Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лимитирование и ингибирование роста METHYLOCOCCUS CAPSULATUS компонентами минеральной среды и газовой фазы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Лимитирование и ингибирование роста METHYLOCOCCUS CAPSULATUS компонентами минеральной среды и газовой фазы"

российская академия наук

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ГАЯЗОВ Ренат Рашидович

УДК 579.222:579.841.42

лимитирование и ингибироваше роста меикьососсиз сарзшлтиб компонентами минеральной среды и газовой фазы

(специальность 03.00.23 - биотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИН» - 1992

О

Работа выполнена е Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ю.Н.Мшенский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

В.М.Горленко

кандидат физико-математических наук И.Г.Минкевич

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно-исследовательский

институт биосинтеза белковых веществ

Защита диссертации состоится .....1992 г.

в . Л^Г. часов на заседании Специализированного совета Д002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, Московская область, г.Пущино, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан "0.."992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов

... -^Актуальность проблемы. Микробное окисление метана известно еще с'накала двадцатого столетия. К настоящему времени накоплено большое, ! количество биохимических и экологических данных о микроорганизмах, осуществляющих процесс аэробного окисления метайМЧИнтерес, вызываемый данной группой микроорганизмов, объясняется несколькими причинами: широким распространением метанотрофов в природных и искуственных экосистемах; уникальностью их. морфологических и биохимических, свойств; а также большим Сиотехнологическим потенциалом (кормовой белок, борьба с метаном в угольных шахтах, биокаталитнческие возможности и др.).

Синтез кормового белка дла нужд промышленного животноводства я птицеводства - одно из возможных применений ма танокис лящих бактерий. Это направление интенсивно разрабатывалось на лабораторном и полупромышленном уровне с конца шестидесятых годов. Однако, энергетический кризис, разразившийся в середине семидесятых годов, привел к существенному росту цен на энергоносители (а основная масса добываемого из земных недр природного газа сжигается для получения энергии) и затормозил дальнейшее развитие работ по микробиологическому синтезу кормового белка. Неблагоприятное общественное мнение, сложившееся в нашей стране в отношении кормового микробиологического белка (движение "зеленых") также оказывает негативное воздействие на исследования в этой области, и особенно на внедрение научных разработок в промышленность. Тем не менее, в СССР эти работы продолжались, и в настоящее время близки к завершению (создана технология получения "гаприна" - кортового белка из природного газа, работает Опытно - промышленная установка). В конце восьмидесятых годов датская фирма "Earisk Bio Protein A/S" предложила процесс получения бежа из природного газа, во многом сходный с советским. Кормовой белок - далеко не единственное возможное практическое применение метанокисляпцих микроорганизмов, и создание высокопроизводительного процесса получения биомассы метанотрофов, наносящего минимальный ущерб окружающей среде, остается актуальной задачей. Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния различных концентраций компонентов минеральной среды и газовой 5азы, а такие потенциальных примесей природного газа на рост ïethylococcus capsulatus (на скорость роста и эффективность ассимиляции метана и кислорода).

Научная новизна работы. Определены константы ингибирования I для рада кошонентов минеральной среда и газовой фазы. Определены ! максимальная скорость роста, затраты метана и кислорода на поддержание, максимальные теоретические выхода по метану и кислороду. Установлено, что зависимость выхода по кислороду от выхода по метану в условиях лимитирования или ингибирования роста компонентами минеральной среда является практически линейной. Найдены условия культивирования, приводящие к повышенной экскреции полисахаридов. Экспериментально подтверждена возможность использования рН-ауксостатного метода культивирования для изучения ингибирундего влияния веществ различной природы и агрегатного состояния на скорость роста микроорганизмов.

Практическая ценность. Результаты работы представляют практический интерес при промышленном получении биомассы метанокислякщих микроорганизмов. Даны рекомендации по величинам остаточных концентраций ряда кошонентов минеральной среды и. содержанию компонентов газовой фазы (кислорода, углекислоты, метана), позволяющие реализовать процесс выращивания Мс. сзрви1а(п1в с высокой эффективностью.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на конференции молодых ученых ИБФМ РАН 1987 г., Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989 г.), на совместных семинарах лаборатории ферментационной микробиологии, лаборатории радиоактивных изотопов и Центра биотехнологических исследований ИБФМ РАН.

Публикации. По материлам диссертации опубликовано 4 работы, одна работа находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (I глава), экспериментальной части (2 главы), обсуждения» заключения и выводов. Описок литературы содержит 163 источника.

Объекты и метода исследования

В качестве объекта исследования была выбрана культура метанокисляицей бактерии 11е1;11у1ососсие сарвиХа^в штамм ВОБ-874, полученная из института "Вниисинтезбелок". Данный микроорганизм используется при опытно-промышленном производстве биомассы из природного газа (гаприна). Культура, переданная из института

"Вниисинтезбелок", была очищена от гетеротрофного спутника путем пересева отдельной колонии из истощающегося штриха на твердой среде. Чистоту культуры контролировали микроскопически и по отсутствию роста на сложных средах (ША. и ПСА).

Асептическое непрерывное культивирование проводилось на ферментационных установках "Uitrafem 1601" (ЬКВ, Швеция) с рабочим объемом 2-4 литра и "Bioengineering ь 1523" (Швейцария) с рабочим объемом 3-7 литра на синтетической минеральной среде с использованием метана (природного газа) как единственного источника углерода и энергии. Температура культивирования составляла 42°С, величина рН-5,4.

Для изучения эффекта ингибирования роста Mc.capeuiatus компонентами среда и газовой фазы использовали рН-ауксостатный метод культивирования. Данный метод является разновидностью турбидостата (позволяет популяции клеток в ферментере реализовать максимально возможную при данных условиях скорость роста). В отличие от классического турбидостата для управления скоростью подачи среды используется не датчик оптической плотности, а датчик рН. В области лимитирующих концентраций использовали хемостапшй метод культивирования.

Концентрацию биомассы определяли гравиметрически на капроновых мембранных фильтрах, расход газовой фазы на выходе из ферментера "Ultraferm" - барабанным расходомером ГСБ-400. Состав газовой фазы на входе и выходе из ферментера определяли газохроматографнчески.

В супернвтанте культурэльной жидкости определяли содержание остаточного азота (аммонийного), фосфора (ортофоофзт), нитритов, нитратов, метанола, формальдегида. Методом атсмно-абсорбционной спектроскопии определяли содержание ряда металлов: к, Na, Са, Mg, Си, Fe, Zn, Mh, Mo, Co. .

Определение констант ингибирования и насыщения проводили графоаналитическим способом: строили зависимость скорости роста от концентрации данного вещества и находили концентрацию, соответствующую скорости роста, равной половине от максимальной.

Величины выходов по метану и кислороду рассчитывали как отношение количества потребленных субстратов за один час к количеству синтезированной за это время биомассы.

Содержание полисахаридов определяли фенальным методом с использованием глюкозы в качестве стандарта.

Вязкость клеточной суспензии определяли при помощи

капиллярного вискозиметра с использованием еоды и растворов глицерина в качестве стандартов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I.Poct Mc.capeulatus с максимальной удельной скоростью.

Культивирование Мс.capsulatus в условиях рН-ауксостата обеспечило достижение стабильного роста популяции с максимальной удельной скоростью, равной 0,285-0,295 час-1. При нестерильном культивировании данного штамма в полупромышленных условиях за 15 лет максимальная удельная скорость роста увеличилась от 0,25 час-1 до 0,4 час-1. Возможно, в условиях многолетнего непрерывного нестерильного культивирования происходит селекция клеток с большей скоростью роста. Нам не удалось достигнуть скорости роста, равной 0,4 час-1. Мы полагаем, что вто связано с тем, что наша работа проводилась с музейной культурой Мс. capsulatus, к тому эта очищенной от гетеротрофного спутника. Поскольку в лабораторных экспериментах непрерывное культивирование обычно не превышало нескольких недель, а для следующих экспериментов вновь использовалась музейная культура, селекция популяции по скорости роста практически отсутствовала, и, на наш взгляд, именно этим объясняется тот факт, что в наших условиях максимальная удельная скорость роста не превышала 0,29 час-1.

2.Влияние парциального давления метана (природного газа), кислорода и углекислоты на скорость роста Ыс. capsulatus

В условиях рН-ауксостата' повышали парциальное давление природного газа, а концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне 30-60 мм.рт.ст (такая концентрация растворенного кислорода не оказывает ни лимитирующего, ни ингибируицэго влияния на рост Ыс. capsulatus). Оказалось, что повышение парциального давления природного газа вплоть до 2 Атм не оказывало ингибируицего влияния на величину максимальной удельной скорости роста Ыс. capsulatus.

Парциальное давление кислорода оказывает заметное влияние на величину удельной скорости роста Ыс. capsulatus: при р02 меньше 10 мм.рт.ст. (0,01 Атм) наблюдается лимитирование роста кислородом, увеличение концентрации растворенного кислорода больше 150 - 200 мм.рт.ст. (0,23 Атм) вызывает уменьшение скорости роств. Определена константа ингибирования кислородом, равная 380 мм.рт.ст. (0,5 Атм) (рисЛ).

О.Зг

о

(Ч V

СП Е* О

о,

£0,

\ с. |\ 1 \

I \ 1 \ , i 1 • Лсо? рО^рСО^

300

600

900 тт.рт.щ.

Рис.1.Зависимость удельной скорости роста Jíc. capsulatus от концентрации кислорода и углекислоты.

Для изучения зависимости удельной скорости роста fíe. capsulatus от парциального давления углекислоты в газовой фазе в ферментер подавали смэсь углекислоты (балонной), природного газа и воздуха (кислорода). Зависимость удельной скорости роста Мс. capEulatus от парциального давления углекислоты в газовой фазе представлена на рис.1. Установлено, что с повышением парциального давления углекислоты происходит ингибирование роста Не. capsulatus. Константа ингибирования составляет 1,19 Атм. (910 мм.рт.ст.). Поскольку при рН=5,4 растворенная углекислота составляет 85$ от общего содержания растворенного неорганического углерода (C09+HC0g), есть основания полагать, что ингибирующий эффект связан в основном с воздействием растворенной углекислоты, а не гидрокарбоната.

З.Ингибируицее действие примесей природного газа на непрерывную культуру hethyxococcus capsuIiATus.

Было изучено действие циклогекезна, бензола, толуола, п-ксилола на культуру Hc.capeulatus, растущую в условиях рН-ауксостатз с максимальной удельной скоростью роста. Подача как бензола, так и толуола с минеральной средой (бензол и толуол добавлялись в свежую минеральную питательную среду в количествах, достаточных для получения насыщенных растворов) не позволила выявить эффект ингибируюцего влияния данных соединений на скорость роста Мс.capsulatus. Поэтому использовался метод "острых

опытов", т.е. добаЕки определенных объемов исследуемых вещастЕ непосредственно в ферментер (при условии, что культура до внесения ингибитора росла в оптимальных условиях с максимальной удельной' скоростью роста в режима рН-ауксостата). Степень ингибирования определяли по нескольким параметрам:

1.Бо уменьшению скорости роста в течение одного часа после внесения ингибитора.

2.По увеличению концентрации растворенного кислорода.

3.По изменению (повышению) величины рН в ферментере.

4.По длительности периода времени, по истечении которого восстанавливаются первоначальные параметры культивирования (ц, р02, оптическая плотность суспензии). •

Полученные данные приведены в таблице I*

Таблица I

Изменение параметров культивирования при добавлении отдельных веществ циклической и1 ароматической природа непосредственно в культуральную жидкость ферментера с популяцией клеток Мс. сарви1аЪив, растущих с максимальной удельной скоростью роста.

Вещество Доза,т/л Дц.час-1 ¿р02,% ЛрН.ед.рН т,час

0,25 0,00 1,0 0,0 0,66

°ен12 0,5 0,00 1,5 од 2,5

1,00 0,07 18 0,2 5,0

2,00 0,29 50 0,4 оо

0,25 0,00 1,5 0,05 3,0

°енб 0,50 0,00 3,0 0,1 3,5

1,00 0,10 28 0,2 8,0

2,00 0,29 70 0,6 со

0,25 » 0,03 15 0,1 3,5

С6Н5СН3 0,50 0,20 56 0,3 30

1,00 0,29 63 0,4 03

0,25 0,24 54 0,2 40

С6Н4(СНз)2 0,5 0,29 62 0,6 <о

^Примечания к таблице:

Доза-количество ингибитора, добавляемое в ферментер, мл/л.

^ = ^\пах(до внесения) ~ ^(в теч.1часа после внесевия^т — П — 11 ггоп

' И(В Теч. I часа после внесения ингибитора)' * Лр02 = Р°2(до) - Р°2(после) ЛрН = рН(ГОСде) - РН(Д0), вд. рН.

т - время возврата к исходному состоянию, час. Значок "со" означает, что культура после добавления ингибитора не вернулась в исходное состояние, т.е. происходила необратимая остановка роста (остановка рН-ауксостата) и лизис клеток.

Сразу после добавления ингибитора в культуральную жидкость ферментера наблюдалась остановка рН-ауксостата (остановка роста). Длительность остановки зависела от количества добавляемого ингибитора и увеличивалась в ряду циклогексан - бензол - толуол -п-ксилол. Так, добавка 0,5 мл циклогэксана на 1л. культуральной жидкости практически не оквзнвала влияния на рост популяции, тогда как такое же количество п-ксилола вызывало полный лизис культуры.

4.Рост Ые1;11у1ососсив сарви1а1;и8 при различных концентрациях аммонийного азота и неорганического фосфора

Зависимости удельной скорости роста от концентраций исследуемых веществ представлены на рис.2. Из графиков видно, что при низких концентрациях эти субстраты лимитируют рост, тогда как при повышении концентраций и неорганический фосфат, и ашонийный азот ведут себя как субстратные ингибиторы. Определены кинетические константы: К =0,7 мгИ/л.; К. ,=380 МГЯ/л.; к о =0,8 вш!; "ро*

4

концэн-

4 4

мгр/л.; К. г,=700 мг?/л. Для достижения а =0.29 час 1ро-сз ппах

трации аммонийного азота и неорганического фосфата должны составлять 2-40 мгЛ/л и 20-100 мгр/л соответственно.

0.3

о га

с 02

я и

а

Й 0.1 и

I

о1— 0.2

■ » ■ ■ ■ ■"

_1_I мин.

■ 111ИИ

I 1. I I I I

20

200

СмСр мг/л

Рис.2.Зависимость удельной скорости роста Мс.сарви1а1;ив концентраций аммонийного азота и неорганического фосфора.

Явных закономерностей в изменения величин выходов по метану и кислороду в зависимости от концентраций аммонийного азота и неорганического фосфата выявить не удалось. Тем не менее, если эти данные предсташть в виде графика зависимости выходов по метану и кислороду от скорости роста (объединив результаты по ингибированию и лимитированию обоими субстратами), то оказывается, что величины выходов однозначно зависят от значений скорости роста - чем больше скорость роста, тем больше величины выходов как по метану, тан и по кислороду (рис.3). Так, при скоростях роста, близких к максимальной, еыходы по метану и кислороду составляют 0,9-1,0 для метана (гАСВ/гСН4) и 0,27-0,29 для кислорода (гАСВ/г02). При понижении скорости роста до 0,1 час-1 величина выхода по метану составляет 0,5-0,6 , гАСВ/гСНд, выход по кислороду при этой скорости составляет 0,19-0,2 гАСВ/гОг,. При этом неважно, чем вызвано ограничение скорости роста - лимитированием или ингибированивм. На имеет решающего значения и природа субстрата, ограничивающего скорость роста (аммонийный азот или неорганический фосфор). Эти результаты дают основания предполагать о физиологической близости явлений "лимитирования" и "ингибирования".

Концентрация аммонийного азота в культуральной жидкости практически не влияла на состав биомассы во всем исследованном диапазоне. Содержание белка в биомассе составляло 52+2Я!, азота

Рис.3.Зависимость выходов по метану и кислороду от скорости роста при лимитировании/ингибировании азотом и фосфором. Значком "О" показаны точки, полученные при лимитировании, остальные -при ингибировании.

10,5+0,3$, углерода 47,8+1$, водорода 7,I?Q,I$, золы 5,3+0,2$. Напротив, концентрация неорганического фосфата оказывала заметное влияние на состав биомассы. Так, в области лимитирования роста фосфором (в диапазоне до 10 мгР/л) возрастало содержание белка (от 45 до 52 $$) и азота (от Э до 10,5 %%). Повышение концентрации фосфатов приводило к уменьшению содержания белка (до 36 % при концентрации фосфатов 600-800 от.Р/л.) и азота (до 655). Задержание фосфора минимально в области лимитирования роста фосфатами (1,0-1,3%), увеличение концентрации фосфатов приводило { возрастанию содержания фосфора в биомассе до 1,9-2,0$. Содержание золы минимально в области лимитирования роста фосфором ¡5$), увеличение концентрации фосфатов вызывало увеличение удержания золы в биомассе (до В% при концентрации фосфатов 300-800 мг.Р/л.). Содержание углерода и водорода постоянно во ¡сем исследованном диапазоне и составляло 47,0+1$ и 7,0t0,II?, »ответственно.

В культуральной жидкости в незначительных количествах обнару-¡ивали интермедиаты цепи окисления метана - метанол и формальдегид. Явных закономерностей в. изменении их концентраций в зависи-юсти от остаточных количеств азота и фосфора не обнаружено.

При росте на средах, содержащих ингибирующие количества ммонийного азота в культуральной жидкости определяли содержание идроксиламина, нитрита и нитрата - тех соединений, до которых еоретически может окислиться избыточный аммонийный азот. :онцентрация гидроксиламина во всех исследованных пробах не ревышала предела чувствительности использованного нами метода 0,5 мг/л). Концентрация нитрит-иона также была очень мала во сем исследованном диапазоне (не более 0,1 мг/л). Напротив, онцентрация нитратов монотонно возрастала от 10 мг/л в области имитирования роста аммонийным азотом до 200 мг/л при онцентрации аммонийного азота 600-700 нгы/л.

/

5.Иш/ибированив роста üethylococcus capsulatue отдельными компонентами минеральной среды.

В состав генеральной среды среды кроме источников азота и эсфора входит ряд катионов и анионов металлов, а также, сульфат и порид-ионы, и увеличение концентраций данных соединений в среде зжет ингибировать рост Не. capsulatue.

Поскольку представляется практически невозможным изучить сдельно влияние анионов и катионов на рост, использовали ззнообразные сочетания катионов калия, натрия, магния, кальция и

сульфат и хлорид анионов, т.е. изучали влияние хлоридов и сульфатов калия, натрия, магния и кальция (за исключением сульфата кальция - ввиду его очень малой растворимости). Полученные результаты представлены на рис.4. Использование мольных концентраций для выражения констант ингибирования позволяет расположить данные соединения в ряд, ингибирупдее действие в котором увеличивается слева направо:

соль: NagS04 KgS04 HaCl MgS04*7H£O KG1 K^mlí 88,5 61,8 53,2 49, G 48,6 К^г/Л 12,6 , 10,8 3,11 12,2 3,62

2

CaCl, 27,2 3,02

«gClgxeHgO 24,2 4,92

В водных растворах данные соли полностью диссоциированы на ионы, и хотя определить константы ингибирования для отдельных ионов в данном случае не представляется возможным (поскольку все ионы, входящие в состав ¿тих солей проявляют ннгибирущий эффект на рост Не. capsulatua), тем не менее, сравнивая величины констант ингибирования для солей, содержащих одинаковые ионы, можно сделать заключение,, что сульфат-ион оказывает меньшее ингибирупдее воздействие, чем хлорид-ион (при равных мольных концентрациях), а в ряду катионов: натрия, калия, кальция, магния при равных мольных концентрациях ингибирущий эффект увеличивается от натрия к магнию.

Кроме вышеперечисленных ионов в состав минеральной среды входят соли меда, железа, кобальта, марганца, цинка, молибдена,

Wa(¿ +КС1 °uce¿ -KLS04 +45Д

Рис.4.Зависимость удельной скорости роста Яс.capsulatua от концентраций отдельных солей.

и

избыток которых также может оказывать ингибирущее воздействие на рост метаяотрофов. Для определения ингибирунцих концентраций использовались сульфаты этих металлов (за исключением молибдена, который сам входит в состав аниона), поскольку сульфат-ион оказывает меньшее токсическое действие, чем хлорид-ион. Полученные результаты представлены на рисунке 5.

Определены константы ингибирования ионами этих металлов:

Ион

мг/л К.., мМ

Мп+2 94

1,72

Мо(Моо|~) 11,47 0,12

ра2+ 5,86 0,104

си2+ 3,45 0,054

Со2+ 2,70 0,046

гп2+ 2,72 0,042

Наименьшее ингибирущее действие среди атой группы ингибиторов оказывают ионы марганца, наибольшее (и практически равное, если выражать концентрации в молях) - ионы меди, кобальта и цинка. Ионы хелеза и молибдат-ионы занимают промежуточное положение по ингибирущэй способности.

Влияние повышенных концентраций компонентов минеральной среды сказывается не только в замедлении скорости роста, но и в уменьшении величин выходов биомассы по метану и кислороду - чем сильнее замедляется рост популяции, тем менее эффективно происходит утилизация метана и кислорода. Графически эта зависимость аналогична зависимости, приведенной на рис 3.

О.Эг

Рис.5.Зависимость удельной скорости роста Kc.capsuJ.atuE от содержания отдельных элементов в культуральной жидкости.

6.Синтез полисахаридов Hethylococcus capsulatus при различных условиях культивирования

В процессе полупромышленного культивирования Ыс. capsulatus иногда наблюдается такое явление, как плохая разделяемость культуральной жидкости после стадии выращивания на стадии сепарации. Это связано в первую очередь с наличием в культуральной жидкости полисахаридов (слизи). В связи с этим было исследовано влияние различных условий культивирования на накопление внутри- и внеклеточных полисахаридов.

'Для сравнения были выбраны четыре режима: рост с максимальной удельной скоростью (в условиях рН-ауксостата); рост,.лимитированный аммонийным азотом; рост, лимитированный неорганическим фосфором; и рост, лимитированный кислородом. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2

Параметры Me.capsulatus в разных условиях культивирования

хемостат хемостат хемостат Параметры рН-ауксостат лимит по лимит по лимит по

кислороду азоту фосфору

Скорость роста, час-1 0,29 ОД ' од . од

Концентрация биомассы, г/л 2,9 8,7 8,0 8,5

Содержание углеводов в культуральной жидкости (г.глюкозы/литр) 0,86 1,84 1,60 1,64

Содержание углеводов в клетках (,% от сухого веса) 27,0 17,0 17,5 16,9

Сод. растворимых углеводов в супернатанте культуральной 0,070 жидкости (г.глюкозы/литр) 0,383 0,197 0,197

Удельн.сод.растворимых утлев. в супернатанте культуральной 0,0Е4 жидкости (г.глюкозы/г.биом.) 0,044 0,025 0,023

Вязкость культуральной жидкости, СП 1,18 3,69 1,40 1,40

При выращивании Нс.сарви1а1;ив в условиях рН-ауксостата удельное содержанке углэводов в клетках составляло 0,27 г/гАСВ. В среде культивирования обнаружены растворимые углеводные соединения (табл.2). При выращивании в условиях хемостата и лимитировании кислородом, аммонийным азотом или ортофосфатом

(0=0,1 час-1) уменьшалось как общее количество образуемых культурой углеводов, так и содержание их в клетках (0,17 г/гАСВ), но увеличивалось количество выделяемых в среду растворимых углеводов. Соотношения связанных с клетками и растворимых внеклеточных углеводов составляли при лимитировании роста кислородом 1:0,6; азотом или фосфором 1:0,14; при росте без внешнего лимитирования 1:0,09 (табл.2). Максимальная продукция растворимых экзополисахаридов происходит при лимитировании роста кислородом, что коррелирует с максимальным значением кинетической вязкости (табл.2).

Итак, при выращивании в условиях рН-ауксостата, т.е. без внешнего лимитирования, Hc.capeul.atus синтезировал преимущественно внутриклеточные полисахариды, локализованные в цитоплазме в виде гранул политлшкозы (содержание глюкозы - 97,8%). Напротив, при росте в условиях лимитирования кислородом изучаемый штагта синтезирует главным образом растворимые, а также связанные с фибриллярной капсулой вкзополисахарида.

7.Затраты на поддержание и максимальные теоретические выходы по метану и кислороду

Наличие большого массива данных по величинам выходов по метану и кислороду в зависимости от скорости роста позволило определить затраты метана и кислорода на процесс поддержания шзнедеятельности - т.е. расходы метана и кислорода на процессы, напрямую не связанные с ростом: оборот клеточного материала, осмотическую работу для поддержания концентрационных градиентов между клеткой и окружающей средой, ресинтез клеточных компонентов и другие. Для определения расходов метана и кислорода , на поддержание был использован метод, предложенный Пертом: строится зависимость величин обратных выходов по субстрату от величин обратных скоростей роста, и если эта зависимость оказывается линейной, то на оси ординат отсекается величина, обратная максимальному теоретическому выходу по субстрату (при (!=<»), а тангенс угла наклона этой прямой к оси абсцисс численно равен величине расходов на поддержание. На рис.6 представлены полученные нами данные по величинам выходов по метану и кислороду в зависимости от скорости роста при лимитировании и ингибировании роста Ыс. сарвиЛ^ив компонентами минеральной среды в виде: 1/Усн , 1/у0 =1(1/р.). Как видно из графика, эти данные

удовлетворительно описываются уравнением типа: 1/У=1/утах+ш/ц,

где У-выход по субстрату при скорости ц, У^^-максимальный выход по субстрату при скорости ц=оо, т-расхода субстрата на поддержание! Были определены следующие величины:

гАСВ/гСН4 (при (1=оо), у^=о,57 гАСВ/г02 (при р=оо), т^ =0,128

2 4

гСН4/гАСВ*час, в^ =0,388 г02/гАСВ*чэс. Знание этих констант

позволило выразить связь, существующую между выходом по метану и выходом по кислороду. Для этого использована система из двух

Решая эту систему относительно ц и приравнивая полученные выражения, получаем следующее равенство:

или:

0,128/(1/^-0,6)=0,388/ (1/У0^-1,7Б), откуда:

"У02=(0,128«*сн )/(0,388-0,0088«Усн )

Последний член в знаменателе можно отбросить, поскольку его значение мало, и тогда величина выхода по кислороду будет прямо пропорциональна величине выхода по метану: У0 =0,33^^ .

Рис.6.Зависимость величин обратных выходов по метану и кислороду от величины обратной скорости при культивировании Ыс.сарви1а1;ив в условиях лимитирования и ингибирования роста минеральными компонентами среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы еыясшно, что все исследованные нами компоненты минеральной среды и газовой фазы (за исключением метана) при повышенных концентрациях вызывают уменьшение скорости роста Мс. сареи1а-кив. Реализуемый в настоящее время полупромышленный процесс получения гаприна осуществляется в условиях лимитирования роста кислородом. Это связано с тем, что затраты на снабжение культуры кислородом занимают значительную долю (до 4058 от стоимости всего процесса). С точки зрения физиологии, эти условия не являются оптимальными, поскольку лимитирование роста растворенным кислородом приводит к выделению в культуральную среду повышенного (по сравнению с нелимитирован-ным ростом) количества углеводов, в том числе и в виде слизи. Увеличивается вязкость культуральной жидкости, затрудняется процесс выделения клеток. Увеличение концентрации растворенного кислорода также неблагоприятно влияет на культуру, вызывая уменьшение скорости роста. Оптимальной является концентрация растворенного кислорода 50-80 мм.рт.ст., или 2-3 мг/л.

Полученные нами данные по ингибируицэму влиянию компонентов минеральной среды могут служить основой для организации рецикла жидкой фазы. В осветленной культуральной жидкости, возвращаемой в процесс после отделения клеток накопление неутилизированных компонентов минеральной питательной среды представляется весьма вероятным. В первую очередь необходимо контролировать содержание тяжелых металлов, особенно меди, железа, кобальта и цинка. Их концентрации не должны превышать 1-2 мг/л.

Для приготовления минеральной среды предпочтительнее использовать сульфаты, а не хлориды, поскольку сульфат-ион оказывает меньшее ингиОирупцее воздействие на рост Мс. сарви1а!;ив, чем хлорид-ион.

При организации рецикла по газовой фазе определяющим параметром должны быть концентрации растворенных газов, в первую очередь кислорода и углекислоты, а также содержание гомологов метана. В случае накопления в газовой фазе ароматических и циклических соединений необходима очистка газовой смеси.

Для роста культуры со скоростью, близкой к максимальной, необходимо поддерживать концентрации компонентов минеральной среды и газовой фазы в следующих пределах: р02 - 50-80 мм.рт.ст. рС02 - не более 200 мм.рт.ст.

рСН4 - не меньше, чем р09 (согласно стехиометрии окисления

метана), т.е. рСН4 - 50-80 мм.рт.ст.

концентрация аммонийного азота - 2-40 мгн/л концентрация неорганического фзсфора 20-100 мгР/л концентрация марганца не более 40 мг/л концентрация молибдена не более 4 мг/л концентрация железа не более 2 мг/л концентрация меда не более 1,5 мг/л концентрация кобальта не более I мг/л концентрация цинка не более 0,8 мг/л

При атом скорость роста будет не менее 0,25 час-1, а выходы по

метану и кислороду - близкие к максимальным, т.е. Усн =0,92

гАСВ/гСН4, У0 =0,3 гАСВ/г02. *

ВЫВОДЫ

1.Изучено влияние лимитирупцих и ингибируюцих концентраций ряда компонентов газовой фазы и минеральной среды на рост Ые1Лу1ососс11а сарви!а1;ив. Показано, что все исследованные вещества (за исключением метана) при повышенных концентрациях оказывают ингибирующее действие на скорость роста. Определены константы ингибирования этими компонентами.

2.Циклические и ароматические соединения, которые могут содержаться в природном газе, ингибируют рост Ыс.сарви1а-Ьив. Ингибирующее влияние увеличивается в ряду: циклогексан - бензол -толуол - ксилол.

3.Как лимитирование, так и ингибирование роста компонентами минеральной среды приводит к уменьшению выходов по метану и кислороду. При этом взаимосвязь мевду выходом по метану и выходом по кислороду является практически линейной - выход по кислоро, составляет одну треть от выхода по метану.

4.На величины выходов по метану и кислороду влияет в первую очередь конкретная величина скорости роста, при атом неважно, чем вызвано ограничение скорости роста - лимитированием или ингибированиэм. Таким образом, можно предполагать, что понятия "лимитирование" и "ингибирование" физиологически близки.

5.Лимитирование роста кислородом приводит к появлению в культуральной жидкости растворимых и частично связанных с клетками экзополисахаридов, что вызывает повышение вязкости культуральной суспензии и затрудняет выделение клеток из культуральной жидкости.

6.Даны практические рекомендации по величинам остаточных концентраций компонентов минеральной среда и газовой фазы, обеспечивающие рост популяции со скоростью, близкой к

максимальной и с высокой эффективностью ассимиляции метана и кислорода.

Список публикаций по материалам диссертации

1.Гаязов P.P., Мшенский Ю.Н. Ингибирущэе действие примесей в природном газе на непрерывную культуру Methylococcus capsulatus. /Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибировашге роста микроорганизмов", 1989, Пущино, с.19.

2.ГаязоЕ P.P., Мшенский D.H., Зякун A.M., Захарченко В.Н. КнгибироЕЗНке роста Methylococcus capsulatus кислородом и углекислотой при повышенном парциальном давлении. /Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", 1989, Пущино, с.20.

3.Гэязое P.P., Мшенский Ю.Н. Лимитирование и ингибирование роста Methylococcus capsulatus солями аммония и фосфора. /Тезисы доклвдов Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", 1989, Пущино, с.21.

4.ГаяаоЕ P.P., Мшенский D.H. Рост Methylococcus capsulatus при различных концентрациях аммонийного азота и неорганического фосфора. /Микробиология, 1991, т.60, JS 6, с.172-174.

Б.Хмеленина В.Н., Гаязов P.P., Сузина Н.Е., Доронина Н.В., Мшенский Ю.Н., Троценко D.A. Синтез полисахаридов Methylococcus capsulatus в различных условиях культивирования. /Микробиология, 1992, т.61, № 3.

19.03.92 г. Зак.ЗЭЗЗР Тир.125 экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте.в 0Н1И ПНЦ РАН