Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и иммунологические механизмы патогенеза классической чумы свиней

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и иммунологические механизмы патогенеза классической чумы свиней"

На правах рукописи УДК 619:616.988.73-092

РГ6 0«

О 9 ФЕЗ 13^

ЮЩЕНКО Юлия Алексеевна

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

03.00.06. - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров,1997 год

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательсю институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВи] Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: Колонцов Александр Алексеевич,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ДШН М.А. (ВНИИВВиМ),

доктор ветеринарных наук, профессор БУРЛАКОВ В.А. (МГАВМиБ

Ведущая организация: : ВНИиТИБП (Щелково).

Защита состоится "19" февраля 1998г. в Ю часов на заседал диссертационного совета Д 120.61.01 по защите диссертаций соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском науч; исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиоло] РАСХН (601120, г. Покров Владимирской области, ВНИИВВиМ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " 6 «М/баря, 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук

Г.П.Федо]

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Со времени первого описания в 1830 году и до [ашнх дней классическая чума евшей (КЧС) представляет серьезную [роблему для свиноводства как в развивающихся, так и развитых странах с ффективной системой ветеринарно-санитарного надзора. Широкое тспространение и экономическое значение данной болезни послужило »сновой для ее постоянного изучения на протяжении последних [есятилетий в иммунологическом и патогенетических аспектах. С середины ¡0-х годов в результате применения подходов с использованием юноклональных антител и генноинженерных конструкций был достигнут ущественный прогресс в представлениях об иммунном ответе при КЧС [а молекулярном уровне. В то же время публикации по изучению [атогенеза КЧС с привлечением современных методов остаются весьма [емногочисленными. До сих пор окончательно неясна последовательность юбытий, инициируемых вирусной инфекцией и приводящих к видимым гатологическим провлениям. Фрагментарность данных о механизмах гатогенеза КЧС особенно заметна при сравнении с результатами 1сследований патогенеза модельного вирусного гепатита, церебральной яалярии, болезни Борна. Вместе с тем, несмотря на повсеместное грименение вакцин, эпизоотологическая ситуация в Российской Федерации характеризуется постоянной регистрацией случаев КЧС среди привитого юголовья [Куриннов В.В. и соавторы, 1992], причем причины их юзникновения не всегда понятны. Кроме того, описаны случаи неудачной щкцинации против КЧС, приведшие к массовой болезни и убою свиней Джупина С.И. и соавторы, 1995]. В связи с вышеизложенным федставляется весьма своевременным выявление тех стадий в шфекционном процессе, которые обладают патологическим потенциалом I реализацию которых впоследствии можно регулировать. Эти стадии логут опосредоваться компонентами, влияющими на гемостаз; тротеиназами, активными при нейтральном значении рН; медиаторами

воспаления; иммунологическими цитолитическими реакциями; реакциями ГЗТ.

1.2. Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в выявлении механизмов и реакций, инициирующих развитие патологических процессов при КЧС и участвующих в них.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- оценить активность протеолитических ферментов в лейкоцитах свиньи, зараженных вирусом КЧС;

- определить уровни активности фактора некроза опухолей в сыворотках крови инфицированных свиней, а так же способность зараженных лейкоцитов свиней секретировать данный медиатор;

- оценить уровни синтеза и секреции прокоагулянтных веществ в зараженных in vitro и in vivo лейкоцитах свиньи;

- охарактеризовать активность естественных киллеров при разных формах КЧС;

- изучить возможность индукции цитотоксических Т-лимфоцитов в организме свиней, инфицированных вирусом КЧС.

- охарактеризовать развитие гиперчувствительности замедленного типа при КЧС и определить возможность ее регуляции.

1.3. Научная новизна диссертационной работы заключается в том, что впервые охарактеризована реакция на инфицирование вирусом КЧС естественных мишеней - лейкоцитов свиньи - в плане синтеза и секреции ими патофизиологических медиаторов - прокоагулянтов, фактора некроза опухолей, протеолитических ферментов. Впервые показано, что вызываемый вирусом КЧС инфекционный процесс у подсвинков приводит к формированию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и эффекторо! гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Выявлена динамике активности естественных киллеров (ЕК) свиней при острой форме КЧС i вакцинации. Установлено, что нейтрализующие антитела в титрах обеспечивающих защиту вакцинированных подсвинков, не предохраняю:

вакцинированных иммуносупрессированных подсвинков от развития клинических признаков болезни после заражения вирулентным вирусом.

1 ^.Практическая значимость работы состоит в разработке методических указаний по тестированию медиаторов замедленного типа при классической чуме свиней. Методика определения активности протеиназ адаптирована к постановке в микроварианте; модифицированы методики определения фактора некроза опухолей и прокоагулянтов. Сформулированы предложения по конкретной реализации и использованию научных выводов.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

- новые данные о синтезе и секреции инфицированными вирусом КЧС лейкоцитами свиньи прокоагулянтов, фактора некроза опухолей и протеолитических ферментов;

- особенности формирования реакций клеточного иммунитета (действия ЦТЛ, ЕК , эффекторов ГЗТ) у свиней, инфицированных вирусом КЧС;

экспериментальное обоснование патофизиологической активности прокоагулянтных веществ и эффекторов ГЗТ при КЧС;

- схема реализующихся при КЧС биохимических и иммунологических механизмов с патофизиологическими проявлениями.

1.6. Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены на научно-практической конференции ВНИИВВиМ "КЧС-неотложные проблемы науки и практики" (Покров, 1994), заседании Ученого Совета ВНИИВВиМ (1996), представлены на республиканской научно-практической конференции по животноводству и ветеринарной медицине (Витебск, 1994), Всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995), 10 международном вирусологическом конгрессе (Иерусалим, 1996).

1.7. Публикация результатов исследований. Материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, вошедших в сборники тезисов

докладов перечисленных выше конференций, и в центральных журналах "Вопросы вирусологии" (1995, N4), "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология" (1995,N2; 1997,N3) и "Доклады Россельхозакадемии" (1996, N6).

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и рекомендации, список сокращений и обозначений, список литературы из 162 первоисточников и приложение. Диссертация содержит 14 таблиц и 25 рисунков.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

В работе использовали вирус КЧС, вирулентный штамм Ши-мынь, аттенуированный штамм Гудзон, вакцинные штаммы ЛК-ВНИВВиМ и ЛК-К, а также перевиваемые культуры клеток РК-15 (клетки почки поросенка), ПСГК (клетки почки сибирского горного козерога), ПТП (клеточная линия тестикул поросенка), К562 (клетки эритромиелобластов человека), БК-6 (клетки почки поросенка). Исследования проводили на подсвинках разных пород, возраста и пола живой массой не более 40 кг.

Лейкоциты выделяли центрифугированием из гепаринизированной крови свиней, отмывали от эритроцитов и инфицировали вирусом КЧС при множественности заражения не менее 0.001 ККИД50/МЛ. После инкубирования в течение 18-20 часов клетки лизировали замораживанием при -703 с последующим ресуспендированием в дистиллированной воде. Для анализа продуктов секреции использовали среду культивирования (среду Игла) инфицированных лейкоцитов.

Активность протеиназ определяли по приросту продуктов ферментативного гидролиза бычьего сывороточного альбумина в цветной реакции с нингидрином путем спектрофотометрирования. Активность кислой фосфатазы определяли по гидролизу р-нитро-фенилфосфата с последующим спектрофотометрированием в щелочной среде

бразовавшегося нитрофенола. Фактор некроза опухолей (ФНО) вотировали, радиометрически оценивая под воздействием исследуемых роб цитолиз клеток ПТП, обработанных актиномицином О. 1рокоагулянтную активность (ПКА) в клетках и в их среде ультивирования измеряли по сокращению времени полурекальцификации [итратной бестромбоцитарной плазмы свиней.

Активность ЦТЛ определяли, основываясь на радиометрической 1етодике выявления ЦТЛ при африканской чуме свиней [Шубина Н.Г. и оавторы, 1993], используя в качестве мишеней аутологичные гнфицированные лейкоциты. При оценке активности ЕК в качестве 1ишеней использовали клетки К562. Постановку реакции торможения шграции лейкоцитов (РТМЛ) осуществляли в капиллярном варианте. При гроведении кожного теста в качестве аллергена использовали гнактивированную солями меди вакцину против КЧС.

Определение инфекционной активности вируса КЧС, титров общих 1ирусспецифических и нейтрализующих антител выполняли с помощью )еакции окрашивания инфицированного монослоя зараженных клеток шмунопероксидазой.

Количественное определение белка осуществляли по методу >редфорд.

2.2. Результаты исследований

2.2.1 Выявление возможных патофизиологических реакций гейкоцитов свиньи на ранних стадиях инфекции, вызванной вирусом КЧС.

2.2.1.1. Оценка индукции и секреции протеолитических ферментов.

Для оценки . индукции нейтральных протеиназ сравнивали тротеолитическую активность в лизатах и среде культивирования гезараженных и зараженных вирусом КЧС лейкоцитов свиньи, при этом методика тестирования нейтральных протеиназ была адаптирована к постановке в микроварианте. При тестировании нейтральных протеиназ в тезараженных лейкоцитах от интактных свиней и в тех же лейкоцитах, инфицированных вирулентным штаммом Ши-мынь, выявлено достоверное

повышение средней удельной активности ферментов в зараженных клетках. Общий уровень активности фермента в лейкоцитах, инфицированных штаммом Ши-мынь, составлял 150-230% от общего уровня активности нейтральных протеиназ в незараженных клетках. При заражении лейкоцитов свиньи штаммом ЛК-К активность нейтральных протеиназ также повышалась в 1.85-3.7 раза в каждом отдельном опыте. Тестирование нейтральных протеиназ в инфицированных штаммами Ши-мынь и ЛК-К и в неинфицированных лейкоцитах иммунных свиней также выявило увеличение средней удельной активности ферментов после заражения. Для оценки секреции нейтральных протеиназ лейкоцитами свиньи использовали два приема. Согласно одному из них активность определяли в среде культивирования зараженных или незараженных клеток. В другом варианте с субстратом протеиназ инкубировали непосредственно неразрушенные инфицированные или неинфицированные лейкоциты. Ни в том, ни в другом случае секретно нейтральных протеиназ обнаружить не удалось. Аналогично не удалось выявить секрецию этих ферментов лейкоцитами, полученными от подсвинка в агональной стадии острой формы КЧС, вызванной штаммом Ши-мынь.

2.2.1.2. Тестирование ФНО.

Оценка трех систем для тестирования ФНО, включающих перевиваемые клеточные линии РК-15, ПТП и ПТП, обработанные актиномицином О, показала, что наиболее чувствительной системой для определения цитотоксических факторов свиных сывороток в наших опытах являлись клетки ПТП, обработанные актиномицином Б. Активность ФНО оценивали в сыворотках крови интактных подсвинков; подсвинков, иммунных к КЧС, а также в сыворотках крови подсвинков с острой формой КЧС в динамике. При острой форме КЧС с 4-х суток после заражения в сыворотках крови обнаружено незначительное по сравнению с нормой повышение активности цитотоксических факторов, выражающееся либо в увеличении их титров на одно двукратное разведение, либо в увеличении индексов цитотоксичности для всех соответствующих

> аз ведений сывороток. Однако, абсолютные значения титров не :оррелировали с иммунным статусом животных. ФНО выявляли в среде :ультивирования лейкоцитов свиней, инфицированных in vitro 1ирулентным штаммом Ши-мынь или вакцинным штаммом ЛК-К. (аражение клеток любым из этих штаммов не приводило к изменению фовней активности цитотоксических факторов в культуральных кидкостях. Как правило, ФНО либо не выявлялся вовсе, либо выявлялся •олько в конечном разведении 1:2 с умеренным уровнем цитолиза. Единственный случай выявления высокого уровня цитолиза («100%) габлюдали в присутствии среды культивирования лейкоцитов от кивотного с признаками хронической, не связанной с КЧС, инфекции гевыясненной этиологии.

2.2.1.3. Прокоагулянтная активность инфицированных лейкоцитов ;виньи.

На основании предварительных опытов и данных литературы, а гакже исходя из возможностей использованного спектрофотометра, были зыбраны экспериментальные условия (объемы и концентрация реагентов, температура) турбидиметрического определения времени толурекальцификации плазмы. Сравнение времени полурекальцификашш 1 л аз мы в присутствии лизатов лейкоцитов, полученных от иммунных :виней и зараженных in vitro, и лизатов неинфицированных лейкоцитов гех же животных выявило в трех независимых опытах повышение уровня ПКА в клетках при заражении их вирусом КЧС. ПКА индуцировалась в пейкоцитах, зараженных как вирулентным, так и вакцинным штаммами вируса. Время полурекальцификации плазмы в присутствии лизата лейкоцитов, инфицированных штаммами Ши-мынь и ЛК-К, уменьшалось соответственно на 15-56% и 15-41% по сравнению со временем коагуляции в присутствии лизата незараженных клеток. Время полурекальцификации плазмы в присутствии инфицированных клеток от интактных свиней также понижалось на 4-14% по сравнению со временем свертывания в присутствии неинфицированных клеток. Секрецию ПКА свиными

лейкоцитами оценивали, сравнивая время полурекальцификации плазмы в присутствии диализованной против дистиллированной воды среды культивирования незараженных и зараженных вирусом КЧС клеток со времёнем полурекальцификации плазмы в присутствии воды. Оказалось, что инфицирование вирусом КЧС лейкоцитов свиньи приводит к увеличению уровней ПКА в среде их культивирования. Так, время полурекальцификации плазмы в присутствии среды культивирования зараженных лейкоцитов понижалось на 7-27% по сравнению со временем коагуляции в присутствии надосадков незараженных культивируемых клеток. Этот эффект наблюдали для культуральных жидкостей лейкоцитов, полученных от интактных и иммунных подсвинков и зараженных in vitro как вирулентным, так и вакцинным штаммами вируса КЧС. Уровни ПКА оценивали в лейкоцитах свиней с различными иммунологическими характеристиками (интактные, иммунные, в предагональной стадии острой формы, иммунные и иммуносупрессированные циклофосфамидом). Не обнаружено очевидной связи между временем свертывания плазмы в данных опытах и иммунным статусом использованных животных. Парные пробы при этом не исследовались. Для определения динамики ПКА в лейкоцитах свиней при инфекционном процессе in vivo проводили опыт на 4-х подсвинках (П-й, Б-й, М-м, Ч-н). Подсвинков П-й и Б-й вакцинировали 6x103 ККИД50 штамма JIK-K и на 19 сутки после вакцинации всех животных заражали 4,8 lgJ^so вирулентного штамма Ши-мынь. У животных несколько раз до вакцинации, после вакцинации, на 4 сутки после контрольного заражения и при обескровливании отбирали пробы гепаринизированной и цитратной крови, из которых соответственно выделяли лейкоциты и получали бестромбоцитарную плазму. Лейкоциты и плазму хранили при -70° и определяли ПКА в клетках и время полурекальцификации плазмы одновременно во всех пробах, полученных от отдельно взятого подсвинка. При острой форме КЧС зарегистрировано достоверное повышение уровней ПКА в лейкоцитах крови свиней на 4 сутки после заражения. Время полурекальцификации плазмы в присутствии

тизата лейкоцитов в конечной концентрации 150 мкг/мл, полученных в этот срок от зараженных подсвинков, уменьшалось в среднем на 49 и 17% юответственно при использовании клеток подсвинков Ч-н и М-м. Аналогично, в присутствии лизатов этих же лейкоцитов в конечной концентрации 75 мкг/мл время полурекальцификации плазмы уменьшалось з среднем на 34 и 32% . К 7-8 суткам после заражения ПКА лейкоцитов тодсвинков Ч-н и М-м возвращалось к уровням, наблюдаемым у них в горме. У вакцинированных и контрольно зараженных подсвинков П-й и Б-г колебания уровней ПКА после иммунизации и инфицирования вирулентным штаммом не выходили за границы значении ПКА, эпределенных в разные сроки до вакцинации. При определении времени полурекальцификации бестромбоцитарной плазмы подсвинков, этобранной на разных стадиях опыта, выявлены значительные колебания абсолютных величин для проб, полученных в разные сроки от интактных животных. Интересно, что в норме у всех 4-х подсвинков значения времени ввертывания плазмы изменялись параллельно. Однако, оценка характера изменения времени полурекальцификации плазмы с учетом данных, полученных после контрольного заражения, выявила прямо противоположные тенденции для плазмы подсвинков с острой формой КЧС и плазмы подсвинков, не реагировавших на контрольное заражение. Наблюдаемое в первом случае увеличение времени полурекальцификации бестромбоцитарной плазмы вероятно свидетельствует об истощении растворимых прокоагулянтов в крови к моменту гибели свиней.

2.2.1.4. Оценка активации моноядерных клеток, зараженных in vitro.

Критерием активации макрофагов/моноцитов служило повышение активности кислой фосфатазы в клеточных лизатах. Активность фермента определяли в незараженных и зараженных штаммами Ши-мынь и JIK-ВНИИВВиМ лейкоцитах свиньи. Удельная активность кислой фосфатазы в клетках, зараженных штаммом Ши-мынь, была на 20-40% выше, чем в контроле. Аналогичный уровень активации фермента был обнаружен и при инфицировании клеток вакцинным штаммом JIK-ВНИИВВиМ. При

заражении in vitro лейкоцитов, полученных от иммунных к КЧС животных, также регистрировали активацию кислой фосфатазы на 17-150% в случае инфицирования штаммом Ши-мынь и на 44-95% в случае инфицирования штаммом ЛК-ВНИИВВиМ.

2.3.2. Выявление и характеристика клеточных эффекторов цитолитических иммунологических реакций.

2.3.2.1. Выявление ЦТЛ при КЧС.

Активность ЦТЛ тестировали у 4-х подсвинков с различным иммунным статусом. Одного из них (А) вакцинировали 10-кратной иммунизирующей дозой штамма ЛК-ВНИИВВиМ и на седьмые сутки выделяли из его крови лейкоциты и лимфоциты, которые хранили при -70° до использования. После размораживания зараженные и незараженные лейкоциты использовали в качестве мишеней, а лимфоциты - в качестве эффекторов. Подсвинка В иммунизировали 10-кратной иммунизирующей дозой штамма Гудзон и на 35 сутки после иммунизации выделяли из его крови лейкоциты, которые использовали в качестве клеток-мишеней. В этот же день подсвинка заражали 1х104 ЛД50 штамма Ши-мынь. Лимфоциты крови, выделенные на 39 день после иммунизации и соответственно на 4 сутки после заражения, служили клетками-эффекторами. Подсвинка С вакцинировали штаммом ЛК-ВНИИВВиМ и через 2 недели заражали 1x104 ЛД50 штамма Ши-мынь и еще через 17 дней - 1х106 ККИД50 штамма Ши-мынь. Непосредственно перед вторым инфицированием выделяли лейкоциты крови, которые использовали в качестве клеток-мишеней. Лимфоциты крови, выделенные через 2 дня после второго инфицирования, служили клетками-эффекторами. Подсвинка D (интактного) заражали штаммом Ши-мынь в дозе 6x104 ЛД5о/голову. Клетками-мишенями служили лейкоциты крови, отобранной до заражения, клетками-эффекторами - лимфоциты, полученные от подсвинка в преагональной стадии на 8 сутки после заражения. Лимфоциты всех трех иммунизированных животных, а так же подсвинка с острой формой КЧС, оказались способны эффективно лизировать

и

зараженные мишени, хотя в некоторых случаях наблюдали лизис незараженных лейкоцитов. Однако, индексы цитотоксичности с незараженными мишенями при одинаковом соотношении эффекторов и мишеней во всех опытах были ниже, чем с зараженными. Лимфоциты нормального (интактного) подсвинка, а также иммунных свиней в отдаленные сроки после иммунизации (более 6 месяцев) не вызывали лизиса зараженных аутологичных лейкоцитов.

2.3.2.2. Определение активности ЕК.

В качестве клеток-эффекторов, обладающих активностью ЕК, использовали нефракционированные лейкоциты крови свиней. В опытах по определению цитолитической активности лейкоцитов вакцинированных подсвинков в отношении аутологичных мишеней четырех подсвинков вакцинировали 10-кратной иммунизирующей дозой штамма ЛК-ВНИИВВиМ, двум из них одновременно вводили циклофосфамид из расчета 50 мг на кг массы. На 3 и 4 сутки после иммунизации определяли способность лейкоцитов крови этих подсвинков лизировать аутологичные мишени. В качестве мишеней использовали лейкоциты крови, полученные в те же сроки ( на 3 и 4 сутки после иммунизации ) и зараженные или незараженные штаммом Ши-мынь вируса КЧС. До инфицирования и постановки реакции клетки хранили при -70°. Лейкоциты иммунизированных животных лизировали в значительно большей степени зараженные аутологичные мишени по сравнению с незараженными. В случае введения одновременно с вакциной иммунодепрессанта лейкоциты иммунизированных животных не вызывали цитолиза аутологичных клеток-мишеней. Для оценки активности ЕК у вакцинированных подсвинков двух животных (N1 и N2) инокулировали 10 кратной иммунизирующей дозой штамма Гудзон вируса КЧС и в различные сроки в течение месяца тестировали цитолитическую активность лейкоцитов крови в отношении клеток К562. У обоих подсвинков наблюдали одинаковую динамику активности ЕК. Так, на вторые сутки после иммунизации отмечали повышение активности,

затем некоторое снижение на 7 сутки с дальнейшим подъемом на 14 сутки. К 30 суткам после иммунизации показатели активности ЕК приближались к таковым, выявленным до иммунизации. Обнаруженной динамике соответствуют результаты, полученные при определении активности ЕК еще у двух животных, иммунизированных 10-кратной иммунизирующей дозой штамма Гудзон. Лейкоциты крови подсвинка N4 при соотношении клеток-эффекторов к клеткам-мишеням 12:1 на 0,2 и 7 сутки после иммунизации вызывали цитолиз мишеней соответственно на -4.3; 45 и 56%. Лейкоциты подсвинка N5 при том же соотношении эффекторов и мишеней на 2 и 35 сутки после иммунизации вызывали цитолиз мишеней соответственно на 62 и -9%. У подсвинков отмечали повышение температуры тела до 40.0-40.4° на 2-4 сутки после иммунизации; подсвинок N4 пал на 12 день. В опытах по тестированию активности ЕК у вакцинированных подсвинков, подвергнутых иммуносупрессии, двух подсвинков (N6 и N7) иммунизировали однократной иммунизирующей дозой штамма Гудзон и одновременно с иммунизацией внутримышечно вводили циклофосфамид в дозе 50 мг на кг массы. Введение иммунодепрессанта повторили через 6 дней. В различные сроки в течение 35 дней у животных оценивали ЕК крови. У обоих животных регистрировали сходные изменения. Так, на фоне вакцинального процесса и первое, и второе введение циклофосфамида приводило к падению активности ЕК крови. У подсвинка N8, иммунизированного и иммуносупрессированного идентично подсвинкам N6 и N7, обнаружено аналогичное уменьшение активности ЕК. Лейкоциты его крови при соотношении клеток-эффекторов к клеткам-мишеням 25:1 на 0 и 3 сутки после иммунизации и первого введения циклофосфамида вызывали цитолиз мишеней соответственно на 44 и 7%. У подсвинков с 4 суток после иммунизации наблюдали повышение температуры тела до 40.240.6° ; подсвинок N8 пал на 14 день. При оценке активности ЕК у подсвинков с острой формой КЧС двух подсвинков (N96 и N97) внутримышечно заражали 1х104 ЛД вирулентного штамма Ши-мынь. У

обоих животных развилась острая форма КЧС с летальным исходом: подсвинки пали соответственно на 12 и 14 сутки после инфицирования. До заражения, на 3 и 7 сутки после заражения оценивали активность ЕК крови. У обоих животных отмечена динамика активности ЕК угасающего типа. Реализация при КЧС иммунных цитолитических реакций (действия ЦТЛ и ЕК) в целом свидетельствует о вирусспецифической антигенной модуляции плазматической мембраны лейкоцитов свиней в процессе вирусной инфекции.

2.3.3. Характеристика развития ГЗТ при КЧС.

Оценку ГЗТ проводили в РТМЛ с клетками крови животных с разными формами болезни. Пятерых интактных подсвинков заражали внутримышечно вирулентным штаммом Ши-мынь вируса КЧС в дозе 4.04.8 ^ ККИДбо/мл. У всех подсвинков развилась острая форма болезни. Со 2-3 суток регистрировали подъем температуры свыше 40°, угнетение, отказ от корма, слабость. Животные были обескровлены в предагональном состоянии на 7-8 сутки после заражения. РТМЛ с клетками этих животных ставили в присутствии 30% стандартной инактивированной прогреванием в течении 30 минут при 56° сыворотки от интактного подсвинка. У двух подсвинков (N96 и N97) ТМЛ оценивали на 3 и 7 сутки после заражения, а у остальных (N2-7492, Ч-н, М-м) только при тотальном обескровливании. На третьи сутки после заражения у подсвинков N96 и N97 регистрировали ТМЛ на 65-86% по сравнению с миграцией клеток до заражения, а на 7 сутки после заражения у этих животных наблюдали восстановление мигрирующей способности лейкоцитов до исходных, регистрировавшихся перед инфицированием, значений (норма). Аналогично, у подсвинка М-м на 8 сутки после заражения так же не обнаружено ТМЛ по сравнению с нормой. В противоположность этому, у подсвинков N2-7492 и Ч-н на 7 сутки после заражения выявляли значительное (65%) ТМЛ по сравнению с миграцией лейкоцитов до заражения. У двух подсвинков (М-м, Ч-н), помимо тестирования ТМЛ со стандартной гомологичной сывороткой, реакцию дополнительно ставили в присутствии аутологичной

неинактивированной сыворотки, отобранной в день постановки РТМЛ. Полученные данные соответствовали результатам оценки ТМЛ в присутствии стандартной гомологичной сыворотки. Развитие ГЗТ оценивали при иммунизации животных реактогенным штаммом Гудзон вируса КЧС. Подсвинку N5/11 ввели 10-кратную иммунизирующую дозу вирусвакцины против КЧС из штамма Гудзон. Со 2-х суток после введения вируса в течении 5 дней отмечали температурную реакцию на уровне 40.1°-40.5°. Миграция лейкоцитов на 2, 7 и 14 сутки после заражения не отличалась от нормальных значений более чем на 36% в ту или иную сторону, а максимальная обнаруженная величина ТМЛ составляла 26%. Подсвинка Нп инфицировали кровью, отобранной при максимальной температурной реакции от животного, инокулированного 1 иммунизирующей дозой штамма Гудзон. На момент обескровливания (7 сутки) при выраженной клинической картине болезни с температурой 41° ТМЛ составило 67%. Подсвинка МЮЛИ инфицировали 1 иммунизирующей дозой штамма Гудзон. Одновременно с иммунизированием и повторно через 6 дней животному вводили иммунодепрессант циклофосфан из расчета 50 мг/кг. У подсвинка развилась болезнь с летальным исходом на 14 сутки. РТМЛ ставили на 3 сутки после заражения и на момент гибели. В последнем случае наблюдали существенное ТМЛ (75%) по сравнению с нормой. Развитие ГЗТ оценивали у иммунных к КЧС подсвинков после заражения вирулентным штаммом Ши-мынь. Двух подсвинков (N1-7492 и N4-7492) пассивно иммунизировали специфической сывороткой против КЧС, причем второму из них одновременно ввели 104ККИД50/мл штамма ЛК-ВНИИВВиМ. Через 2 месяца после иммунизации подсвинков заразили вирулентным штаммом Ши-мынь. У подсвинка N1-7492 наблюдали более выраженную температурную реакцию на контрольное заражение и более выраженное ТМЛ на 7 сутки после заражения по сравнению с подсвинком N4-7492. У этого животного миграционная способность лейкоцитов нормализовалась к 14 суткам, а у подсвинка N4-7492 регистрировали усиление миграции

лейкоцитов на 62%. Подсвинок Б-й был ировакцинирован 10-кратной иммунизирующей дозой вирусвакцины против КЧС из штамма ЛК-К и через 15 дней был заражен вирулентным штаммом Ши-мынь в дозе 4.81g ККИД50. Реакции на контрольное заражение не отмечено, а показатель ТМЛ на 7 сутки находился в пределах нормы. Для тестирования медиаторов ГЗТ при КЧС, в частности ФТМЛ в свиных сыворотках, использовали предложенный нами вариант постановки РТМЛ. В опытах оценивали сыворотки крови от животных с острой формой КЧС, отобранные непосредственно перед гибелью (N160192, 150492, 220493). Кроме того, была протестирована сыворотка крови привитого инактивированным материалом и в последствии зараженного штаммом Ши-мынь подсвинка, выжившего после переболевания (N290192). Реакцию ставили в присутствии 30% тестируемой сыворотки. По сравнению с нормальной гомологичной сывороткой, сыворотки от больных животных тормозили миграцию нормальных лейкоцитов на 37-89%, что свидетельствует о присутствии в них ФТМЛ. Сыворотка N150492 по сравнению с сывороткой, отобранной от того же животного до заражения штаммом Ши-мынь ("предиммунной"), вызывала торможение миграции лейкоцитов в тех же пределах (более 30%). ФТМЛ выявляли в сыворотках двух подсвинков (N96,N97) с острой формой КЧС, отобранных на 3 сутки после заражения, в РТМЛ с 10% тестируемой сыворотки. Уровни ТМЛ составили 25-38%. Сыворотки, полученные перед гибелью животных с острой формой болезни, в этой концентрации (10%) вызывали торможение миграции нормальных лейкоцитов на уровне 29-57%о.

2.3.4. Воздействие иммуномодуляторов Т-клеточных реакций на течение КЧС у интактных и иммунных свиней.

С целью определения воздействия иммуномодуляторов Т-клеточных реакций на течение КЧС у животных с различным иммунным статусом проводили опыт на подсвинках иммунных к КЧС (БМ, П, Ч, БД) и неиммунных (N18, N40). Подсвинков Ч, БД и N40 иммуносупрессировали введением циклофосфана в общей дозе 4, 4 и 2 г , соответственно.

Подсвинков П, Ч, БД заражали в/м штаммом Ши-мынь в дозе 4.8 ЛД5о/голову, а подсвинков N18 и N40 - в дозе 3.8 ^ ЛДбо/голову. Иммунного подсвинка БМ использовали в качестве контроля. У неиммунных к КЧС подсвинков N18 и N40 со вторых суток отмечали подъем температуры, слабость, отказ от корма. В дальнейшем у животных наблюдали выраженную клиническую картину течения болезни. Подсвинок N40 (иммуносупрессированный циклофосфаном) пал на 7 сутки после заражения. Подсвинок N18 был обескровлен на 8 сутки после заражения в предагональном состоянии, характеризовавшемся снижением температуры до 39.1°. У иммунных, иммуносупрессированных и зараженных подсвинков Ч и БД на 4 сутки после заражения регистрировали подъем температуры до 40.2-40.8°. На 5 сутки животные с трудом передвигались, у них наблюдали общую слабость и потерю аппетита. Болезнь продолжалась в течении 5 дней, но к 10 суткам после заражения у подсвинков нормализовалась температура и исчезли клинические признаки. Иммунный несупрессированный подсвинок П не реагировал на контрольное заражение. В ходе опыта у животных определяли уровни общих специфических и нейтрализующих антител и уровни виремии, оценивали развитие ГЗТ в различных вариантах РТМЛ и кожном тесте, а также измеряли активность ФНО в сыворотках крови. До заражения титры общих специфических антител у подсвинков П,Ч и БД составляли соответственно 1:20, 1:40 и 1:20. В реакции нейтрализации антитела у этих же животных достигали титров 1:256, 1:256 и1:512. После заражения у подсвинка П наблюдали увеличение титра нейтрализующих антител, причем на 11 сутки после введения вирулентного штамма Ши-мынь вируса КЧС титр возрастал до 1:512, а к 20 суткам превосходил 1:1024. Титры общих специфических антител у подсвинка П в эти сроки составляли 1:40 и 1:20. У подсвинка Ч титры нейтрализующих и общих специфических антител оставались на одном и том же уровне ( 1:256 для нейтрализующих антител и 1:20 для общих специфических антител). У подсвинка БД на 11 сутки после заражения регистрировали падение титра нейтрализующих

антител до 1:128, однако к 20 суткам его величина возрастала более, чем до 1:1024. Титры общих специфических антител у подсвинка БД в эти сроки составляли 1:20 и 1:40. У подсвинков П, БД и Ч не удалось выделить вирус КЧС из крови на 4 и 7 сутки после заражения. В то же время у неиммунного и контрольно зараженного подсвинка N18 после инфицирования титр вируса в крови на 4 сутки превышал 4.2 ККИДзо/мл, а на 7 сутки - 3.7 1ц ККИД50/МЛ. У неиммунного, иммуносупрессированного и контрольно зараженного подсвинка N40 после инфицирования титр вируса в крови на 4 сутки превышал 2.7 ^ ККИД50/МЛ, а на 7 сутки - 4.7 [5 ККИДй/мл. В сыворотках крови, отобранных до заражения подсвинков П, БД и Ч, а также на 4, 11 и 20 сутки после заражения определяли активность ФНО. У подсвинков БД и Ч не зарегистрировано значительных изменений уровней активности в динамике: титры снижались не более, чем на 2 ^2. В целом, в сыворотках крови всех животных наблюдалась тенденция к падению титров ФНО со временем. ФТМЛ тестировали в сыворотках крови, отобранных у подсвинков до заражения и в различные сроки после заражения, оценивая воздействие данных сывороток на миграционную способность лейкоцитов контрольного подсвинка БМ . Оказалось, что ФТМЛ присутствует в сыворотках крови, отобранных в поздние сроки при летальной инфекции. Развитие ГЗТ тестировали в реакции ТМЛ крови подопытных животных. В качестве контроля использовали подсвинка БМ, не подвергавшегося ни иммуносупрессии, ни заражению вирулентным штаммом Ши-мынь. Сравнение результатов ТМЛ всех животных в данном эксперименте проводили относительно ТМЛ этого подсвинка, полагая, что на миграцию его лейкоцитов в течении всего опыта не оказывалось какого-либо воздействия. Предварительно несколько раз (2-5) ставили РТМЛ с клетками всех подсвинков до введения циклофосфана и контрольного заражения. Полученные величины площадей миграции лейкоцитов подсвинков П, БД, Ч, N18 и N40 нормализовали относительно соответствующих площадей миграции лейкоцитов подсвинка БМ и рассчитывали средние нормальные значения миграции каждого подсвинка.

Аналогично определяли величины миграции лейкоцитов у всех животных после заражения вирулентным вирусом. На 11 сутки после заражения у подсвинков Ч и БД наблюдали торможение миграции лейкоцитов соответственно на 48% и 60% относительно средних нормальных значений. Способность к миграции восстанавливалась у подсвинка Ч к 20 суткам, тогда как у подсвинка БД она все еще составляла 48%) от нормы. У неиммунного подсвинка N18 с развившейся в результате заражения штаммом Ши-мынь острой формой КЧС к 4-м суткам после инфицирования зарегистрировано снижение миграционной способности лейкоцитов на 43%. Однако, непосредственно перед гибелью выявлено ее восстановление как и в случае с подсвинками N96 и N97 (с острой формой КЧС), описанными в разделе 2.3.3. У подсвинков N40 и Ч, иммуносупрессированных введением циклофосфана, на 4 сутки после заражения наблюдали сильную лейкопению, не позволившую выделить достаточное количество клеток для постановки реакции из более чем 50 мл крови. Результаты, полученные в РТМЛ подсвинка П, не дали возможности однозначно судить о динамике ГЗТ у этого животного после контрольного заражения. На 5 сутки после заражения развитие ГЗТ у всех подопытных подсвинков оценивали в кожном тесте. Судя по данным кожного теста, наибольшей сенсибилизацией отличался подсвинок БД, что соответствует результатам оценки его сенсибилизации в РТМЛ.

В целом на основании собственных результатов и данных литературы можно проследить последовательность событий, развивающихся после заражения клеток-мишеней в организме свиньи вирулентным вирусом и приводящих к патологическим проявлениям. Соответствующая схема реализующихся при КЧС биохимических и иммунологических механизмов, имеющих отношение к патогенезу этой болезни, представлена на рис.1. Вследствие проникновения вируса КЧС в клеточные мишени и вирусной репродукции на начальной стадии инфекции происходят

вирусиндуцированные биохимические изменения в клетках моноцитарно-макрофагального ряда, выражающиеся в антигенной модуляции

плазматической мембраны, активации протеиназ, а также в синтезе и секреции прокоагулянтных веществ. Антигенная модуляция плазматической мембраны мишеней вируса КЧС, являющихся антигенпредставляющими клетками, способствует развитию реакций ГЗТ, причем ее эфферентная стадия проявляется у животных с 3 суток после заражения. Чрезмерное проявление эффектов, связанных с ГЗТ, в том числе повышенный синтез медиаторов типа ФТМЛ, приводит на поздних стадиях болезни к гипервоспалению, образованию геморрагий и некрозам, несмотря на то, что к этому сроку иногда образуются Т-супрессоры ГЗТ. В это же время неспецифическое разрушение тканей обусловливает повышение уровня химотрипсина в крови свиней. Прогрессивное снижите активности ЕК в крови с 3 суток после заражения может отягощать течение болезни. Образование прокоагулянтных веществ в зараженных клетках и их поступление в кровоток инициирует реакции свертывания крови по внешнему пути. Последовательно осуществляются две фазы развития ДВС-синдрома, состоящие в повсеместном внутрисосудистой коагуляции крови с нарушением микроциркуляции в органах и последующем истощении механизмов гемостаза с неконтролируемыми кровотечениями. Активация протеиназ в инфицированных клетках, в том числе и В-лимфобластах, может быть связана с феноменом апоптоза и определять их истощение в зародышевых центрах лимфоидных органов. Этот процесс может усугубляться их разрушением под действием ЦТЛ, обнаруживаемых при острой форме болезни непосредственно перед гибелью животных. Реализация и взаимодействие перечисленных биохимических и иммунологических реакций и механизмов приводят к летальному исходу при острой форме КЧС с характерной патоморфологической картиной. В качестве ключевых моментов в патогенезе этой болезни можно рассматривать индукцию и секрецию прокоагулянтов в зараженных клетках, инициирующие развитие ДВС-синдрома, и формирование эффекторов ГЗТ, опосредующих гипервоспалительную реакцию.

Рис.1. Схема реализации при КЧС биохимических и иммунологических механизмов с патофизиологическими проявлениями.

21

З.ВЫВОДЫ.

1. Механизмами, инициирующими патологические процессы при классической чуме свиней и участвующими в них, являются индукция и секреция прокоагулянтных веществ зараженными лейкоцитами, а также гиперчувствительность замедленного типа.

2. При острой форме классической чумы свиней развитие клинических признаков совпадает с активизацией прокоагулянтных веществ в лейкоцитах крови. В лейкоцитах свиньи, инфицированных in vitro вирусом классической чумы, индуцируются повышенные уровни прокоагулянтной активности. Инфицированные лейкоциты свиньи по сравнению с неинфицированными клетками секретируют в среду культивирования повышенные уровни прокоагулянтной активности.

3. При классической чуме свиней степень проявления гиперчувствительности замедленного типа коррелирует с исходом болезни. У павших животных в различные сроки после инфицирования торможение миграции лейкоцитов превышает 65%.

4. Иммуносупрессирование циклофосфаном иммунизированных свиней с высокими титрами (>1:256) нейтрализующих антител при последующем заражении вирусом классической чумы приводит к возникновению болезни. Патогенетические проявления в этом случае совпадают с активизацией реакций гиперчувствительности замедленного типа.

5. Инфицирование in vitro вирусом классической чумы свиней лейкоцитов свиньи не приводит к повышенной секреции фактора некроза опухолей в среду культивирования клеток. В сыворотках животных с острой формой болезни с 4-х суток после заражения активность цитотоксических факторов повышается незначительно. Фактор некроза опухолей не играет решающей роли в патогенезе классической чумы свиней.

6. Инфицирование in vitro вирусом классической чумы свиней лейкоцитов свиньи приводит к активации гемопоэтических клеток, судя по

повышению в них удельной активности протеиназ и кислой фосфатазы. Секреция индуцированных при вирусной инфекции протеиназ не определяет развития патогенетических реакций при классической чуме свиней ввиду отсутствия протеолитической активности в среде культивирования инфицированных лейкоцитов.

7. Изменения активности протеиназ, кислой фосфатазы, фактора некроза опухолей и прокоагулянтов в зараженных in vitro вирусом классической чумы лейкоцитах свиньи и среде культивирования этих клеток не зависят от вирулентности инфицирующего штамма. В инфицированных in vitro лейкоцитах интактных и иммунных подсвинков изменения активности вышеназванных ферментов и медиаторов воспаления носят аналогичный характер.

8. При классической чуме в организме свиньи формируются вирусспецифические цитотоксические лимфоциты, обнаруживаемые в реакции цитолиза аутологичных, инфицированных in vitro, лейкоцитов. Судя по результатам данной реакции, а так же лизису этих же мишеней естественными киллерами, инфицирование вирусом классической чумы свиней лейкоцитов свиньи приводит к антигенной модуляции их плазматических мембран.

4.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные методические указания по тестированию медиаторов гиперчувствительности замедленного типа при классической и африканской чуме свиней, утвержденные директором ВНИИВВиМ 25 ноября 1994 года, предлагается использовать для выявления медиаторов ГЗТ у подсвинков, вакцинированных или инфицированных вирусом КЧС, с целью оценки одного из параметров иммунного статуса (сенсибилизации) животных. Разработанный микровариант определения активности протеиназ предлагается использовать для быстрой, простой и экономичной количественной характеристики протеолитической активности клеточных препаратов. При тестировании активности фактора некроза опухолей в качестве новых клеток-мишеней рекомендуется применять

распространенные в исследованиях по ветеринарной медицине клетки ПТП, обработанные актиномицином D. Для оценки активности прокоагулянтных веществ предлагается использовать вариант методики, адаптированный для полуавтоматического учета результатов.

Научные выводы и результаты диссертации могут быть использованы для формулировки нескольких перспективных направлений исследований, и пути их конкретной реализации предполагают разработку вакцин, стимулирующих образование специфических к вирусу КЧС ЦТЛ, для иммунизации подсвинков с колостральными специфическими антителами; проведение исследований по оценке роли ФНО, индуцируемого бактериальными инфекциями, в отягощении вакцинального процесса против КЧС; проведение исследований по конкретизации условий иммуносупрессии, приводящей к возможности возникновения КЧС у вакцинированных животных. Два последних направления нацелены на выявление параметров иммунного статуса подсвинков, препятствующих проведению успешной вакцинопрофилактики, и оценка которых позволила бы в ряде случаев снять вопросы об эффективности используемых вакцин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шубина Н.Г., Песковацков A.A., Ющенко Ю.А., Колонцов А,А. Гиперчувствительность замедленного типа при классической чуме свиней. // Мат. Респ. научн.-практ. конф. по животноводству и ветеринарной медицине 921-22 сентября 1994 г.), Витебск, 1994. - С.80.

2. Шубина Н.Г., Гусев A.A., Толокнов À.C., Захаров В.М., Рыбакова С.А., Лобачева С.Б., Бьядовская О.П., Юшенко Ю.А., Колонцов A.A., Макаров В.В. Естественные киллеры и цитотоксические лимфоциты при классической чуме свиней. //Вопр. вирусол. - 1995. - N4. - С. 182-186.

3. Ющенко Ю.А. Активация кислой фосфатазы в лейкоцитах, зхараженных вирусом классической чумы свиней. // Акт. вопр. вет. вирусол., Мат. научн.-практ. конф. ВНИИВВиМ "Классическая чума

свиней- неотложные проблемы науки и практики", 9-11 ноября 1994 г., Покров, 1995. -С.76.

4. Ющенко Ю.А., Колонцов A.A., Шубина Н.Г., Витин В.Г. Определение активности нейтральных протеиназ в свиных лейкоцитах, зараженных вирусом классической чумы свиней. // Вирусн. болезни с.-х. животных, Тез. докл. Всерос. научн.-практ. конф., 17-21 апреля 1995 г., Владимир, 1995. - С.27.

5. Колонцов A.A., Ющенко Ю.А. Иммунные реакции имеханизмы при классической чуме свиней. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1995. - N2. - С. 18-20.

6. Kolontsov A.A., Shubina N.G., Yuschenko Y.A., Makarov Y.V. Classical swine fever: cell-mediated immunity. // Xth Intern. Congr. of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996. - PW04-21, P.111.

7. Шубина Н.Г., Ющенко Ю.А., Колонцов A.A. Тестирование факторов некроза опухолей (цитотоксических факторов) при классической чуме свиней. //Докл. Россельхозакадемии. - 1996. - N6. - С.39-41.

8. Ющенко Ю.А., Колонцов A.A., Шубина Н.Г., Витин В.В., Макаров В.В. Активация протеиназ и кислой фосфатазы в лейкоцитах свиней, инфицированных вирусом классической чумы свиней. II Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1997. - N3. - С.20-24.