Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм функционирования мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (штамм М) в реакции окисления метана

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм функционирования мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (штамм М) в реакции окисления метана"

На правах рукописи

ТУМАНОВА Лидия Владимировна

механизм функционирования мембраносвязанной метангидроксилазы из

Ме1ку1ососст сарБиШШБ (штамм м) в реакции окисления метана

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2008

003452980

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Гвоздев Рудольф Иванович

доктор химических наук, профессор

Михайлов Альфа Иванович

доктор биологических наук, профессор

Ванин Анатолий Федорович

Ведущая организация:

Химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится «¿¿6"» 2008 г. в и* на заседании

диссертационного совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН по адресу: 118334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н. Н. Семенова РАН.

Автореферат разослан «ЛЗ» ПС/пЯ^Я' 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук М. А. Смотряева

Общая характеристика работы

Метанотрофы, насчитывающие нескольких сотен видов, для своего развития используют метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Ежегодно они перерабатывают около 107 т метана. Таким образом, они играют большую роль в круговороте углерода на нашей планете. Метаболизм этих бактерий начинается с окисления метана до метанола молекулярным кислородом. Реакция протекает по монооксигеназному механизму. Эту реакцию катализирует метанмонооксигеназа (ММО). В природе известны два вида ММО: растворимая в воде (рММО) и мембраносвязанная (мММО). мММО входит в геном всех изученных метанотрофов, а рММО - лишь в состав некоторых из них. Окисление метана этими ферментами, в отличие от существующего двухстадийного промышленного способа, требующего высокого давления и температуры, протекает в одну стадию при нормальной температуре и давлении. Знание о том, как эти ферменты активируют С-Н-связь, имеет большое фундаментальное и практическое значение и в ближайшем будущем может дать развитие новому дешевому одностадийному промышленному синтезу метанола из природного метана. Таким образом, мММО является важнейшим объектом биомиметики.

Работа является частью исследований, выполнявшихся по планам научно-исследовательских работ ИПХФ РАН. Результаты, включенные в работу, частично были получены в рамках проектов, поддержанных различными фондами: ШТАБ (грант 03-51-3945) и программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (проект РНП 2.2.1.1.7181).

Цель работы состоит в установлении структуры и механизма действия каталитически активного центра мембраносвязанной метангидроксилазы из МегИуЬсоссия сарянЬШя (штамм М).

Для достижения поставленной цели в настоящей работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и очистить мембраносвязанную метангидроксилазу (мМГ) из ферментативного комплекса мММО, необходимую для активации и окисления метана до метанола.

2. Выяснить причины низкой удельной активности ранее выделяемых препаратов мМГ.

3. Установить природу, возможную структуру каталитически активного центра мМГ и предложить механизм его действия.

Научная новизна

Впервые методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии экспериментально доказано наличие биядерного железного центра мМГ, на котором происходит окисление метана до метанола. В результате проведенного исследования были оптимизированы условия солюбилизации и очистки мМГ.

Практическая ценность работы

На основе полученных результатов исследования мМГ разработан новый подход в очистке мМГ, который может быть использован в ряде исследовательских лабораторий для получения активного фермента, что позволит уточнить структуру фермента и механизм окисления метана, а также создавать аналоги фермента, которые можно будут использованы для одностадийного промышленного получения метанола.

Публикации

По результатам работы опубликовано 3 статьи (2 из которых входят в список ВАК, рекомендованных для защиты кандидатских диссертаций) и 7 тезисов докладов, список которых приводится в конце реферата.

Апробация работы

Результаты работы обсуждались на 7 российских и международных симпозиумах и конференциях. Работа представлена на конкурсе молодых ученых им. С. М. Батурина (ИПХФ РАН, Черноголовка, 2008) и удостоена 2 места.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения и 5 глав: литературного обзора, главы материалов и методов и двух глав экспериментальной части, главы с обсуждением результатов, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 115 страницах, включает 22 рисунка и 12 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 148 источников российских и зарубежных авторов.

Основное содержание работы Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель, научная новизна и практическая значимость.

Глава I. Обзор литературы. Эта глава состоит из двух частей. Первая часть посвящена метанокисляющим бактериям. Приводится история открытия этих микроорганизмов, схема метаболизма и их классификация.

Вторая часть посвящена ключевому ферментативному комплексу метанотрофов - ММО (КФ 1.14.13.25). Описано строение и свойства рММО и мММО. В настоящее время известно, что мММО является многокомпонентной ферментной системой, в состав которой входит мембраносвязанная метангидроксилаза (мМГ), NADH-оксидоредуктаза (NADH-OP) и, возможно, ряд пока неизвестных переносчиков электрона и активаторов. Приводятся литературные данные по изучению мМГ: схемы очистки, содержание металлов в активном центре и его структуры.

Глава II. Материалы и методы. В первой части главы приводятся описания проведения экспериментов. Описана методика выращивания метанокисляющих клеток М. capsulatus (штамм М) в режиме проточного культивирования на ферментёре Анкум 2М, разрушения клеток, солюбилизации мембранных структур, условия хроматографии белков, аффинное мечение субстрат-связывающего центра мМГ 14С-ацетиленом и способы определения радиоактивности, приготовление образцов для ЭПР-спектроскопии и методы анализа, полученных препаратов (электрофоретический анализ, определение активности, определение белка, определение содержания ионов меди и железа, электронная спектроскопия).

Во второй части приводятся характеристики использованных реактивов, а также описаны методики получения некоторых необходимых реагентов.

Глава III. Очистка и свойства мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (М). Представлены фотографии целых клеток и их срезов, полученные с помощью электронного микроскопа (рис. 1а-в). мММО расположена на цитоплазматической и внутрицитоплазматической мембранах (рис. 1в).

Рисунок 1. Электронная микроскопия клеток, срезов клеток и фрагментов мембран (везикул) М. сарЫМш (М): а - растровая электронная микроскопия целых клеток (ув. х20000); б - срезы делящейся клетки (ув. х40000), негативное контрастирование 2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, рН 7,0 (для рис. б-г); в -внутриклеточные мембраны на срезах клеток при высоком увеличении: х250000; г - везикулы, полученные в результате ультрацентрифугирования разрушенных клеток, ув. ><50000.

Везикулы, полученные из разрушенных клеток, представляют собой схлопнувшиеся фрагменты внутрицитоплазматических мембран и цитоплазматической мембраны (рис. 1г). Нативная мембранная фракция, которая катализировала окисление метана в присутствии NADH, состояла из везикул с удельной активностью около 150-300 нмоль СН4/(мин • мг белка), Что значительно ниже активности мММО нативных клеток (Таблица 1).

После разрушения клеток около 70 % активности метанолдегидрогеназы (МД) и 80 % активности ЫАЭН-ОР были обнаружены в надосадочной фракции. Эти результаты показывают, что МД и 1МАОН-ОР связаны с мембраной, но не являются интегральными мембранными белками.

Для солюбилизации биологических мембран был использован додецил-Р-Э-мальтозид (ЭОМ). Этот детергент применялся во всех процедурах очистки. Для оптимизации процедуры солюбилизации было изучено различное соотношение мг белка/мг детергента на степень солюбилизации и активности мМГ. Установлено, что оптимальное соотношение равно 1:1,2. Это соотношение и было использовано в экспериментах. Солюбилизацию проводили в течение часа при 4 °С в присутствии 0,5 М ЫаС1. Отделение несолюбилизированных везикул и обломков мембран проводили ультрацентрифугированием при 140000 g 1 час. Процедуру обессоливания, которую многие авторы выполняли с помощью гель - фильтрации, заменили на центрифугирование на ячейках СепЫсоп 50000 (МШероге). Результаты солюбилизации представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы, надосадочная фракция, полученная ультрацентрифугированием мембранных структур, солюбилизированных ЭБМ, не окисляла метан в присутствии NADH. Однако эта фракция при

концентрации белка около 4 мг/мл катализировала окисление метана и пропилена в присутствии дурохинола.

Таблица 1

Солюбилизация мМГ из клеток М. саряиШиз (М)

Препарат Активность

нмоль СНДмин • мг белка) нмоль СзНб/(мин -мг белка)

Целые клетки (300-400)±10 1 -

Фракция везикул (150-300)±8 (NADH) 1 (60-80)±3 (NADH)

Надосадочная фракция 0 (NADH) -

Надосадочная фракция после солюбилизации 0 (NADH) 65±2 (дурохинол) 0 (NADH) 75±2 (дурохинол)

Осадок после солюбилизации 0 (дурохинол) 0 (дурохинол)

Примечание: "-" - измерения не проводились. Для сравнения активность определяли по скорости окисления метана до метанола и по скорости окисления пропилена до окиси пропилена. В скобках указан восстановитель. 1 - активность клеток и везикул определят полярографически по поглощению Ог в присутствии метана и по скорости окисления метана газохроматографическим методом.

Нами было установлено, что в ходе процедур очистки происходит значительная потеря ионов железа и меди (данные не приведены). Поэтому при очистке мМГ количество стадий очистки было снижено до минимума и очистку для сохранения нативности каталитически активного центра проводили в присутствии ионов Си2+ и Fe3+ (50 мкМ).

Очистку мМГ осуществляли с помощью анион-обменной хроматографии на колонке Mono Q в градиенте 0-1 М NaCl. Фракцию мМГ снимали при 0,7 М NaCl. Типичная хроматограмма представлена рисунке 2.

0,2

s 6

1 v L

L Б_/ 1 1

3 1 / / vJ

J V

Рисунок 2. Фракционирование надосадочной фракции после центрифугирования везикул,

растворенных DDM, на колонке Mono Q HR 5/5 (10x1 см): А - поглощение при 260 нм; Б - линейный градиент NaCl; 1-6 - номера объединенных фракций.

12 18 Объем элюекга, мл

Как видно из этого рисунка, на колонке Mono Q солюбилизированный мембранный препарат делится на ряд фракций. Значительная часть (около 40%) препарата не связывается с носителем (фракция 1). В составе этой фракции обнаружены: МД, цитохромы (преимущественно цитохромы группы с) и неидентифицированные белки.

NADH-OP в основном обнаружена во фракции 4. Белок, содержащий медь и негемовое железо, найден во фракции 5. Количество белка во фракции 5 обычно составляло около 30 % от суммы белков исходных мембран.

Фракция 6 содержала незначительное количество белка. Основываясь на максимуме длины волны в спектре поглощения этой фракции (240 нм), можно полагать, что эта фракция в основном содержит нуклеиновые кислоты.

Ни одна из полученных фракций не проявляла ММО активности ни с NADH, ни с дурохинолом. Эти результаты дают дополнительное подтверждение предположению, что дурохинол не является непосредственным восстановителем мМГ. Непосредственный природный восстановитель мМГ, по-видимому, разбавляется и/или инактивируется в процессе фракционирования. В результате этого высоко очищенная мМГ не катализирует окисление пропилена до окиси пропилена.

Фракция 5 состояла из полипептидов с молекулярными массами 47, 27 и 25 кДа, которые могут входить в состав мМГ. Однако не исключено, что эти полипептиды входят в состав разных белков, которые по плотности зарядов на поверхности при рН 7,5 не разделяются используемым методом ионообменной хроматографии. Поэтому фракцию 5 дополнительно фракционировали методом гидрофобной хроматографии на колонке Phenyl Superóse HR 5/5. Фракция 5 делится на две субфракции: первая субфракция не связывалась с фенилсуперозой (субфракция 1); вторая (субфракция 2) связывается с фенилсуперозой и элюируется DDM. Субфракция 1 содержала около 5-7 % белка, а субфракция 2 содержала основную часть белка.

Методом электрофореза в линейном градиенте полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) субфракция 2 разделилась на 3 полипептида: 47 (а), 27 (В) и 25 (у) кДа в соотношении 1:1:1 (рис. 3). По данным атомно-абсорбционного анализа мМГ имеет 1-2 атома негемового железа и 2-4 атома меди на минимальную массу 99 кДа.

1 2

97 кДа 66 кДа

45 кДа

30 «Да 24 кДа 14.4 кДа

Рисунок 3. Электрофорез мМГ (субфракция 2 фракции 5) с маркерами в 10-25% градиенте ПААГ в присутствии 0,1 »/оЭОЗ.

1 - полоса маркеров (100 мкг белка);

2 - мМГ (60 мкг белка).

ГкДа Р у

Из литературы известно, что ацетилен является конкурентным ингибитором мМГ и взаимодействует с центром мМГ, связывающим субстрат. Кроме того, ацетилен является субстратом самоуничтожения, так как при его окислении образуется высоко реакционная (пока неидентифицированная) частица. Основываясь на этих данных, было проведено аффинное мечение 14С-ацетиленом везикул М. capsulatus (М).

При фракционировании солюбилизированной мембранной фракции (предварительно меченной |4С-ацетиленом) при условиях, описанных выше, установлено, что 60-70 % радиоактивности (аффинной метки) обнаруживается в надосадочной фракции (рис. 4). Остальная радиоактивность остается в осадке в несолюбилизированной части мембран.

После хроматографии солюбилизированной фракции на Mono Q, 65 % радиоактивной метки обнаружили во фракции 5 (рис. 4) в составе полипептида с молекулярной массой 27 (В) кДа (Рис. 5).

/

/

/ / 4,

/ ~7\

/ / П

/ /

/

/ / J 77

Клетки Частицы Солюб. Фр.5,мМГ

Рисунок 4. Распределение радиоактивности. По оси ординат отложена радиоактивность (%), по оси абцисс - фракции.

Электрофоретический анализ солюбилизированной фракции, предварительно меченой 14С-ацетиленом (рис. 5), показал, что существенная часть радиоактивности находится в составе полипептида с молекулярной массой 27 (В) кДа. Иногда очень незначительное количество радиоактивной метки (не более одного-нескольких процентов) обнаруживалось в составе полипептидов с молекулярной массой 47 кДа и 60 кДа (рис. 5). Последний полипептид соответствует одной субъединице метанолдегидрогеназы.

Рисунок 5. Электрофорез экстракта M. capsulatus (M) в

61) кДа ■ а 47 кЛа ■

Р 27 кДа у 25 кДн

присутствии SDS после мечения клеток С-ацетиленом:

1 - бесклеточный препарат (200 мкг белка); 2, 3 — везикулы, выделенные из бесклеточного препарата клеток M. capsulatus (M), обработанных |4С-ацетиленом (100 и 50 мкг белка соответственно).

Проведенное исследование показало, что мМГ из М. capsulatus (М) по пептидному составу и содержанию металлов родственна мМГ из М. capsulatus (Bath) и является Cu-Fe-белком. Мы предполагаем, что ионы меди и железа входят в состав металлоцентров фермента и, наиболее вероятно, участвуют во внутримолекулярном переносе электрона от восстановителя на молекулярный кислород, активации молекулярного кислорода и активации метана с последующим превращением в метанол в течение ферментативного процесса.

В связи с неопределенностью состава ионов металла каталитически активного центра мМГ нами предпринята работа по исследованию этого центра методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии.

Глава IV. Исследование каталитически активного центра мМГ методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии. В данной главе представлены экспериментальные данные по изучению везикул и очищенной мМГ из М. сар5и1аШ5 (М) методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии.

Из литературных данных известно, что в ЭПР спектрах везикул наблюдается сигнал меди типа II. Такой же сигнал мы наблюдали на везикулах М. сарБиЫиз (М). Спектры ЭПР везикул с кислородом не отличаются от спектров везикул с кислородом и пропиленом. Спектры ЭПР везикул с пропиленом без кислорода не отличаются от спектров везикул с ИАОН (данные не приведены). Можно предположить, что мМГ сначала активирует кислород, а затем пропилен.

Чтобы прояснить вопрос об ионах металлов активного центра, не детектируемых методом ЭПР в обычных условиях, мы попытались обнаружить возможные интермедиаты (промежуточные состояния) этого центра. Для этого мМГ инкубировали с перекисью водорода (20 сек) при 4 и -30 °С. Различие в степени замедления разных стадий реакции при низкой температуре может привести к образованию метастабильных состояний активного центра. Последующее замораживание фиксирует возникшие интермедиаты и позволяет их исследовать при низких температурах. Стационарная концентрация таких интермедиатов может быть как низкой, так и высокой, поскольку существенно зависит от времени их жизни.

На рисунке 6 приведены спектры ЭПР мМГ, инкубированной с перекисью водорода при 4 °С (а) и при -30 °С (б, в). Рисунок 7 - увеличенная низкополевая часть этих спектров.

2,05

[

Условия регистрации: частота

микроволнового поля 9,4 ГГц, частота модуляционного поля 100 кГц, амплитуда модуляционного поля 0,5 мТл, мощность микроволнового поля 16 мВт (а, б); 100 мВт (в), температура 10 К.

Рисунок 6. Спектры ЭПР мМГ с перекисью водорода, инкубированной при 4 °С (а) и -30 °С (б, в) в 50% этиленгликоле.

частота

В.шТ

g= 13.5 8.5 Л,5 6.0 4,3

Рисунок 7. Увеличенная низкополевая часть спектров ЭПР мМГ с перекисью водорода, инкубированной при 4°С (а) и -30 °С d (б, в) в 50% этиленгликоле.

Условия регистрации: см. рис. 6.

«

i-1-1-'-1

О 100 200

В, гаТ

В спектре ЭПР на рисунке 6 наблюдается пик при g=3,0, который принадлежит компоненте сигнала низкоспинового цитохрома (согласно спектрам поглощения исследуемый препарат мМГ содержит небольшое количество цитохромов). Сигнал при g=4,3 принадлежит высокоспиновой форме Fe (III), неспецифически связанного с мМГ. Сигналы при g= 6,0 и 6,5 обусловлены гемовыми комплексами высокоспиновой формы Fe (III). Подобные сигналы также наблюдались другими авторами в препаратах мМГ и AMO, но нет прямых доказательств, что высокоспиновые гемовые комплексы железа являются активным центром мМГ. В работах A.A. ДиСпирито сделано предположение о возможном присутствии двухядерного центра железа в каталитическом центре мМГ.

P.JI. Либерман и Э.С. Розенцвейг впервые сделали рентгеноструктурную модель мМГ из М capsulatus (Bath) и не обнаружили атомы железа, однако они предполагают, что ионы железа могут быть потеряны при очистке и кристаллизации в присутствии ионов Zn2+.

При инкубации мМГ при -30 °С в спектре ЭПР наблюдаются новые сигналы: пики при g= 8,5 и 13,5. Так же, как и сигнал при g=6,0, амплитуда этих сигналов увеличивается при увеличении мощности радиочастотного поля при регистрации спектра при 10 К (Рис. 6, 7). Последнее свидетельствует в пользу сильного взаимодействия этих парамагнитных центров с решеткой. Следует отметить, что низкополевые сигналы в препаратах мМГ наблюдали только Дж. А. Зан и A.A. ДиСпирито. Однако сами авторы указывают, что наблюдаемый

ими сигнал при 2,5 подобен широкому низкополевому сигналу от системы с целым спином (Б=п). Этот сигнал имеет форму производной сигнала поглощения, характерную для центров со спином 5=я(и>2). В отличие от этого сигнала наблюдаемые нами сигналы интермедиатов имеют существенно меньшую ширину и форму пиков (т.е. сигналов поглощения), что характерно для низкополевых компонент сигналов центров с 5=и/2 (п=2к+\) при наличии ромбического искажения центров. В.Р. Хаген в приближении слабого поля (£$#=/гу«|0|) рассчитал зависимости величин эффективного значения g-фактора (§-:,ф) от параметра ромбичности ЕЮ для Крамерсовых дублетов высокоспиновых центров с 5=3/2, 5/2, 7/2, 9/2, где Б и Е - параметры расщепления в нулевом поле. Согласно этим зависимостям, сигнал при я=13,5 может наблюдаться для центров с 5=7/2 и 5=9/2. Димер, содержащий формально Ре (5=5/2) и Ее (5=2), может иметь величину 5, равную 9/2, при наличии делокализации электрона, что соответствует взаимодействию по типу двойного обмена. Если 5, равная 5/2, принадлежит Ее(Ш), то 5=2 могут иметь как Ре(Н), так и Ее(1У). Димер, который формально (так как при наличии делокализации валентности обоих ионов равны) можно обозначить как [Ре(Н)-Ее(Ш)] или [Ре(Ш)-Ре(1У)], может возникнуть как интермедиат соответственно при восстановлении или окислении исходного димера [Ре(Ш)-Ре(Ш)].

В соответствии с диаграммами, представленными В.Р. Хагеном, при 5=9/2 сигнал с §Эф=13,5 можно наблюдать при малой ромбичности {ЕЮ-0,025) для переходов с|т5=±1/2> дублета (при £»0 он является нижним). Сигнал с £=8,5 при этом не должен наблюдаться. При увеличении ромбичности до 0,125 можно наблюдать сигнал с §Эф=8,5 для | /и,.=±3/2> дублета. Согласно работе В.Р. Хагена, при увеличении ромбичности возрастают трудности с регистрацией субспектра от | от(=±1/2> (характеризуется g■¡ф =16), что объясняет отсутствие данного сигнала в спектрах ЭПР (рис. 6-7). Для дублетов \т5=±5/2>, | /я.,=±7/2> и | т,=±9/2> вероятности переходов крайне малы и сигналы также не должны наблюдаться. Таким образом, если димер имеет спин 5=9/2, то в спектре могут наблюдаться сигналы с §=13,5 {ЕЮ-0,025, | т,=±)/2>) и/или с §=8,5 {ЕЮ ~ 0,125, дублет | да5=±3/2>). Таким образом, этот димер имеет две возможные структуры: первую - с малой ромбичностью, и вторую - с заметной ромбичностью.

Аналогично, для биядерного комплекса с суммарным спином 5=7/2, и малым ромбическим искажением (£/¿5—0,015) может наблюдаться сигнал с

13

g„¡,=8,5 для дублета | ms =±1/2>. При увеличении ромбичности до £/£>=0,285 сигналы имеют следующие величины £Эф=8,5 для дублета | ms =±5/2> и 13,5 для дублета | т5 =±1/2>. При увеличении ромбичности до максимально возможного значения £/£>= 1/3 для дублета | т, =±5/2> и для дублета |«i.s=±3/2> наблюдаются переходы с одним и тем же значением £Эф=8,4, что, ввиду грубости наших оценок, вполне соответствует нашим экспериментальным данным. Хотя эти значения g^ соответствуют значениям g-фактора наблюдаемых сигналов, анализ вероятности переходов свидетельствует в пользу того, что для £/£>= 1/3 вероятность перехода для ga;!,, равного 13,5, настолько мала, что сигнал не должен наблюдаться. Вероятность перехода для дублета | ms=±7/2> является крайне малой, поэтому сигнал наблюдаться не должен. Таким образом, сигнал с g=13,5 может наблюдаться лишь в случае спина 5=9/2 для структур с малой ромбичностью. Поэтому возможны интермедиаты - димеры [Fe(II)-Fe(III)] и [Fe(III)-Fe(IV)], причем второй интермедиат более вероятен, так как при описаниях реакций с участием кислорода и (или) перекиси водорода образуются формы железа с высокой степенью окисления. При этом сигнал с £:)ф=8,5 наблюдается от соответствующей димерной [Fe(III)-Fe(IV)] структуры с 5=9/2 и более высокой ромбичностью £/£> ~ 0,125.

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные, как и результаты проведенного анализа, свидетельствуют в пользу образования высокоспинового интермедиата смешанной валентности [Fe(III)-Fe(IV)] при реакции перекиси водорода при -30 °С с активным центром мМГ. Образовавшийся при этих условиях интермедиат [Fe(III)-Fe(IV)] характеризуется несколькими структурами с 5=9/2, различающимися степенью ромбического искажения; структура с малым ромбическим искажением (£/£>-0,025) ответственна за сигнал cg=13,5, с более значительным искажением (£/£>-0,125) - за сигнал с g=8,5, возможна также структура с 5=7/2 и ромбическим искажением (£/£>-0,015) тоже ответственная за сигнал с g=8,5.

Образование интермедиата [Fe(III)-Fe(IV)] служит достаточным основанием для заключения о присутствии биядерного комплекса железа в качестве активного центра мМГ, находящегося в состоянии окисления [Fe(III)-Fe(III)] до начала рассматриваемой реакции. По аналогии с другими ферментами, содержащими биядерные центры негемового железа, для димера

[Fe(III)-Fe(III)] должно наблюдаться антиферромагнитное обменное взаимодействие и S= 0.

Глава V. Обсуждение результатов. В данной главе приводится обсуждение полученных экспериментальных и литературных данных.

О природе активного центра мМГ в литературе до сих пор ведутся споры. Рентгеноструктурная модель мМГ P.JI. Либерман и Э.С. Розенцвейг не прояснила этот вопрос. С.И. Чэн с сотрудниками до сих пор настаивают на трехядерном медном центре, который выполняет роль каталитического центра, ссылаясь на то, что препараты, использованные для кристаллизации были не активны. Авторы воспроизвели методику очистки мМГ, по которой получали эти белковые препараты для кристаллизации и показали, что в ходе всех процедур очистки происходит значительная потеря ионов меди, вызывая разрушение трехядерных медных центров и потерю ферментативной активности. Вероятно, погрешность в определение меди (методом атомно -абсорбционной спектроскопии) вносило присутствие метанобактина. Недавно авторы рентгеноструктурного анализа опубликовали работу по изучению мМГ из М. capsulaíus (Bath) методом поглощения на краю рентгеновского излучения. Авторы показали, что взаимодействие Cu-Cu присутствует во всех образцах мМГ и это расстояние между атомами меди увеличивается при восстановлении медного центра. Также авторы сделали вывод, что железо, присутствующее в препаратах мМГ, полученных ими самими и другими исследователями, обусловлено присутствием примеси - гемсодержащего белка. Других данных о структуре и составе активного центра мМГ, сделанных на основе рентгеноструктурного анализа, в литературе нет. В данной работе впервые предприняты попытки получить переходные состояния активного центра и представлены экспериментальные данные о наличии интермедиата [Fe(III)-Fe(IV)] в препаратах мМГ. Это позволяет предположить, что исходным состоянием активного центра является ЭПР недетектируемый димер [Fe(III)-Fe(III)]. На момент окончания наших экспериментов подобные результаты в литературе отсутствовали. Однако, недавно (в конце 2007 г) A.A. ДиСпирито с соавторами опубликовали работу по изучению мМГ из М. capsulatus (Bath) методом мёссбауэровской спектроскопии. Согласно представленным данным мМГ содержит биядерный Fe-Fe центр, подобный Fe-Fe центру рМГ, что хорошо согласуется с нашими выводами.

Биядерный Fe-Fe центр должен быть расположен в составе (3-субъединицы мМГ, так как только эта субъединица аффинно метится 14С-ацетиленом, и содержит весь набор консервативных лигандов (His38, His40, His 168, His 232, Asp47, Asp 49, Asp 53, GlulOO, Tyr37, Tyrl57, Met42 - данные из анализа первичной последовательности мМГ из М. capsulatus (Bath)), необходимых для его расположения в составе фермента.

Обобщенные данные по изучению мМГ, полученные в данной работе и на основе анализа литературных данных, представлены на рисунке 8. Согласно работам Э.С. Розенцвейг и Н. Мироновой мМГ после солюбилизации и очистки представляет собой тример (для удобства на рисунке изображен один протомер). Известно, что NADH не является непосредственным восстановителем мМГ. Электроны от NADH через NADH-OP, убихинон(ы) и цитохромы попадает на медный центр мМГ. Дальнейший путь электрона также является объектом дальнейших исследований. Электрон может непосредственно с моноядерого медного центра попадать на биядерный железный центр, расположенный в р-субьединице, где происходит окисления метана. Не исключено, однако, что электрон на Fe-Fe центр попадает через Cu-Cu центр. Ведь о природе и функциях Cu-Cu центра в литературе до сих пор нет достоверных данных.

мММО

Рисунок 8. Предполагаемые пути переноса электронов от NADH-OP в активный центр мМГ в мембране М. capsulatus (М) и М. capsulatus (Bath).

N/s —

Условные обозначения: а, у

NADH-OP

субъединицы мМГ; Си - моноядерный, Cu-Cu - биядерный медные центры, расположенные в водорастворимой части а-субъединицы; биядерный Fe-Fe центр мМГ, расположенный в 13-субъединице; NADH-OP и Cyt с -неинтегральные мембранные белки; 2Fe2S - Fe2-S2 центр NADH-OP;

Q - убихинон; Cyt с - цитохром с.

Предполагаемая схема каталитического цикла активного центра мМГ представлена на рисунке 9.

Рисунок 9. Предполагаемый механизм каталитического цикла активного центра мМГ в реакции окисления метана.

Сначала идет двухэлектронное восстановление [Ре(Ш)-Ре(Ш)] до [Ре(П)-Ре(П)]. Этот интермедиат быстро связывает 02, образуя гидроперекисный интермедиат. Далее происходит гетеролитический разрыв связи О-О. Кислород связывается с биядерным железным центром, давая супероксо- и мостиковые пероксо аддукты. Которые затем, с введением двух протонов, превращается в уникальное бис-р-оксо-биядерное соединение Ре (IV), названное соединением О (для рМГ образование этого соединения было доказано экспериментально Рчгакс=330, 430 нм, 8=8000 моль/л-см]. Скорость исчезновения 0 зависит от природы и концентрации субстрата, что указывает на то, что 0 является активным интермедиатом.) Затем соединение О взаимодействует с субстратом и превращается в переходный метастабильный комплекс [Ре(Ш)-Ре(1У)]. Существование этого переходного состояния было подтверждено нами экспериментально. Затем наступает последняя стадия, в которой метастабильное состояние переходит в исходное состояние активного центра [Ре(Ш)-Ре(Ш)]. На этой стадии каталитический цикл заканчивается.

Мы склоняемся к тому, что активация метана начинается со связывания метана с атомом железа активного центра (соединением 0). При этом

О Ре (III) ©Ре (II)

О Ре (IV)

происходит деформация тетраэдра молекулы метана с разрыхлением С-Н-связей метана (без их разрыва). При этом С-Н-связь ослабевает, в нее внедряется атом кислорода с образованием метанола, и каталитический центр возвращается в исходное состояние. Этот механизм, ранее предложенный А.Ф. Шестаковым и А.Е. Шиловым, удовлетворительно объясняет кинетические изотопные эффекты, проявляемые мМГ.

Выводы

1. Разработаны оптимальные условия выделения и очистки мМГ из М capsulatus (штамм М) в присутствии детергента додецил-р-О-мальтозида. Показано, что в ходе очистки происходит потеря как ионов Си2+, так и ионов Fe3+. Этот процесс усиливается с увеличением числа стадий очистки и может быть существенно снижен добавлением ионов меди и железа в среды для выделения.

2. Установлено, что мМГ из М capsulatus (штамм М), также как и мМГ из М capsulatus (Bath), состоит из трех полипептидов с молекулярными массами 47 (а), 27 (Р) и 25 (у) кДа в молярном соотношении 1 : 1 : 1. На одну молекулу мМГ приходится 2-4 атома меди и 1-2 атома железа. Спектр ЭПР очищенной мМГ содержит только сигнал Си (II).

3. Впервые для мМГ в реакции с перекисью водорода обнаружен интермедиат [Fe(III)-Fe(IV)], проявляющий сигнал ЭПР. Образование интермедиата [Fe(IlI)-Fe(IV)] служит основанием для заключения о присутствии биядерного комплекса железа в качестве каталитически активного центра мМГ из М. capsulatus (штамм М), находящегося в состоянии окисления [Fe(III)-Fe(III)].

4. Проведено аффиное мечение активного центра мМГ из М. capsulatus (штамм М) 14С-ацетиленом. По данным радиоавтографии с 14С-ацетиленом установлено, что каталитически активный центр, на котором происходит окисление метана до метанола, находится в р-субъединице фермента.

5. Установлено, что метанолдегидрогеназа и NADH-оксидоредуктаза из М capsulatus (штамм М) связаны с мембраной, но не являются интегральными мембранными белками.

По теме диссертации опубликованы работы:

Т. Р. И. Гвоздев, И. А. Тухватуллин, Л. В. Туманова, Очистка и свойства мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (Штамм M) II Известия АН, серия биологическая, 2008, № 2, с. 186 - 195.

2. Л. В. Туманова, И. А. Тухватуллин, Д. Ж. Бурбаев, Р. И. Гвоздев, К. К. Андерссон, Биядерный железный центр мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (штамм M) II Биоорганическая химия, 2008, том 34, № 2, с. 194 - 203.

3. Л. В. Туманова, И. А. Тухватуллин, Д. Ш. Бурбаев, С. А. Голованова, Р. И. Гвоздев, К. К. Андерссон, Активный центр мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (M) II Сборник трудов VII конференции имени Воеводского "Физика и химия элементарных химических процессов", Черноголовка, 2007, с. 300 - 305.

4. Л. В. Туманова, И. А. Тухватуллин, Р. И. Гвоздев, Свойства и функция цитохрома с из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus, "Молодая наука в классическом университете" II Тезисы докладов, Иваново, 2004, с. 28 -29.

5. Л. В. Туманова. И. А. Тухватуллин, Р. И. Гвоздев, Изучение мембраносвязанной метанмонооксигеназы из Methylococcus capsulatus (штамм M), I Всероссийская школа - конференция. Молодые учёные - новой России. Фундаментальные исследования в области химии и инновагрюнная деятельность II Тезисы докладов, Иваново, 2005, с. 188.

6. Л. В. Туманова. Р. И. Гвоздев, И. А. Тухватуллин, Природа металлоцентров мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (штамм M), XXIV Всероссийская школа - симпозиум молодых учёных по химической кинетике II Программа и тезисы, Пансионат "Берёзки", Московская обл., 2006, с. 67.

7. Л. В. Туманова. И. А. Тухватуллин, Р. И. Гвоздев, Мембраносвязанная метангидроксилаза из Methylococcus capsulatus (штамм M), "Молодая наука в классическом университете" И Тезисы докладов, Иваново, 2006, с. 25.

8. Л. В. Туманова. И. А. Тухватуллин, Д. Ж. Бурбаев, Р. И. Гвоздев, Биядерный железный центр мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (штамм M), Современная химическая физика II Программа и тезисы, Пансионат МГУ "Буревестник", г. Туапсе, 2006, с. 282 - 283.

9. Л. В. Туманова. И. А. Тухватуллин, С. А. Голованова, Р. И. Гвоздев, Изучение мембраносвязанной метангидроксилазы из Ме(ку1ососст сар$и\а1т (штамм М), "Молодая наука в классическом университете" // Тезисы докладов, Иваново, 2007, с. 44.

10. Л. В. Туманова. И. А. Тухватуллин, Д. Ж. Бурбаев, Р. И. Гвоздев, К. К. Андерссон, Биядерный железный центр мембраносвязанной метангидроксилазы из МеЖуЬсоссш саряиШт (штамм М), VII конференция имени Воеводского "Физика и химия элементарных химических процессов" // Тезисы докладов, Черноголовка, Московская обл., Россия, 2007, с. 282.

Заказ № 135/10/08 Подписано в печать 14.10.2008 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25

/'г<\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 . ) www. cfr. ru ; e-mail: info@cfr. ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Туманова, Лидия Владимировна

Список условных сокращений.

Введение.

Глава I Обзор литературы

1.1 Метанокисляющие бактерии.

1.2 Мембраносвязанная метанмонооксигеназа.

1.3 Активный центр мМГ.

1.4 Метанобактин.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм функционирования мембраносвязанной метангидроксилазы из Methylococcus capsulatus (штамм М) в реакции окисления метана"

3.2 Метанокисляющая активность, электронная микроскопия клеток М. сарзиШш (штамм М) и их срезов.42

3.3 Солюбилизация мМГ.45

3.4 Очистка мМГ.51

3.5 Аффинное мечение субстрат-связывающего центра мМГ 14С-ацетиленом.59

3.5 Заключение.63

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Туманова, Лидия Владимировна

выводы

1. Разработаны оптимальные условия выделения и очистки мМГ из М. capsulatus (штамм М) в присутствии детергента додецил-Р-О-мальтозида. Показано, что в ходе очистки происходит потеря как ионов Си2+, так и ионов Fe3+. Этот процесс усиливается с увеличением числа стадий очистки и может быть существенно снижен добавлением ионов меди и железа в среды для выделения.

2. Установлено, что мМГ из М capsulatus (штамм М), также как и мМГ из М capsulatus (Bath), состоит из трех полипептидов с молекулярными массами 47 (а), 27 (Р) и 25 (у) кДа в молярном соотношении 1 : 1 : 1. На одну молекулу мМГ приходится 2-А атома меди и 1-2 атома железа. Спектр ЭПР очищенной мМГ содержит только сигнал Си (II).

3. Впервые для мМГ в реакции с перекисью водорода обнаружен интермедиат [Fe(III)-Fe(IV)], проявляющий сигнал ЭПР. Образование интермедиата [Fe(III)-Fe(IV)] служит основанием для заключения о присутствии биядерного комплекса железа в качестве каталитически активного центра мМГ из М capsulatus (штамм М), находящегося в состоянии окисления [Fe(III)-Fe(III)].

4. Проведено аффиное мечение активного центра мМГ из М. capsulatus (штамм М) 14С-ацетиленом. По данным радиоавтографии с 14С-ацетиленом установлено, что каталитически активный центр, на котором происходит окисление метана до метанола, находится в Р-субъединице фермента.

5. Установлено, что метанолдегидрогеназа и NADH-оксидоредуктаза из М. capsulatus (штамм М) связаны с мембраной, но не являются интегральными мембранными белками.

5.2 Заключение

В результате проведенного исследования была разработана схема очистки мМГ. Рассмотрены факторы, влияющие на активность мМГ. На основании анализа представленных и литературных данных рассмотрены причины потери ММО активности. Представлены экспериментальные доказательства, указывающие на природу металлоцентров мМГ, и предложена схема каталитического цикла активного центра мМГ. Дальнейшие исследования должны быть направлены на более полное изучение структуры мМГ, каталитического центра мМГ и изучение интермедиатов этого активного центра. Необходимо выращивать кристаллы мМГ из активного препарата. Вероятно, что потеря ионов железа из активного центра мМГ в ходе очистки приводит не только к потере активности, но и к нарушению структуры белка. И из такого препарата методом рентгеноструктурного анализа невозможно получить достоверную белковую структуру и структуру активного центра. Только комплексное изучение различными методами исследования позволит дать точный ответ на вопрос о транспорте электрона.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Туманова, Лидия Владимировна, Москва

1. Н. Dalton, The Leeuwenhoek Lecture 2000. The natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria // Phil. Trans. S. Soc. В, 2005, V. 360, p. 1207 1222.

2. J. W. Foster, R. H. Davis, A methane dependent coccus, with notes on classification and nomenclature of obligate methane-oxidizing bacteria // J. Bacterid., 1966, V. 91, p. 1924 1931.

3. R. Wittenbury, К. C. Phillips, J. F. Wilkinson, Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria II J. Gen. Microbiol., 1970, V. 61, p. 205 -218.

4. В. К. Акименко, "Альтернативные оксидазы микроорганизмов", M.: Издательство "Наука", 1989, 263 с.

5. Ю. Р. Малашенко, В. А. Романовская, Ю. А. Троценко, "Метанокисляющие организмы", М.: Издательствово "Наука", 1978, 198 с.

6. А. А. Штейман, Структура и каталитический механизм метанмонооксигеназы и подходы к ее моделированию // Изв. РАН (сер. хим.), 1995, №6, с. 1011- 1020.

7. И. А. Тухватуллин, Л. А. Коршунова, А. 3. Авербах, Р.И. Гвоздев // Тез. Докл. Конф. "Высокоорганизованные каталитические системы на основе комплексов меди: принципы формирования и механизма действия" (Москва 19 июня 1996), Москва, 1996, с. 4.

8. С. Anthony, Bacterial oxidation of methane and methanol // Adv. Microbiol. Physiol, 1986, V. 27, p. 113 210.

9. S.-I. Chan, H.-H. Nguyen, A. K. Shiemke, M. E. Lidstrom // Bioinorganic chemistry of copper/Eds. Karlin K.D., Tyeklar Z. N. Y.; L.: Chapman Hall, 1993, p. 184-195.

10. S.-I. Chan, H.-H. Nguyen, A. K. Shiemke, M. E. Lidstrom // Microbial growth on Ci compounds/Eds. Murrell J.C., Kelly D.P. U.K.: Intercert, 1993, p. 93 107.

11. J. D. Semrau, A. Chistoserdov, J. Lebron et al., Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs // J. Bacteriol., 1995, V. 177, p. 3071 -3078.

12. D. J. N. Cardy, V. G. Laidler, P. C. Salmond, J. C. Murrell, Molecular analysis of the methane monooxygenase (MMO) gene cluster of Methylosinus trichosporium OB3b //Mol. Microbiol, 1991, V. 5, p. 335 342.

13. Raquel L. Lieberman, Amy C. Rosenzweig, Biological Methane Oxidation: Regulation, Biochemistry, and Active Site Structure of Particulate Methane Monooxygenase // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2004, V. 39, p. 147-164.

14. M. P. Woodland, H. Dalton, Purification and characterization of component A of the methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) // Biochim. Biophys. Acta, 1984, V. 73, p. 53 59.

15. S. J. Pilkington, H. Dalton, Purification and characterisation of the soluble methane monooxygenase from Methylosinus sporium 5 demonstrates the highlyconserved nature of this enzyme in methanotrophs // FEMS. Microbiol. Lett., 1991, V. 78, p. 103 108.

16. D. A. Kopp, S. J. Lippard, Soluble methane monooxygenase: activation of dioxygen and methane // Current Opinion in Chem. Biol., 2002, V. 6, p. 568 576.

17. J. D. Lipscomb, Biochemistry of the soluble methane monooxygenase // An. Rev. Biochem., 1994, V. 48, p. 371 -399.

18. А. С Rosenzweig, C. A. Frederick, J. S. Lippard, P. Nordlund, Crystal structure of a bacterial nonheme iron hydroxylase that catalyses the biological oxidation of methane II Nature, 1993, V. 366, p. 537 543.

19. Amanda S. Hakemian, Amy С. Rosenzweig, The Biochemistry of Methane Oxidation И Annu. Rev. Biochem., 2007, V. 76 p. 223 241.

20. M. S. P. Logan, A. B. Hooper, Suicide Inactivation of Hydroxylamine Oxidoreductase of Nitrosomonas europaea by Organohydrazines // Biochemistry, 1995, V. 34, p. 9257-9264.

21. J. Colby, H. Dalton, Resolution of the methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath) into three components // Biochem. J., 1978, V. 171, p. 461-468.

22. И. А. Тухватуллин, Р. И. Гвоздев, К. К. Андерссон, Структурная и функциональная модель метангидроксилазы из мембраносвязанной метанмонооксигеназы из Methylococcus capsulatus (Bath) // Изв. РАН (сер. хим.), 2001, № 10, с. 1783 1792.

23. Д. Ш. Бурбаев, И. А. Мороз, Р. И. Гвоздев, JI. А. Коршунова, Медьсодержащий белок мембранных структур метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus (шт. М), содержащих метанмонооксигеназу // Доклады Академии Наук, том 339, 1994, № 4, с. 541 543.

24. И. А. Тухватуллин, JI. А. Коршунова, Р. И. Гвоздев, Г. Долтон, Исследование Cu-центра мембраносвязанной метанмонооксигеназы из субклеточных структур Methylococcus capsulatus штамм М // Биохимия, 1996, №61, с. 1241- 1250.

25. S. S. Lemos, М. L. Perille Collins, S. S. Eaton, G. R. Eaton, W. E. Antholine, Comparison of EPR visible Cu" sites in pMMO from Methylococcus capsulatus (Bath) and Methylomicrobium album BG8 // Biophis. J., 2000, V. 79, p. 1085 -1094.

26. D. D. S. Smith, H. Dalton, Solubilisation of methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) // Eur. J. Biochem., 1989, V. 182, p. 667 — 671.

27. P. Basu, B. Katterle, К. К Andersson, H. Dalton, The membrane-associated form of methane mono-oxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) is a copper/iron protein, // Biochem. J., 2003, V. 309, p. 417 427.

28. J. A. Zahn, A. A. Dispirito, Membrane associated methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) // J. Bacteriol., 1996, V. 178, p. 1018 — 1029.

29. M. Takeguchi, K. Miyakawa, I. Okura, Purification and properties of particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b // Jornal of Molecular Catalysis A: Chemical, 1998, V. 132, p. 145 153.

30. R. L. Lieberman, A. C. Rosenzweig, Crystal structure of a membrane bound metalloenzyme that catalyses the biological oxidation of methane // Nature, 2005, V. 434, p. 177-182.

31. A. Kitmitto, N. Myronova, P. Basu, H. Dalton, Characterization and structural analysis of an active particulate methane monooxygenase trimer from Methylococcus capsulatus (Bath) II Biochemistry, 2005, V. 44, p. 10954 10965.

32. Hee Jung Hwang, Yi Lu, Spectroscopic evidence for interactions between hexacyanoiron (II/III) and an engineered purple CuA azurin, // J. Inorg. Biochem., 2004, V. 98, p. 797 802.

33. Hiep-Hoa T. Nguyen, S. J. Elliot, J. Hon Kay Yip, S. I. Chan, The particulate Methane Monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) is a novel copper -containing three - subunit Enzyme II J. Biol Chem., 1998, V. 273, No. 14, p. 7957 -7966.

34. Chan Li Chen, K. H.-C. Chen, Shyue-Chu Ke, S. S.-F. Yu, S. I. Chan, Preparation and characterizaition of a (Cu, Zn) - pMMO from Methylococcus capsulatus (Bath) II J. Inorg. Biochem., 2004, V. 98, p. 2125 - 2130.

35. J. A. Zahn, D. M. Arciero, A. B. Hooper, A. A. DiSpirito, Evidence for an iron center in ammonia monooxygenase from Nitrosomonas europaea II FEBS Letters, 1996, V. 397, p. 35-38.

36. M. Takeguchi, K. Miyakawa, I. Okura, Purification and properties of particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b // J. Mol. Catal. A: Chemical, 1998, V. 12, p. 145 153.

37. M. Takeguchi, K. Miyakawa, I. Okura, Properties of the membranes containing the particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b //

38. Biometais, 1998, V.l 1, p. 229 234.

39. M. Takeguchi, M. Ohashi, I. Okura, Role of Iron in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b // BioMetals, 1999, V. 12, p. 123- 129.

40. M. Takeguchi, T. Yamada, T. Kamachi, I. Okura, Redox behavior of copper in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b // BioMetals, 1999, V. 12, p. 27-33.

41. M. Takeguchi, I. Okura, Role of iron and copper in particulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b // Catal. Surv. Japan, 2000, V. 4, p. 51-63.

42. H. Yuan, M. L. Perille Collins, W. E. Antholine, Low frequency EPR of the copper in particulate methane monooxygenase from Methylomicrobium albus BG8 // JACS, 1997, V. 119, p. 5073 - 5074.

43. H. Yuan, M. L. Perille Collins, W. E. Antholine, Type 2 Cu2+ in pMMO from Methylomicrobium album BG8 //Biophys. J., 1999, V. 76, p. 2223 2229.

44. A. A. DiSpirito, J .A. Zahn, D. W. Graham et al., Copper-binding compounds from Methylosinus trichosporium OB3b // J. Bacteriol, 1998, V. 180, p. 3606 -3616.

45. Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи, "Электрофорез в разделении биологических макромолекул", М.: Издательство "Мир", 1982, 448 с.

46. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс, "Справочник биохимика", М.: Издательство "Мир", 1991, 544 с.

47. S. D. Prior, H. Dalton, Acetylene as a suicide substrate and active site probe for methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) // FEMS Microbiol. Lett., 1985, V. 29, p. 105 109.

48. Л. А. Коршунова, H. П. Акентьева, P. И. Гвоздев, Ё. В. Шушеначева, Изучение NADH-редуктазного компонента мембраносвязанной метанмонооксигеназы из Methylococcus capsulatus (штамм М) // Биохимия, 1989, №54, с. 1852- 1857.

49. М. М. Bradford, A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem., 1976, V. 72, p. 248 254.

50. A. K. Shimke, S. A. Cook, T. Miley, P. Singleton, Detergent solubilization of membrane-bound methane monooxygenase requires plastoquinol analogs as electron donors II Arch. Biochem. Biophys., 1995, V. 321, p. 421 428.

51. U. K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 И Nature, 1970, V. 227, p. 680 685.

52. В. В. Лалов, Анализ и синтез технологических систем производствакормового белка из природного газа, Дис. . д-ра технич. наук, М., 1991, 350 с.

53. S. D. Prior, H. Dalton, The effect of copper ions on membrane content and methane mono-oxygenase activity in methanol-grown cells of Methylococcus capsulatus (Bath) II J. Gen. Microbiol., 1985, V. 131, p. 155 163.

54. B. A. Atherton, E. L. Cunningham, A. G. Splittgerber, A mathematical model for the description of the coomassie brilliant blue protein assay // Analyt. Biochem., 1996, V. 233, p. 160- 168.

55. И. А. Тухватуллин, P. И. Гвоздев, К. К. Андерссон, Структура активного центра В- пептида мембраносвязанной метанмонооксигеназы (рММО) из Methylococcus capsulatus (Bath) II Докл. РАН, 2000, № 1, с. 115 120.

56. Е. I. Solomon, U. М. Sundaram, Т. Е. Machonkin, Multicopper Oxidases and Oxygenases // Chem. Rev., 1996, V. 96, p. 2563 2605.

57. W. R. Hagen, EPR spectroscopy as a probe of metal centres in biological systems II Dalton Trans., 2006, p. 4415 4434.

58. С. В. Хангулов, В. В. Барынин, В. Р. Мелик-Адамян, Н. В. Воеводская, JI. А. Блюменфельд, С. Н. Добряков, В. Н. Ильясова, ЭПР исследование Т-каталазы из Thermus thermophilus II Биоорган, химия, 1986, Т. 12, с. 741 — 748.81. Chem. Rev., 1996, V. 96.

59. S. P. J. Albracht, Application of electron paramagnetic resonance in the study of iron-sulfur clusters in energy-transducing membranes // Curr. Top. Bioenerg., 1984, V. 13, p. 79- 106.

60. H. Beinert, R. Sands, Succinic and reduced diphosphopyridine nucleotide dehydrogenase preparation by paramagnetic resonance spectroscopy // Biochem. Biophys. Res. Communs., 1960, V. 3, p. 41 -46.

61. Г. Эйхгорн, "Неорганическая биохимия", M.: Издательство "Мир", 1978, 260 с.

62. R. Н. Sands, W. R. Dunham, Spectroscopic studies on two-iron ferredoxins // Quart. Rev. Biophys., 1974, V. 7, p. 443 504.

63. D. O. Hall, К. K. Rao, R. Cammack, The iron-sulfur proteins: structure, function and evolution of ubiquitous group of proteins // Sci. Progr. (Oxf.'), 1975, V. 62, p. 285-316.

64. J. F. Gibson, D.O. Hall, J. H. M. Thornley, F. R. Whetley, The iron complex in spinach ferredoxin // PNAS, 1966, V. 56, p. 987 990.

65. J. P. Gayda, J. Gibson, R. Cammack, D. O. Hall, R. Mullinger, Spin lattice relaxation and exchange interaction in a 2-iron, 2-sulphur protein // Biochim, Biophys. Acta., 1976, V. 434, p. 154 163.

66. Д. Ш. Бурбаев, А. В. Лебанидзе, Оценка обменного интеграла антиферромагнитного взаимодействия между атомами железа в активном центре ферредоксинов II Биофизика, 1979, Т. 24, с. 392 — 395.

67. L. A. Blumenfeld, D. Sh. Burbaev, R. M. Davydov // Nonequilibrium Problems in the Physical Sciences and Biology/Eds. Welch G.R., New York; Chichester; Brisbane; Toronto; Singapore: Wiley-Interscience Publ., 1986, p. 369 — 402.

68. D. O. Hall, R. Cammack, К. K. Rao // Iron in biochemistry and medicine/Eds. Jacob A., Worwood M. London: Acad. Press, 1974, p. 279 327.

69. H. Beinert, EPR spectroscopy of components of the mitochondrial electron-transfer system // Methods in Enzymology, 1978, V. 54, p. 133 151.

70. T. Ohnishi, Studies on the mechanism of site I energy conservation // Eur. J. Biochem., 1976, V. 64, p. 91 103.

71. Д. HI. Бурбаев, JI. А. Блюменфельд, Трансформация энергии в митохондриях: роль железосерного центра N-2 НАДН-дегидрогеназы // Биофизика, 1984, Т. 29, с. 506 515.

72. L. S. Que, Bioinorganic Catalysis. New York: Marcel Dekker, 1993.

73. B. J. Wallar, J. D. Lipscomb, Oxygen activation by enzymes containing binuclear non-heme iron clusters. // Chem. Rev., 1996, V. 96, p. 2625 2657.

74. R. H. Holm, P. Kennepohl, E. I. Solomon, Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology II Chem. Rev., 1996, V. 96, p. 2239 2314.

75. R. C. Reem, E. I. Solomon, Spectroscopic studies of the binuclear ferrous active site of deoxyhemerythrin: coordination number and probable bridging ligands for the native and ligand-bound forms // JACS, 1987, V. 109, p. 1216 1226.

76. N. Voevodskaya, F. Lendzian, A. Graslund, A stable Felll-FelV replacement of tyrosyl radical in a class I ribonucleotide reductase // Biochem. Biophys. Res. Communs., 2005, V. 330, p. 1213 1216.

77. D. L. Brautigan, B. A. Feinberg, В. M. Hoffman, E. Margoliash, J. Preisach, W. E. Blumberg, Multiple low spin forms of the cytochrome с ferrihemochrome // J. Biol. Chem., 1997, V. 252, p. 574 582.

78. W. R. Hagen, EPR spectroscopy of iron-sulfur proteins // Adv. Inorg. Chem., 1992, V. 38, p. 165-222.

79. R. L. Lieberman, A. C. Rosenzweig, The quest for the particulate methane monooxygenase active site // Dalton Trans., 2005, p. 3390 — 3396.

80. P. W. Andersen, H. Hasegava, Considerations on Double Exchange // Phys. Rev., 1955, V. 100, p. 675 681.

81. Ю. В. Яблоков, В. К. Воронкова, Л. В. Мосина, "Парамагнитный резонанс обменных кластеров", М.: Издательство "Наука", 1988, 198 с.

82. G. Blondin, J. J. Girerd, Interplay of electron exchange and electron transfer in metal polynuclear complexes in proteins or chemical models // Chem. Rev., 1990, V. 90, p. 1359 1376.

83. S. S. Lemos, M. L. P. Collins, S. S. Eaton, G. R. Eaton, W. E. Antholine, Comparison of EPR-visible Cu(2+) sites in pMMO from Methylococcus capsulatus (Bath) and Methylomicrobium album BG8 // Biophysical Journal., 2000, V. 79, p. 1085 1094.

84. B. R. Crouse, J. Meyer, M. K. Johnson, Spectroscopic Evidence for a Reduced Fe2S2 Cluster with a S = 9/2 Ground State in Mutant Forms of Clostridium pasteurianum 2Fe Ferredoxin // J ACS, 1995, V. 117, p. 9612 9613.

85. R. Bernhardt // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 1995, V. 127, p. 137 -221.

86. I. C. Gunsalus, T. C. Pederson, S. G. Sligar, Oxygenase-catalyzed biological hydroxylations // Annu. Rev. Biochem., 1975, V. 44, p. 377 407.

87. M. Sono, M. P. Roach, E. D. Coulter, J. H. Dawson, Heme-Containing Oxygenases II Chem. Rev., 1996, V. 96, p. 2841 2887.

88. A. Glieder, E. T. Farinas, F. H. Arnold, Laboratory evolution of a soluble, self-sufficient, highly active alkane hydroxylase II Nat. Biotechnol., 2002, V. 20, p. 1135 -1139.

89. D. M. Doughty, L. A. Sayavedra-Soto, D. J. Arp, P. J. Bottomley, Product repression of alkane monooxygenase expression in Pseudomonas butanovora II J. Bacteriol., 2006, V. 188, p. 2586 2592.

90. J. G. Leahy, P. B. Patchelor, S. R. Morcomb, Evolution of the soluble diiron monooxygenases //FEMSMicrobiol. Rev., 2003, V. 27, p. 449 479.

91. M. K. Sluis, L. A. Sayavedra-Soto, D. J. Arp, Molecular analysis of the soluble butane monooxygenase from Pseudomonas butanovora II Microbiology, 2002, V. 148, p. 3617-3629.

92. J. Shanklin, C. Achim, H. Schmidt, B. G. Fox, E. Miinck, Mossbauer studies of alkane omega-hydroxylase: evidence for a diiron cluster in an integral-membrane enzyme. // PNAS, 1997, V. 94, p. 2981 2986.

93. J. T. Groves, High-valent iron in chemical and biological oxidations // J. Inorg. Biochem., 2006, V. 100, p. 434 447.

94. S. S. Stahl, W. A. Francisco, M. Merkx, J. P. Klinman, S. J. Lippard, Oxygen Kinetic Isotope Effects in Soluble Methane Monooxygenase // J. Biol. Chem., 2001, V. 276, p. 4549-4553.

95. В. Ф. Гальченко, JI. В. Андреев, Ю. А. Троценко, "Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий", Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1986 г., 96 с.

96. R. Balasubramanian, А. С. Rosenzweig, Structural and mechanistic insights into methane oxidation by particulate methane monooxygenase // Acc. Chem. Res., 2007, V. 40, p. 573-580.

97. Yasuhiro Kashino, Separation methods in the analysis of protein membrane complexes II Journal of Chromatography B, 2003, V. 797, p. 191-216.

98. T. Nakajima, H. Uchiyama, O. Yagi, T. Nakahara, Purification and properties of a soluble methane monooxygenase from Methylocystis sp. M. // Biosci. Biotech. Biochem., 1992, V. 56 (5), p. 736 740.

99. K. Yoshizawa, Y. Shiota, Conversion of methane to methanol at the mononuclear and dinuclear copper sites of particulate methane monooxygenase (pMMO): a DFT and QM/MM study // JACS, 2006, V. 128 (30), p. 9873 9881.

100. Peter P.-Y. Chen, Sunney I. Chan, Theoretical modeling of the hydroxylation of methane as mediated by the particulate methane monooxygenase // Journal of Inorganic Biochemistiy, 2006, V. 100, p. 801 809.

101. J. Zhang, H. Zheng, S.L. Groce, J.D. Lipscomb, Basis for specificity inmethane monooxygenase and related non-heme iron-containing biological oxidation catalysts // Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2006, V. 251, p. 54 — 65.

102. N. D. Priestley, H. G. Floss, W. A. Froland, J. D. Lipscomb, P. G. Williams, H. Morimoto, Cryptic stereospecificity of methane monooxygenase // J ACS, 1992, V. 114, p. 7561-7562.

103. S. K. Lee, B. G. Fox, W. A. Froland, J. D. Lipscomb, E. Munck, A transient intermediate of the methane monooxygenase catalytic cycle containing an FelVFelV cluster //JACS, 1993, V. 115, p. 6450 6451.

104. K. Yoshizawa, T. Yumura, A Non-radical mechanism for methane hydroxylation at the diiron active site of soluble methane monooxygenase // Chem. Eur. J., 2003, V. 9, p. 2347 2358.

105. Stephen J. Lippard, Hydroxylation of C-H bonds at carboxylate-bridged diiron centres II Phil. Trans. R. Soc. A, 2005, V. 363, p. 861 877.

106. B.F. Gherman, S.J. Lippard, R.A. Friesner, Substrate hydroxylation in methane monooxygenase: quantitative modeling via mixed quantum mechanics/molecular mechanics techniques. II JACS, 2005, V. 127, p. 1025 1037.

107. Alexander E. Shilov and Georgiy B. Shul'pin, Activation of C-H Bonds by Metal Complexes // Chem. Rev., 1997, V. 97, p. 2879 2932.1. Благодарности

108. Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н. Р. И. Гвоздеву за помощь в постановке цели исследования, проведении экспериментов, обсуждении результатов исследования и подготовке рукописи диссертации.

109. Также автор благодарен сотрудникам группы структуры и технологии ферментов (ИПХФ РАН): Е. К. Ходеевой С. А. Головановой И. А. Тухватуллинуза помощь в проведении экспериментов и дружеское участие.

110. Отдельная благодарность профессору К. К. Андерссону и О. К. Рёху (Университет г. Осло) и Д. Ш. Бурбаеву (ИХФ им. H.H. Семенова РАН) за проведение и обсуждение ЭПР экспериментов.