов были выделены следующие клеточные модели, расположенные в порядке убывания активности кислой фосфатазы и кислой ДНКазы:

I — м.акрофагн от стимулированных мышей линии С57Вг,

II — макрофаги от иитактны.к мышей линии С57Вг,

Ш — макрофаги от стимулированных мышей линии СЗН,

IV — макрофаги от интактных мышей линии СЗН.

На каждой из этих моделей, отличающихся по исходному функциональному состоянию культуры макрофагов, проводилось изучение процесса взаимодействия с живыми, убитыми и дез интегрированными микроорганизмами (12 серий экспериментов).

3. Локализация и активность кислой фосфатаэы и кислой ДНКазы в макофагах от стимулированных мышей С57Вг при взаимодействии с микробным материалом в различном физическом состоянии

Через 5 минут от начала взаимодействия культуры макрофагов с живыми рожистыми микробами штамма ВР-2 последние обнаруживались в фагосомах и сохраняли свою конфигурацию. Отдельные цистерны гранулярного эндоилазматнчес-кого рстпкулума и ядерпоперннуклеарная зона расширялись; митохондрии с уплотненным матрнксом наблюдались и в зоне Гольджн. Лизосомы располагались вокруг аппарата Гольджн, многие цистерны которого были расширены. Активность кислой фосфатазы н кислой ДНКазы, локализованной в лизосо-мах и в некоторых пузырьках Гольджн, повышалась по сравнению с контрольной культурой клеток. Увеличение ультраструктур, содержащих продукты ферментативной реакции, н повышение активности исследуемых ферментов свидетельствовало о новообразовании первичных лнзосом на этом сроке наблюдения.

Через 1 час от начала фагоцитоза в мультивезнкулярных тельцах находились микробные фрагменты, окруженные гранулами фосфата свинца (продукт реакции на исследуемые ферменты). При этом в лнзосомах макрофагов активность кислой фосфатазы н кислой ДНКазы резко снижалась вследствие расхода гндролаз на деструкцию н переваривание микроорганизмов. В то же время в некоторых пузырьках Гольджн регистрировалась активность исследуемых ферментов, что указывает на начинающийся процесс рееннтеэа израсходованных ферментов. Наряду с изложенным наблюдалось усиление электронной плотности матрикса цистерн эндоплазм этического гранулярного ретнкулума и митохондрий, которые в отдельных участках контактировали с ядром, причем в местах такого контакта на наружной ядерной мембране имело место упорядоченное расположение рибосом, Электронная плотность матрикса нерннуклеарных зон при близком расположении мультивезнкулярных телец увеличивалась. В зонах скопления хроматина (вблизи внутренней ядерной оболочки) появлялись продукты реакции ira кислую ДНКазу.

Через 3 часа микробный материал в макрофагах не обнаруживался. Происходило наиболее резкое увеличение активности маркерных ферментов-в лнзосомах, расположенных довольно равномерно по нсей цитоплазме макрофагов. Количество лпзосом (первичных и вторичных) значительно увеличивалось. В митохондриях с уплотненным матрнксом уменьшалось количество крнст. Продукт реакции на кислую ДНКазу в вп-10

де крупных глыбок п конгломератов обнаруживался в зонах скопления хроматина по всему ядру, исключая ядрышко.

Через б часов активность исследуемых ферментов в лизосо-мах макрофагов понижалась, а в ядре продукт реакции на кислую ДНКазу не наблюдался- На этом сроке исследования отмечено появление большого количества различных по величине аутофагическнх вакуолей. Через 24 часа ферментативная активность в л изо сом ах макрофагов достигала исходного уровня.

При взаимодействии макрофагов этой клеточной модели с убитыми микроорганизмами картина наблюдаемых изменений в общих чертах соответствовала предыдущей, но подъемы и спады ферментативной активности на идентичных сроках наблюдения был» более сглажены. *

Через 1 час во вторичных лнзосомах выявлялись микробы, сохранившие свою форму. Активность исследуемых ферментов в лнзосомах снижалась, но определялась в пузырьках Гольд-жи. В зонах скопления хроматина, прилежащих к ядерной оболочке, отмечалось отложение продукта реакции на кислую ДНКазу менее выраженное, чем при взаимодействии с живыми микроорганизмами.

Через 3 часа в мультивезикулярных тельцах можно было наблюдать фрагменты микробов, напоминающие по своему виду фрагменты, полученные при ультразвуковом воздействии иа микробные тела. На этом же сроке наблюдения увеличивалась активность кислой ДНКазы в ядре.

Через 6 часов в исследуемых клетках микробы пли их фрагменты не встречались, активность кислой ДНКазы в ядре не регистрировалась. Активность лнзосомальных ферментов уменьшалась, восстанавливаясь до исходного уровня лишь к 72 часам наблюдения.

Фагоцитированный макрофагами данной клеточной модели микробный материал, дезинтегрированный с помощью ультразвука, вначале прослеживался в фагосомах, а затем — во вторичных лнзосомах в течение 6 часов наблюдения. Динамика активности лнзосомальных ферментов была принципиально той же по своему характеру, но еще более сглаженной. Это откосится также и к выявлению кислой ДНКазы в области ядра через 1—3 часа от начала контакта.

И

4. Локализация и активность кислой фосфатазы и кислой ДНКазы в макрофагах от интактных мышей С57Вг

при взимоденствии с микробным материалом в разком физическом состоянии

Через I час после фагоцитоза живых микроорганизмов во вторичных лизосомах макрофагов наблюдались как микробные фрагменты, так и измененные микробные клетки, а через 3 часа микробный материал не определялся.

Общий характер динамики лнзосомальной реакции соответствовал изменениям активности в макрофагах от стимулированных мышей этой же генетической линии при взаимодействии с живыми микробами, но был более сглаженным. После снижения ферментативной активности через 1 час, повышения через 3 часа отмечалось снижение ее к 24 часам почти до исходного уровня. К 72 часам наблюдения в цитоплазме макрофагов увеличивалось количество остаточных телец и мнелииоиодобных фигур-

Активность кислой ДНКазы в ядре появлялась через 1 час от начала фагоцитоза в виде отдельных гранул фосфата свинца, вблизи ядерной оболочки, а через 3 часа продукт реакции располагался в ядре в виде крупных гранул. Через б- часов ДНКазиая активность в ядре не прослеживалась.

При взаимодействии макрофагов этой клеточной модели с убитыми микробами через 5 минут от начала фагоцитоза мнк-робиые тела наблюдались в фагосомах, находящихся вблизи цнтонлазматической мембраны, а через I .час. — вокруг области Гольджн. Через 6 часоа в исследуемых макрофагах можно было видечь лишь фрагменты микробов в остаточных тельцах, а через 24 часа микробный материал в клетках не определялся.

Как и в соответствующих опытах предыдущей серии экспериментов, отмечалась та же тенденция к подъемам и спадам ферментативной активности на идентичных сроках наблюдения, но выраженная в меньшей сгепеин. Исходного уровня активность лизосомальных ферментов макрофагов достигала к 72 часам наблюдения.

ДНКазпая активность в области ядра прослеживалась начиная с одного часа наблюдения в виде отложений мелких гранул фосфата свинца в краевых зонах скопления хроматина, а также в перпнуклеарнои зоне.

Через 3 часа продукт реакции на ДНКазу выявлялся в зонах скопления хроматина в виде зерен, а через 0 часов — отсутствовал.

Фагоцитоз дезентегрировашшх микроорганизмов вызывал еще менее выраженную лнзосомальную реакцию, чем в соот-12

встствующнх опытах предыдущей серии экспериментов. Микробные фрагменты прослеживались вплоть до 24 часов наблюдения. Регистрировалась также ДНКазная активность в области ядра, по выраженная в небольшой степени, о чем можно было судить по количеству и величине гранул фосфата свинца.

5. Локализация и активность кислой фосфатазы и кислой

ДНКазы в макрофагах от стимулированных мышей СЗН

при взаимодействии с микробным материалом в различном физическом состоянии

При фагоцитозе жнвых микроорганизмов макрофагами этой клеточной модели микробные фрагменты и измененные микробные клетки в виде нечетких контуров наблюдались во вторичных лизосомах и через 3 часа от момента контакта. Убитые микробные клетки, изменившие свою конфигурацию, выявлялись в фаголизосомах через б часов, а через 24 часа определялись только фрагменты микробов. При фагоцитозе дезинтегрированных микроорганизмов микробные фрагменты наблюдались и через 72 часа (в основном в остаточных тельцах).

Таким образом, отмечалось удлинение сроков лизосомаль-ной деструкции микробного материала в макрофагах данной клеточкой модели по сравнению с иредыдущей-

Характер изменений ферментативной активности в макрофагах данной клеточной модели был принципиально аналогичен вышеописанному, но выражен в несколько меньшей степени. Так, через 5 минут отмечалось небольшое увеличение активности кислой фосфатазы и кислой ДНКазы в лизосомах по сравнению с контролем; через 1 час ферментативная активность снижалась в лизосомах, а в зоне ядра идентифицировалась активность кислой ДНКазы; через 3 часа также имел место подъем активности исследуемых ферментов с постепенной нормализацией ее к 72 часам наблюдения.

6. Локализация и активность кислой фосфатазы и кислой

ДНКазы в макрофагах от интактных мышей СЗН при взаимодействии с микробным материалом в различном физическом состоянии

Макрофаги этой клеточной модели имели самую низкую исходную активность исследуемых лизосомальных ферментов но сравнению с рассмотренными выше клеточными моделями. Как живые, так и убитые микроорганизмы наблюдались во вторичных лизосомах до б и 24 часов соответственно, а их фрагменты — и через 72 часа. Та же по характеру динамика

ферментагнвной активности в макрофагах данной клеточной модели претерпевала наименее выраженные колебания.

Таким образом, проведенные исследования показали, что, несмотря па генетическую предетермииированность лизосо-мальпого аппарата макрофагов, их функциональное состояние может быть изменено искусственным путем, например с помощью предварительной стимуляции животных.

От функциональных особенностей фагоцитирующих клеток, равно как и фагоцитируемых объектов, зависит степень выраженности лнзосомальной реакции.

Наиболее значительные ферментативные сдвиги отмечены в макрофагах от стимулированных мышей линии С57Вг> наименее выраженные — от ннтактных мышей линии СЗН. Живые микроорганизмы на всех изученных моделях вызывают более интенсивную лнзосомальную реакцию, чем убитые, н, тем более, дезинтегрированные. Наряду с этим выявлены общие закономерности лнзосомальной динамики макрофагов с различными исходными функциональными особенностями при г-заимодействни с микробными раздражителями одинаковой антигенной специфичности в разном физическом состоянии, чю свидетельствует о существовании единого, возможно сте- / реотннного механизма первичной энзнматической обработки \ антигенного материала. Обнаружено соответствие между выраженностью энзнматической активности и сроками внутрилн-зосомальион деструкции микроорганизмов или их фрагментов, т. е. получены доказательства участия лизосомальных ферментов в катаболизме фагоцитированного материала.

Показано, что этот процесс также определяется функциональными свойствами макрофагов и особенностями микробных раздражителей.

Вопрос о ДНКазной активности в области ядра в первые ч&сы взаимодействия макрофагов с рожистыми микробами ВР-2 в силу своей важности и сложности требует дальнейшего специального изучения.

ВЫВОДЫ

1. Субмнкроскопнческое строение вакцинного штамма ВР-2 возбудителя рожи свиней соответствует ультраструктур-поп организации г рам положительных бактерий.

2. Рожистые микробы вакцинного штамма ВР-2 содержат аналоги лизосом, идентифицируемые по тесту активности кислой фосфатазы и кислой ДН1\азы- В связанном виде эти гиа-ролнтнческпе ферменты локализуются также в цитоилазматн-ческой мембране живых микроорганизмов, солюбилизируясь в убитых и дезинтегрированных.

3. Макрофаги, полученные ог ннтактных п предварительно стимулированных мышей двух генетических линии (С57Бг и СЗН), могут быть подразделены на четыре клеточные модели, характеризующиеся определенным исходным уровнем активности лнзосомальных ферментов. Это же подразделение применимо и к 3-суточной культуре указанных макрофагов-

4. При взаимодействии используемых тест-микробов с лн-зосомальным аппаратом макрофагов различных клеточных моделей степень выраженности ферментативной активности их кислых гпдролаз определяется как особенностями микробного раздражителя, так к исходной функциональной активностью макрофагов.

5. Наиболее выраженные изменения активности изученных лнзосомальных ферментов в пределах каждой из использованных клеточных моделей наблюдаются при взаимодействии' с живыми микроорганизмами, менее выраженные—с убитыми и незначительные — с дезинтегрированными,

6. При фагоцитозе однотипных микробных раздражителей изменения активности лнзосомальных ферментов зависят от исходных функциональных способностей макрофагов, являясь наиболее выраженными при использовании в качестве доноров стимулированных мышей С57Вг, наименее выраженными — при получении макрофагов от ннтактных мышеи линии СЗН,

7. Наряду с вышеуказанным, лизосомальная реакция, возникающая при взаимодействии с тест-микробом, независимо от его физических свойств и исходного функционального состояния фагоцитирующих клеток, имеет одинаковый характер. Динамика эмзнматпческнх изменений заключается в подъеме активности изученных ферментов в первые минуты после контакта, наиболее резком падении ее-—через 1 час., наиболее высокой активизации — через 3 часа и постепенной нормализации в сроки, зависящие как от особенностей клеточной модели, так и от физических свойств фагоцитируемых объектов.

8. Энзнматнческая деструкция микробных тел или их фрат-ментов происходит тем быстрее, чем активнее реакция лнзосомальных ферментов.

9. Отработанная памп методика электроиномнкроскопичес-кого выявления локализации и активности маркерных ферментов лизосом эукариотнческнх и микробных клеток однотипными способами может быть рекомендована для проведения аналогичных исследований н с другими микроорганизмами с соответствующими коррективами, зависящими от их фнзнко-хн-мнческнх особенностей.

Список работ по теме диссертации:

1. Электроппогистохимпческое исследование раковых клеток. 7-я Всесоюзная конференция по электронной микроскопии тез, докл.), М„ 1971, 3, 87 (совместно с Н, Т. Райхлиным, Л. С, Шубиным и Н. А, Филипповой).

2. Электронногнстохимнческое исследование лнзосом в экспериментальных гепатомах с разной степенью днфференци-ровкп. Бюллетень эксперимент, биологии, 1972, 10, 81—84.

3. Ферменты лнзосом макрофагов в иммуногенезе. Ж* «Сельскохозяйственная биология», 1974, 9, 1, 128—137 (совместно с В, С. Гуткнным и Т. А, Феоктистовой).

4. Роль лнзосом макрофагов при завершенном фагоцитозе рожистого вакцинного штамма ВР-2. Труды ВИЭВ, 1975, том 43, 70—70 (совместно с В. С. Гуткнным, В. А. Горбатовым и Т. А. Феоктистовой).

Материалы диссертации доложены на II Всесоюзной конференции Совета по молекулярной биологии и генетике ВЛСХНИЛ (г. Одесса), нюнь 1974 г-, и на заседании Ученого совета ВИЭВ, декабрь, 1974 г.

Ответственный за выпуск — кандидат медицинских паук, старший научный сотрудник В. С. Гуткин.

Поди, б печ. 28, ¡V—75 г.

За к. 634 Тир. 200

Типография .Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академик им. К- И, Скрябина