Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ СВИНЕЙ В НОРМЕ, ПРИ ЧУМЕ И ИНФЕКЦИОННОМ АТРОФИЧЕСКОМ РИНИТЕ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ СВИНЕЙ В НОРМЕ, ПРИ ЧУМЕ И ИНФЕКЦИОННОМ АТРОФИЧЕСКОМ РИНИТЕ"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА.ИНСТИТУТ . ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА' ЛЕНИНА АКАДЕМИИ- . СЕЛЬСКОХОЗЯИСТВЕИНЫХ^НАУК ИМЕНИ В.; И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

Аспирант Круть Николай Иванович

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ '

СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ СВИНЕЙ В НОРМЕ, ПРИ ЧУМЕ И-ИНФЕКЦИОННОМ АТРОФИЧЕСКОМ

РИНИТЕ

' (03.00.06 — вирусология) . """ ""

А втор е фер ат -диссертации:на соискание ученой степени кандидата биологических'наук:

МОСКВА-1Э71-

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА

Аспирант Круть Николай Иванович

ЦИТО ГЕН ЕТИ ЧЕСКИ Е ИССЛЕДОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ СВИНЕИ В НОРМЕ, ПРИ ЧУМЕ И ИНФЕКЦИОННОМ АТРОФИЧЕСКОМ

(03,00.06 — вирусология) Диссертация напнса-на на русском языке

А .в т о р е ф е г]з а т діюснртаїщда на осадска.ніие ученой стеледи кандидата биологических наук

На правах рукописи

РИНИТЕ

ґ'

деД о-д. .

МОСКВА — 1974

■Работа вьмтолнеиа в лаборатории по изучению болезней свиней Всесоюзного ордера Ленина института экогвдри.мен-талыной 'Ветеринарии (директор—заіслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных «аул, академик ВАСХНИЛ, профессор Я. .Р. Коваленко) :н отделе ганетакм Всесоюзного ордена Трудового 'Красного Знамени нау ч ноіігсс л едователь-ского (института животноводства (директор —член-Кіоріреопон-лент ВАСХНИЛ Л. К. Эрнст).

Материалы дис-ое^ртащии изложены на 152 страницах машинописного текста, иллюстрированы 31 таблицей и 36 рисунками. Список -использованной литературы включает 230 ■работ, .в там числе 105 отечественных и 125 зшостра,нмых авторов.

Научные руководители: заслуженный деятель науки РСФ'СР, доіктоїр ■биологических .нау,к, профессор П. 'И. Приту-ллш; кандидат медіиц-иінских жіук И. Л. Гольдмаїн.

Официальные оппоненты:

■Доктор 'ветеринарных нау.к Л. Г. Бурба,

Кандидат биолошч-еаких наук Ґ. Н. Шанган-Березо©скмй.

■Ведущее .научное учреждение — (Казанский ветеринарный ¡шгетитут им. Н. Э. Баумана.

Автореферат разослан с » МО. \ 1974 г.

Зашита днооертащии -состоится «¿6 » и Ю нЯ 1974 г. щ 14 часоїв на заседании Ученого 'Совета Всесоюзного ©рден-а Ленина іинсттитута эксперт ментальной ветеринарии (Москва, 109472, ВИЭВ)..

С диссертацией можно ознакомиться в 'библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь Совета, кандидат биологических наук

¡В. В, Калугин

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие широкое .развитие получила пито* гакеттп'ка, Разработаны новые <м-ет,оды (последовалия .хро.мосом in методология ка.рдалапн'чес.кого аиалтза. На этой основе лзу-ченым сшсрем'атизи'рова.иы «ариотапы человека, лабораторных, некоторых даюих к основных та ¡дав сел ьс.ко хоз л йств ен 11 ы.\ животных.

Цитогенетические исследования используются в таксонемнн, П|р;!1 >Пр"ОЮеДйШШ ХЮпуЛЯЦТЮН НЫХ р.абОТ, ДЛЯ изучения -механизма действия 'рада,ац-ии ni хп^шчесюи.х мутагенов, в практике (медицины hi ■ветеринарии! для раскрытия этнологии л патогенеза ряда за'бол'ввал;mii,

Определенные -у,еле,-Xi]i .имеет шттогенетика в вирусологии. Исследования, 'выполненные на человеке, животных и культуре ткани открыли картину вдрусного поражения хромосом (Натра г, Ellison 1961, 1963; Nichols, 1362, 1966; Sak&ela, Moorhead, 1963; Rapp, Hsu 1965; Stich 1964, 1970; В. В. Ваш-JiQ&a, В. М. Ждан то®, 1966; В. И. Г<ав рилов, А. И. Соловьева и др. 1966; С. Я. Зал мина, 1964, 1971; Г. Р, Михайлова, 1967; Д. С. М'ар'карлн, 3. В. Шевцова ж др. 1970; В. Н. Блюм.кин, Л, А. Монастьиркмва, 1971; 'В. Н. Блюмк.нн, В. М. Жданов, 1973 иг др.), что явилось существенным (вкладом в ооашмаине эт'игопатоген'еза ряда ©п.руаных .ннфакаий, основой новых дщаг-.ностичесдюс тестов, 1В том числе in на скрытое OlipycoIlOCrtiteль-етво (H. Ф. йартешаий, И. В, Дементьев, 1967, 1968; О. В, Ба-рояи, P. A. Кантаровтч, 1970; Р. А, Канторович, А. И. Резетго-ва, 1973 и др;).

Несмотря .на расширение экспериментальных работ по горо-б-ле1ме даруспого [мутагенеза три тнфекщновны-х процессах у человека и лабораторных животных, у сельскохозяйственных ЖИВОТНЫХ, ® ТС(М ЧЛЙМе Ч! у СШШеЙ, ЦИ'ТОГеНКТИ ЧССКИе нсследо-вагщя с этом ¡направленны! только начинаются.

Между тем, Becb'Mia терспектидньщ для практики 'ветеринарии ЯВЛЯЕТСЯ изучение влияния .вирусов на хромосомы клеток тканей сельскохозяйственных ЖИВОТНЫХ Й связи с широким раогпространешем чредн ¡них инфекционных болезней вмрус-

ИОН ЭТгНОЛОПЫ! Ill Ш1;ССОВЫ1М пр.ИМеНеННВМ С ЦСЛЬЮ Шроф-ИЛaKTII-lili живых вирусных вакцпи.

В настоящей работе ир;имвдгятсн результаты ц,итоге лети ч«-■синх я юсл едав алий не тзуч-авштхея ранее в этом плане классической чумы 51 .и.тфекц]ioii.fiопо атро фшческого■ршмта сытей.

¡Классическая чулга свтией, .как 'было установлено Schweinitz, Dorset, 19Q3; Dorset, Bolton at Brvde, i905, вызывается специфическим влрусом.

■Прмкрода «нфе к.щ юн но по а трофического рятнта сшшен, несмотря на 140-летнюю историю его изучения, до настоящего юрвмепн окончательно не <выяснша.

Существует ряд ТеОр(ИЙ II ГЙ1ПОТ&3 щ отношенил этиологии нтфсшисшнопо атрофпческого ришта -свиней. Все лх .можно объединить в три группы: ншшфекщтниую —(-иаследствешилн характер <болезш1, явитамшюзы (А, Д), .недостаток кальшня и фосфора, шлохше условия кормления и содержания н др.), инфекционную (вирусная, дшкоплзз лозная, риккетснозная, бордетелл.ноз'ная, inacreре ллезная -и др.) я полп[этнологическую (заболевание .вызывается ¡комплексом повреждающих факторов) . Согласно тируемо-ген старческой пнпотезе ИА-Р, предложенной в 1966 г. П. И. ¡Притулиным, возбудителем болезни является ятрювирус, который передается вертикальным путем.

Целью лашей работы было:

1. Изучить нормальный .кариюттап at его вариации в клетках оочатнческ.и.х тканей свашен крупной белой породы.

2. Исследовать влияние вируса чумы свиней на хромосомы at им (готическую а.ктив^юсть клеток гемопоэтической тка.нм животных, больных чумой, а также клеток первичной культуры почек эмбрионов свиней (ПЭС), (инфицированных этам виру-

GO!M.

3. Исследовать хромосом!)! клеток системы крови свиней больных (инфекционным а трофическим рикш том.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы исследований

Исследовашгя (проводили в лаборатории] по лзучеипю болезней свиней 1ВИЭВ, па ¡базе совхозов «Белая Дача» и «Оста.н-к.шю» Московской области л отделе те нети кл ВИЖ. Хромосомы 56 свиней (табл. 1) крупной белой (породы изучены в 8278 .клетках костного .мозга, культур лейкоцитов и культур клеток почечиюй ткани.

Данные, тюлу-чопные npin (изучении дром-осам у 18 здоровых свиней служил« контролем для сопоставления с ¡результатами ц итоге и era час ко го (исследования клеток 26 свиней больных

А

¡ннфеюционным атрофичесявшм ринитом ¡п 12 свиней, больных ¡классической чумой.

Таблица 1

Исследованные животные

Количество и пол животных 'Вид изучаемом ткани

Группа животных костный: МОЗГ культура лейкоцитов

Клинически здоровые Больные 18 Ю?) * + +

л 3 Инфекционным атро-фиЧвСКНМ р(111ИДОМ (ИАР) 2G (I3J, 13J) + -1-

d ia Классической чумой 12 (■■»г. »<-!> + —

Всего: 56 (24J, 32J)

Для заражения животных в опытах iiпопользовали лабораторный (вирус классической чумы свиней (штамм «Дороет») в виде вирус— крови в дозе 0,5 мл, вводимого подкожно в область верхней трети ШЗИ.

'Цитагененическтй анализ .клеток костного -мезга сан ней больных чумой проводили через 48, 72, 96 часов после заражения и .на 7-й дань болтани.

¡Культуры клеток эмбриональной тюанм свиньи (ПЭС) заражали ей руосш 'чумы через 70 час. ;после яасава (в период логари фм;ичадной фазы ¡роста .культуры). Миожесгоешость зарожеашя составляла 1Л -ЛДюо на клетку. Хромосомы изучали s 2 (Срока— через 8 щ 24 часа после инфицирования культур. -'.-.»ос?;

Для приготовления препаратов хромосом из пункта то в ксстното мозга использовали методику Ford et ¿1. (1958), мойифими ров айву ю Д, С. Доб р и яновьлм м И. Л. Гольдманом (1968) (применительно к данному ввду животных.

Пуимшию .грудной 'косТо! свиней проводили специально сконструированной иглой. Животных фиксировали в горизонтальном ¡положении «а наготовленном иаш! станюе.

^Костный (мозг из 2—3 сегментов грудной кости асшфиро-вал)н ¡20 (мл стерильным шигрицом ¡в количестве 0,5—1,5 ,мл. Пунктах шмещали в ирабирку с 5 мл подогретой но 38°С питательной средой 199 (для культуры тшамей) и 0,5 мл 0,02%-ного раствора иолдтщ-ина. Пробирки несколько минут тша-

5

дельно (встряхивали (для -отдел е 11« я ф[б.рл:на) і г 1 час лнкуби-ровалл (при 38°іС.

Для лятютсшмзаціш ;нспользсвалін 0,75% 'раствор основного цитрата нат.ріия.

Кул ьт,] Иверов а шіе лейкоцитов проводили іпо методу 'Moor-head etal. (I960), 'М-одифт-щпрева.гаюму применительно к свиньям (Д. С. Добри га нов, И. Л. Гальдман, В. X. Нечлгпю'рен-J<i0, 1968), 'Крсівь от подсети.ков толучали из передней іполой вены їй помещали -в стерильные пробирки, «предварительно смоченные раствором геп.аірігша {фирма «Вихтер», Венгрия). Выделе тис лейкоцитов осуществляла! выдерживанием в течение часа проб тердал »а холоду, .с дальнейшим отсасыванием отстоявшегося слоя ш.таамы. Затем в ¡катаре Поряегва (подсчитывали число лейкоцитов а выделенных порциях плазмы и эти объемы разбавляли аредюй 199 (с одер "ж а щей 50 ЕД/'МЛ пенициллина и стрептомицина) та ким образом, чтобы конечная концентрация лейкоцитов составляла 1—2X 10Є -в 1 <мл смеси.

Для стамуляими імїитотичесшпо діленні я лимфоцитов в приготовленную взвесь добавляли фит ore м а г гл ютиінл н производства фирмы «Difco» США (ФГА «М»—0,1 мл «Р»—0,01 мл на 9 імл клеточной суоітензиіи).

"Приготовленную взвесь разливали по 2 мл ©о флаконы пз-под пенициллина или по 15 —20 мл :_в ЙЙил матрасы, создавали тазовую среду, содержащую 5% ССЬ путем ігродува-чшя остаточного воздуха легких и ломещалл в термостат при 38°С,

На 68 часу культивирования во флаконы вводили колхицин в ¡концентрации 0,6 у на 1 мім3 культуральной среды. Культуру .на 4 часа вишь 'помещали в термостат. В качестве гипотонического раствора использовали 0,75% раствор шітрата натрия.

Первично т pi шеи пширова ни ые .культуры іиіз ¡почечной ткани эмбрионов евлшей {'ПЭС) выращивали чірм 38°С в орвде гид-рол из ат л а кта л ьбу м и н а с добавлением 10% сыворотки КРС, Смену ср>еды проводил л через 3 дня после посе&а клеток. Приготовление пргп-а.ратов хролгосом из їмо послойных 'культур выполняли по методике А. А. Хактамова, В. Н. Влюмкина (1966).

iKvTeTK.Il ¡костного :мозга, культур лейкоцитов и ПЭС (»почек эмбрионов оаиней) 'фиксировали а евежелриготовлешюаі фиксаторе, состоящем из 3-х частей метилового спирта <н -оаной части ледяной .улсусной кислоты.

Препараты для аіналтеза хромосом 'штоташи' на охлажденных предметаых стеклах с последующим людсушиваиием лх над пд.аіменіем горелки. -Применяли также подогретые до 50" стекла, нанося н.а -них 2—3 капли клеточной суспензии, которую 'равномерно распределялся по его поверхности.

G

Препараты лр-омосам окр а шив а л л (по Уина с докраской 0,1% раствором Эозина, я также применяли ацетоореевш или краску Ром'а нове кого - Пі ш з а.

^ Щітагенетическіий анализ меток костного мозга культур лейкоцитов Ц{ ¡первичной культуры почек эмбрионов свиньи провожай ля с учетом 'Всех требований, предъявляемых (К даарио-л опти ческом у 'исследованию, Определяли: імитотнч'ескую активность КЛЄТОК, -МОрфОЛОГИЮ хромосом, анеуплоидию, полиплоидию, структурные аіберрацліи хромосом.

Препараты хром отім анализировали под микроскопом МБ И—6 с и сдал ьзо»а ннем масляной тімерсин.

Микрофотографирование .хромосом ,выползня ли этим же прибором на 'фотопленку мінор ат 200 плит /ми крат 300, которую обрабатывали ¡контра синьи и проявителем А—'100. Подсчет чисел Хромосом, измерение хромосом ,п детальный анализ структурные а<беіррадаій лрюїводнли на (микрофотографиях (при конечном увеличении х 2000—4000) с карнотігіпніровашіем.

* Митотнческую активность клеток 'костного імозга, культур

лейкоцитов И .культур пас определяли в %о с -подсчетом не менее 25000 «леток на нескольких препаратах.

Определение ¡.митотмческой активности зараженных їй леза-раженных (контроль) вирусом чумы свиней клеток эмбриона свиньи проводили через 8, 16 и 24 часа. На каждый срок инфекции брали по 5—10 препаратов опытныхи по 3—5—контрольных .культур. Для этого шыр-а'щенные на покровных стеклах .во флаконах клетки промывали фас фат н о - бу фер н ььм раствором ¡и фиксировали в жидкости, состоящей из 3 ч. метилового спирта и 1 ч. ледяной уксусной кислоты на протяжении 10 мчш. Затем .препараты красили 1% (раствором ацетоорсеші.а пли юраской Ром аі юве к о го - Гитм з а.

Диагностика инфекционного атрюфич'еокото ринита основы-, валась на данных .клинического осмотра и последующего латаного-а,натоми час,к ого нослсцования.

'После 'прямого заражения діиа!гност,н.ка чумы свиней основывалась на результатах клинического, -гематологического и л а т ол,э гоаи атоми чес ко го исследований.

Цифровой материал экспериментов обработан методам вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Цитогенетическая характеристика соматических клеток здоровых свиней

Изучение кариотнпіа у здоровых свиней было .проведено на 18 .разновозрастных животных. Всего проа.иализирова ли! 2172 метафа-зных пластинок (1422—клеток костного мозга, 400 —

культур лейкоцитов и 350 — первичной культуры почек эмб-рнонш шшыи).

Установлено, что диплоидный набор хромосом соматических клеток спишем pasen 38 хромосомам (2п = 38). Кариоти-пшрованіие п&кааало, что .хромосомный л »бор клеток соматических т-камей здоровых хдапггей состоит ¡из J8 пар аутосом пі одной пары половых хромосом (XX—'у свивок, ХУ—у хряков).

Единой системы классификации хромосом свягн«й нет. Мноні« исследователи попользуют 'собственный систематнческии принцип, применяемый іп.ріи карнотииировашш, В своей работе мы придерживались кл.асшфи:ка'шш Vogta (1967).

Измерение 20 мєтафазлшх пластинок с оптимальной степенью сшіралігізащнін хромосом сопоставление полученных результатов с данными аналогичных намерений, проведенных другими -авторами показывают отзвестную идентичность. Так, .например, для выбранных 1 и 2 паір хромосом ¡мы получили соответствующее значение 107 и 73%о (в % ;10,7 їй 7,3); в исследованиях В. X. Нечашоремко (1971) лшслеввьье показатели ■*. этих пар были 111,3 їм 64,1 %о (/в % 11,1 зі 6,4), >по данльш И. J1. Гольлмана и Д. В. Карликова (1969)—11,4% и 8,0.

В общем виде кариотат свиней представлен хромосомами 3-х типов:

I *шп — субметаїцентршкії (9 лар аутосом) 'С центромер ным индексом 23—47,5;

II тиіп -— метанентрикм (4 іпарьг, включая пару половых хромосом) с цеігтіромерным индексом 47,15—50,0;

III тип — акіроценпритеи (6 тар -аутосом) с терминально расположенными центромерами и короткими плечами, не поддающимися тэмйревию.

В каротине оаинец хромосомы можно расположить в четырех грутіпахз

Первая группа .включает 3 ла,ры. Достоверно идентифицируется первая 'пара хромосом; oí ги самые трупные. Вторая trt третья гп-ары 'По размерам значительно меньше.

іВтор'ая ¿группа хромосом образована шестью парами а.кро--нентрикав, которые располагаются по убывающей величине. Среди лих до,CTCtBCip.no идентифицируются лары самых ¡крупных—№ 4 .и средних—№ 7. Хромосомы ,внут,ри пар 5—6 и 8—9 практически идентичны но размерам.

■Третья группа образована шестью параміи субме та центри-ческнх хромосом. Идешадфикання шх <при классических методах окраски хромосом практически невозможна. Среди них нахолится X — хромосома, которая .идентифицируется весьма условно.

Четвертая группа состоит ¡из четырех пар метацентриков, включая У—хромосому. У — храм'ОСом.а представлена самым

г

маленьким мет а ¡центри ком, который ¡ігделнифямгруется абсолютно достоверно.

'Среди ЛрОМОСОМ четвертой Группы Кар:ИЮ71ИПа свиней достоверно выделяется «пара № 16, имеющая отчетливо выраженные стаут,ніжи.

іКаріїго лог,п чес кое исследование .показало, что .большинство исследованных .клеток шмели дишкшдний .набор хіромосо-м 2л—38 (в костном мозге 87%, >в культуре лейкоціито® 89,5% л в .культуре ЛЭ'С—92,3%). Количество отклонений де превышает соответственно 13%, 10У5% и 7,7%- Средний уровень анеуплоидии 'клещк костного імозга сосгавіїл 11,7%±0,62, пріпчіам доминирую щи мл і с-редш них был« ппгтоллощды—9,4 ± ±0,83%. іГіїшвріпЛістдьі составили .2,3%±0,42. Как и їв іклетках .костного мозга, аиеуіплоидия в культуре лейкоцитов и культуре ПЭС 'формировалась .в основном шпоплаидам.и (8,6% ±0,77 пг 6± 1,31 % соответственно). Гиперилоиды был,її малочисленны — всего 0,6% в ікультуре лейкоцитов [II ІВ культуре ПЭС.

Наблюдалось некоторое увеличение числа анеуилондных клеток у вькоковозраст.н ысил шеи. Можно предположить, что уменьшение хромосом в клеткам таких особен является след-егшюм изменения физиологического состояния ткаїшей организма.

Нарядусдиплоиднымн нанеуплондными клеткамив исследуемых тканях в незначительном проценте были обнаружены по лип лай дни« клепки. Средней -уровень чю.тташломапш для клеток костного 'МОзга п культур лейкоцитов состав-ил 1,3% «для (культуры ПЭС—1%, Однако .различшым оказался спектр полиплоидных клеток. Если в клетках .костного моз<га полиплоиды имели широкий размах (изменчивое™—от 3 до 10 п., то зз культуре лейкоцитов доминировали тетр'Э.шкшды, а та других ТИПОВ полиплоидов регулярно вьіделяліірсь лишь трншломды.

Из шроа:н а ли ш і;ро.в а и п ы х у клинически здоровых животных 1422 метафазных пластинок клеток костного мозга 49 (3,4%) лмели спонтаимые 'повреждения хромосом.

В 400 лгетз'фазах из <культури лейкоцитов 14 (3,3%) имели аберрации хромосом, а в 350 .клетках из культуры ПЭС—іЮ (2,9%). По качестве! ином у составу они были следующими: гэпы — 14% хром-атндные и изохром анидные разрывы —86%. Каких-либо других іформ структурной изменчивости хромосом о клетках системы крови у здоровых животных мы не наблюдали.

іПрн исследовании митоти ческой іактив-постш установлено, что іміптотлческніі ¡индекс -кратковременно культивируемой И И течение 1 часа колхицинизнраванной ткани костного мозга составляет 8±0,122%о, культуры лейкоцитов (фиксация на 72 ч. с предварительным 4 час. колхишіпиз.проіВ'а.ннеіМ и ирименени-

ем фнтогем агглютішшна) —4,5±0,25%.о, .культуры клеток ПЭС в логарифмической фазе роста через 72—96 ч. .культивирования — 10—20%о.

(Результаты лашепо 'исследования нормального кариотлла свиней крупной і&елой породы .и «то вариащий во многом сходны с данчіьщіи каїриоліошического анализа, проведенного другими исследователями на этой же и других породах ладного вида.

2. Цитогенетические исследования клеток костного мозга

свиней, больных классической чумой и клеток первичной культуры ПЭС, зараженных вирусом чумы

Цнгто генетический анализ костного імдага проведен в двух с ерш я х опытов: у О животных хром осам ы исследовали в динамике—'через 48, 72 и 96 часов от момента заражения, у 3-х — в остром -периоде заболевания, на 7-й день 'болезни. Влияние .вируса чумы свиней на хромососы клеток первичной ■культуры Г13С -изучали їв 2 срока—через 8 и 24 часа после инфицирования «культур, Всего в этих экс пери мент а х -проанализировали 3198 -метафазных ил астнноїк (2528—клеток костного -мозга и 670 метафаз .кіультуірьі ПЭС).

Первая серил опытов: 9 подсвинков, .не иммунных к чуме, «озрастом 2,5—3 м-ц-а, доставленных из опытной базы В И Эй; о. Лисий, заразили вирусом -классической чуімьі свиней шт. «Дорсет», титр і О6 ЛДюо в 1 мл, подкожно їв дозе 0,5 мл. Данные термометрии (повышайте температуры тела у всех подопытных жшвотпых через 48 часов (после 'введения (вируса), ге м ато лоти чес ки і и анализ (выраженная лейкопения и сдвиг лейкоцитарной формулы влево), клиническая картина свидетельствовали! о том, что заражение подсвинков привело к развитию классической картины *пу;мы '(їв последующем это подтвердилось патологоанатомическим исследованием).

Цитогенетичеіская картина гклеток <костного імозга в начальный период '(юлезшт показала нарастание числа анеуплошдных ■клеток и -количества клеток с повреждениями хр'симосом. Так, через 48 часов (После зараження .процент .а неуплоидных клеток составлял 24,7, а через 72 часа—30,2%. Детальный анализ этого лвлелшя показывает, что апеуіплоидия развиївалась преимуществе! пі ю за счет пи поп лендов, табл. 2.

Интересно отметить, что средние (показатели тапоплюйдни от 3-го « 5-:му дню заіболеваиіия не нарастали. Участие пипер-плоидных клеток в развитии анеуплоидин при ' заболевании сди-ней чумой незначительно.

Остается неясным, чем (было вызвано «появление гипоплоид-11 ы,х клеток: либо они возникали после нер ас хождения хромосом "в гмитозе, либо тю шричшне механической утери хромосом

в процессе іп'ріпготавлепіия препаратов ©следствие возможного снижения оам'отнчсскон резИСТеНТНОСТП клсто'к При чуме.

Таблица 2

Средние показатели анеуплоидии клеток костного мозга крупной белой породы в ранней стадии развития чумы

Сроки исследования после заражения (в часах) Изучено метафаз-'иых пластинок Вариации чисел хромосом (в %>

пшопл онд-ных диплоидных гнперплоид-ных всего анеуплоид-,ных

Контроль 1422 9,4 ±0,83 87 ±0,70 2,3 ±0,42 11,7±0,62

Через 48 1022 20,9 ±0,92 75,2±3,21 3,8 ±0,48 24,7 ±0,73

» 72 753 25,7 ±0,81 69,8 ±3,52 4,5 ±0,65 30,2 ±0,58

» 96 554 25,3 ±0,65 72,8 ±2;55 1,9 ±0,31 27,2 ±0,85

Начиная с 3-го дня шііфищиро.вашіія -у свилей наблюдалась 'выраженная пол»п лай днгзация клеток. Через 48 часов после заражения 'число ,нх составило 5,74 ±0,96% и ¡возросло до 7,35± 1,09% спустя 72 часа. В картине полиплоидии характерным было увеличение числа тетріаплондных клеток. Мы полагаем, что это яівлешіе может быть отнесено к разряду геномных мутаций, индуцированных -вирусом классической чумы саипей.

Структурные л№;реждедяя хромосом. Этот .класс генетических ¡изменений ;был представлен сл.ютанпями, пульверизацией хромосом, деагшралшацней хрюїмосом и аберрациями хромосомі] юго и хірома-шдлого типа.

ОбіЦ'ЄЄ .количество поврежденных клеток обнаруживало тенденцию к повыше шло от 3-го к 5-му дню, табл. 3.

Таблица 3

Динамика повреждений хромосом в клетках костного мозга свиней крупной белой породы, инфицированных вирусом классической чумы

Сроки исследования после заражения (в час.) Исследовано метафаз % клеток с аберрациями хромосом

Контроль 1442 3,4 ±0,9

Через 48 ч. 1022 ]4,53±1,47

Через 72 ч. 753 17,3 ±1,67

Через 96 ч. 554 20,7 ±2,76

■Склеивание хромосом проявлялось в образовании из них плотных ,ко н гл омер-а тов.

Пріїї чуме свиней мы обнаружили один лз признатов, характерных дл,я вирусного поражения—пульверизацию хромосом. У здоровых животных клеток С нулввеїризаїшгей хромосом мы -не наблюдали, у животных, 111 іфіщнрован н ы х и больных чумой —(їх число достигало 4—6 на 100 клеток.

В отдельных клетках .наблюдалась деспарализация отдельных или групп хромосом. Мы зарегистрировали также увеличение количества хромосом с «пробелами (гэпамш). Процентное соотношение указанных типов ¡аберраций [было в среднем следующим: Г&пы—20,1%, хроматидиые и изохроманидные разрывы — 71,2%, хрю'матидщые пранслюк.а.щии— 7,5% хромосомные храпело,кадащ— 1,2%.

Установлено также снижение м.итотп ческой активности клеток костного і мозга больных чумой свиней. Если у здоровых животных на 1000 подсчитанных клеток 8±0,22 были в состоянии митоза, то у 'больных —2±0,46.

гВо второй серии опытов находилось б неиммушных к чуме подтинка, возрастом 3 м-ца, доставленных из опытной базы ВИЭВ и зараженных эпизоотическим вирусом чумы свиней.

Цпт огенетич ее вне исследования проводили в острой фазе заболевания, на 7-й день.

Полученные материалы подтвердили результаты исследовании, полученных в -первом опыте. К а риотипичесжие изменения были аналогичными.

В 'совокупности .материалы іцитогенетического исследования 'клеток костного імозга показывают, что н>а различных этапах от момента заражения до острого периода развития «лили,кп чумы 'Сииней можно наблюдать отчетливую .картину ци-ТОРЄІІ'ЄТІГЧЄСКІНХ изменений -в -известной степени специфичных для вирусных поражений.

'Влияние вирус а ,н,а генетический аппарат клеток ЛЭС изучено через 8 и 24 часа после инфицирования культур. Исследованиями установили картину іпораженип хромосом, аналогичную наблюдаемой в клетках больных животных. При оаи-накшой множестве,!пюсти заражения (1,1 ЛДто на -клетку) после 8-часового инфицирования клеток процент метафаз с аберрациями хромосом со,ста®нл 18,4%, .а после длительного воздействия 'вируса (на протяжении Û4 часов) до 22%,

Качественно поражение хромосом клеток ПЭС было представлено аберрациями хромат.идного тина, склеиванием и пульпе ризацне й хро мосом.

В іклетка.х 'первичных ,культур из почек эмбрионов свиньи вирус классической чумы штамм «Дорсет» вызывает понижение мптотнческой активности, Установлено, что начитал с 16 часа инфицирования митотп-чеокая активность клеток первич-12

лой культуры уменьшается до 10%о (iipat 10—20%о в контроле), а на 24 час инфекции млтотичестсий индекс равен всего лишь 6% о.

Эти явления отражают глубокую перестройку метаболизма клеток ПЭС, инфицированных, вирусом классической чумы СВ1Иней. Изменяется цикл .клетки.

Сапост ав леиие шitoгек'етаiческо по эффекта, вызываемого (вирусом .кл-аюспгческой чумы свиней in vivo m in vitro доказывает идентичность поражающего действия -аир-уса ibo времени. Не лодлежит сомнению тот факт, что ¡шгтоr.eiгетические исследования можно (использовать в качестве дополнительного теста при диагностике классической чумы свиней.

3. Ц н то генетические исследования клеток костного мозга

и культуры лейкоцитов свиней, больных инфекционным атрофическим ринитом

Основной задачей настоящего раздела работы было установление возможного поражения хромосом в клетках системы крови свиней npj] инфекционном аттрофичеоком рините (ИАР).

Исследовали я проведены та материале от 26 свиней крупной белой породы возрастом от 3 до 5 месяцев, больных ИАР.

(Всего про а на лизирсю а л« г 2028 метаф аз пы«х пластинок .клеток костного мозга и 880—волученлых из ¡культур лейкоцитов больных жи.вотныл.

Полученные намн данные по иссл-еаованию наследственного аппарата .клеток костлош мозга и культур лейкощитш свилей, (больных ИАР, указывают на ггоя'влем.ие числовых if структурных изменений хром-осам у 'большинства обследованных животных, Изменения ч/иела хромосом (варьировала! в охоло-длщлоидных гр-ашщах, табл. 4, ;5.

Результаты писследшаний свидетельствуют о том, что бо.щ,-ШН.ПСТ1В0 клеток (61,7—91 %) имели 38 хромосом. Наряду с эти,м заметно, что значительный процент (9—38,3) состзэтлялл гетероплоидные клетки. Такое увеличение количества плеток происходило, в основном, за счет шло плоидиых наборов. Анализом у ста лови лл, что основной .процент таких -клеток лред-сташлялш клетки с 35—37 хромосомами. При ¡карнотитонсском исследоваши этих клеток определено, что чаще в 'наборах отсутствовали а«роцентрлчески е хромосомы 7—8—9 пар it ме-талентрич^кие— 17, 18(па,р.

В то же время У [больных животных (возрос лроиент пнпер-о л-ан дн ы х iK лето к (5% по сравнению с 2,3%) у здоровых, Карло логический 'анализ обнаружил, что мнюгаешз гнпертгандов содержали 40 .хромосом. Чаше дополнительной парой были акрсцеитрические, .реже субмета цент,рл ческлте и метацентриче-ские хромосомы.

i;s

Результати исследования хромосом клеток крови свиней крупной белой породы, больных инфекционным а трофическим ринитом

Клеток с числом хромосом іК.іеткн іс аберрациями хромосом

о л (о о о сч >33 38 >38 Полиплоиды з* м „ ° Й

£ 1 § и ^ и о.® п £ о й и ц * в? ой а £ 5 ** ° ¥ з ¡2 о ^ СГ ГС ¡»е-Р. « § к всего % всего і всего % всего % всего % £ 3 р 2 5 ?

15 О + 3.5 22,6 100 Д4 н 78 78 7 7 . 1 Л 18 18 3

10 1 О 4 23 100 7 7 90 90 2 2 ■ I 1, » 7 7 4

18 О + 4 26,3 120 17 14,2 ■96 80 4 3,3 3 ¡2,5 43 10,8 2

23 с-+ 4,5 20 140 :15 10,7 119 85 4 2,8 2 !,5 14 10 3

24 С; 4 ■22 130 25 19,2 88 58,1 ■13 10 2,7 її & 14 1

25 \ 4 26 150 27 ,18 105 70 9 6 9 6 25 1С,7 3

2б о 1- 5 21 140 (25 18 т- 09,3 12 8,4 6 4,3 20 14,3 2

880 130 14,8±, 1,05 673 70,5 ± 3,04 ■51 5,7±!,И 26 3±0,71 115 13±1,49 2,57+ 0,37

Результаты исследования хромосом клеток костного мозга свиней крупной белой породы, больных инфекционным а трофическим ринитом

Клеток с числом хромосом Клетки с аберрациями хромосом

[-1 о к ^ о 1 ь о о ш ей 5 о £ еЗ >33 38 >38 і І0.Н1- ИЛЭЛДЫ с: те

3 £ * Ї Г-. Э СІ о Я СІ с, В о * О в о Ел «Я! = 2 Е АЪ 2 А Ч н ей 8 Ё 3 г абс. % абс. % абс. % абс. % о с. а) у а % ¡1 а л; Й

і 2 3 4 5 6 7 8 9 '10 И 12 13 14 15 1С

і О + 4 26,3 52 5 9,7 39 75 6 11,5 2 3,8 6 11,5 2

2 О + 5 29,1 63 7 11 51 61 2 3,2 3 4,8 5 8 1

3 1 о 5 23 61 7 11,5 50 82 3 5 1 1*5 18 1

4 Т о 4 24,7 .56 7 12,5 .46 82,1 1 1,8 2 ЗД 8 14,2 2

о О 5 19,5 55 8 Н,6 44 80 3 5,4 — — 7 12,7 1

6 4 22,5 57 6 10,6 46 80,7 3 5,2 2 3,5 5 8,8 1

7 т о 3,5 28 69 6 ■9 58 84 3 4,4 2 2,6 9 13 2

8 Д 4 25,0 56 8 14,4 ■42 75 3 5.3 3 5.3 10 18 1

9 О + 3 27,5 74 8 10,9 57 77 4 5,4 3 6,7 9 12,1 1

10 О + 4,5 26 67 7 10,5 50. 83,6 2 2,9 2 3 4 6 2

Продолжение таблицы 5

1 2 3 4 5 6 7 ■ 8 9 -10 11 12 | 13 14 15 16

11 О + 5,5 19 89 19 21,3 63 71 4 4,2 3 3,5 12' 13,4 1

12 О + 4 29,5 76 7 9,2 65 86 2 ,2.4 2 2,4 6 8 3

13 1 О 4 25,5 62 8 ¡08 74 ■10 10,6 6 6,4 11 12 2

14 т о 3,5 .28 80 8 -10 70 87,5 1 1,2 1 1,3 7 8,7 7

15 С) + 3,5 22,6 45 111,3 34 75,6 4 8,8 2 4,3 б и 4

16 т о 4 23 81- 3- 3.7 74 91- 3,7 1 1,6. 4 5 3

17 : о 4 27,2 $5 9 ;11 82 86- ^ 2 1.5 2 1,5 9 9,5 1

18 о -1- 4 26,3 48 7 И,6 38 79,2 3 6.2 — — 4 8,3 3 ,

19 1 о 3,5 25,5 04 17 18,1 70 74,5 4 4,4 3 3 5 5,3 1

20 О + 4 21 105 23 23,8 72 68,6 4 3,8 4 3,8 16 15,2 2

21 О + 3 28,2 112 119 16,9 90 80,4 1 0,9 2 1,8 ¡14 12,5 3

22 1 О б 18,4 83 19 21,6 57- 65 4 4,3 8 9,1 40 11,3 1

23 О -+■ 4,5 20 08 ¡0 ,10,3 85- 86,7 1 I 2 2 12 12,2 4

24 О -+■ 4 22 86 6 7 72 83,7 7 8,2 1 1.1 17 20 I

25 1 4 26 \2Ъ и 0 100 82 8 ' 6,5 3 2/> ■14 11,5 2

20 О + 5 2.- 107 26 24,3 ео 61,7 12 П2 3 2,8 8 ■7,8 3

Итого |2028 | 268. 1 13,2± | 0,98 11595" 1 78,6 ± 1 1,39 | 100 | 5 ±0,58 | 65 13,2 ±0,39 228 | 1и± 1 0,75 |2,2 ±0,24

■У свиней, .больных ИАР отмечено увеличение л 2—3 раза процента лолишлондных клеток (как ;в костном мозгу, так лі т культурелейкоцитов) по сравнению с этими показателями для тканей здоровых -свиней.

Среди нсследавапншх 2028 <метафазпых пластинок клеток костного мозга 228 клеток (J 1.2±0,75%) шмели аберрации хромосом, а из 880 клеток культуры лейкоцитов были с повреждениями— 115 (13± 1,49%). Эти материалы показывают, что щнт&геретическая картина клеток сметамы крови животных, -больных ИАР существенным образом отличается от наблюдаемой у здоровых животных. Если с,распить ци то гене тче-с мне изменения при инфекционном атрофн'чесжом (рините 01 классической чутме ошиней, то становится очевидным, что эта изменчивость (Представлена одинаковыми категориями. Разница ¡состоит »в количественной выраженности .¡шблюдаемых от-«лонеїшй їй некоторых моментах качественной картины (при ИАР не наблюдали феномена (пульверизации хромосом).

Феномен итульверизащш является ¡весьма своеобразной формой поражения хромосом. Это явление, мак стало теперь очевидным, характерно «исключительно для действия виру,сои tía генетический аппарат клеток.

Для ИАР -свиней, согласно 'Современным представлениям, ß числе -причины заболевания называют вирусы. Если в действительности дело обстоит так, то обнаруженные ¡нами цито-генетич-еские изменения можно 'Считать результатом действия этого вируса. -Причем, е действии вируса классической чумы и вызывающего ИАР обнаруживаются различия (отсутствие или присутствие феномена пульверизации хромосом).

Если же считать, что HA¡P свиней не .вызывается вирусом, то -следует, очевидно, найти .какие-либо д.рупие объяснения картшш поражен™ хромосом.

Та-шм объяснением іможет быть предио.тожшие о возможности вторичной иніфекціиіи терлее-іподобн'ого или какого-либо другого вируса, íie имеющего прямой этиологической связи с настоящим заболеванием.

Еість-сообщения, что этиологическим фактором ИАР является лр'овирус, жоторый в виде нуклеиновой .кислоты .включен в генетический аппарат клеток органов носовой полости свиней, наїследственіно inрадрасПолож енны.х к этому заболеванию. Под воодейсшиеїм -ин'дукторов он (размножается .как активный вирулентный вирус, (вызывающий структурные повреждения клеток (П. И. Притулил, ІІ966).

О характере и повреждающем действии на хромосомы латентных и хронических вирусных инфекций сообщали -В. П. Блюм'КИ'н, В. М. Жданов (4973), О. В. Бароян, Р. А, Канторович (1970), В, Д. Соловьев, В, М. Жданов (1974) и др. Они

отмечают «вертикальную передачу» таких заболеваний через геномы вирусов, .включенных в геном клетки хозяина.

Нашими исследованиями установлено понижение митоти-ческой .актившости клеток 1КОСТНОГО мозга и .культуры лейкоцитов у шипей, больных инфекционным а трофическим ринитом (с 8 ±0,22% о и 4,5 ±0,25 %о [соответственно у здоровых до 2,2±0,24%о и 2,57±0,37%о у больных ИАР), что также указывает па возможность наличия вирусной инфекции при данном заболевании.

ВЫВОДЫ

1. В ¡соматических клетках свиней крупной белой ¡породы содержится 38 хромосом: 9 пар субметацентриков, 4 пары -меггащентрикав и 6 шар акроцентрнлов, оредн которых при кари отпирав а.н и н достоверно идентифицируются 1, 2, 3, 4, 7, 16 пары н У—хромосома.

2. Подсчет хромосом в клетках костного «мозга и культуре лейкоцитов, полученных от здаршых жтвотных, обнаруживает Ы ,7±0,62% анеуплоидных нечеток в первом и 9,2±0,86% во втором случае. Качественно анеуплоидия представлена гигго—(9,4±0,83% и 8,6±0,77%) и ¡гшюрплоид'ными клетками (2,.3 + 0,76% и 0,6±0,38% соответственно).

Полиплоидия плеток системы крови составляет 1,3±0,38% (в основном тетращлоиды).

Анализ хромосом в клетках первичной культуры почек эмбрионов «свиньи обнаруживает 6,6± 1Д2 % анеуплоидных клеток (типюплоиды 6±|1,31%, гиперилоиды 0,6± 1,31 %). Полиплоидные клетки в ПЭС составляют 1,0±0,417%.

3. Спонтанные аберрации хромосом в клетках костного мозга, кульпуры лейкоцитов клинически здоровых овиней и культуры ПЭС составляют соответственно 3,4±0,55%, 3,5± ±0,44% и 2,9±0,510%о. Качественно они представлены абер-рацилми х;ро1матид,!гопо типа.

4. У свиней, зараженных эпизоотическим вирусом классической чумы, во времени, достигая (максиму,ма к острому периоду заболевания, в клетках системы крови развивается ане-уплоидия— 30,2 ±0,68%, полиплоидия—7,35± 1,09%, возникают аберрации хромосом—20,7±<2,76%.

5. В первичной культуре ПЗС, зараженной вирусом 'классической чумы свиней 1В0 времени развивается анеуплоидия 19±0,60%, полиплоидия 5,7±0,62%, возникают аберрации хромосом -— 2 2 ±0,86%,

6. Общим типом повреждений хромосом, иедуццрованных вирусом классической чумы ювиней в клетках системы -крови и 1в клетках первичной культуры ПЭС были хроматшшые и

мзохромагидпые разрывы, хром анидные и хромосомные транслакании, ігзітьі, пульваризащия хромосом,

7. 'Вирус классической чумы свиней угнетает митотическую активность -клеток аистемы -крови и первичной культуры ПЭС в более іпозднне с,ро:кн наблюдения.

8. У свиней, больных инфекционным атрофи четким ринитом, установлена выраженная авеуплшідия -клеток костного мозга и нультуры лейкоцитов—Л8Д±0,98% и 20,6+1,33%, полиплоидия— 3,2±0,39% и 3±0,71%, аберрации хромооом — 11,2±0,7б% в клетках -костного мозга и 13±1,49% в культуре лейкоцитов,

9. У свиней, больных инфеїкциоініи ьш а трофическим ринитом, снижена митотичеекая активность клеток системы мрови.

10. При классической чуме .и инфекционном атрофмческом рините іавиїней о&нарудаиваемые в клетках системы нроіви аберрации хромосом имеют схожий характер.

Различие представляет феномен пульверизации хромосом, наблюдаемый при чуме свиней.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Сравнительная характеристика хромосом свиней в норме и при нн-ф ек пишно м атрофическом рините. Доклады ВДСХНИЛ, 1974, I, 38—40.

2. Повреждения хромосом, индуцированные вирусом чумы свиней. Ветеринария, 1974, 4, 55—36.

Материалы диссертации доложены «а П-й Всесоюзной конференции молодых ученых по ветеринарии (Москва, 14—17 декабря 1971 г.), на заседании Ученого Совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии, 1973, декабрь.

Ответственный за выпуск — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор П, И. Притулин.

Сдано в наб. 21/V-74 г. Формат бОХЭО'Ле Подп. в печ. 24/V-74 г. Заказ 1303а Объем 1,25 п. л. Бесплатно Тираж 150

Тип, № 5 Управления издательств, полиграфии и книжной торговли Мое гор ис по л к о м а Москва, Таганская, 58