Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липолиз, система глутатиона и окислительная модификация белков в адипоцитах крыс при аллоксановом диабете

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липолиз, система глутатиона и окислительная модификация белков в адипоцитах крыс при аллоксановом диабете"

На правах рукописи

005043704

Шахристова Евгения Викторовна

ЛИПОЛИЗ, СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА И ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ В АДИПОЦИТАХ КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ

03.01.04 - биохимия 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 МАЙ 2012

Новосибирск - 2012

005043704

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск).

Научные руководители:

кандидат биологических наук,

доцент Иванов Владимир Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Степовая Елена Алексеевна

Официальные оппоненты:

Усынин Иван Федорович доктор биологических наук, ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, заведующий лабораторией

Пальчикова Наталья Александровна доктор биологических наук, ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Омск).

Защита состоится «£9» 2012 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.034.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ биохимии»

СО РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

Русских Галина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в патогенезе сахарного диабета (СД) на стадии его возникновения (деструкция В-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы) и в период развития осложнений [Меньшикова Е. Б. и др., 2006; Балаболкин М. И. и др., 2008; Меньшикова Е. Б и др., 2008; Но Е., Bray Т. М., 1999; Evans J. L. et al., 2003; Robertson R. Р., 2004; Спор M. et al., 2005; Kaneto H. et al., 2007; Rains J. L., Jain S. K., 2011]. В основе диабетогенного действия аллоксана лежит его способность генерировать токсичные свободные радикалы [Иванов В. В. и др., 2010; Sakurai К., Ogiso Т., 1991; Szkudelski Т., 2001; Elsner М. et al., 2006; Lenzen S., 2008], что позволяет использовать аллоксановый диабет как адекватную модель для изучения роли окислительного стресса в нарушении метаболизма жировой ткани при СД 1 типа.

Повышению активности свободнорадикалыюго окисления при СД сопровождающемуся снижением антиокислительной защиты, имеющей тканевую специфичность, способствуют недостаточность инсулина, гипергликемия и гиперлипидемия [Carriere A. et al., 2003; Faure Р., 2003; Galinier A. et al., 2006; Poglio S. et al., 2009]. Важнейшим компонентом антиоксидантной системы, принимающим также участие в регуляции экспрессии генов, активности ферментов, клеточной сигнализации и других процессов, является глутатион [Кулинский В.И., Колесниченко JI.C., 1990; Кулинский В. И., 2009; Stadtman Е. R., 2000; Curtís J. М. et al., 2010]. Дисбаланс систем «прооксиданты - антиоксиданты» и индукция свободно-радикального окисления могут приводить к изменению белково-липидых взаимодействий в биологических мембранах, повреждению нуклеиновых кислот, окислительной модификации белковых молекул в клетках-мишенях, в частности в адипоцитах [Владимиров Ю. А., 2000; Дубинина Е. Е., 2006; Лущак В. И., 2007; Дубинина Е. Е., 2010; Stadtman Е. R., Levine R. L., 2000; Droge W., 2002; OsawaT., 2005; Edeas M. et al., 2010]. Окислительная модификация вызывает изменения структурной организации белков, их агрегацию и денатурацию, приводя к нарушению или исчезновению функциональной активности протеинов (каталитической, регуляторной, транспортной, рецепторной и др.), и может индуцировать гибель клетки [Дубинина Е. Е., 2006; Лущак В. И., 2007; Droge W., 2002].

Известно, что высокий уровень АФК и свободных жирных кислот (СЖК) в плазме крови, играет важную роль в механизмах развития осложнений СД [Rahimi R. et al., 2005; Eriksson J. W„ 2007; Newsholme P. et al., 2007; Pérez-Matute P. et al., 2009; Giacco F„ Brownlee M., 2010]. Важным фактором определяющим уровень СЖК в плазме крови является липолиз в жировой ткани. Последние работы в этой области показали, что липолиз - не просто метаболитический путь, стимулируемый катехоламинами и ингибируемый инсулином, а более сложный и тонко регулируемый процесс [AhmadF. et al., 2009; Miyoshi H. et al., 2010; Degerman E. et al., 2011]. Открытие новых белков, вовлеченных в регуляцию гидролиза

триацилглицеролов, ряда эндокринных и паракринных факторов привели к пересмотру механизмов трансдукции сигнала в жировых клетках [Шварц В., 2009; Romijn J. A., Fliers Е., 2005; Bartness Т. J., Song С. К. 2007]. В тоже время регуляция липолитических процессов в адипоцитах, в частности влияние на них системы глутатиона и окислительной модификации белков в жировой ткани при диабете 1 типа недостаточно изучены.

Цель исследования: установить роль системы глутатиона и окислительной модификации белков в механизмах изменений активности липолиза в адипоцитах крыс при аллоксановом диабете.

Задачи исследования:

1. Определить содержание продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в адипоцитах и плазме крови крыс при аллоксановом диабете.

2. Оценить состояние системы глутатиона в адипоцитах и плазме крови крыс при аллоксановом диабете.

3. Изучить особенности спонтанного и индуцированного липолиза в адипоцитах крыс при аллоксановом диабете.

4. Установить механизмы изменения активности спонтанного и стимулированного липолиза in vitro в адипоцитах крыс при действии аллоксана.

5. Выявить влияние системы глутатиона и окислительной модификации белков на активность спонтанного и стимулированного липолиза в адипоцитах крыс при аллоксановом диабете.

Научная новизна. Впервые установлена роль системы глутатиона и окислительной модификации липидов и белков в механизмах модуляции спонтанного и стимулированного изопротеренолом липолиза в адипоцитах, изолированных из эпидидимальной жировой ткани, при экспериментальном аллоксановом диабете. Показано, что в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом и при действии аллоксана (5 мМ) на жировые клетки in vitro, увеличено содержание продуктов липидной пероксидации и окислительной модификации белков, снижены редокс-потенциал системы глутатиона и активность глутатионпероксидазы. Установлено, что окислительный стресс, развивающийся в адипоцитах при аллоксановом диабете, приводит к активации спонтанного и ингибированию стимулированного изопротеренолом липолиза, а также снижению ингибирующего действия инсулина на липолиз.

В экспериментах in vitro на изолированных адипоцитах крыс показано, что механизмы активации спонтанного и ингибирования стимулированного изопротеренолом липолиза сопряжены с участием супероксидного анион-радикала и редокс-состоянием системы глутатиона.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования носят фундаментальный характер и раскрывают механизмы влияния системы глутатиона и окислительной модификации белков на липолиз в адипоцитах при аллоксановом диабете, что позволяет расширить существующие представления о патогенезе СД 1 типа.

Полученные данные о механизмах активации спонтанного липолиза и снижении ингибирующего действия инсулина на стимулированный липолиз при экспериментальном аллоксановом диабете могут стать основой для разработки способов фармакологической коррекции осложнений СД.

Положения, выносимые на защиту:

1. При аллоксановом диабете в адипоцитах крыс, изолированных из эпидидимальной жировой ткани, регистрируется активация окислительной модификации липидов и белков, снижение редокс-состояния системы глутатиона, повышение спонтанного и ингибирование стимулированного агонистом (32-адренорецепторов изопротеренолом липолиза, при этом способность инсулина ингибировать стимулированный липолиз снижается.

2. Ловушка супероксидного анион-радикала марганец-тетра (N-mcthji-4-пиридил) порфирин в условиях окислительного стресса in vitro в изолированных адипоцитах крыс предотвращает активацию спонтанного липолиза, частично снимает ингибирующее действие аллоксана (5 мМ) на стимулированный изопротеренолом липолиз и полностью - на N(6)-2'-дибутирил-цАМФ индуцированный липолиз.

3. Блокирование функциональных SH-групп глутатиона и белков N-этилмалеимидом в изолированных адипоцитах крыс in vitro сопровождается увеличением спонтанного и ингибированием стимулированного изопротеренолом липолиза.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на X Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009), XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009), Научной конференции с международным участием «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии» (Томск,

2009), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва,

2010), XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 2010), XVII Межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы, включающего 336 источников, из них - 38 отечественных и 298 иностранных. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 11 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для реализации предпринятого нами исследования были выделены два блока: эксперименты на модели аллоксанового диабета и опыты in vitro на изолированных адипоцитах крыс.

В исследование были включены 73 белых беспородных крысы-самца весом 310 ± 50 г, полученных из ОАО Питомник «Рассвет» г. Томска. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном рационе кормления, при свободном доступе к воде и пище. Крысы были разделены на группы согласно задачам исследования (табл. 1).

Таблица 1

Распределение животных по группам эксперимента

Группы животных Количество животных в группе

1 - контрольная группа (введение физ. раствора) 19

2 - опытная группа (введение аллоксана в дозе 90 мг/кг в течение 4 дней) 16

3 -эксперименты in vitro 38

Исследования проводили на базах межкафедральной лаборатории оптической спектроскопии (зав. лабораторией - Е. В. Шахристова) и лаборатории биологических моделей (зав. лабораторией -к.б.н. В. В. Иванов) ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (ректор - акад. РАМН В.В. Новицкий).

Сахарный диабет у крыс индуцировали внутрибрюшинной инъекцией натощак раствора аллоксана («Sigma», St. Louis, МО) в цитратном буфере (рН=4,4) в дозе 90 мг/кг в течение 4 дней [Mathews С. Е„ Leiter Е. Н., 1999]. Контрольным крысам вводили физиологический раствор в том же объеме, что и аллоксан опытным животным. Через четырнадцать дней после окончания курса введения аллоксана у крыс определяли концентрацию глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены. В эксперимент включали животных с уровнем гипергликемии не менее 19 мМ. Крыс подвергали С02-асфиксии, получали плазму крови и эпидидимальную жировую ткань, из которой выделяли адипоциты по методу М. Rodbell (1964) с использованием коллагеназы 1 типа в концентрации 1 мг/мл (активность 146 ед/мл, «Sigma», St. Louis, МО). Кусочки жировой ткани инкубировали с коллагеназой 45 мин при 37°С в СОг-инкубаторе («Sanyo», Япония), фильтровали через нейлоновый фильтр. Изолированные адипоциты трижды промывали 5 мл буфера (10 мМ Hepes буфер, раствор Кребса-Рингера, 2 % бычий сывороточный альбумин, 5 мМ глюкоза) и центрифугировали на центрифуге Biofuge Primo R (Thermo, Великобритания) 1 мин при 1000 об/мин. Адипоциты ресуспенди-ровали в 3 мл буфера, осуществляли подсчет числа клеток и определение их жизнеспособности с применением 0,1 % раствором трипанового синего.

В плазме крови контрольных крыс и животных с СД определяли концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом с помощью набора реагентов «Новоглюк» («Вектор БЕСТ», Россия) и инсулина при помощи наборов Insulin IRMA KIT (Immunotech, Чехия), иммунорадиометрическим методом, основанным на использовании двух видов мышиных моноклональ-ных антител к различным эпитопам молекулы инсулина [Yallow R. S., Berson S.A., 1970].

Так же в плазме крови и изолированных адипоцитах контрольных крыс и животных с аллоксановым диабетом оценивали содержание СЖК с использованием набора «NEFA» («RANDOX», Великобритания).

В плазме крови и изолированных адипоцитах контрольных крыс и животных с аллоксановым диабетом, а также в опытах in vitro оценивали интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации гидроперекисей липидов, определяемых FOX-2 методом [Hermes-Lima M. et al., 1995] по способности гидроперекисей липидов при кислом значении pH окислять ионы Fe2+ с образованием комплекса Fe^-ксиленол-оранж, имеющего максимум поглощения при >„=580 нм; и содержанию ТБК-активных продуктов по методу К. Yagi [Yagi К., 1976; Yagi Y. et al., 1976], основанному на флюоресценции триметинового комплекса, образующегося при взаимодействии малонового диальдегида (конечного продукта ПОЛ) с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Показатели окислительной модификации белков (карбонильные производные белков, битирозин и окисленный триптофан) определяли в плазме крови, адипоцитах контрольных крыс и животных с аллоксановым диабетом, а также в опытах in vitro. Карбонильные производные белков (КП) оценивали методом, основанным на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-альдегидфенилгидразонов и 2,4-кетондинитрофенилгидра-зонов, которые регистрировали спектрофотометрически при Х=214 нм и Х=363 нм, соответственно [Арутюнян А. В. и др., 2000]. Концентрацию окисленного триптофана регистрировали по снижению флюоресценции триптофана и при длине волны возбуждения 295 нм и длине волны испускания 325 нм, содержание битирозина - по увеличению флюоресценци при длине волны возбуждения 325 нм и длине волны испускания 415 нм, определяемой на спектрофлюориметре («Hitachi 850», Япония).

В экспериментах in vitro детекцию образования АФК, представленных перекисными группировками, в изолированных адипоцитах осуществляли с использованием флюоресцентного -зонда 2,7-дихлор-флюоресцеиндиацетата (ДХФДА, «Sigma», St. Louis, МО), который способен проникать в цитоплазму клеток в виде ацетилового эфира. В цитоплазме зонд деэстерифицируется под действием эстераз, что исключает возможность его транспорта из клеток, и приобретает способность флюоресцировать после взаимодействия с перекисными группировками.

В плазме крови и изолированных адипоцитах контрольных крыс и животных с аллоксановым диабетом, а также в опытах in vitro определяли

содержание общего, восстановленного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG) чувствительным циклическим методом, предложенным М. Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004), основанным на способности GSH взаимодействовать с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой с образованием тионитрофенолыгого аниона, имеющего характерный максимум поглощения при Х=412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается специфически глутатионредуктазой и восстановленная форма трипептида вновь взаимодействует с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой.

Определение концентрации белковосвязанного глутатиона в плазме крови и изолированных адипоцитах контрольных крыс и животных с аллоксановым диабетом, а также в опытах in vitro основано на способности боргидрата натрия высвобождать глутатион из связи с белками, содержание которого затем измеряется спектрофотометрически [Burchill B.R. et al., 1978].

Глутатионпероксидазную активность в плазме крови и изолированных адипоцитах контрольных крыс и животных с аллоксановым диабетом определяли в сопряженной глутатионредуктазной системе по скорости окисления НАДФН при Х= 340 нм с гидропероксидом трет-бутила в качестве субстрата [Little С., О "Brien P.J., 1968].

В изолированных жировых клетках оценивали интенсивность базального и стимулированного липолиза по выходу в инкубационную среду глицерола и СЖК. Для стимуляции липолиза к адипоцитам добавляли агонист р2-адренорецепторов - изопротеренол («Sigma», США) в конечной концентрации 1 мкМ [Kraemer F. В., Shen W. J., 2002]. Ингибирукмцее действие инсулина на интенсивность липолиза исследовали при добавлении гормона в конечной концентрации 10 нМ («Sigma», США) [Morimoto С. et al., 1998] к изолированным адипоцитам контрольных крыс и жировым клеткам животных с аллоксановым диабетом. Клетки инкубировали 3 ч при 37°С в COi-инкубаторе («Sanyo», Япония), интенсивность липолиза оценивали по содержанию глицерола в инкубационной среде, который определяли ферментативным методом [Wieland О. N., 1984] с использованием «Free glycerol reagent» («Sigma», США).

На следующем этапе исследования в экспериментах in vitro к адипоцитам добавляли аллоксан («Sigma», США), растворенный в дистиллированной воде, в конечных концентрациях 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 мМ [Kandulska К. et al., 1999], пробы инкубировали 3 ч при 37°С в С02-инкубаторе («Sanyo», Япония), затем клетки использовали для определения концентраций ряда показателей: гидроперекисей липидов, ТБК-активных продуктов, АФК, КП, битирозина, окисленного триптофана, GSH и GSSG, глицерола. Тестирование функциональной активности адипоцитов проводили в суспензиях клеток с жизнеспособностью не менее 90 %.

Для выяснения механизмов влияния аллоксана на спонтанный и стимулированный липолиз в адипоцитах и выявления роли в этих процессах ПОЛ и системы глутатионзависимой антиоксидантной защиты использовали аналог цАМФ - 1\'(6)-2'-дибутирил-цЛМФ (Db-cAMP) («Sigma», США) в

конечной концентрации 0,5 мМ [Lei Т. et al., 2004], ловушку супероксидного анион-радикала - марганец-тетра (М-мегил-4-пиридил) порфирин (Мп-ТМРуР) («Sigma», США) в конечной концентрации 100 мкМ [Buckley В. J., Whorton A. R., 2000] и блокатор SH-групп - N-этилмалеимид (NEM) («Sigma», США) в концентрациях 0,2 и 0,8 мМ [Giudicelli Y. et al., 1975].

При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Гублер Е. В., Генкин А. А., 1973; Гланц С., 1999]. Проверка на соответствие выборок нормальному закону распределения проводилась критерием Шапиро-Вилка. В связи с отсутствием согласия данных с нормальным распределением на уровне значимости р<0,01 и р<0,05 вычисляли средневыборочные характеристики: медиана (Me), первый и третий квартили (Q1-Q3). Достоверность различий независимых выборок оценивали с помощью непараметрических критериев для малых групп Манна-Уитни - для двух независимых групп исследования и Краскала-Уолиса - для пяти независимых групп исследования. Различия считались достоверными при достигнутом уровне значимости р<0,05. Межгрупповой анализ проводили с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни. Для выявления взаимосвязей между показателями, оценки их силы и направления применяли непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате экспериментов было установлено, что через две недели после инъекций аллоксана (в дозе 90 мг/кг) у крыс развивался СД. Содержание инсулина в плазме крови у животных с аллоксановым диабетом снижалось до 9,2 (8,3-10,1) мкЕд/мл (р<0,05) (в контроле 26,2(24,0-27,8) мкЕд/мл). Это является результатом селективного поглощения аллоксана B-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, который в результате восстановления в диалуровую кислоту генерирует свободные радикалы (супероксидный анион-радикал (02*), гидроксильный анион-радикал (ОН')), вызывающие повреждение белков, разрывы ДНК и гибель инсулинсекретирующих клеток [Sakurai К. et al., 2001, Szkudelski Т., 2001, Eisner М. et al., 2006]. Снижение секреции инсулина приводило к стойкой гипергликемии. Концентрация глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом натощак составила 22,1 (19,6-25,3) мМ (р<0,01), в контроле 5,1 (4,4-5,5) мМ. Параллельно с возрастанием концентрации глюкозы в крови крыс с экспериментальным диабетом было выявлено повышение уровня СЖК до 0,62 (0,50-0,83) мМ (р<0,01) по сравнению с соответствующими величинами в контрольной группе, составившими 0,32 (0,29-0,34) мМ.

Известно, что высокие концентрации глюкозы и СЖК нарушают секрецию инсулина, воздействуя на важнейшие этапы синтеза и секреции гормона [Eriksson J. W., 2007]. Это подтверждается обнаруженной нами

отрицательной корреляционной связью между содержанием инсулина и глюкозы в плазме крови крыс с аллоксановым диабетом (г=-0,53, р<0,05).

При развитии аллоксанового диабета у крыс стойкая гипергликемия и высокое содержание СЖК в плазме крови способствовали генерации АФК и развитию окислительного стресса в организме. У крыс с аллоксановым диабетом в плазме крови увеличивалась концентрация гидроперекисей липидов до 18,6 (7,8-29,3) мкМ (р<0,05), в контроле - 5,4 (4,8-7,9) мкМ, а также возрастал уровень ТБК-активных продуктов в 26,8 раза, в контроле 0,013 (0,013-0,014) мкМ), что свидетельствует об активации процессов ПОЛ в организме.

При СД избыточная продукция АФК в условиях дефицита компонентов антиоксидантной защиты способствует образованию широкого спектра продуктов окисления, среди которых наиболее известны малоновый диальдегид, 4-гидрокси-2-ноненапь, глиоксаль и 4-окси-2-ноненаль. Малоновый диальдегид, содержащий в своей структуре альдегидные группы, взаимодействует с аминогруппами белков с образованием шиффовых оснований. Аминокислотные остатки в составе протеинов подвергаются атаке 4-гидрокси-2-ноненаля с образованием циклических аддуктов, которые могут далее превращаться до КП [Дубинина Е. Е., 2006; Лущак В. И., 2007; Дубинина Е. Е., 2010].

В плазме крови контрольных крыс содержание КП, регистрируемое при длине волны 274 нм, составляло 11,39 (10,87-13,10) у.е./мг белка, а при длине волны 363 нм - 23,06 (21,18-23,42) у.е./мг белка. У крыс с аллоксановым диабетом в плазме крови выявлено увеличение концентрации КП в 3,1 раза и 2,3 раза, при 1=274 нм и 1=363 нм, соответственно.

Известно, что металлы переменной валентности (Си2+, Ре2+) участвуют в металл-катализируемых процессах окислительной модификации белков, характеризующих окисляемость протеинов. Для стимуляции процессов окисления белков плазмы нами были использованы компоненты системы Фентона [Арутюнян А. В. и др., 2000]. При инкубации плазмы крови контрольных крыс с 4 мМ раствором Ре804 и 0,3 мМ раствором пероксида водорода содержание КП составило при длинах волн 274 нм и 363 нм, соответственно 131,96 (109,78-137,99) у.е./мг белка и 192,90 (191,75-195,01) у.е./мг белка. В плазме крови крыс с аллоксановым диабетом при добавлении компонентов системы Фентона отмечено увеличение содержания КП в 1,8 раза при 1=274 нм и в 1,5 раза при 1=363 нм относительно контрольных значений, что свидетельствует о большей подверженности молекул белков плазмы крови окислительным повреждениям.

При определении содержания окисленного триптофана в плазме крови крыс с аллоксановым диабетом было отмечено его увеличение в 1,2 раза по сравнению с аналогичными значениями в группе контрольных животных, которые составили 0,92 (0,90-0,95) у.е./мг белка. Концентрация битирозина в плазме крови контрольных крыс составила 0,13 (0,12-0,14) у.е./мг белка. По сравнению с этими показателями у крыс с аллоксановым диабетом уровень битирозина в плазме увеличился в 1,5 раза.

Активация процессов свободнорадикального окисления приводила к снижению концентрации общего и восстановленного глутатиона в плазме крови крыс с экспериментальным диабетом в 1,5 раза по сравнению с контрольными значениями, составляющими 0,067 (0,0650,082) нмоль/мг белка и 0,060 (0,059-0,076) нмоль/мг белка.

Наиболее показательной с точки зрения антиоксидантного потенциала глутатиона является величина отношения GSH к GSSG, которая в настоящее время рассматривается как один из маркеров окислительного стресса [Меньщикова Е. Б. и др., 2006]. Величина отношения GSH/GSSG в плазме крови крыс с экспериментальным диабетом была в 1,4 раза ниже этого показателя у контрольных животных - 9,7 (8,2-13,4). При снижении величины отношения GSH/GSSG в условиях окислительного стресса тиоловые группы белков могут модифицироваться обратимо с образованием смешанных дисульфидов между белковыми SH-группами и SH-группами молекул с низкой молекулярной массой, такими как глутатион, этот процесс называется S-глутатионилирование [Gilge J. L. et al., 2008].

Нами установлено, что в плазме крови крыс с аллоксановым диабетом увеличивалась концентрация белковосвязанного глутатиона в 1,4 раза по сравнению с контрольными значениями, составляющими 0,005 (0,0040,005) нмоль/мг белка. Можно предполагать, что расходование GSH в окислительных реакциях сопровождается генерацией GSSG, взаимодействующего с SH-группами белков.

Уровень GSH в плазме крови определяется многими факторами, в том числе активностью глутатионпероксидазы, восстанавливающей гидроперекиси и использующей GSH в качестве субстрата. У крыс с аллоксановым диабетом в плазме крови активность глутатионпероксидазы уменьшалась в 1,9 раза по сравнению с контрольными величинами, составившими 108,9 (101,2-142,4) нмоль НАДФН/мин-мг белка.

В плазме крови преобладающую роль играет глутатионпероксидаза 3, секретируемая клетками почек и легких [Drevet J. R., 2006]. Lee Y. S. и коллеги показали, что ген глутатионпероксидазы 3 с высокой скоростью также экспрессируется жировой тканью, фермент секретируется в кровь, однако, скорость экспрессии гена в адипоцитах снижается в условиях окислительного стресса [Lee Y. S. et al., 2008]. Действительно, нами обнаружена отрицательная корреляционная связь (г=-0,77, р<0,05) между активностью глутатионпероксидазы и концентрацией гидроперекисей липидов в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом. В тоже время нельзя исключить, что снижение активности фермента в крови крыс с экспериментальным диабетом обусловлено высокой интенсивностью свободнорадикального окисления, к продуктам которого глутатионпероксидаза чувствительна [Suzuki К. et al., 2000; Miyamoto Y. et al., 2003]. Подтверждением данного предположения является наличие отрицательной корреляционной связи между активностью глутатионпероксидазы и концентрацией гидроперекисей липидов в плазме крови крыс с экспериментальным диабетом (г=-0,58, р<0,05).

Активация окислительного стресса и снижение антиоксидантного потенциала в плазме крови широко описаны в литературе на различных экспериментальных моделях СД 2 и 1 типа, а также в клинических исследованиях [Но Е., Вгау Т. М., 1999, Robertson R. Р., 2004, Меньшикова Е. Б. и др., 2008]. В тоже время отсутствуют сведения о состоянии систем про- и антиоксидантов в жировой ткани при аллоксановом диабете - модели СД 1 типа. Поэтому нами было исследовано состояние ПОЛ, окислительной модификации белков и глутатионовой системы антиоксидантной защиты в адипоцитах эпидидимальной жировой ткани крыс.

В ходе экспериментальных исследований в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом нами было зарегистрировано повышение концентрации гидроперекисей липидов в 1,6 раза по сравнению со значениями соответствующих показателей в группе контроля (5,64 (5,125,86) нмоль/мг белка). Деградация первичных метаболитов ПОЛ приводит к накоплению вторичных и конечных продуктов свободнорадикального процесса. Нами установлено повышение содержания в 5,8 раза ТБК-активных продуктов в адипоцитах крыс с экспериментальным диабетом по сравнению с контрольными значениями, составившими 0,98 (0,921,05) нмоль/мг белка.

Оценка состояния процессов окислительной модификации белков в адипоцитах крыс с аллоксановым даибетом показала увеличение содержания КП (табл. 2). Повышение концентрации КП обусловлено, с одной стороны, гиперпродукцией АФК, а с другой стороны, снижением активности систем антиоксидантной защиты клеток. Продукты ПОЛ и окислительной модификации белков медленно элиминируются из клеток, выступая в качестве источника свободных радикалов, истощая запасы внутриклеточных антиоксидантов - глутатиона, аскорбиновой кислоты и др. [Кулинский В. И., 2009, Stadtman Е. R., 2000, Curtis J. М. et al„ 2010]. Так, в адипоцитах нами была отмечена тесная корреляционная связь между содержанием продуктов металл-катализируемого окисления белков, определяемых при /.=363 нм, и концентрацией окисленного глутатиона (г=0,78, р<0,01).

Альдегидфенилгидразоны, регистрируемые при длине волны 274 нм, являются ранними маркерами окислительной деструкции белка и свидетельствуют о начальном этапе повреждений белковых молекул. В нашем исследовании их содержание в адипоцитах крыс с экспериментальным диабетом увеличивалось в 5,8 раза по сравнению с аналогичным показателем в группе контроля (табл. 2). При спонтанной окислительной модификации белков кетондинитрофенилгидразоны, определяемые при длине волны 363 нм, рассматриваются как поздние маркеры окислительной деструкции белка. В адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом содержание кетондинитрофенилгидразонов в 3,8 раза превышало контрольные значения, что свидетельствует о значительной подверженности молекул белков адипоцитов окислительным повреждениям при СД.

Большое количество карбонильных соединений, связанных с деградацией белков, образуется в результате металл-катализируемого

окисления [Дубинина Е. Е., 2006]. Действие компонентов системы Фентона при металл-катализируемом окислении связывают, в основном, с генерацией гидроксильного радикала, однако не исключена возможность образования и других реакционных соединений, в частности феррил- и перферрил-ионов (РеО , РеОН ). Увеличение содержания кетондинитрофенилгидразонов в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом в 2,1 раза по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе при металл-катализируемой окислительной модификации белков (табл. 2), свидетельствует об истощении резервных возможностей клеток.

Таблица 2

Содержание карбонильных производных белков в изолированных адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом при спонтанном и металл-катализируемом окислении (Ме (СЬ-СЬ), р)

Группы животных Карбонильные производные белков, у.е./мг белка

Спонтанная окислительная модификация белков Металл-катализируемая окислительная модификация белков

>1=274 им /.=363 им Х=274 им Х=363нм

Контроль (введение физиологического раствора), п= 9 4,66 (4,28-5,55) 8,36 (8,07-8,56) 16,83 (14,89-16,98) 22,65 (21,70-23,77)

Аллоксановый диабет, п= 9 27,01 (24,09-27,88) р<0,01 31,78 (31,02-31,99) р<0,01 41,84 (41,39-46,26) р<0,01 48,22 (45,94-48,48) р<0,01

Примечание: р - уровень значимости различий, рассчитанный относительно контрольных величин

Состояние окислительной деградации белков отражает не только содержание карбонильных компонентов. Окислению при участии АФК подвергаются и отдельные радикалы аминокислот. Битирозин стабилен в присутствии различных протеаз, устойчив при кислотном гидролизе, что создает предпосылки для его накопления в организме и участия в патологических процессах [Дубинина Е. Е., 2006, Лущак В. И., 2007]. Так в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом нами было выявлено увеличение в 1,5 раза содержания битирозина по сравнению с контрольной группой (2,28 (2,06-2,53) у.е./мг белка). В адипоцитах крыс с экспериментальным диабетом также увеличивалась концентрация окисленного триптофана в 1,4 раза по сравнению с аналогичными значениями в жировых клетках контрольных животных, которые составили 0,73 (0,70-0,76) у.е./мг белка.

Обнаруженное нами увеличение содержания продуктов окислительной модификации белков в адипоцитах может играть важную роль в нарушении метаболизма липидов и его регуляции в жировой ткани при аллоксановом диабете.

Наряду с увеличением содержания продуктов окислительной модификации липидов и белков в жировой ткани крыс с аллоксановым

диабетом существенно изменяется состояние системы глутатиона. Активация процессов ПОЛ в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом приводила к снижению в 1,2 раза концентрации общего глутатиона ив 1,3 раза содержания С8Н. Наметилась тенденция к снижению концентрации GS.SC (табл. 3). При этом величина отношения ОБН/вЗЯС значительно снижалась, что свидетельствует о сокращении редокс-потенциала системы глутатиона в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом.

Таблица 3

Содержание общего (05Н + ОБЗв), восстановленного (05Н), окисленного (С55С) и белковосвязанного глутатиона (Белок^в), активность глутатионпероксидазы (ГПО) в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом (Ме «2,-Оз), р)

Исследуемые показатели Контроль (введение физиологического раствора), п= 8 Аллоксановый диабет, п= 7

вБН + 0580, нмоль/мг белка 19,61 (19,02-19,86) 15,75(14,68-15,89) р< 0,01

СЯН, нмоль/мг белка 17,01 (16,42-17,33) 13,28(12,10-13,66) р< 0,01

GS.SC, нмоль/мг белка 2,43 (2,31-2,53) 2,55 (2,54-2,71)

СвН/вЗЯС 7,30 (6,90-7,60) 5,20 (4,75-5,30) р< 0,05

ГПО, нмоль НАДФН/мин мг белка 241,1 (219,6-284,1) 131,8 (85,7-187,6) р<0,01

Белок- 55С, нмоль/мг белка 1,68(1,45-1,93) 2,22 (2,05-2,42) р<0,05

Примечание: р - уровень значимости различий, рассчитанный относительно контрольных величин

В недавних исследованиях А. СаНшег е! а1. (2006), было показано, что эпидидимальная жировая ткань характеризуется более высоким содержанием общего глутатиона, но низким редокс-состоянием системы глутатиона, что способствует повышенной чувствительности адипоцитов к окислительному стрессу по сравнению с гепатоцитами и кардиомиоцитами. В ней также обнаруживается более высокая концентрация малонового диальдегида несмотря на высокую активность глутатионпероксидазы и каталазы [СаПтег А. & а1., 2006].

В наших исследованиях было показано, что активность глутатионпероксидазы в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом снижалась в 1,8 раза (табл. 3).

В адипоцитах крыс с экспериментальным диабетом нами было выявлено увеличение в 1,3 раза содержания белковосвязанного глутатиона по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе животных (табл. 3). Эти данные свидетельствую о высоких потребностях жировых клеток в 08Н, необходимом для защиты белков в адипоцитах от окислительных

повреждений, и как следствие - снижение в клетках жировой ткани содержания вБН в условиях окислительного стресса при аллоксановом диабете.

Известно, что липолиз в жировых клетках характеризуется гормончувствительной и гормоннечувствительной активностью. Последний получил название спонтанного липолиза [Моптою С. (Н а1., 1998]. В наших экспериментах установлено, что окислительный стресс в жировой ткани крыс при аллоксановом диабете приводит к стимуляции спонтанного липолиза в адипоцитах (табл. 4).

Таблица 4

Влияние инсулина и изопротеренола на содержание глицерола в среде инкубации адипоцитов крыс с аллоксановым диабетом, (Ме (Ог(2з), р)

Группы исследования Глицерол, мкмоль/106 клеток

Без добавок Контроль(введение физиологического раствора), п= 12 1 0,35 (0,32-0,37)

Аллоксановый диабет, п= 10 2 0,45 (0,43-0,47) р..,<0.05

Инсулин (10 нМ) Контроль (введение физиологического раствора), п= 12 3 0,36 (0,35-0,38)

Аллоксановый диабет, п= 10 4 0,48 (0,47-0,50) р4.1< 0,05

Изопротеренол (1 мкМ) Контроль (введение физиологического раствора), п= 12 5 1,27(1,15-1,36) Ps-|< 0,01

Аллоксановый диабет, п= 10 6 0,86 (0,84-0,89) р6-,< 0.05; р6.2< 0,01

Инсулин (10 нМ) и изопротеренол (1 мкМ) Контроль (введение физиологического раствора), п= 12 7 0,93 (0,90-0,96) р7л< 0,05

Аллоксановый диабет, п= 10 8 0,75 (0,72-0,78) Р8-7< 0,05; ps.„< 0,05

Примечание: р - уровень значимости различий, рассчитанный относительно контрольных величин в соответствующих группах исследования

Агонист (52-адренорецепторов изопротеренол в меньшей степени стимулирует липолиз в адипоцитах, изолированных из эпидидимальной жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом (табл. 4). Таким образом, активация окислительного стресса в адипоцитах крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом приводит к стимуляции спонтанного и ингибированию стимулированного агонистом р2-адренорецепторов липолиза.

Механизмы регуляции липолиза в жировых клетках в настоящее время интенсивно изучаются [Holm С. et al., 2000, Yu Y. H. et al., 2005, Jaworski K. et al., 2007]. Гормончувствительная липаза и перилипин - основные факторы в адипоцитах, которые регулируют липолиз [Lei Т. et al., 2004]. В нестимули-руемых эффекторами клетках гормончувствительная липаза диффузно распределена в цитозоле, в то время как перилипин покрывает поверхность липидных капель. Это препятствует гидролизу молекул триацилглицеролов гормончувствительной липазой [Greenberg A. S. et al., 1993]. При стимуляции гормонами повышается концентрация внутриклеточного цАМФ и активируется протеинкиназа А, которая фосфорилирует гормончувствитель-

ную липазу и облегчает ее транслокацию на поверхности жировых капель [Londos С. et al., 1999, Sztalryd С. et al., 2003, Morimoto С. et al., 2004]. Одновременно протеинкиназа А фосфорилирует перилипин, что изменяет поверхностную структуру жировых капель и облегчает связывание гормончувствительной липазы [Sztalryd С. et al., 2003]. Таким образом, два одновременно происходящих события - фосфорилирование гормончувствительной липазы и белка перилипина - приводят к быстрому липолизу [Sztalryd С. et al„ 2003].

Можно предполагать, что активация ПОЛ приводит к дезинтеграции фосфолипидного монослоя на поверхности жировой капли. Это повышает доступность триацилглицеролов для действия липаз и приводит к активации спонтанного липолиза. Данное предположение подтверждает наличие положительной корреляции между активностью липолиза (концентрация глицерола в среде инкубации адипоцитов) и интенсивностью ПОЛ (содержание ТБК-активнывных продуктов в жировых клетках) (г=0,73, р<0,05).

Одним из биологических эффектов инсулина является его ингибирующее действие на стимулируемый катехоламинами липолиз в жировой ткани [Morimoto С. et al., 1998]. Нами было установлено, что в адипоцитах изолированных из жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом снижается способность инсулина ингибировать стимулированный агонистом Р2-адренорецепторов липолиз (табл. 4). Это свидетельствует о нарушении антилиполитического действия инсулина в жировых клетках при аллоксановом диабете.

Повышение содержания АФК, по-видимому, является одним из факторов нарушения способности инсулина блокировать стимулированный гидролиз триацилглицеролов. Действительно, АФК способствуют положительной и отрицательной регуляции действия инсулина. С одной стороны, они участвуют в трансдукции инсулинового сигнала, а с другой, при высоких концентрациях, нарушают эффекты гормона на адипоциты [Bashan N. et al., 2009].

В экспериментах in vitro на изолированных адипоцитах крыс нами было исследовано влияние аллоксана на продукцию АФК, интенсивность ПОЛ, окислительную модификацию белков, систему глутатиона и липолиз. При концентрации аллоксана в инкубационной среде адипоцитов 5,0 мМ интенсивность флюоресценции 2,7-дихлорфлюоресцеиндиацетата составила 8,5 (7,6-9,2) отн. ед. флюоресценции/106 клеток, что в 2,3 раза выше таковых значений в интактных клетках. Добавление в инкубационную среду аллоксана в концентрации 10,0 мМ приводило к максимальному увеличению (р< 0,05) флюоресценции (15,9 (12,2-19,3)отн. ед. флюоресценции/106 клеток) адипоцитов, нагруженных зондом.

Повышенная генерация АФК в адипоцитах при добавлении аллоксана в инкубационную среду приводила к активации перекисного окисления ненасыщенных фосфолипидов в биологических мембранах клеток, о чем свидетельствует возрастание содержания его промежуточных и вторичных продуктов - гидроперекисей липидов и ТБК-активных продуктов. При

концентрациях аллоксана в инкубационной среде 5,0 мМ и 10,0 мМ содержание ТБК-активных продуктов увеличивалось в 2,3 и 2,9 раза, соответственно, по сравнению сконтрольными значениями в интактных клетках (0,84 (0,80-0,91) нмоль/106 клеток).

С возрастанием концентрации аллоксана в среде инкубации в жировых клетках увеличивалось (р< 0,01) содержание КП, достигая максимальных значений при 10 мМ аллоксана - 24,6 (22,2-27,2) у.е./мг белка (1=274 нм) и 28,0 (24,3-28,1) у.е./мг белка (1=363 нм), в адипоцитах контрольных крыс при 1=274 нм данный показатель составил 6,2 (5,7-6,3) у.е./мг белка, при 1=363 нм - 12,1 (12,1-13,8) у.е./мг белка.

Аллоксан in vitro вызывал снижение содержания общего глутатиона и GSH, увеличение уровня GSSG и белковосвязанного глутатиона в изолированных адипоцитах, и величина эффекта возрастала с повышением концентрации прооксиданта в инкубационной среде. При этом величина отношения GSH/GSSG, характеризующая редокс-состояние системы глутатиона, на фоне добавления аллоксана снижалась в 1,2; 2,7; 2,4 и 3,4 раза при концентрациях диабетогена 0,5 мМ, 1,0 мМ; 5,0 мМ и 10,0 мМ, соответственно (в интактных клетках - 7,8 (7,2-8,4)).

В условиях индуцированного аллоксаном окислительного стресса активируется спонтанный липолиз. Выход глицерола в среду инкубации жировых клеток повышался в 1,3 раза при добавлении 0,5 мМ аллоксана и в 1,5 раза при добавлении 1,0 мМ аллоксана по сравнению с контрольными величинами (0,24 (0,22-0,28) мкмоль/106 клеток), достигая максимальных значений при 5,0 мМ диабетогена - 0,43 (0,39-0,48) мкмоль/106 клеток.

Для доказательства участия активных метаболитов кислорода в модулировании липолиза аллоксаном адипоциты предварительно инкубировали с проникающим в клетки миметиком супероксиддисмутазы марганец-тетра (1Ч-метил-4-пиридил)-порфирином (МпТМРуР, 100 мкМ). Нами было установлено, что МпТМРуР (100 мкМ) полностью предотвращал активацию спонтанного липолиза под влиянием аллоксана (рис. 1). Это свидетельствует о важной роли О/ в стимулирующем эффекте аллоксана на спонтанный липолиз в адипоцитах.

Наряду с активацией спонтанного липолиза, аллоксан in vitro ингибирует стимулированный изопротеренолом (1 мкМ) липолиз (рис. 1). Мп-ТМРуР (100 мкМ) достоверно повышает сниженный под действием аллоксана стимулированный р-агонистом липолиз. Эти данные свидетельствуют о том, что в механизмах ингибирующего эффекта аллоксана на стимулированный липолиз важную роль играет 02*. В тоже время, уровень глицерола в среде инкубации оставался ниже, чем в экспериментах с адипоцитами, инкубированными без аллоксана (рис. 1). Это может быть обусловлено тем, что в реакции восстановления аллоксана в адипоцитах наряду с продукцией АФК образуются радикалы диабетогена [Szkudelski Т., 2001, Eisner М. et al., 2006], которые не инактивируются ловушкой супероксидного анион-радикала Мп-ТМРуР и могут повреждать липиды и белки, участвующие в трансдукции гормонального сигнала.

о 1,6

чо 1,2 О

л 0,8 Ч

О

* I Г

¿I

гЬ

+

различий

+

сравнению

+

+

адипоцитами

Изопротеренол (1 мкМ) Ь-сАМР (0.5 мМ) Мп-ТМРуР +

(100 мкМ)

Аллоксан _ _

(5 мМ)

*-р<0,01 уровень значимости соответствующей группы

Рис. 1. Влияние стимулятора р2-адренорецепторов изопротеренола, аналога цАМФ - 1Ч(6)-2'-дибутирил-цАМФ (БЬ-сАМР), ловушки супероксиданион радикала - марганец-тетра (Ы-метил-4-пиридил) порфири-на (Мп-ТМРуР) и аллоксана на липолиз в адипоцитах интактных крыс (ось ординат - концентрация глицерола в среде инкубации жировых клеток).

Для уточнения механизма ингибирующего эффекта аллоксана на стимулированный Р-агонистом липолиз, нами было исследовано влияние Мп-ТМРуР на липолиз стимулированный, проникающим в клетку аналогом цАМФ - М(6)-2'-дибутирил-цАМФ (БЬ-сАМР), негидролизуемым внутриклеточными эстеразами. Мп-ТМРуР (100 мкМ) полностью предотвращал ингибирование аллоксаном стимулированного ВЬ-сАМР липолиза в адипоцитах (рис. 1).

Полученные результаты о способности ловушки Ог" Мп-ТМРуР частично снимать ингибирующее действие аллоксана на стимулированный изопротеренолом и полностью на ОЬ-сАМР индуцированный липолиз, позволяют предполагать, что мишенью для СЬ" являются белки -компоненты аденилатциклазного пути передачи гормонального сигнала после аденилатциклазы.

Известно, что при развитии окислительного стресса, сопровождающего СД, в клетках окислительным изменениям подвергаются в первую очередь редокс-чувствительные элементы, особенно функциональные БН-группы белков и пептидов. Изменение тиолдисульфидного обмена в адипоцитах может приводить к ингибированию стимулированного липолиза, поэтому в следующей серии экспериментов нами было исследовано влияние блокатора

8Н-групп М-этилмалеимида (ЫЕМ) на липолиз и систему глутатиона адипоцитов.

Инкубация адипоцитов с 0,2 мМ и 0,8 мМ ЫЕМ приводила к снижению содержания общего глутатиона в адипоцитах в 1,2 раза в обоих случаях по сравнению с контрольными величинами (рис. 2). В адипоцитах, инкубированных с ЫЕМ (0,2 мМ и 0,8 мМ) концентрация С8Н снижалась, наряду с этим содержание в88С и белковосвязанного глутатиона увеличивалось с возрастанием в среде инкубации клеток концентрации блокатора 5Н-групп (рис. 2)._______

□ С8Н+С58С

Интактные ЫЕМ (0,2 мМ) КЕМ (0,8 мМ)

адипоциты

(контроль)

*- р<0,05 уровень значимости различий по сравнению с интактными адипоцитами

Рис. 2. Параметры системы глутатиона адипоцитов при добавлении блокатора вН-групп 1М-этилмалеимида (ЫЕМ) в концентрации 0,2 мМ и 0,8 мМ.

Можно предполагать, что при окислительном стрессе в адипоцитах, вызванном блокатором вН-групп ЫЕМ, часть С8Н может расходоваться для защиты 5Н-групп белковых молекул путем обратимого связывания с ними. Однако это способствует уменьшению восстановительного потенциала системы глутатиона. Подтверждением этого предположения является, обнаруженное нами в адипоцитах, достоверное снижение отношения ОБН/СБЗС с увеличением концентрации ЫЕМ в среде инкубации клеток (рис. 2).

В условиях сниженного восстановительного потенциала системы глутатиона в адипоцитах увеличивается интенсивность спонтанного и ингибируется стимулированный изопротеренолом (1 мкМ) липолиз (рис.3). Увеличение концентрации блокатора .ЯН-групп ЫЕМ до 0,8 мМ в среде инкубации адипоцитов приводило к резкому снижению стимулированного (в 6,7 раза) и спонтанного (в 1,3 раза) липолиза (рис. 3). Это может быть следствием токсического влияния высоких концентраций №М на адипоциты.

Таким образом, блокатор 8Н-групп в адипоцитах. так же как и

аллоксан, способствует активации спонтанного и ингибированию стимулиро-

<о

О 0,9 -

# тг

. 1,5 # *

? I I П !

£ 0,6 о

* 0,3

п

й

а

(0.2 мМ) -+-- + -

(0,8 мМ) -- + -- +

Изопротеренол

(1 мкМ) - - + + +

*-р<0,05 и #-р<0,01 уровни значимости различий по сравнению с адипоцитами соответствующей группы

Рис. 3. Влияние стимулятора (З^-адренорецепторов изопротеренола и блокатора 8Н-групп Ы-этилмалеимида (ЫЕМ) на липолиз в адипоцитах (ось ординат - концентрация глицерола в среде инкубации жировых клеток).

ванного изопротеренолом липолиза. Это свидетельствует об участии АФК и системы глутатиона в регуляции липолиза в адипоцитах при аллоксановом диабете, сопровождающемся окислительным стрессом.

Известно, что аллоксан при введении крысам поглощается преимущественно В-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы и осуществляет свое диабетогенное действие, превращаясь в диалуровую кислоту, что сопровождается генерацией супероксидного анион-радикала кислорода, который в реакции с ионами металлов переменной валентности образует гидроксильный анион-радикал. Этот радикал повреждает ДНК и вызывает гибель В-клеток, что сопровождается у крыс развитием аллоксанового диабета, который можно рассматривать как модель СД 1 типа.

Гипоинсулинемия при СД 1 типа способствует возникновению стойкой гипергликемии и повышению уровня СЖК в плазме крови. Высокие концентрации глюкозы и СЖК вызывают повышенную генерацию АФК в различных клетках, что приводит к развитию в них окислительного стресса. Источником АФК также являются гликозилированные белки. Окислительный стресс, развивающийся в В-клетках при СД, нарушает синтез и секрецию инсулина. В других органах и тканях прооксидантное действие аллоксана и развивающаяся гипергликемия также способствуют возникновению окислительного стресса.

В жировой ткани, играющей важную роль в нарушении липидного обмена при СД, активация свободнорадикального окисления приводит к повышенной окислительной модификации липидов и белков в адипоцитах. При этом отношение восстановленного глутатиона к окисленному в жировых клетках значительно снижается, что свидетельствует о сокращении редокс-потенциала системы глутатиона. В тоже время в адипоцитах увеличивается содержание белковосвязанного глутатиона, что свидетельствует о высоких потребностях жировых клеток в ОБН, необходимом для защиты белков в адипоцитах от окислительных повреждений. Развитию окислительного стресса в жировой ткани в этих условиях также способствует низкая активность основного фермента антиоксидантной защиты глутатионперокси-дазы. Возникающая при активации ПОЛ дезинтеграция фосфолипидного монослоя на поверхности жировой капли в условиях окислительного стресса в адипоцитах, повышает доступность триацилглицеролов действию липаз и активирует спонтанный липолиз. Наряду с этим окислительный стресс приводит к снижению ингибирующего действия инсулина на стимулированный катехоламинами липолиз. Образование большого количества белково-смешанных дисульфидов может быть одной из причин ингибирования стимулированного изопротеренолом липолиза при аллоксановом диабете. Увеличение активности спонтанного липолиза и ингибирование антилиполитического действия инсулина в жировых клетках крыс в условиях окислительного стресса вызванного аллоксаном может являться одной из причин повышенного содержания свободных жирных кислот в плазме крови при экспериментальном диабете.

Развитие окислительного стресса и активация спонтанного липолиза в жировой ткани на фоне нарушения редокс-состояния системы глутатиона и увеличения окислительной модификации белков могут играть важную роль в возникновении осложнений при СД 1 типа.

ВЫВОДЫ

1. Аллоксановый диабет у крыс сопровождается развитием окислительного стресса, характеризующегося увеличением в изолированных адипоцитах и плазме крови концентрации продуктов липидной пероксидации (гидроперекиси липидов, ТБК-активные продукты), окислительной модификации белков (карбонильные производные белков, битирозин, окисленный триптофан, белковосвязанный глутатион), снижением редокс-состояния системы глутатиона и активности глутатионпероксидазы в адипоцитах эпидидимальной жировой ткани и плазме крови крыс.

2. В адипоцитах, изолированных из эпидидимальной жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом, повышен спонтанный и ингибирован стимулированный агонистом р2-адреиорсцептороп изопротеренолом липолиз, а также снижена способность инсулина ингибировать стимулированный липолиз. Увеличение спонтанного липолиза в условиях развития окислительного стресса, индуцируемого аллоксаном, способствует

повышению уровня свободных жирных кислот в плазме крови крыс с экспериментальным диабетом.

3. Аллоксан in vitro в изолированных адипоцитах крыс увеличивает продукцию активных форм кислорода, содержание гидроперекисей липидов, концентрацию карбонильных производных белков, битирозина, окисленного триптофана, снижает редокс-состояние системы глутатиона и активирует спонтанный липолиз.

4. Марганец-тетра (ЬГ-метил-4-пиридил) порфирин, ловушка супероксидного анион-радикала, предотвращает активацию спонтанного липолиза, частично снимает ингибирующее действие аллоксана (5 мМ) на стимулированный изопротеренолом и полностью - на М(6)-2'-дибутирил-цАМФ индуцированный липолиз.

5. В адипоцитах крыс in vitro блокирование функциональных SH-rpynn глутатиона и белков N-этилмалеимидом сопровождается активацией спонтанного и ингибированием стимулированного изопротеренолом липолиза. При аллоксановом диабете у крыс дисбаланс системы глутатиона и увеличение окислительной модификации белков способствуют активации спонтанного и ингибированию стимулированного изопротеренолом липолиза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шахристова, Е. В. Влияние инсулина на базальный и стимулированный изопротеренолом липолиз в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом / Е. В. Шахристова // Науки о человеке: Материалы X конгресса молодых ученых и специалистов, 28-29 мая 2009. - Томск: СибГМУ, 2009. - С. 112-113.

2. Шахристова, Е. В. Влияние аллоксана на перекисное окисление липидов и интенсивность спонтанного липолиза в изолированных адипоцитах крыс / Е. В. Шахристова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы XV межгородской конференции молодых ученых, 21-23 апреля 2009. - СПб.: СПбГМУ, 2009. - С. 131-132.

3. Влияние аллоксана на продукцию активных форм кислорода в изолированных адипоцитах крыс / В. В. Иванов, Е. В. Шахристова, Е. А. Степовая, Т. В. Жаворонок // Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии: Материалы научной конференции с международным участием, посвященной 120-летию кафедры нормальной физиологии СибГМУ и кафедры физиологии ТГУ, 2223 октября 2009. - Томск: СибГМУ, 2009. - С. 80-82.

4. Иванов, В. В. Влияние аллоксана на глутатион-зависимую систему антиоксидантной защиты в изолированных адипоцитах крыс / В. В. Иванов, Е. В. Шахристова, Е. А. Степовая // Биоантиоксидант: Материалы VIII международной конференции, 4-6 октября 2010. - М.: РУДН, 2010. - С. 181-182.

5. Иванов, В.В. Глутатион-зависимая система антиоксидантной защиты в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом / В. В. Иванов, Е. В.

Шахристова, Е. А. Степовая // Биоантиоксидант: Материалы VIII международной конференции, 4-6 октября 2010. - М.: РУДН, 2010. - С. 179-180.

6. Участие глутатиона в регуляции окислительной модификации внутриклеточных белков при окислительном стрессе / Т. В. Жаворонок, Е. А. Степовая, Г. В. Петина, Е. В. Шахристова // Биоантиоксидант: материалы VIII международной конференции, 4-6 октября 2010. - М.: РУДН. - 2010. -С. 152-153.

7. Перекисное окисление липидов и система глутатиона в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом / В. В. Иванов, Е. В. Шахристова, Е. А. Степовая, Т. В. Жаворонок, В. В. Новицкий // Бюллетень СО РАМН - 2010. -Т. 30,№6.-С. 101-104.

8. Шахристова, Е. В. Глутатион-зависимая система антиоксидантной защиты и окислительная модификация белков в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом / Е. В. Шахристова, В. В. Иванов, Е. А. Степовая // Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни: Материалы XI международного конгресса, 8-12 декабря 2010. - М.: РУДН, 2010. - С. 313.

9. Влияние аллоксана на спонтанный липолиз и систему глутатиона в изолированных адипоцитах крыс / В. В. Иванов, Е. В. Шахристова, Е. А. Степовая, Т. В. Жаворонок, В. В. Новицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2011. - Т. 151, № 3. - С. 288-291.

10. Шахристова, Е. В. Карбонилирование белков при окислительном стрессе в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом / Е. В. Шахристова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы XVII межвузовской конференци молодых ученых, 20-21 апреля 2011. - СПб.: СПбГМУ, 2011. - С. 198-199.

11. Влияние аллоксана на систему глутатиона и окислительную модификацию белков в адипоцитах при экспериментальном диабете / В. В. Иванов, Е. В. Шахристова, Е. А. Степовая, Т. В. Жаворонок, В. В. Новицкий // Бюллетень сибирской медицины - 2011. - Т. 10, № 3. - С. 44-47.

12. Шахристова, Е. В. Липолиз и окислительная модификация белков в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом / Е. В. Шахристова, В. В. Иванов, Е. А. Степовая // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Пятая всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, 12-14 апреля 2011. - Новосибирск: НГУ, 2011.-С. 246-247.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода Db-cAMP - Ы(6)-2'-дибутирил-цАМФ КП - карбонильные производные GSH - восстановленный глутатион белков GSSG - окисленный глутатион

ПОЛ - перекисное окисление Мп-ТМРуР - марганец-тетра (N-

липидов метил-4-пиридил) порфирин

СД - сахарный диабет NEM - N-этилмалеимид

ТБК - тиобарбитуровая кислота 02' - супероксидный анион-радикал

ОН' - гидроксильный анион-радикал

Подписано в печать 26.04.2012г. Услл. печ. листов 0,65 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050. г. Томск, Московский тракт 2, тел. 53-04-08 Заказ№107 Тираж 100 зкз