Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование морганелл для получения диагностических О-сывороток

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гурдина, Валерия Викторовна, Москва

03. 00. 07 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

могияеек!

доктор медицинских наук

БАТУРО А.

L«rf С) Ф С! 41'

Ф в> О «■ й Ф ft «•

стр.

3 - 7

в) ф е>

.8 -40

вне бактерий рода свойства........„.. .8 -23

ровашш на имфпшюмов........24.....43

остических

.44-60

Ii. Ol 41' d> Ф Ol 41' & Ф CI «I' Ф

fli # Ci «> J

0) с Oi » О» Ф

особенности Morgan

ирования

fli «■ 4t 0> fl!

С: 3ГСГ'т.1

ф <n «■ ® e> a

1. 11 ВЕДЕНИЕ

Среди инфекций, вызываемых услшпо-патогеннымж djггсробактсриями, наряду с широко известными возбудителями диареи (бак-юриями родоъ ГвоЬоichin, Citrobacter, Puieiis, Salmonella, Pseudomonas} ломаный удсштый »sx имеют заболевания, обусловлен лыс аредстяпичm»wh новых семейств Enterobacteriaceae , в частности такы1 ниды как Yersinia enterocolitica, Edwardsiella tarda, Morg;mc)l?i rooi/ymij. Providencia stuartii, которые способны обусловливать как простую, так и смотанную инфскции/МА Известны случаи, когда мор) и <.и и и бы ни вы до иены среди друлгх знтеротоксигенных бактерии от лшук kjia путешественников, страдающих диареей /117/, описано редкое позднее

осло лисп не после алло* и.....лои трапа i и я in ации костного мозга, вызванное

ростом бактерий Moipanella яюгрдшл в культуре гнойной жидкости, уди леи» ой лрн: перикардиотомии /145/, в 1996 году в литературе описал: первый случай абсцесса мозга у новорожденного, ъьтыиши куш lypon Morgan с)) а morganii, выделенной из спиномозгоиии жидкие га, ранее были описаны случаи абсцесса мозга у новорожденных, вызванные грамотрицательными бактериями: Escherichia, coli; Proteus mirabilis, P.vulgaris, Citrobacter /151/. Исследованиями Л.С.Каврука было установлено, что бактерии вида Morganella morganii способны самостоятельно или в ассоциации с другими видами энтеробактфий вызывать тяжело протекающую с летальным исходом диарею у поросят-сосунов и новорожденных телят /38,67,84,85,111/,.

Бактерии рода Мо^апе11а относятся к числу малоизученных представителей семейства Еп1егоЬас1;ет1асеае. Отсутствие статистических данных о широте их распространения явилось

причиной недооценки роли этих микроорганизмов и недостаточного внимания к глубокому изучению биологических особенностей морганелл, выделенных из различных источников.

В связи с этим перед исследователями встала проблема •■• выяснение этиологического значения бактерий рода Мо^апеПа в патологии, осуществление контроля за их распространением с целью профилактики заболеваний, проведение

противоэпидемических мероприятий, для решения этих задач; необходима точная идентификация выделенных штаммов от больных и здоровых людей и животных, поэтому потребовались препараты для серотипирования морганелл.

Расшифровка антигенного строения штаммов морганелл, выделяемых от больных людей и животных, а также из других источников возможна лишь при наличии соответствующих диагностических сывороток. В 1987 году Л.С.Ковруком были получены эритроцитарные морганеллезные диагностикумы и агглютинирующие морганеллезные О-сыворотки /43/.

Бритова С.В. предложила реакцию коагглютинации для ускоренной идентификации энтеробактерий рода МощапеЦа тог|ргш в объектах внешней чреды, кормах и патологическом материале/15/.

В НИИВС им. И.И.Мечникова Прошушнской М.А. /81/ разработана диагностическая рапид-система для одноэтапной

идентификации О-антигенов морганелл, однако, при этом: в ряде мопоеьто роток уровень ангшеи составил всего 1 : 800 - I :: 400.

В связи с изложенным, псиью работы являлся поиск оптимальных условий получения полноценной в антигеннО'м отношении биомассы моргшиулг для приготовления аггдатинирук^ни диагностических О-

СЫ'ВО рОТОК,

Досгижепис поставленной: цели осуществлялось решением: следующих задал:

1, Изучить физиолого-биохимические свойства морганелл при культивировании в различных условиях.

2. Выбрать оптимальный режим культивирования морганелл: с целью получения О-антигена для иммунизации животных.

3. Мзу)И'1 ь ношожлость использованная полуполной биомассы для иммунизации жшнл лых с целью получения дииглоел ических.

ОМВОрОТСЖ,

4. Получить сыворотку от иммунизированных животных и: определить ее специфичность и стецифичесжук) активность,.

НАУЧНАЯ ЛОЙИ'ША

Получены новые да] i j л о физиологе - биохимических особенностях: морганелл при глубинном культивировании в колбах, на качалке и в ферментере.

'Выявлено влияние предистории культуры на содержание белка в клетках морганелл; при: использовании" старого " посевного маршала (4В - часовой и »роной куш гуры ) содержание белка в к истках выше в фазе жсполспциального роста , в тех случаях , ко}да длу посева использовали 24-х часовую культуру содержание белка в клетках Морганелл практически не зависело от фазы роста. ) > ли я i тио предистории культур ы отмечалось только при культивировании в средах без углеводов.

Содержание полисахарида в клетках морганелл наибольшее в 'жшополриалыгой фазе роста и значительно падает в фазах замедления и сгщлопарпо'й.

Самые высокие значения максима иыюй удельной скорости роста и лай больший выход биомассы 11 нбл юдаются при культи вировании морганелл в условиях средних значений концентраций растворенного в среде кислорода (рОг = 20 30% от полного насыщениия).

Впервые получены диагностические агглютинир> юл/ш О -

сыворотки морганелл: при использовании принципиально новой: модели животных - продуцентов, мини-свиней Светлогорской породы.

ПР'АК'Ш^ЖС ХАЯ 3] ] Л "ШМОСТЬ

Разработан способ получения диагностических агглютинирую]пи/ О сывороток морганслл, заключающийся в приме л? пип ь качество вчтипы

для иммуни^лии мини-свиней биомассы, ш»)р «шиной в ллу^ииш-ы условиях культивирования в казеиново-дрожжевой среде до фазы экспоненциального роста.

1' Н) ДОЖЕНИЯ, ВЫНОСИ М!') 11Г Ш ЧА11Щ ТУ

11 овыс данные о физиолого-биохимических особенностях мор1 лисил, позволившие ьыбратъ оптимальный режим: культивирования да]у иолуч011 т кы(хжоспоцифических диагностических О-сывороток..

2. C"Ki-:]"C>r>' iíihi'iKjpiriiviiPibi«

2.1 Классификациониое положение бактерий рода Morganeüa и их биологические свойства-

Биологи всех направлений стремятся к созданию естественной системы организмов. Однако, усилия и поиски нескольких поколений ученых не привели к успешному решению этой проблемы в микробиологии. Классификаций предлагалось много. Они в какой-то степени служили; практическим запросам определения и идентификации микробов, но системы, как таковой, фактически до сих пор нет: /10/. В систематике бактерий для наименования объектов используют биноминальную номенклатуру К. .Линнея, согласно которой биологическому виду присваивают название, coa шц<е из двух слов: первое определяет принадлежность организма к определенному роду, второе - виду. Названия бактерий присваивают в соответствии с правилами Международного Кодекса номенклатуры бактерий. Основной таксономической единицей является вид. Виды объедш но гея в роды, роды в семейства, далее следуют порядки, классы, отделы, царства /29/.

Традиционная классификация, основанная на изучении внешних, проявляющихся в процессе жизнедеятельности признаков -признаков фенотипа, получила название фенотипической систематики, или просто феносистематики. Ее развитие в направлении расширения, доступной исследователю, информ иди о фенотипе и использовании вычислительной техники для ее обработки привел» к возникновению нового направления - числовой таксономии (численной, нумерической, numerical taxony ) /10/. Иерархическая система бактерий, созданная на основании значимости фенотипических признаков при субъективной их оценке, оказалось несовершенной. С целью устранения субъективизма было предложено использовать нумерическую (числовую) таксономию, принцип которой был: разработан в 18-ом веке фршцузским hoi пником М. Адансоном и использован в микробиолг» ии в 20-м: веке после создания: вычислительной техники (ЭВМ;.),, Основные положения М. Адансонаг при описании исследуемого объекта использовать большее число признаков (около 100), все признаки считаются равноценными, степень сходства является функцией числа совпадающих признаков. Недостатком данного подхода является неполная информативность, так как. использование даже 100 признаков для оценки сходства прокариот составит только 1.0 % от количества признаков, определяющих фенотип бактерий. Принцип нумерической таксономии в настоящее время: используется для определения сходства в пределах рода / 19/.

Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариотных организмов решается с помощью определителя

бактерий Берги, выпускаемого периодически: обществом американских бактериологов с привлечением:: крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий /29/. В восьмом издании Определителя бактерий Берги, выпущенном в 1974 г., Морганелла была отнесена к роду Proteus.,

Согласно этому руководству Proteus входит в трибу Proteeae , а

в пределах рода различают следующие виды: Proteus vulgaris (являющийся типовым видом рода), Proteus mirabilis, Proteus naorganii, Proteus rettgeri и Proteos inconstans ( с подгруппами А и В ). Наряду с этим: в литературе достаточно широкое отражение нашла, и классификация Ewmg по которой в трибу Proteeae включены 2-а рода. :: Proteus и Providencia. В роде Proteus представлены те же виды, что и в упомянутой ранее классификации, за исключением Proteus inconstans, выделенного в самостоятс иьный род Providencia с двумя видами: Providencia alcahíaeícns (соответствует биохимической подгруппе А.) и Providencia stuartii (соответствует подгруппе В). Направление, характеризующееся еще Оош шш "расщеплением" протеев (по выражению S. Cowan-"sp]ittÍHg") отразилось в ряде предложений, рассматривать в трибе 'Proteeae 4-е рода: Proteus, Могр-iíkJIi Rettgerella, Providencia/146/.

Позднее Моргакеллы классифицировали как самостоятельный род, относящийся к трибу Proteeae /37,77/ в информационном бюллетене Всесоюзного Микробиологического Общества при

Академии наук СССР в 3-ем приложении 1982 Морганелла выделена в отдельный род, относящийся к: семейству Е]11егоЬас1епасеае /классу 8ео1;оЬас1епа/ /72/. Семейство энтеробактерий по новой классификации Берги /определитель бактерий Берги, 1984/ включает 14 родов, и представляет собой многочисленную группу возбудителей кишечных инфекций. В ранг родов внесены Рго\ас1еп.ща и Мог§апе11а. Кроме того, здесь представлены дополнительные сведения о малоизученных или недавно описанных энтеробактериях, составляющих группу из шести, так называемых, "других родов" /103/.

ТАБЛИЦА. № 1.

Сравнение к дасс ифик ли ци й семейства Е1|егоЬас1ег1асеае, приведенных в наследием (9 ом) и 8.....ом изданиях "'Определителя

бактерий " Берджи,

Классификация Enterobacteriaceae по 9- ому изданию Синонимы Классификаиш Enterobactariaceae по 8-ому изданию

........................1................~~..............~~.............................. ...................................2.......................................................................... .....................................................з...................................................................................................

'Escherichia coli E. coli

Е. blattete NL

Shigella dysenteriae /V. dysenteriae

S. flexneri S. flexneri

S.boydii S.boydii

S.sonnei S 'onnei

Eäwardsieüa tarda E.anguiUimortt fem 1 tarda

Edctaluri NL

I 2 3

E.hoshinae NL

Citrobacterfreundii C freundii

C.diversus Levinea malonatica, C. koseri C intermedins biogroup b

C. amalonaticus Levinea amalonatica C. intermedins biogroupa a

Salmonella choleraesuis S. choleras

S. hirschfeldii S. paratyphi C S. hirschfeldii

S. typh i S typhi

S. paratyphi A S paratyphi A

S. shottmuelleri S. paratyphi B S. shottmuelleri

S. typhimurium S. typhimurium

S. enteritidis S. enteritidis

S. gallinamm S, gallinarum

S. salamae S. daressalaam S, salamae

S. arizonae Arizona hinshawii S. arizonae

8, houtenae S. houtenae

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae IL pneumoniae

^pneumoniae subsp.ozaenae K,. ozaenae

K.pneumoniae subsp. rhinos cleromatis K. rhinoscleromatis

K. oxytoca K. pneumoniae, indole-positive biogroup

K. plcmticola NL

K. terrigena NL

Enterobacter cloacae E. cloacae

E, aerogenes Klebsiella mobilis E. aerogenes

E. agghmeram Erwinia herbicola, Erwinia stewartii, and Erwinia uredovora

E, gergoviae NL

E. amnigenus NL

E. sakazakii yellow-pigmented J (loacae

1 2 3 !

E. intermedium

ffafnia alvei H. alvei

.............. S. marcescens

S. liquefaciens NIL,

S. rubidaea S. marinorubra N1,

S. plymuthica biogroup of S. marcescens

S. proteamaeulans NI-

S, odorífera HIL

S. fontieola NL

S. ficaria NL

Proteus vulgaris P. vulgaris

P. mirabilis P. mirabilis NL Pi ote us im ansian s biop/cmp A Proteus inconstans IiiciíM'oi¿|> B

P. myxofaciens

Providencia akalifaciens

P. stuartii

P. rettgeri Proteus rettgeri

Morganella morganii Proteus morganii

Yersinia pseudotuberculosis Y .-pseudotuberculosis

Y. pestis Y. pestis

Y. enterocolitica Y. enterocolitica

Y. ruchen NL

Y. intermedia biogroup of Y. enterocolitica

Y. frederíksenii biogroup of Yenterocolitica

Y.krisiensenii biogroup of Y .enterocolitica

Erwinia amylovora E. amylovora

E. salicis E. salicis

E. tracheriphila E. tracheriphila

E. nigrifluens E. nigrifluens

E. quercina E. quercina

E. rubrifaciens E. rubrifaciens

E. herbicola Enterobacter agglomerans E. herbicola

E. stewartii E. stewartii

i 2 3

Е. uredovora E. uredovora

Е. carotovora Pectobacterium carotovorum E. carotovora

Е. chrysanthemi Pectobacterium chrysanthemi E. chrysanthemi

Е. cypripedii Pectobacterium cypripedii E, cypripedii

Е. rhapontici Pectobacterium rhapontici E. rhapontici

Е. carnegiearta Pectobacterium carnegieana NL

Е. mallotivora NL

Obesumbacterium proteus NL

Kluyvera ascorbaia NL

К. cryocrescens NJ

Cedecea lapagei NJ

C. davisae NL

Tatumrlla ptyseos NJ

Xenorhabdus nematophilus N1

luminescens NL

Rahnetta aquatilis NL

Диагностическая значимость триб в настоящее время отвфгнута, так как их таксономическое значение вызывает сомнение. В связи с этим семейство Bnterobacteriaceae разделено

непосредственно на роды, а понятие "трибы" опущено /4/,

Морганелла названа по имени Н. De R. Morgan., которой впервые изучил этот микроорганизм. Морганеллы представляют собой палочки, 0,6-0,7 ¡гм в диаметре и 1,0-1,7 рм в длину, что соответствует общему определению семейства энтеробактерий. Грам - отрицательные бактерии, передвигаются посредством жгутиков, но

некоторые штаммы жгутиков не образуют. Штаммы M.morganii были выделены из клинических образцов (кровь, слюна, гной, выделении! из ран /105/ и инфекций мочевого тракта) /124/. Они являются менее частым случаем! инфекции мочевого тракта, чем: Proteus mirabilis , из-за их более медленной скорости роста в моче и их неспособности быстро её защелачивать /141/. Некоторые штаммам M.morganii могут быть причиной диарии у человека /123,129,135,148,149/, могут быть ассоциированы со вспышкой инфекции /115,116,150/ с серьезными последствиями и смертью /154/. M^morganii были рассмотрены как причина диареи /123,129,135,148,149,/потому, что были найдены, в испражнениях при диареи, в то время как другие известные патогены ( Salmonella, Shigella ) не присутствовали. Морганеллы были выделены из содержимого кишок людей, собак, других млекопитающих и рептилий /152/. Проведенные исследования по изучению видового состава условно -патогенной микрофлоры репродукторных помещений свиноводческих и молочных ферм при массовых жеяудочло кишечных заболеваниях поросят-сосунов и новорожденных телят показали, что наряду с известными возбудителями диареи, относящимся к роду Escherichia, Proteus, Citrobacter и др. встречаются бактерии рода Morganella, (вид morgan»), обладающие патогенностью для лабораторных, животных. Роль этих микроорганизмов в этиологии желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных долгое время оставалась не изученной, как: и место их в общей: структуре возбудителей указанных заболеваний /15/. Как уже упомни ин <j еще недавно морганеллы классифицировались как

Proteus, и таким образом рассматривались в свете их членства в этом роде скорее, чем как отдельный род. Подобно Proteus морганеллы могут быть выращены на питательной среде, используемой для энтеробактерий. Подобно Proteus и Providencia штаммы морганелд продуцируют уреазу и фенилаланиндезаминазу. Некоторые штаммы морганелл: образуют гемолиз на кровяном: агаре /36,119,152/. Энзимы морганелл. серологически не связаны с энзимами этих двух родов, и уреаза имеет другие свойства, которые заметно отличаются от уреазы Proteus и Providencia. В отличие от Proteus и Providencia штаммы морганелл известны своей неспособностью ферментировать углеводы. Глюкоза и манноза являются единственными сахар ами, которые штаммы, морганелл: ферментируют с oU|ji30i шжм кислоты. Некоторые штаммы ферментируют трегалозу и: глицерин, в единичных случаях выделяются лактозоположительные штаммы. Штаммы морганелл декарбоксилируют в основном только орнитин, некоторые декарбоксилируют и орнитин и лизин, а другие не карбоксилирукэтг ни: ту, ни другую аминокислоты. Штаммы морганелл требуют для своего роста ниацин и пантотенат,. Биохимические свойства морганелл приведены в таблице № 2 /103/.

ТАБЛИЦА №2

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ РОМ МОКСА^ЬЬА.

ТЕСТ РЕАКЦИЯ ИЛИ РЕЗУЛЬТАТ

1 2

Фенилаланиндезам и \ % за I-

Уреаза +

Индол: +

Рост на iv.CN +

Орнитиндекарбоксилаза

Лизиндекарбоксилаза

Аргтшндегидролаза

Тест с метиловым красным: +

Реакция Фогеса-Проскя.уэра

Восстановление МОз :в N0?,

Утилизация тирозина +

Оксидаза .....

1 2

СЖРО .....

Дюоксирибонукяеаза ™

Липаза

Утилизация тартрата +

Образование №8 (трех-сахарный, железо-агар)

Подвижность +

Желатина +

Утилизация цитрата (Симмонса) .....

Утилизация ацетата или малонага

Образование кислоты из:

¡1 Глюкозы, маннозы +

Трегалозы с!

Лактоза, сахароза, рафиноза, Ь -арабиноза, Ь..... рамноза, В - ксилоза, целлобиоза, & ■■ метилглюкозид, метилбиоза, салицин, муках

1 2

Газ из глюкозы с!

А) Температура реакции 36° + I 0 С. Все реакции учитывают через 48 часов,

Б) ON.PG, о-нитрофенил-|3-гал:ажтопиранозид

Лучшие способы распознания M.morganii достигаются прежде всего серотапированием или типиропанием по 0 ш i сриоцинам /136,137,138,152/. Оригинальная антигенная схема, основанная на соматическом /О/ и жгутиковом /НУ антигенах, распространяется на 42-е серогруппы и 75 сероваров. О -антигены могут быть определены пассивной гемагглютинацией /142/. В. W. Senior, /142/ описал: схему типирования M.morganii, основанную на продукции бактфиоцинов (морганоцинов) и чувствител�