Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липополисахаридобелковые комплексы внешней мембраны возбудителя туляремии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липополисахаридобелковые комплексы внешней мембраны возбудителя туляремии"

г. А а ' 1

- ( •лл Государственный комитет

санитарно-эпидемиологического надзора России Российский научно-исследовательский противочумный институт „МИКРОБ"

На правах рукописи

КУЛЕВАЦКИЙ Дмитрий Павлович

УДК 616.981.455.576.314.7

ЛИПОПОЛИСАХАРИДОБЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ

03.C0.04—биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических неук

Саратов—1994

Г0СШРС7ГВЕННЫЯ КОМИТЕТ САШТГАРНО-ЭПШШИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИИ РОССШСКИИ НАУЧНО-ИХШЮЗАТЕЛЬСЗШИ рротавочшш . ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

На правах рукописи

КШВАЦОТ Дмитрий Павловэт

УДК 616*981.455.576.314.7

ЛГООПОЛИСАХАРИДОБЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ВНЕШНЕЙ 1ЛЕМБРАНЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ

03.00.04 - оиохкмия

Автореферат .

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сарзтов-1994

Работа выполнена в Институте иммунологии Государственного концерна "Биопрепарат".

Научный руководитель -

доктор силлогических наук, старший научный сотрудник В.С. ХЛЕБНИКОВ

Официальные оппонента: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Тараненко Т.М,;

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Л.В.

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт.

Автореферат разослан " 6 " мая__1994 г.

Запита диссертации состоится " 7 " таня 1994 г.

в 22. часов на заседании специализированного совета К 074.32.01. при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г.Саратов, ул.Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб"

Ученый секретарь

специализированного совета Девдариани З.Л.

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОЕШЫ. В связи с существованием в мире природных очагов туляремии проблема ее, специфической профилактики остается на сегодняшний день достаточно актуальной.

Основным достижением в профилактике ■ туляремии, несомненно, является создание живой туляремийной вакцины {ЖГВ), применение которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до состояния спорадических ш мелкогрупповых вспышек. Вкисте с тем, как и всякая живая вакцина, ЖГВ имеет определенные недостатки, важнейшим из которых является введение человеку чужеродной генетической информации.

Одним из наиболее перспективных направлений в области совершенствования и разработки различных способов эффективной защиты от возбудителя туляремии является создание нового поколения вакцинных препаратов на основе протективных антигенов.

Однако отсутствие исчерпывавших сведений о важнейших антигенах Ргапо1ве11а Шагепе1е является одной из основных причин, сдерживающих исследования в этой направлении. До настоящего времени остается дискуссионным вопрос о протективном компоненте микроба и природе защитного иммунитета щи туляремии.

К числу наиболее изученных - антигенов внешней мембраны (ВМ) Р.^игагепгАе относятся мембранные белки, привлекающие внимание исследователей в связи с их ведущей рольв в формировании Г-клеточного иммунитета [Запугал, 1987; Б;)огге<1, 1989, 1990; 5игое1, 1989. 1990; ТагпуЦс, 1989]. При этом пока не обнаружено существенных различий в- спектре мембранных белков между аеарктическими и голарктическими штаммами, включая вакцинные и их авирулентные бескаПсульные варианта, : что затрудняет объяснение формирования иммунитета при туляремии только проявление» свойств' зелков, входящих в состав ВМ (Запоют, 1988; Родионова, 1989.19901.

Особое значение в иммуногенезе туляремии. .• занимает иипополисахарид (ЛПС), очищенные препарата которого не обладают зыраженными токсическими и протективныки свойствами, характерными ш эндотоксинов многих неотрицательных бактерий. В то «б время шенно между липополисахаридами из вирулентнш Б- и авирулентных 1-культур г.ги1агопз1е имеются существенные структур®® отличия 'Хлебников,1990,1991]. н-ЛПС не имеет б-специфических юлисахаридных цепей и его молекулы состоят только из липида А и

коровых Сахаров.

В связи с вышеизложенным, исследования ЛПС, белков и ЛПС-белкоаых конплесоз (ЛПБК) внешних мембран РДи1агепг15 являются одним из основных подходов к пониманию природы протективного туляреикйного антигена и механизмов формирования защитного иммунитета.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ является изучение физико-химических свойств и иммунологической активности ЛПС-бедковъгх комплексов внешней мембраны возбудителя туляремии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1.Получить препарата внешних мембран и оценить их протектавнум

активность.

2.Внаелить ЛПС-белковые комплексы из внешних мембран и исследовать их физико-химические и протектавные свойства. .

3.Получить и охарактеризовать очищенные препараты основных белков и ЛПС из внешних мембран.

4.Сконструировать ЛПС-белковые комплексы из очищенных индивидуальных мембранных белков и лкпоподасахарида.

5.Оценить протективкые свойства сконструированных ЛПС-Оелковых комплексов,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. . Впервые на молекулярном уровне экспериментально показано, что ведувдй протективный антиген туляремийного микроба представляет собой липополисахаридобелковый комплекс, белковая часть которого состоит из основных мембранных белков с молекулярной массой (м.м.) 17-19 кД. Причем для проявления защитного эффекта оптимальное соотношение ЛПС и белка в комплексе дол»но составлять 1:1.

Впервые выделены и изучены основные свойства природного белка 17 кД Р.Ш8гепа15.

Показано, чт^ иммунизация очищенными препаратами ЛПС и мембранных белков (17 кД и 63 кД) каждым в отдельности не обеспечивает защиту мышей от гибели при , заражении вирулентным штаммом Р.ги1агепв1з. Препараты Ш. ЛПС-белковые комплексы, выделенные из внешней мембраны.или сконструированные из препаратоз ЛПС вирулентного штамма и мембранного белка 17 кД из авирулентного й-варианта вакцинного штамма, обладают протективными свойствами при

экспериментальной туляремии.

Предложен простой способ выделения ЛПС-белковых комплексов из внешних мембран путем их солюбилизации дезоксихолатом натрия и фракционированием на сефакриле Б-200.

Препарата ВМ, полученные как из вирулентного, так и из вакцинного штаммов, способны защищать 60-100% морских свинок, зараженных вирулентным штаммом 503 в дозе 1000 живых микробных клеток (я.м.к.).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Полученные в результате работы сведения о природе протективного антигена являются обоснованием возможности создания туляремийных вакцин нового поколения., В соответствии с разработанными методами получения препаратов - ЛПС-белковых комплексов из внешних мембран подготовлена инструкция по изготовлению и контролю молекулярной туляремийной вакцины, утвержденная директором Института иммунологии "10" декабря 1990г.

АПРОЗАШ РАБОТЫ И,ПУБЛИКАЦИИ.Материалы диссертации доложены и обсуждены на 20-ом Европейском биохимическом сьезде (РЕВЗ), август 1990г Будапешт, Венгрия; на И-ом Европейском иммунологическом сьезде, июнь 1991 Хельсинки, Финляндия; на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы профилактики туляремии", ноябрь 1991г Симферополь; на традиционных екегодных конференциях Института иммунологии, I986-1ЭЭОг; на межлабораторном Семинаре Института иммунологии, апрель. 1994г. По теме диссертации опубликовано II печатных работ.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы, отражающей результаты собственных исследований по теме, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель содержит 215 источников, в том числе ?4 отечественных и 141 иностранных авторов.

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность за плодотворное сотрудничество и полезные обсуждения своим коллегам. Материалы соавторам (указаны поименно в диссертации в соответствии с разделами работы) принадлежат поровну.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЖГУ.

1.Липополисахаридобелковый комплекс, белковая часть которого состоит из основных мембранных белков с молекулярной массой 17-19 кД, является ведущим протектизнш антигеном туляремийного микроба.

2.Данные, характеризующие биохимические и иммунохимические свойства'внешних мембран, ЛПС-белковых комплексов и белка 17 кД.

3.Иммунизация препаратами внешних мембран p.tuiarensis создает у морских свинок иммунитет, обеспечивающий, эффективную защиту животных при заражении виру летными штаммами голарктической разновидности.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований.

Штаммы F.tularensis; вирулентные 503 и 144/713 голарктического подвида, a'cole неарктического подвида; вакцинный №15 НШЭГ и его авирулентный R-зариант. ' R-взриант получали путем многократных пересевов на твердой среде отобранных единичных колоний ,[Емельянова.19631.

Бактерии выращивали в течение 24 часов при 37°С на плотной среде производства Гос. НИИ прикладной микробиологии (Гос.НИИПМ) (эритрит-агар с цистеином, глюкозой, витаминами и триптическим гилродиэатом "черного альбумина"). Глубинное культивирование клеток вакцинного штамма выполняли в ферментере фирмы "Электролюкс" (Швеция). Культуру выращивали в течение 16-18 часов при 37°С, используя среду на основе сернокислотного гидролизата рыбокостноя муки с добавлением солей, витаминов, цистеина и глюкозы (Гос.НИИПМ).

Ацетон-высуиешше клетки получали из взвеси бактерий, осг-'денных центрифугированием при 15000 g в течение 40 минут при 4°С. Осадок ресуспеал^лвали в трехкратном 'обьеме ацетона, охлажденного до -30°С. Суспензию тщательно перемешивали и выдерживали при в течение двух суток, периодически встряхивая. Затем центрифугировали при 15000 g в течение 40 минут. Цикл повторяли дважды, используя ацетон, охлажденный, до 4°С. Осадок клеток после последней обработки распределяли тонким слоем на чашках Петри и высуживали при 18°с.

Водно-солевой экстракт (ВСЭ) получали из ацетон-высушенных клеток, ресуспендированных в физиологическом растворе ( 100 мг

в

сухих клеток в I мл ) и инкубированных 8 часов при Э7°С и 16 часов при 4°С. Суспензию центрифугировали при 15000 g 40 минут при 4°С. Получетшй супернатант центрифугировали при 105000 g в течение I часа при 4°С. Надосадок использовали в качестве ВСЭ.

Бактериальные внешние мембраны (ВМ) получали из клеток штаммов A'Coie, 503, МБ и R-варианта штамма №15, инактивированных фенолом (конечная концентрация 0,5-1%) в течение 20 ч. Затем бактерии осаждали при 15000 g в течение 40 мин, ресуспендировали в соотношении 1:5 (v/v) в забуференном фосфатам: физиологическом растворе (ЗФР), pH 7,2, обрабатывали ультразвуком (дезинтегратор "Uw&onic" ("B.Braun",ФРГ) при мощности 200 вт три раза по. Г мин в ледяной баке и выдерживали 16 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Неразрушенные бактерии удаляли центрифугированием при 15000 g, 40 мин. Супернатант центрифугировали I ч при 105000 g. Все операции проводили при 4°С. Верхний светлый слой осадка, представляющий собой фракцию внешних мембран, трижды прошзали деио1Шзова!жой водой 1:50 v/v, перзосаждая каждый раз центрифугированием при 105000 g в течение I ч. Осадок ресуспендировали в минимальном количестве воды и лиофильно высукивали. Растворы ВМ (кони. 10-40 мг/мл) имеют вид полупрозрачного слизистого вещества. В среднем, с 10 л биомассы (штамм A'Coie), выращенной в 12-100 л ферментерах на среде, основой которой является гидролизат рыбокостной муки, выход ВМ составлял.. 2-4 г по сухому весу.

Метод выделения белка 63 кД повторяет начальные этапы процесса получения ВМ P.tularensis, включая этап центрифугирования супернатанта,свободного от неразрушенных меток, при 105000 g, I ч. Далее выполняли осаждение белков из вновь полученного надосадка сернокислым аммонием (50% насыщения). Осадок ресуспендировали в ЗФР 1:10 (v/v), диализовали против ЗФР, pH 7,4 и подвергали гель-фильтрацки на Scpharose сь-бв. Фракции, содержащие исследуемой белок, концентрировали на мембране РМ-30 (Amicon) и рехремато-графировали в тех же условиях.

Липополисахарид (ЛПС) получали по Westphal (1965).

В работе использовали коммерческую туляремийную сыворотку ' СНИПЧИ Сиб1фи и Дальнего Востока), сыворотки кроликов против живых клеток штамма Я5 и антигенов внешней мембраны, а также коноклональнне антитела (МКА) против ЛПС и бел!са 17 кД ВМ, полученные в нашей лаборатории.

Очистку МКА класса из асшинсй таксета .проводили,

обрабатывая ее каприловой кислотой, с последующей аффинной хроматографией на белок-А-сефарозе Е5ке1пЬисЬ, 19С9; Еу.1978]. Препараты МКА получали также из культуральной жидкости после трехсуточного культивирования гибридом путем осаждения сульфатом аммония при 50 Я насыщении.

Иммуноглобулины о' кролика получали из сыворотки крови путем трехкратного осавдения сульфатом аммония при 358 насыщении с последующей ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целдюлозе в 0,02 М фосфатном буфере рН 8,0.

Иммуноглобулины с козы против 1зс кролика получали хроматографый на ДЕАЕ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере рН 8,0, используя непрерывный градиент ионной силы 0,033 М - 0,1 М.

Коньюгирование МКА и иммуноглобулинов с пероксидазой проводили периодатныи методом по Канале (Ш4). Коньагаты очищали от несвязавшегося фермента гель-фяльтраииея на сефароае 6В ("РИаш!ао1ап,-Швеция),

Реакцию,агглютинации (РА)- ставили в соответствии с инструкшей по применении диагностикуыа туляредайного шдкого (Одесское предприятие по производствубакгерийшх препараюэ).

Реакцию пассивной гемагглатинащщ (РПГА) проводили согласно наставлению по применению коммерческого эратрошшрного антигенного сухого диагностикума (Одесское предприятие по производству бактерийных препаратов).

Реакшш диффузионной црешпитаики (РЛП) ставили по Оухтершш в 0,3% геле агарозыС*$1®ва'*, США) на 0,01 М модинал-аиетатном буфере рН 8,6 , используя лунки диаметром 4 мы. Учет реакции проводили через 24 часа при наличии линий преципитации между лункой с контрольным антигеном и спещфической антасьшороткой.

Иммуноэлектрофорез (ЮФ) проводили в течение , 50 мин при напряжении 200 в и силе тмка 50 ма на пластину размером 9x12 см. в качестве электродного буфера использовали 0,04 М мешиал-рцетатный буфер рЯ 8,6. Под-ерншваицая среда - гель 0,93 агарозы на 0,01 М ьтдкнал-ацетатном оуфзре рЦ 8,6 с толщщоЯ слоя геля 3 мм.

Имнунофергентный анализ (ЙШ для определения серологической активности препаратов проводили в прямом и сэндвич-вариантах СУоНегИЭТбЬ

Иммуиоблотгинг ставили по то^Ып (1979) с 12,5й ЯСН -ПААГ-электрофорезоы по методу ЬаемпП (1970) при постоянном токе 30

па. Перенос на штроцелшолозную бумагу осуществляли в течение ночи при токе равном 6 ггА. Для проявления нитроцеллюлозшл роплик использовались коньюгаты антавидовых Ig и ККА с пероксидазой. Субстратом являлся 0.0025S ортодианизидин в . ÎO кМ тркс-HCl pH 7,5 в присутствии О,OIS перекиси водорода.

Электронную микроскопии проводили на микроскопе "Hitachi Н-ЗОО" „ (Япония). Препарата контрастировал! нейтральным раствором фосфорновольфрамовой кислота. • Ультратонкие срезы готовили на ультратоме "1KB ssoo-in.'1 (Швеция) и контрастировали is? раствором уранилацетата.

Концентрацию белка и углеводов определяли по Lowry 095i ) и по Dubois (1956) соответственно.

Экстракцию липидов из I г БМ осуществляли по методу Polch (1957) и их концентрацию определяли гравиметрически.

ДСН-электрофорез в ПААГ по Laerrrali (1970) проводили в 8S и 12,5 % геле и окрашивали Кумасси й-250 или ионам серебра по Oakleu (1980) и îsai (1982).

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на дихрографе "Jasco-500A" (Япония) в кюветах с длиной оптического пути Ï га, ультрафиолетовые -- на спектрофотометре "Shimadzu UV-2IOO" (Япония), Ж-спектры - на "Spcoord IR-71" (Германия); спектры флуоресценции -на "HPF-44A" . фире.ы "Perltin-Elmer" (США) В- КЕЗетэ с длиной оптического пути 10 мм. Расчет вторичных структур 3 белках выполняли по метода Болотиной H.A. (1980).

Аминокислотный анализ "белка S3 ' кД проводили на анализаторе "Biotronio ъс 700" (ФРГ).

Статистическую обработку результатов проводили По Ашмарину И.П. и Воробьеву A.A. (1962).

Результата исследования

Изучение биохимических и защитных свойств внешних мембран туляремийного микроба позволяет определить перспективность использования ВМ в качестве одного из основных источников для выделения протективных антигенов.

В электронном микроскопе образцы ВМ P.tularensis выглядели как электронно-прозрачные структуры округлой и неправильной Форш, имевшие трехслойный профиль на ультратонком срезе.

В препаратах ВМ F. tularensis содержание белка составляло 12-22«, углеводов 15-30%, липидов до 40/». Достоверных различий в химическом составе препаратов ВМ, подученных из разных штаммов голарктического (шт. Я5 и 503) и неарктаческого (шт. A'Colo) подвидов, не обнаружено.

Препараты ВМ обладали высокой серологической активностью в Шк с применением МКА, специфичных к туляремийному ЛПС. Так в прямом методе ИФА при использовании МКА (lgG2a подкласс) гибридомы РВИ-х ВМ выявлялись в концентрации I мкг/мл, в "сэндвич" варианте -0,01 мкг/мл. Высокое содержание ЛПС в препаратах ВМ подтверждалось прямым выделением ЛПС из них по Вестфалю. Выход ЛПС составил 20-30S от сухого веса мембран,

В ДСН-электрсФореэе в ПААГ при окрашивании серебром молекулы туляремийного ЛПС распределялись в виде дискретных зон, характерных для ЛПС грамотрицательных бактерий.

По данным УФ-спектроскопии и флуоресценции, содержание белка в препаратах ЛПС составляло менее I%. В углеводной части ЛПС обнаружено значительное количество аминосахаров с и-ацилированнкми аминогруппами, выявляемыми в спектрах кругового дихроизма и инфракрасных спектрах. Препарата ЛПС как из вакцинного, так и из вирулентных штаммов были активны в реакции диффузионной преципитации (РДП) с коммерческой туляремийной сывороткой в разведениях 1:256-1:512 (исходная концентрация ЛПС I мг/-ш). При сравнительном анализе препаратов ЛПС из ВМ и из ацетон-высушеккых клеток различий не выявлено.

Изучение белкового состава ВМ туляремийного микроба в ДСН-электрофорезе в ПАЛГ позволило обнаружить до 25 белковых фракций с молекулярными массами от 10 до 80 кД. Причем качественных отличий 9 белковом составе штамма .«15 и штамма A'coie нами не обнаружено. Мажорные фракции были представлены белками с

ю

молекулярными массами 47, 43, 17 и 12 кД. Отсутствие в га составе белка 63 кД, упомянутого в работах [£апс!зкгош, 1987! Ветапзег,1983: Родионова, 19891, обясняется тем, что этот белок не является интегральным. Основное количество этого белка удаляется с поверхности мембран при их промывке воянши буферными растворами (процедура 3-х кратной промывки использовалась наш при получении препаратов ЕМ).

При окрашивании электрофореграмм ВМ ионами серебра, кроме полос полипептидов, можно наблюдать также полосы, характерные для ЛПС. Наиболее отчетливого их проявления удается достигнуть при анализе препаратов ВМ методом иммуноблоттинга с применением моноклональных антител Р.11-х, специфичных к ЛПС.

При анализе препаратов ВМ в РДЛ и ИЭФ с антитуляремийндаи сыворотками в регистрируемых количествах удается выявить только один компонент, идентифицированный нами как.ЛПС-содеркаший антиген. Это еще раз подтверждает данные [5апйз*гот, 19371 о прочном связывании основных интегральных белков с БМ в отличие от ЛПС, экстрагируемого солевыми раствор?®.

Иммуноэлектрофоретические исследования ВМ, обработанных дезоксихолатсм натрия, не позволили получить четкого распределения преципитируших компонентов. Затруднения в выявлении поверхностных антигенов ми попытались преодолеть путем сравнительного изучения спектров пре имитируют антител, содержащихся а' сыворотках кроликов, гиперикмунизированкых ВМ и живыми клетками штамма Я5, при использовании в качестве антигена ВСЭ ацетон-высушешшх клеток штамма Я5. Выявленные в составе ВСЭ аце тон-высуиенных клеток с помошьв гипериммунных сывороток 5-6 мембранных антигенов, один из которых идентифицирован как белок 63 кД, а два антигена в катодной области как ЛПС и его полисахарид, не отражают в полной мере спектр антигенов ВМ.

рюжная антигенная картина ВМ, представленная ЛПС и мембранными белками, эффективно проявляется техникой иммуноблоттинга, с применением специфических туляремийных сывороток. В этом случае нитроцеллюлознке реплики ВМ, проявленные антитуляремййными сыворотками, ггриобретают вид ДСН-электрофореграмм в ПААГ, окрашенных нитратом серебра, где на многочисленнее белковые полосы по всей длине г зля накладываются дискретные полосы молекул ЛПС с разной длиной О-цепи.

Для исследования иммунитета, создаваемого ВМ использовали

и

высоковярулентные штамма: A'Cole (тип А), 503 и 144/713 (тип В). Однократная подкожная . иммунизация препаратами ВМ (БООккг), полученными как из вакцинного, так к из вирулентного штаммов, создает у морских . свинок напряженный иммунитет, который обеспечивает - защиту 60-100$ животных в течение месяца (срок наблюдения) после заражения 1000 клетками штамма БОЗ или штамма 144/713..Достигнутый уровень специфической защиты при использовании отдельных серий препаратов ВМ, в этом случае сравним с уровнем, индуцируемым ЖТВ. •. Усиление защитного.эффекта наблюдается в течение первых суток ■ и достигает максимума к 15-21 суткам с момента иммунизации. Достаточно напряженный иммунитет сохраняется на высоком уровне " в течение 6 месяцев. Выраженного бактерионосительства у морских свинок, иммунизированных ВМ и зараженных 'штаммом 144/713 в. дозах от 10 до 1000 ж.м.к. в отдаленные сроки, после заражения» не выявлено.

Защитные свойства 8М против штата 503 были также подтверкдены нами в экспериментах на мышах линии СБА. При'этом эффективная зашита.наблюдалась при введении штамма 503 в дозах до ICO е.м.к,

Вместе с тем добиться высокой резистентности при иммунизации морских свинок ВМ к заражению • вирулентным 'штаммом A'cole не удалось. Лишь в , отдельных экспериментах при внутрибрюшинном введении ВМ удавалось, получить выживших кпвотагх при заражении штаммом A'Cole в дозах не более 20 вс.м.к.

Следувдий этап работы заключался в определении и характеристике мембранных компонентов, играют основнув роль в создании защтаого туляремийного иммунитета.

Одним из решавших условий при выполнении этой задачи явилась разработка способа получения антигенов ВМ, сохранявших нативные свойства. Из ряда опробованных ионных и неионных детергентов, использованных для солюбилизашш ВМ, наиболее эффективным оказался дезоксихолат натрия. Удачный выбор детергента в используемых концентрациях (0,05 М дезоксихолат натрия в 50 мМ трис~НС1 буфере, рН 8,0, содержащем 2 ЭДТА, 0,15 М хлористого натрия), позволил получить препараты, в которых содержание белка достигало 45-55Я от исходного.

Процедура солюбилизаши осушествлялась в. течение 4-8 часов при 18°С в условиях постоянного перемешивания. Затем смесь центрифугировали (100000 g, I час)' и супернатант (солюбилизат) фракционировали на колонке с сефакрклом $-200, уравновешенной тем

же оуферса, но с концентрацией детергента 10 кМ.. Нрсфяди элшии солюбшизатов ВМ, полученные из. разных партий биомассы одного и того же штамма, были обычно сходны по форме (рис.1).

3,3

1.5-

0.5

п.пасса

Рис Л. Гель-хроматография на сефгкриле 3-200 солюбилизи^эванных дезоксихолатом натрия внешних мембран Р.Шагепз1а (штамм А'Со1е>.

1 - (А280) - поглощение при 280 нм.

2 - С0215) - молярная эллиптичность при 215 нм.

3 ~ (сбелкэ) " концентрация белка по Лоури.

4 " (СЛПС5 " относительная концентрация ЛПС ш> показателю эллиптичности при 215нм (вклад белков в эллиптичность вычтен).

Некоторые штаммовые различия наблюдались в области высокомолекулярна Фракций. Фракции солюбилизата ЕМ с молекулярными массами: более 200 кД (фракция I), 85-200 кД (II), 35-85 кД (III), 15-35 кД (IV) и 5-15 кД (V) - диалиэовали против 10 мМ грис-riCl, pH 8,0, концентрировали на мембране РМ-Ю (Ajnicon) до исходного объема образца, нанесенного на колонку и при необходимости лиофильно высушивали.

Из данных, представленных на рис.1, следует, что основное содеркание белка приходится на'фракции III и iv. Липополисзхарид в силу своей гетерогенности присутствует во фракциях i-iv. По данным ИК-спектроскопии соотношение ЛПС:белок составило для фракции I -1:1,5, для II - 4:1, для III - 1,5:1 и для IV -ГЛ по массе.

Анализ ДСН-электрофореграмм белок-содеркащих фракций ill и IV из штаммов a'Cole и Mb подтвердил наличие в составе фракций белков с различными молекулярными массами и ЛПС, который представлен характерным для s-ЛПС грэмотрицательных бактерий набором дискретных полос. Во фракции Ш мажорным белковым компонентом является белок 43 кД. Белок 41-43 кД (РорА) описан как основной мембранный белок, имеющий существенное значение для диагностики туляремии [Bevanger, 1988, 19391. Между тем при исследовании его функциональной активности в PET со специфически!® Т-лимфоцитаыи существенных преимуществ среди других мембранных белков не выявлено fSurcel. 1SS9; SJosteüt, 19901■

В составе фракции IV обнаружено 3-4 белковые полосы в области моле^лярных масс 15,17,19 и реже 22 кД. Иногда в результате фракционирования солюбилизата ВМ из отдельных партий биомассы, как в случае штамма a'Cole, так и для штамма Я5, получали ЛПС-белковие комплексы (ЛПБК), содеркащие ЛПС и один белок 17 кД. Пока не ясно, с чем связаны эти различия. Возможно, что определенное значение имеют условия культивирования туляремийного микроба, или ке ЛПС оказывает влияние на миграцию бежа 17 кД. В дальнейшем методом иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител, полученных против белка 17 кД из R-клеток штамма Ш. 5, было выявлено связывание антител с белками (область м. м.15Л7.19 кД), присутствующих в препаратах ВМ вирулентного (шт.А'СоХе) и вакцинного (ит.Я5) штампов. Белок 17 кД принадлежит к группе интегральных мембранных белков и, возможно, входит в состав мембран в форме олигомерэ {Sends troni, 1937 3. Как отмечалось выше, мембранные белки Р. tularemic в указанной области молекулярных масс обладали

выраженной активностью в реакциях Т-клеточного иммунитета tSJostedt. 1990: Suroel, 19901.

С целью уточнения структурной организации белков, входящих в состав Фракций III и IV, было проведено более детальное изучение белковых спектров кругового дихроизма (КД) этих фракций. Форма спектра КЯ белкового компонента фракции III свидетельствует о том, что белок, входящий э ее состав» принадлежит к белкам с »-структурной укладкой полипептидной цепи.Белки в составе ЛПБК -Фракции IV имеют по данным кругового дихроизма преимущественно а-спиральнув конфорыацию. В отсутствии детергента мембранные белки образуют с ЛПС смешанные мицеллы или, возможно, ЛПС-Селковые комплексы с кажущейся ма сой более I07 кД.

ЛПБК фракций i-iv анализировали на серологическую активность в РД Т и ИФА со специфической кроличьей сывороткой, полученной на живые клетки вакцинного штамма J6I5, коммерческой лошадиной туляремийной сывороткой .. (КТО и моноклональкыми антителами гибридомы РВ11-х, специфичными к ЛПС. Серологическая активность фракций зависит от содержания в них ЛПС.

Таким образом, разработанный нами метод солюбилизации дезоксихолатом натрия 8М F.tularensis с последующим фракционированием на сефакриле s-200 обеспе'шл получение в препаративных количествах различающихся по составу и свойствам ЛПБК, что позволило далее перейти к анализу их протективных свойств. •

Препараты ЛПБК в различных концентрациях вводили мышам линии СБА внутрибрюшшно в объеме 0,2 мл. В качестве контролей использовали животных, которым вводили физиологический раствор, а также интактных мышей. Через 21 день после иммунизации животных заражали суспензией двухсуточной культуры вирулентного штамма 503. Наблюдение осуществляли в течение 28 суток с момента заражения.

Однократная иммунизация препаратами ЛПЕК-фракция IV, содержащими белок 17 кД, обеспечивает дозозависимый эффект выживания мышей (таблица I). Величина E%q препаратов из различных партий биомассы штамма М5 для трех независимых опытов составила 25. 34 и 4 мкг.

ЛПЕК-Фракция га, содеркашая белок 43 кЛ, также обладала протективными свойствами, однако значение ЕД^.для него Зыло в 7 раз выше по сравнению с £Hg0 для ЛПБК-фрзкщщ IV. Полученные результаты исследований демонстрируют возможность

достижения определенного уровня защиты от вирулентного шташа РДи1агепз1г при использовании изолированных структур бактериальной клетки - ЛПЕК.

Таблица I

Протектавная активность различных серий ЛПС-Оелхового комплекса (ЛПБК-^раишя Г?) из внешней мембраны штамма Мб для мышей при заражении вирулентным штаммом 503

Группа Препарат Доза Заражаю- Отношение Средняя про- ЕДцП кивот- препэ- щая доза количества доЛкитель-

ных рата (к.м.к.) выживших жи- ност*>. жизни (мкг)

(мкг) вотных к взя- павших кивот-

тым в;опыт ных (сутки)

1.6 90 1/6 10,6-4,2

ЛПЕК-Й фракция IV 8 40 200 90 90 90 0/6 4/6 6/6 9,4-0,35 17,5-4,0 25

Физ. р-р — 90 0/6 5,0*0,5

— —• 90 0/6 • 4,4*0,3

4 ' 75 3/6 11,3*3,8

ЛПБК-Л2 2. фракция IV 20 100 75 75 3/6 2/6 13,8-4,3 12,7*4,0 34

500 75 5/6 18,7

ФИЗ. ]>р — 75 0/6 5,4*0,3

1,6 50 5/8 15.0*2,2

ЛПНК-йЗ 3. фракция IV 8 40 50 &0 5/8 7/8 15,4*2,0 18,2*2,5 4

200 50 7/8 18,7*2,8

Сиз. р-р — 50 0/10 6,5*0,3

Оставалось невысненным: достаточно ли только белка 17 кД, свободного от ЛПС, для - формирования резистентности против туляремии; возможно ли моделирование протективных ЛПС-белковых комплексов из индивидуальных очищенных препаратов белка 17 кД и

ЛПС; какое оптимальное соотношение ЛПС и белка необходимо для реализации защитного эффекта; возможно ли заменить белок 17 кД в конструируемом . комплексе на другой мембранный белок.

Выделение,бедка■ 17 кД осуществляли из эвирулентного Я-варианта вакцинного штамма Ж5. Условия солюбилизащш ВМ детергентом и гель-хроматографии те же, что и при выделении препаратов ЛПБК из ВМ э-клеток. Коэффициент эксташии белка 17 кД в максимуме при 279 нм составляет 1,3 л х г"] х см*г. Рассчитанное из спектров кругового дихроизма значение. удельной эллиптичности в минимуме при 208 нм составляет : 9800 - 1200 град % см2/даоль. Содержание : «-спиралей в молекуле белка 17 кД составляет 28 - 2%, »-структуры - 26 - 2%, неупорядоченной конформе н - 46 - 3%. Белок обладает выраженными гидрофобными свойствами.

Для конструирования ЛПШ, бит использованы: очищенный ЛПС из вирулентного штамма 503, очищенный белок 17. кД из внешней мембраны эвирулентного й-взрианта аакшлнного штамма Щ5 и очищенный белок 63 кД из внешней мембраны вакцинного штамма Я5 .

В отличие от белка 17 кЯ белок 63 кД не является интегральным белком ВМ. Коэффициент экстинции белка в максимуме поглощения при 275.5 нм составляет 0.4 л х х см"1, По данным аминокислотного анализа в состав белка. 63 кД входит около 600 аминокислотных остатков. Рассчитанное из спектров кругового дихроизма содержание а-спиралей в молекуле белка составляет 55 £ Белок не содержит остатков триптофана. Отмечено взаимодействие белка бЗкД с I&В интактных кролика и че;:>века. .

ЛПС-белковые комплексы получали просим смешиванием препаратов ЛПС и белков в необходимых пропорциях, растворяли в физиологическом растворе и обрабатывали ультразвуком на льду.

Определение протективной активности проводили на мышах линии СБА массой 16-18 г. Препарата антигенов вводили внутрибршигоо в объеме 0,2 мл в различных концентрациях. В качестве контроля использовали животных, которым вводили физиологический раствор, а также интактных мышей. Через 21 день после иммунизации животных заражали суспензией двухсуточной культуры вирулентного штамма 503 в дойе 50 ж.м.к. Наблюдение вели в ■ течение 28 суток с момента заражения.

Установлено, что ни ЛПС, ни белок 63 кД. т сконструированные из них комплексы с различным соотношением ЛПС:белок не обладали протективными свойствами ни при одной из использованных

концентраций. Очищенный белок 17 кД обладал слабый защитным эффектом. Иммунизация ие комплексом ЛПС-белок 17 кД обеспечивала дозоэавискшй эффект выпивания мышей при заражении вирулентны?.! штаммом. Причем наиболее выраженный защитный эффект (Ш^д - 38 мкг) для комплекса ЛПС-белок 17 кД наблюдали при их соотношении 1:2. С увеличением количества ЛПС в комплексе защитный эффект препарата снижался. Для получения максимального защитного эффекта оптимальным, по-видимому, является эквивалентное соотношение ЛПС ."белок 17 кД в комплексе. Ранее такое соотношение ЛПС:белок 17 кД было обнаружено для препаратов ЛПБК-фракцки IV, выделенных из ВМ Г.г.ц1агепв1Б.

Совокупность представленных данных о роли ЛПС и мембранного белка 17 й в формировании защитного иммунитета позволяет предложить рекомендации по конструированию на их основе ЛПС-оелковых комплексов с протективными свойствами. С разработкой технологии получения препаратов очищенного рекомбинантного белка 17 кД, открывается перспектива создания рекомбинантной туляремийной вакшйш. Интересные результаты следует ожидать на пути создания молекулярной вакцины, например, на основе коньюгатов ЛПС, полисахарида или олигосахаридов с белком 17 кД или его пептидами, представляющими собой Т-клеточные эпитопы.

ВЫВОДЫ

I.Ведущий протективный антиген возбудителя туляремии представляет собой липополисахаридобелковый комплекс, белковая часть которого состоит из основных мембранных белков с молекулярной массой 17-19 кД.

2.Экспериментально созданные ЛПС-белковые комплексы из очищенных препаратов ЛПС и белка 17 кД, так же как ЛПС-белковые комплексы, выделенные из внешней мембраны Р.Ш1агепе1б, обладают защитными свойствами.

3.Для проявления защитного эффекта оптимальное соотношение ЛПС и белка в комплексе должно составлять 1:1 по массе; Замена белка 17 кД в ЛПС-белковом комплексе на белок 63 кД не позволяет получить препараты комплекса с защитными свойствами.

4.Выделен белок 17 кД внешней мембраны РЛи1агепв1б и изучены его основные свойства. Белок 17 кД присутствует как в Б-, так и В-клетках туляремийного микроба. Коэффициент экстинкции бежа 17 кД

- 1,3 л х г"1 х см'1, содерзаняе вторичных структур в молекуле оелка: а-спиралей - 28 ± 2%, о-структуры - 26 - 2 %, неупорядоченной конформацки - 46 i 355 о

5.Препараты ЕМ, полученные как из вирулентного (A'Coleh так из вакцинного штаммов» способны защищать 60-1СШ морских свинок, зараженных вирулентным штаммом 503 в дозе 1000 а.м.к. Защитный эффект достигает Максимума в 15-21 суткам с момента иммунизашс:.

6.Предложен способ. выделения ЛПС-белковых комплексов из ВМ P.tularensis путем солюбилизации последних дезоксихолатом натрия и фракционированием на сефакриле S-200.

СПИСОК РАБОТ. ОПУЕШ!КОВАНШ ГО ТЕЖ ДИССЕРТАЦИИ

1.Khlebnikov У.. Korovina 0.„ Golovliov I., Yetchinin S.. Zhemchugov V., loseva О., Kulevatsky D.» Urakov N. Purification and irmjunochemical characteristics of the 63 KDa protein from outer membrane of Francisella tularensis // 20th Meeting TEBSs Abstracts.- Budapest, 1990.-РИ7Э.

2.Kulevatsky D., Golovliov I., Korovina 0.. XhlebniUov V.. Urakov N. Conformational resistance of 63 kDa protein from the outer membrane of Francisella tularensis // 20th Meeting PEBS: Abstraots.-Budapest,1990.-P.174.

3.Хлебников В.С.,Головлез И.P. , Кулевашай Д„П., ЛзеринС.С., . Пширков C.D., Тохтамышева Н.В., Жемчугов 8.Е., Сафонова Л.А., Герасимов В.Н., .Чугун^з А.М.,Ветчиний С»С., Галактионов В.,' Г.. Афанасьев С.с. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии // Молекул, генетика -I99I.-J6 7.-С.15-20.

4.Khlebnikov V.S., Yetchinin , S.S., Tokhtamysheva N.V., Golovliov I.R., Grechko G.K., Kulevatsky D.P., Averln S.P., Zhenphugov v.E. Preventive of monoclonal antibodies specific to LPS of Francisella tularensis and localisation of antigenic determinant // 11th Meeting Europ. Federat. Imnunol. Soc.: Abstracts. -Finland,1991.-23-21.

5.Xhlebnikov V.S., Kulevatsky 0.7., Golovliov I.R., Tokhtamysheva H.v., Averin S.F., Korovina 0. v., Chugunov a M. Development of molecular antitularemio vaccine: approaches and prospeots // 11th Meeting Europ. Federat. Immunol. So'o.s Abstracta, -Finland,1991.-23-22,

6• Golov 1 iov I.R., Kulevatslcy. D.P.. Averin S.F. , Khlebnikov V.s. Protsotive IPS-pro te in сс-:лр1ех 2roa outer meabrtme ol Fraoiselia Sularensis // 11 tb Meeîijjg Жхгор. yeüerat. ïranunol. Soc.: Absiraots. -Finland,HS91.-12-9.

7.Хлебников B.C., Кулевацкий Д.П., Головлев И.Р., Тохтамышевз Н.В», Жемчугов В.Е., лверин С.Ф.« Коровина О.Б., Афанасьев С.С. Перспективы создания противотуляремийных вакцин нового поколения // Актуальн.пробл. щхзф.;.туляремии: Тез. докл. Всесоэзэ» конф. 15-17 ОКТ.19Э1,-Симферополь -M./J99I.=C.Î88-I89.

8.Хлебников B.C. .ТохтамышеваН.В. .Кулевацкий Д.П..Головлев И.Р., Аверин С.Ф., Чугунов А. И. Свойства основных имыуногенов (ЛПС и белка 17 кД внешней мембраны) Pranoisella tularensis //Актуальн.пробл. проф. туляремии::Тез., докл. Всесоюз. конф. 15-17 OKT.I99I, Симферополь -M.,1991.-С.189-190.

Э.Хлебников B.C..Кулевацкий Д.П., Головлев И.Р., Аверин С.Ф., Жемчугов В.Е, Чугунов .; A.M., Афанасьев С.С. Исследование ЖЮ-белкового комплекса из внешней, мембраны Franoîsella tularensis // Ж. ыгфобиол. эпидемиол. и шмуиобйол.-1992. -J£3.-C.I3-I7.-

Ю.Хлебников В.С.'.Головлев И.Р.чТохтамшева Н.В., Аверин С.Ф., Кулевацкий Д.П., Гречко/ Г.К., . Аверина âU., Ветчинин С.С. Определение антигенной детерминанта превентивных моноклональных антател, специфичных к лшополисахариду : дашрешйного ншфоба // Ж.иикробиол.эпидемиол. к нммунобиол.-ШЗЗ.-йЬ -С.63-88.

И.Хлебников B.C.,Коровина О.В., Кулевацкий Д.П., Жемчугов В.Е. Иммуноглобулинсвязывавший " оелок 63. кД «цуляремийного• микроба. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Тез.докл. Российской научн.конф.21-22 окт.1992, Волгоград - В. 1932. - С.143.

ira, >е-е.,з»*лаь.